Tài liệu Khảo sát khả năng phát triển trứng và sự tạo thành phôi chó trong điều kiện phòng thí nghiệm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGÔ THỊ MAI HƯƠNG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN TRỨNG VÀ SỰ TẠO THÀNH PHÔI CHÓ TRONG ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGÔ THỊ MAI HƯƠNG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN TRỨNG VÀ SỰ TẠO THÀNH PHÔI CHÓ TRONG ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM (Sinh lý động vật) Mã số: 60 42 30 3 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. TS. NGUYỄN THANH BÌNH 2. PGS. TS. TRẦN THỊ DÂN Thành phố Hồ Chí Minh - 2011 MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa......................................................................................................... i MỤC LỤC............................................................................................................ ii DANH MỤC BẢNG ........................................................................................... iv DANH MỤC HÌNH.............................................................................................. v DANH MỤC BIỂU ĐỒ....................................................................................... vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.............................................................................. vii PHẦN 1: MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Chu kỳ động dục ở chó .............................................................................. 3 2.1.1. Kỳ không động dục.................................................................................... 3 2.1.2. Kỳ tiền động dục........................................................................................ 3 2.1.3. Kỳ động dục............................................................................................... 4 2.1.4. Kỳ đình dục ............................................................................................... 4 2.2. Sự thành thục của trứng chó in vivo............................................................ 7 2.2.1. Các giai đoạn phát triển của trứng chó ....................................................... 7 2.2.2. Đặc điểm môi trường phát triển của trứng chó in vivo ................................ 8 2.3. Sự thành thục của trứng chó in vitro......................................................... 10 2.3.1. Thử nghiệm mô phỏng điều kiện in vivo .................................................. 11 2.3.2. Môi trường nuôi cấy................................................................................. 13 2.3.3. Các điều kiện nuôi cấy in vitro................................................................ 17 2.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện sinh lý chó ....................................................... 19 2.4. Kết quả tạo phôi chó in vitro .................................................................... 20 PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Địa điểm và thời gian............................................................................... 22 3.2. Nội dung nghiên cứu................................................................................ 22 3.3. Dụng cụ, thiết bị, và hóa chất................................................................... 22 3.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 22 3.5. Chỉ tiêu đánh giá ...................................................................................... 27 ii 3.6. Xử lý số liệu ............................................................................................ 27 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1. Tỉ lệ trứng sống/ trứng thoái hóa .............................................................. 28 4.2. Nuôi thành thục trứng chó in vitro............................................................ 30 4.3. Kết quả thúc đẩy sự thành thục của trứng chó khi đồng nuôi cấy với tinh trùng ............................................................................................................ 33 4.4. Kết quả thụ tinh và tạo phôi ..................................................................... 37 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận ................................................................................................... 40 5.2. Đề nghị .................................................................................................... 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................... 41 PHỤ LỤC........................................................................................................... 46 iii DANH MỤC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ sống của trứng theo thời gian nuôi thành thục........................ 28 Biểu đồ 4.2: Tỉ lệ trứng chó ở các giai đoạn thành thục in vitro .......................... 31 Biểu đồ 4.3: Tỉ lệ thành thục nhân trứng IVM/IVF sau 48 giờ nuôi .................... 34 Biểu đồ 4.4: Tỉ lệ thành thục nhân trứng IVM/IVF sau 60 giờ nuôi .................... 35 Biểu đồ 4.5: Tỉ lệ thành thục nhân trứng IVM/IVF sau 72 giờ nuôi .................... 35 Biểu đồ 4.6: Tỉ lệ thành thục nhân của trứng được thụ tinh ................................. 36 Biểu đồ 4.7: Tỉ lệ thụ tinh ................................................................................... 37 vi DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1: Diễn tiến hormone trong chu kỳ động dục chó ................................. 5 Hình 2.2: Hình ảnh tế bào học ống sinh sản chó trong chu kỳ động dục........... 6 Hình 2.3: Các giai đoạn phát triển nang buồng trứng....................................... 9 Hình 2.4: Trứng chó trước khi nuôi cấy và sau khi nuôi cấy.......................... 11 Hình 2.5: Phôi chó thu nhận in vitro ở các giai đoạn...................................... 21 Hình 3.1: Chó giống nội ................................................................................ 22 Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm .................................................................. 22 Hình 3.3: Các hình thái buồng trứng.............................................................. 24 Hình 3.4: Trứng được thu nhận cho thí nghiệm ............................................. 25 Hình 3.5: Tinh hoàn và phó tinh hoàn............................................................ 26 Hình 3.6: Trứng chó được nhuộm với Hoechst 33342 sau nuôi thành thục ... 27 Hình 4.1: Trứng chó sau nuôi cấy.................................................................. 29 Hình 4.2: Trứng chó sau nuôi thành thục và nhuộm với PI ............................ 32 Hình 4.3: Phôi chó thu nhận in vitro .............................................................. 38 Hình 4.4: Hợp tử với 2 tiền nhân ................................................................... 39 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT – THUẬT NGỮ ECG Equin Chorionic Gonadotropin Kích thích tố màng đệm ngựa FSH Follicle Stimulating hormone Hormone kích thích nang trứng GVBD Geminal Versicle Break Down Vỡ túi mầm HCG Human Chorionic Gonadotropin Kích thích tố màng đệm người IVF in vitro fertilization Thụ tinh trong ống nghiệm IVM in vitro maturation Nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm LH Luteinlazing hormone Hormone hoàng thể hóa MI Metaphase I Kỳ giữa giảm phân lần I MII Metaphase II Kỳ giữa giảm phân lần II PI Prophase I Kỳ đầu giảm phân lần I TCM 199 Tissue culture medium 199 Môi trường nuôi cấy mô Gonadotropin Chất kích thích tuyến sinh dục giải phóng từ tuyến Yên In vitro Trong ống nghiệm In vivo Trong cơ thể vii MỞ ĐẦU Nghiên cứu về sinh lý sinh sản và công nghệ hỗ trợ sinh sản đã phát triển từ lâu trên đối tượng động vật có vú. Cơ chế sinh sản ở các loài này tương đối giống nhau (heo, bò, người, chuột..) tuy nhiên ở loài chó, có một số khác biệt với các loài động vật có vú khác. Thứ nhất là chu kỳ sinh dục của chó kéo dài khoảng 3 – 10 tháng tùy giống trong khi bò, người, heo là 20 – 28 ngày. Thứ hai là sự kiện chảy máu âm đạo ở giai đoạn tiền động dục. Sự chảy máu này không giống ở người là do bong tróc lớp niêm mạc dạ con khi không thụ tinh, ở chó sự chảy máu này là để bong lớp tế bào ngoài giúp tử cung sẵn sàng cho phôi làm tổ. Thứ ba là quá trình chín của trứng chó. Ở các loài động vật có vú khác, trứng tiến hành giảm phân trong nang trứng ở giai đoạn nang tiền rụng. Khi rụng, trứng ở giai đoạn Metaphase II và sẵn sàng cho thụ tinh. Tuy nhiên, ở chó không xảy ra như vậy, khi rụng trứng, trứng ở giai đoạn túi mầm (germinal versicle –GV) và quá trình giảm phân hoàn thành sau khoảng 48 giờ trong ống dẫn trứng [36]. Trên thực tế, chỉ có sự kiện thứ nhất và thứ ba là có ảnh hưởng nhiều tới những nghiên cứu về sinh sản in vitro của chó. Hiện nay, trên thế giới, kết quả của những nghiên cứu nuôi trưởng thành trứng in vitro còn rất hạn chế. Tỷ lệ nuôi chín trứng chó chỉ đạt khoảng 20% ngoại trừ nghiên cứu gần đây của tác giả Songsasen và Wildt đã báo cáo nuôi chín trứng thu nhận từ những nang trứng có kích thước > 2 mm đạt tỷ lệ 79,5% [14], [46]. Do đó, tỷ lệ phôi hình thành từ nguồn trứng nuôi trưởng thành in vitro này cũng rất hạn chế [14]. Ở Việt Nam, hiện nay chưa có quy trình nào hiệu quả cho việc nuôi thành thục trứng chó và tạo phôi chó in vitro. Năm 2005, nhóm tác giả Quách Tuyết Anh và Trần Thị Dân [35] đã báo cáo nuôi thành thục được trứng chó với tỉ lệ 0,75% ngoài ra không còn công bố nào có kết quả cao hơn. Với mục đích nghiên cứu về nuôi thành thục trứng và tạo phôi chó in vitro, tôi tiến hành đề tài: “Khảo sát khả năng phát triển của trứng và sự tạo thành phôi chó trong điều kiện phòng thí nghiệm” Mục tiêu của đề tài là khảo sát thời gian tối ưu cho nuôi thành thục trứng và tạo phôi chó in vitro, đồng thời kiểm tra khả năng thúc đẩy trứng chó thành thục bằng việc đồng nuôi cấy với tinh trùng sau mỗi khoảng thời gian nuôi. Kết quả được đánh 1 giá thông qua các chỉ tiêu về tỉ lệ trứng sống/ thoái hóa; tần suất và mức độ thành thục nhân của trứng; tỉ lệ thụ tinh và khả năng tạo phôi. 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Chu kỳ động dục ở chó Ở chó, mỗi chu kỳ động dục kéo dài vài tháng; ngoài ra, biểu hiện về thời gian động dục ở mỗi con và mỗi giống rất khác nhau, đôi lúc những biểu hiện cũng khác nhau. Chu kỳ sinh dục bình thường của chó cái có thể phân chia thành 4 giai đoạn, mỗi giai đoạn có hành vi, sinh lý và kiểu nội tiết riêng biệt. 2.1.1. Kỳ không động dục Kỳ không động dục (anaestrus) ở chó kéo dài 2-10 tháng [47]. Tuyến sinh dục của chó ở kỳ này không có hoạt động rõ rệt. Chúng không đòi hỏi giao phối hoặc không chấp nhận cho chó đực giao phối. Âm hộ nhỏ và không phồng lên. Phân tích tế bào học ống sinh dục của chó cái cho thấy các tế bào nhỏ chiếm đa số và một phần nhỏ các tế bào bạch cầu và các vi khuẩn. Nội soi âm đạo thấy các nếp gấp phẳng, mỏng và đỏ. Sinh lý của chó trong giai đoạn này vẫn chưa được hiểu rõ nhưng chắc chắn là có sự giảm chức năng thể vàng và giảm tiết prolactin. Ở kỳ này, kết quả đo nồng độ estrogen được công bố rất khác nhau nhưng đều cho rằng hàm lượng đạt mức độ cao hơn mức trung bình một tháng trước kỳ tiền động dục rồi tăng lên nhanh chóng [30]. Trong khi đó, nồng độ của Luteinizing hormone (LH) trong huyết thanh đạt ở mức thấp, dưới 1 ng/ml, chỉ bằng 2-20% so với nồng độ đỉnh. Ở giai đoạn đầu của kỳ không động dục, follicle stimulating hormone (FSH) luôn ở nồng độ căn bản (khoảng 20 ng/ml) và tăng lên vào giữa và cuối của kỳ (>30ng/ml) [8], [29]. Trong giai đoạn không động dục, chó cái không thấy có sự hoạt động chức năng của buồng trứng. 2.1.2. Kỳ tiền động dục Trong suốt kỳ tiền động dục (proestrus), chó cái bắt đầu hấp dẫn con đực nhưng vẫn không chấp nhận giao phối. Có sự bong lớp màng niêm mạc giả ở tử cung khiến chảy máu âm đạo, và âm đạo mở rộng ở mức trung bình. Phân tích tế bào âm đạo cho thấy, có sự thay đổi phát triển từ những tế bào nhỏ cận gốc thành các tế bào trung gian nhỏ và lớn, tế bào trung gian và cuối cùng là tế bào biểu mô bề mặt phản 3 ánh tác dụng của sự thay đổi nồng độ estrogen. Nếp gấp âm đạo của chó biểu hiện sự sung phù, có màu hồng và tròn. Khi chuyển dần từ kỳ tiền động dục sang kỳ động dục, nồng độ estrogen tăng từ mức độ trung bình (26 pg/ml) cho tới đỉnh (50-100 pg/ml) rồi giảm xuống nhanh chóng sau đó [6], [9]. Trong kỳ tiền động dục, LH đạt đỉnh (4-40ng/ml) khoảng 1-3 ngày sau đỉnh của estrogen [6]. Ngược lại, progesterone lại tăng chậm. Progesterone tăng từ mức căn bản (0,2-0,4 ng/ml) tới trước đỉnh LH thì đạt 0,6-0,8 ng/ml và sau đỉnh thì đạt 3,2-5,4 ng/ml [7]. Vào giai đoạn sớm của kỳ tiền động dục, nang trứng trội có kích thước khoảng 2-3 mm. Các nang này phát triển tới kích thước khoảng 9-12 mm trước khi vào cuối kỳ tiền động dục [7]. 2.1.3. Kỳ động dục Trong suốt kỳ động dục (estrus), chó có biểu hiện chấp nhận hoặc thụ động trong giao phối và có thể bị chảy máu. Sự chảy máu âm đạo này là do sự bong màng niêm mạc giả ở tử cung chó. Giai đoạn này, âm hộ chó phồng hết cỡ. Các tế bào bề mặt âm đạo chiếm đa phần. Các nếp gấp âm đạo trở nên cuộn nhiều hơn. Nồng độ estrogen giảm rõ rệt sau đỉnh LH, trong khi progesterone tăng dần (khoảng từ 4-10 ng/ml ở thời điểm rụng trứng) đánh dấu pha thể vàng của buồng trứng. Kỳ động dục kéo dài 3 ngày tới 3 tuần và thường là 9 ngày. Hành vi động dục của chó có thể có trước hoặc sau đỉnh LH. Nó kéo dài (khác nhau ở mỗi cá thể) và có thể không cùng lúc với thời kỳ có khả năng thụ tinh. Trứng tiền trưởng thành rụng ở thời điểm 2 ngày sau đỉnh LH và thành thục khoảng 2-3 ngày sau. Thời gian tồn tại của trứng sau thành thục là 2-3 ngày [6], [8], [29]. 2.1.4. Kỳ đình dục Trong kỳ đình dục (diestrus), những con chó bình thường trở nên khó tính cùng với giảm các biểu hiện lôi cuốn con đực. Sự chảy máu âm đạo giảm và âm hộ cũng giảm phồng từ từ. Nồng độ estrogen ở mức thấp, còn nồng độ progesterone tăng dần tới đỉnh là 15-80 ng/ml và duy trì ở mức cao trước khi giảm dần vào cuối kỳ đình dục (khoảng 30-50 ngày) ở cả chó mang thai và không mang thai [6]. Nội mạc tử cung và cơ tử cung phát triển dưới ảnh hưởng của sự tăng nồng độ progesterone. Kỳ đình dục thường kéo dài 2-3 tháng ở những con chó mang thai. Cá thể sẽ đẻ khoảng 4 64-66 ngày sau đỉnh LH. Nồng độ prolactin tăng ngược lại với sự giảm progesterone ở giai đoạn cuối của kỳ đình dục hoặc mang thai. Progesterone đạt mức độ cao nhất trong giai đoạn mang thai. Sự sừng hóa âm đạo Thời kỳ thụ thai Thành thục Rụng trứng Kỳ tiền động dục Kỳ động dục Chu kỳ động dục với ngày bắt đầu kỳ động dục là ngày thứ nhất Hình 2.1: Diễn tiến hormone trong chu kỳ động dục chó (Nguồn: http://www. yourownvet.com) 5 Kỳ đình dục Giai đoạn đầu kỳ tiền động dục có sự tập trung của bạch cầu trung tính, tế bào cận gốc, tế bào biểu mô bề mặt, hồng cầu, và chất nhầy Giai đoạn cuối kỳ tiền động dục, hồng cầu, tế bào biểu mô, và sự vắng mặt của các bạch cầu trung tính Giai đoạn động dục đặc trưng bởi các tế bào biểu mô được keratin hóa, phần lớn không có nhân và tế bào có góc cạnh Giai đoạn đình dục đặc trưng bởi sự giảm sút các tế bào biểu mô, sự tăng các tế bào trung gian, và sự hiện diện của bạch cầu trung tính. Nguồn: http://www.vet.uga.edu/vpp/clerk/beimborn. Tế bào gốc (basal cell): là những tế bào trẻ nhất của tế bào biểu mô âm đạo Tế bào cận gốc (parabasal cell): là những tế bào nhỏ nhất trong các tế bào biểu mô âm đạo Tế bào trung gian (intermediate cell) có kích thước rất khác nhau nhưng thường lớn hơn 2 lần tế bào cận gốc Tế bào biểu mô (superficial cell): là những tế bào già nhất trong các tế bào biểu mô âm đạo Hình 2.2: Hình ảnh tế bào niêm mạc trong ống sinh sản chó trong chu kỳ động dục 6 2.2. Sự thành thục của trứng chó in vivo 2.2.1. Các giai đoạn phát triển của trứng chó Ở giai đoạn nang sơ cấp, các trứng chứa một nhân, bao quanh bởi ty thể, mạng lưới nội chất trơn và thể Golgi. Vào giai đoạn phát triển sớm, liên kết giữa trứng và nang chưa hoàn thiện đầy đủ [53] [54]. Màng trong suốt của trứng trong nang sơ cấp bắt đầu hình thành và trở nên rõ ràng cùng với sự tăng trưởng tế bào. Một nghiên cứu về vi cấu trúc gần đây đã chứng minh rằng màng trong suốt ở trứng chó được hình thành bởi mạng lưới các sợi fibrin và các lỗ với nhiều kích thước [51]. Độ dày của màng trong suốt của trứng phát triển đầy đủ khoảng 10 µm. Ty thể hiện diện ngày càng nhiều trong suốt thời kỳ phát triển của trứng, thể hiện sự gia tăng các hoạt động trao đổi chất trong trứng [53], [54]. Tế bào chất của trứng giai đoạn nang sơ cấp bao gồm các hạt và sợi hoặc các phiến lưới nội chất. Thể Golgi cũng tăng về số lượng. Các hạt lipid đầu tiên xuất hiện trong noãn sơ cấp của nang đang phát triển và gia tăng trong suốt quá trình sinh trứng [53], [54]. Trong giai đoạn sớm của nang trội, nhân chiếm gần hết thể tích của noãn bào, bao xung quanh là các ty thể, và số lượng các hạt lipid tiếp tục tăng. Các vùng tế bào chất của trứng tiếp giáp với các tế bào hạt có sự hiện diện với số lượng lớn các thể Golgi và vài ty thể. Trong suốt quá trình phát triển, trứng vẫn tiếp tục gia tăng kích thước cùng với đó là sự gia tăng của các hạt lipid khiến cho trứng có màu đen [12], [54]. Cho tới nay, người ta vẫn chưa biết hạt lipid hiện diện trong trứng chó với số lượng lớn như thế có ảnh hưởng như thế nào đến sự trưởng thành và phát triển trứng ở loài này. Trong sinh lý bình thường, trứng chó được giải phóng khỏi nang trứng ở giai đoạn prophase I của quá trình phân chia giảm phân [14] lúc này trứng vẫn còn sự hiện diện của túi mầm (germinal vesicle) ở trong tế bào chất. Túi mầm được tạo thành từ màng nhân và một nhân chứa vật chất di truyền. Trứng có sự thay đổi quan trọng về hình thái nhân trong suốt quá trình thành thục bao gồm sự phiên mã của mRNA và tổng hợp protein ở mức cao. Ở tế bào chất, sự hình thành của các bào quan, điển hình là ti thể và ribosome và sự hình thành nên màng trong suốt (zona 7 pellucida) và hạt vỏ cho phép quá trình giảm phân tới giai đoạn metaphase II, thể hiện ở sự giải xoắn của các nhiễm sắc thể và xuất hiện của thể cực thứ nhất. Sự rụng trứng xảy ra 2 ngày trước kỳ động dục và ở hầu hết các con chó cái là khoảng ngày thứ 3 sau khi có biểu hiện chấp nhận giao phối [22], [55]. Trứng được giải phóng khỏi nang tiền rụng (có đường kính khoảng 4-13 mm) ở giai đoạn túi mầm có đường kính khoảng 118-135 µm. Quá trình vỡ túi mầm ở trứng chó diễn ra khoảng 48 giờ trong ống dẫn trứng [22], [55]. Trứng đạt giai đoạn thành thục về nhân khoảng 48-72 giờ sau rụng trứng. Theo kết quả báo cáo của Reynaud và cs (2005), khi quan sát trứng từ 17 đến 138 giờ sau rụng trứng cho thấy trứng đầu tiên đạt giai đoạn metaphase II vào 54 giờ sau rụng [36]. Các trứng thành thục in vivo cũng cho thấy có sự giãn nở của lớp tế bào hạt tuy nhiên lớp trong cùng bao quanh sát trứng còn tồn tại quanh trứng tới tận giai đoạn phôi nang [22]. Trứng chó được thụ tinh di chuyển trong ống dẫn trứng khoảng 9-10 ngày sau đó mới tiến vào tử cung [22], [55]. 2.2.2. Đặc điểm môi trường phát triển của trứng chó in vivo Môi trường nang trứng Trong buồng trứng của tất cả các loài động vật có vú, nang trứng là một đơn vị cấu trúc và chức năng. Nang trứng chứa giữ trứng phát triển và thành thục. Trong nang trứng đang tăng trưởng, trứng chó phát triển và gia tăng về kích thước [12]. Trứng nhỏ với một lớp tế bào hạt tiền thân hình thành trong nang nguyên sơ (primordial) (đường kính 25 µm); trong nang tiền xoang (pre-antral follicle), trứng hiện diện cùng với sự bao quanh của lớp đơn tế bào hạt và ở cuối nang tiền xoang (advanced preantral follicles) (đường kính khoảng 211,4 ± 1,5 µm) trứng lớn lên (đường kính khoảng 115 ± 14 µm), có sự tập trung các hạt lipid với số lượng lớn. Đây cũng là đặc trưng của trứng chó tiền rụng với nhiều lớp tế bào hạt bao quanh. Ở giai đoạn sớm của nang trưởng thành (đường kính khoảng 360,5 ± 18 µm) có sự hình thành những xoang [12] và kích thước nang trưởng thành giai đoạn tiền rụng đạt khoảng từ 2-3 tới 8-10 mm [8]. Do vây, trong suốt giai đoạn phát triển này, đường kính của trứng tăng từ khoảng gần 20 µm đến 120 µm và trở nên tương đối hoàn thiện. 8 Hình 2.3: Các giai đoạn phát triển nang buồng trứng. (a): Nang nguyên sơ (b): Nang sơ cấp (c): Nang thứ cấp (d): Nang tiền trội (e) Nang trội (f): Nang đa noãn (Nguồn: Blackmore và cs 2004) Đa số các nang chỉ gồm 1 trứng mặc dù nang đa rụng trứng đã được quan sát ở chó cũng như nhiều loài động vật có vú khác. Tuy nhiên, phần trăm nang đa rụng ở chó gặp nhiều hơn: 14% ở những con chó 1-2 tuổi và 5% ở những con 7-11 tuổi [52]. Sự hiện diện của nang đa rụng không được coi như một hiện tượng bệnh lý mà nó là một hiện tượng tự nhiên bắt nguồn từ sự hiện diện với mật độ cao các mảng nang sơ cấp trong tủy của buồng trứng chó non. Số phận của các nang rụng nhiều lần vẫn chưa được biết rõ. Chúng có thể hoặc rụng hoặc trải qua sự thoái lui (atresia) như ở đa số các nang rụng một lần [1]. Có 2 kiểu thoái hóa được quan sát ở buồng trứng chó: thoái hóa kiểu A, kiểu này chiếm đa số ở nang tiền xoang, đặc trưng bởi sự hoại tử của trứng và màng trong suốt. Trái lại, sự thoái hóa kiểu B, là sự hoại tử của tế bào hạt. Quá trình thoái hóa kiểu B dẫn tới kết quả là nang tăng trưởng giả bởi sự phát triển giả hình thành cấu trúc giống nang tăng trưởng [49]. Môi trường ống dẫn trứng Sự thành thục ngoài nang trứng và thời gian sống kéo dài trong ống dẫn trứng là nét đặc biệt của trứng chó. Ống dẫn trứng của chó giúp trứng tồn tại trong thời gian 9 dài bao gồm sự thành thục hoàn toàn, sự thụ tinh và sự phát triển tới giai đoạn phôi nang. Do vậy, tổng thời gian trứng chó trong ống dẫn trứng khoảng 8,5 tới 9 ngày, nhiều hơn 3-4 ngày so với các loài khác [22]. Bởi thế, hình thái của ống dẫn trứng phải thích hợp cho sự tồn tại dài ngày của giao tử trong cơ quan này. Trong thực tế, lòng trong của ống dẫn trứng động vật có vú được hình thành bởi tổ hợp hệ thống những nếp gấp niêm mạc nhầy đan dọc vào nhau. Những nếp gấp dọc được sắp thành hàng bởi một lớp biểu mô hình trụ đơn giản. Hình thái và đặc tính sinh học của mô này được điều khiển bởi hormone buồng trứng [56]. Trong suốt chu kỳ động dục của chó, các tế bào biểu mô xếp hàng bao gồm các tế bào có lông nhung đã biệt hóa hoàn toàn và các tế bào tiết, chúng chiếm tới 40-50% các tế bào biểu mô. Do vậy, ở chó, trứng được đặt trong môi trường các chất tiết và chất nhầy của ống dẫn trứng trong một thời gian dài, và có thể những chất này có vai trò chủ chốt trong sự kiện toàn của trứng. Sự tương tác với tinh trùng trong ống dẫn trứng Trong cơ thể, trứng chó rụng duy trì khả năng thụ tinh ít nhất 4 ngày [55]. Sự giao phối có thể xảy ra trước 2-3 ngày đến 1 tuần sau khi rụng trứng. Tinh trùng có thể thực sự hiện diện quanh tổ hợp trứng-tế bào ổ trước cả khi trứng thành thục. Chúng vẫn có thể còn sống sau khi giao phối 11 ngày trong ống dẫn trứng của con cái [11]. Thời gian tinh trùng tập trung quanh trứng chó không chắc chắn vì chênh lệch giữa thời điểm rụng trứng, thụ tinh và thành thục của trứng. Trong một nghiên cứu in vivo đã báo cáo có sự hiện diện của tinh trùng trong trứng ở giai đoạn túi mầm, mặc dù không có sự thay đổi trong những đầu tinh trùng được quan sát cho tới sau khi trứng bài xuất thể cực thứ 2. Trong khi sự tập trung của tinh trùng ở trứng tiền thành thục có thể xảy ra, hiện nay vẫn không có bằng chứng về phôi phát triển sau đó của những trứng được báo cáo này. Mặt khác, ở loài cáo xanh sự phát triển của tiền nhân đực đã được quan sát ở trứng giai đoạn túi mầm thu nhận từ những con đã giao phối [13]. 2.3. Sự thành thục trứng chó in vitro Theo các báo cáo hiện nay, tỷ lệ IVM trên trứng chó chỉ đạt khoảng 20% và do đó tỉ lệ phát triển thành phôi cũng thấp trong các thử nghiệm IVF [21]. Trong thập kỷ gần đây, các nhà khoa học đang cố gắng tìm hiểu sự thành thục và thụ tinh in 10 vitro ở trứng chó. Đó là một thách thức vô cùng hấp dẫn đối với các nhà khoa học. Đa số ý kiến cho rằng sự phân chia giảm phân của trứng chó in vitro là kết quả ảnh hưởng một cách gián tiếp bởi gonadotropin, hormone nhóm steroid, nhân tố tăng trưởng và protein bổ sung trong môi trường nuôi cấy. Ngược lại, một số tác giả khác lại cho rằng sự trưởng thành nhân của trứng có thể xảy ra in vitro không phụ thuộc vào nguồn protein bổ sung trong môi trường. Do đó, nhiều thử nghiệm đã được tiến hành nhằm mô phỏng các đặc tính sinh hóa cũng như sinh lý môi trường nang trứng hay ống dẫn trứng. 2.3.1. Thử nghiệm mô phỏng điều kiện in vivo Nuôi cấy nang trứng Sự duy trì cấu trúc ba chiều của nang trứng cho phép bảo tồn chức năng và hình thái của đơn vị chứa và nuôi dưỡng trứng phát triển và thành thục một cách toàn vẹn. Bolamba và cs (1998) ước lượng sự trưởng thành nhân của trứng chó thông Hình 2.4: Trứng chó trước khi nuôi cấy (A) và sau khi nuôi cấy (B) (Nguồn: Shaikhun và cs, 2008) qua nuôi cấy nang trứng trên đĩa nuôi cấy mô bằng nhựa trong điều kiện in vitro có phủ 0,6% agar vô trùng để ngăn cản sự mất các tế bào hạt. Kết quả thu được sau nuôi 48 giờ cho thấy số nang tiền xoang đạt 11,5% hoặc giai đoạn sớm của nang có xoang đạt 8,7% mặc dù tỉ lệ này thấp. Sự tách nang trứng ra khỏi buồng trứng làm gián đoạn sự vận chuyển sinh lý của các nhân tố trong buồng trứng, có thể thúc đẩy trứng hoàn tất giảm phân [3]. Nuôi cấy trên lớp tế bào đơn Ảnh hưởng có lợi của đồng nuôi cấy tới sự phát triển của phôi đã được chứng 11 minh trong sản xuất phôi bò in vitro [15]. Otoi và cs (2000) đã nuôi trưởng thành trứng chó trên lớp đơn tế bào ổ của bò với môi trường nuôi phôi bò [32]. Mặc dù tăng số trứng đạt giai đoạn metaphase II song không có ảnh hưởng tới sự phát triển tiếp theo sau thụ tinh. Việc đồng nuôi cấy với lớp đơn tế bào ống dẫn trứng chó đã được tiến hành lần đầu tiên bởi Hewitt và England (1999). Kết quả cho thấy các tế bào ống dẫn trứng không có bất cứ ảnh hưởng có lợi nào lên sự trưởng thành nhân của trứng sau 48 giờ đồng nuôi cấy. Chỉ sau 96 giờ thì có cải thiện về sự hoàn tất giảm phân [20]. Gần đây, Bogliolo (2002) đã chứng minh rằng việc đồng nuôi cấy với các tế bào ống dẫn trứng thu nhận từ phần loa của ống dẫn trứng chó ở giai đoạn động dục có ảnh hưởng tốt tới tỉ lệ trưởng thành của trứng, đạt 16,7% sau 48 giờ và 23,2% sau 72 giờ nuôi [2]. Việc đồng nuôi cấy trứng chó trên lớp đơn tế bào ống dẫn trứng là một thử nghiệm nhằm gia tăng điều kiện sinh lý mà ở đó trứng hoàn tất quá trình giảm phân. Tuy nhiên, mô hình này vẫn khác rất nhiều so với môi trường ống dẫn trứng trong cơ thể, do đó, ở chó có một số đặc trưng đặc biệt ảnh hưởng có lợi tới sự trưởng thành và khả năng tồn tại lâu của trứng ở đây. Nuôi cấy trong ống dẫn trứng Một đoạn ống dẫn trứng được cô lập có thể cung cấp môi trường in vitro với các đặc điểm khác với lớp đơn tế bào ống dẫn trứng. Trong thực tế, việc nuôi cấy tế bào rất khác so với nuôi cấy ống dẫn trứng. Trong nuôi cấy tế bào thì số lượng kiểu tế bào nuôi cấy được giới hạn trong khi ở ống dẫn trứng còn nguyên có sự hiện diện của tất cả các loại tế bào và được giữ ở cùng giai đoạn như ở động vật sống. Một lợi ích khác của kiểu nuôi cấy này là sự điều chỉnh về không gian và những liên kết sinh lý giữa màng nhầy và trứng. Điều này tạo vi môi trường khác với điều kiện nuôi cấy trong vi giọt hoặc trên lớp đơn tế bào ống dẫn trứng. Việc nuôi cấy trứng chó trong đoạn loa của ống dẫn trứng đã được chứng minh là có ảnh hưởng tốt tới sự tồn tại, phát triển nhân trong 30 giờ nuôi cấy [25] và kết quả cho thấy nhân ở giai đoạn giữa metaphase I tới metaphase II đạt từ 12,5% đến 31,9%. Tuy nhiên, nghiên cứu này được cho là không phù hợp thực tế và nó không hẳn là một kiểu nuôi cấy; nhưng với kết quả đó, người ta dự đoán rằng ống dẫn 12 trứng nguyên vẹn cùng với sự hiện diện của các tế bào ống dẫn trứng có thể tiết các nhân tố khác (như các chất có dinh dưỡng cao hoặc là các nhân tố) trong sự trưởng thành và khả năng sống của trứng chó. Tiến hành tương tác với tinh trùng Như được quan sát trong in vivo, trong in vitro cũng thấy có sự tập trung tinh trùng chó ở màng trong suốt và ở khoảng không quanh trứng ngay cả khi trứng ở giai đoạn chưa thành thục. Tuy nhiên, thông tin liên quan tới mối quan hệ giữa giai đoạn thành thục của trứng và đầu tinh trùng trong tế bào chất của trứng còn giới hạn và trái ngược nhau. Mahi và Yanagimachi (1976) đã thấy sự trương phồng của nhân tinh trùng không khác so với sự giãn nhân của nó trong tế bào chất trứng ở tất cả các giai đoạn trưởng thành [28]. Yamada và cs (1992 và 1993) đã quan sát tinh trùng mở rộng trong những trứng ngừng ở giai đoạn túi mầm nhưng nhân nguyên đực lại chỉ được quan sát ở trứng đã thực sự có nhân nguyên cái. Những ảnh hưởng của sự tập trung tinh trùng lên sự khởi động và hoàn tất giảm phân lần thứ I ở trứng chó vẫn còn đang được tìm hiểu [58], [59]. Trong nghiên cứu khác lại khẳng định sự tập trung tinh trùng là một phần trong những tác động có lợi tới sự hoàn tất giảm phân ở trứng chó [42]. Những kết quả đó cho thấy rằng ngoài sự tập trung tinh trùng còn có các nhân tố khác tham gia vào sự hoàn tất giảm phân của trứng chó trong nuôi thành thục trong ống nghiệm. 2.3.2. Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi thành thục trứng có thể được chia ra 2 loại, môi trường đơn giản hoặc môi trường phức hợp. Môi trường đơn giản được cân bằng bởi các dung dịch với các nguồn năng lượng như pyruvate, lactate và glucose còn môi trường phức hợp có thêm các chất như amino acid, vitamin và một số phân tử khác [15]. Môi trường đơn giản được sử dụng rộng rãi cho nuôi thành thục trứng chó in vitro là môi trường Modified Krebs Ringer Bicarbonate (mKRB), Synthetic Oviductal Fluid (SOF) và môi trường phức hợp như Tissue Culture Medium 199 (TCM 199). Vẫn chưa có báo cáo nào so sánh hiệu quả giữa môi trường đơn giản và môi trường phức hợp cho nuôi trưởng thành trứng chó nhưng môi trường TCM199 đã được báo cáo là môi trường tốt hơn cho sự trưởng thành nhân của trứng chó đạt tới giai đoạn metaphase II so với môi trường Connaught Medical Research Labs 13