Tài liệu Nghiên cứu tái sinh cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) chất lượng cao bằng kỹ thuật in vitro.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM MA KIÊN CHƢƠNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TÁI SINH GIỐNG CÂY ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L.) Harms) CHẤT LƢỢNG CAO BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chuyên ngành Khoa Khoá học : Chính quy : Công nghệ sinh học : CNSH & CNTP : 2011 - 2015 Thái Nguyên, 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM MA KIÊN CHƢƠNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TÁI SINH GIỐNG CÂY ĐINH LĂNG (Polyscias fruticosa (L.) Harms) CHẤT LƢỢNG CAO BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH & CNTP Khoá học : 2011 - 2015 Giảng viên hƣớng dẫn: 1. ThS. Vi Đại Lâm Khoa CNSH & CNTP- Trƣờng ĐHNL Thái Nguyên 2. ThS. Đào Duy Hƣng Viện Khoa học Sự Sống - Trƣờng ĐHNL Thái Nguyên Thái Nguyên, 2015 i LỜI CẢM ƠN Được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Viện khoa học sự sống em đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tái sinh cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) chất lượng cao bằng kỹ thuật in vitro” tại Phòng thí nhiệm nuôi cấy mô của Bộ môn Công Nghệ Tế Bào thuộc Viện Khoa học Sự Sống thuộc trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Hiện nay, em đã hoàn thành đề tài tốt nghiệp Đại Học. Được kết quả như ngày hôm nay em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa và các thầy cô Bộ môn Công nghệ Tế bào cùng các thầy cô trong bộ môn đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong thời gian qua. Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới: ThS. Vi Đại Lâm và ThS. Đào Duy Hưng đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài. Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn toàn thể gia đình, bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ tạ điều kiện về vật chất và tinh thần cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu. Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 26 tháng 5 năm 2015 Sinh viên thực hiện Ma Kiên Chƣơng ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Các vi lượng thông dụng được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật .................................................................................................... 19 Bảng 2.2. Bốn loại vitamin thường dùng ........................................................ 20 Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch H2O2 (5%) đến hiệu quả vô trùng mẫu cấy ...................................................... 31 Bảng 4.2. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng sử dụng viên khử trùng Johnson (2,5 ppm) đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy .............................. 33 Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng với HgCl2 (0,1%) ...... 34 đến hiệu quả vô trùng mẫu cấy ....................................................................... 34 Bảng 4.4. Kết quả ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả tái sinh chồi ............. 36 Bảng 4.5. Kết quả ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả tái sinh chồi ................ 38 Bảng 4.6. Kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu quả tái sinh chồi ............................................................................................. 40 Bảng 4.7. Kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả tái sinh chồi ............................................................................................. 42 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 4.1. Biểu đồ thể hiện kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch H2O2 (5%) đến hiệu quả vô trùng mẫu cấy………………..32 Hình 4.2 Biểu đồ thể hiện kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng sử dụng viên khử trùng Johnson (2,5 ppm) đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy ..... 33 Hình 4.3: Biểu đồ thể hiện kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng v ới HgCl2 (0,1%) đến hiệu quả vô trùng mẫu cấy ........................................ 35 Hình 4.4 Biểu đồ thể hiện kết quả ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả tái sinh chồi .......................................................................................................... 37 Hình 4.5 Ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng Hình A: Công thức đối chứng, Hình B: Công thức 2 ........................................... 38 Hình 4.6 Biểu đồ thể hiện kết quả ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả tái sinh chồi .......................................................................................................... 39 Hình 4.7 Ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng; Hình A: Công thức đối chứng, Hình B: Công thức 4 ........................................... 40 Hình 4.8. Biểu đồ thể hiện kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu quả tái sinh chồi ............................................................... 41 Hình 4.9 Ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng; Hình A: Công thức đối chứng, Hình B: Công thức 4 ........................................... 42 Hình 4.10 Biểu đồ thể hiện kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả tái sinh chồi ................................................................ 43 Hình 4.11 Ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng; Hình A: Công thức đối chứng, Hình B: Công thức 3 ........................................... 44 iv DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Cs : Cộng sự CT : Công thức CV : Coeficient of Variation LSD : Least Significant Difference Test Kinetin : Furfurylaminopurine BAP : Best Absolute Perfect IAA : Indole-3- lacetic acid IBA : Indole-3-butyric acid NAA : α-naphthaleneaceticd Đ/C : Đối chứng B1 : Thiamin B2 : Ribonavin B6 : Pyridoxien 2,4D : 2,4-diclorophenoxy axetic acid C : Acid ascorbic MS : Murashige and skoog TDZ : Thidiazuron WPM : Woody Plant Medium GA3 : Gibberellin v MỤC LỤC Trang PHẦN 1: MỞ ĐẦU.......................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 2 1.3. Yêu cầ u của đề tài ...................................................................................... 3 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiến của đề tài ................................................... 3 1.4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài .................................................................... 3 1.4.2. Ý nghĩa thực tiến của đề tài..................................................................... 3 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 4 2.1. Giới thiệu chung về cây Đinh lăng ............................................................ 4 2.1.1. Đặc điểm thực vật học của cây Đinh lăng .............................................. 4 2.1.2. Nguồn gốc và phân bố............................................................................. 4 2.1.3. Giá trị của cây Đinh lăng ........................................................................ 5 2.1.4. Saponin .................................................................................................... 7 2.2. Tình hình nghiên cứu cây Đinh lăng ở trong nước .................................. 10 2.3. Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật ............... 10 2.3.1. Sơ lược lịch sử nuôi cây mô tế bào thực vật ......................................... 10 2.3.2. khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật............................................. 12 2.3.3. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vậy ................................ 13 2.3.4. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật.................................. 14 2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật ..................... 16 2.4.1. Vật liệu nuôi cấy ................................................................................... 16 2.4.2. Điều kiện nuôi cấy ................................................................................ 17 2.4.3. Thành phần môi trường nuôi cấy .......................................................... 17 2.4.4. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ........................ 23 PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 25 vi 3.1.Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu................................................... 25 3.1.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 25 3.1.2. Hóa Chất................................................................................................ 25 3.1.3.Thiết bị ................................................................................................... 25 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 25 3.2.1. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 25 3.2.2. Thời gian nghiên cứu ............................................................................ 25 3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 25 3.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 26 3.4.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đế n hiệu quả vô trùng mẫu Đinh lăng.................................................................... 26 3.4.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng. .......................................... 28 3.5. Xử lý số liệu ............................................................................................. 30 PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................... 31 4.1. Kết quả ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến hiệu quả vô trùng mẫu Đinh lăng ................................................................................................. 31 4.1.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch H2O2 (5%) đến hiệu quả vô trùng mẫu ...................................................................... 31 4.1.2. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng sử dụng viên khử trùng Johnson (2,5 ppm) đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy .............................. 33 .1.3 Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng với HgCl 2 (0,1%) đến hiệu quả vô trùng mẫu cấy .............................................................................. 34 4.2. Kết quả của một số chất điều hòa sinh trưởng đến hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng ................................................................................................. 36 4.2.1. Kết quả ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả tái sinh chồi ................... 36 4.2.2. Kết quả ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả tái sinh chồi....................... 38 vii 4.2.3. Kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IAA đến hiệu quả tái sinh chồi .................................................................................................. 40 4.2.4. Kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả tái sinh chồi .................................................................................................. 42 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................... 45 5.1. Kết luận .................................................................................................... 45 5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 46 I. Tài liệu tiếng Việt ........................................................................................ 46 II. Tài liệu tiếng Anh ....................................................................................... 48 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cây Đinh lăng có tên khoa ho ̣c là Polyscias fruticosa (L.) Harms, thuộc họ ngũ gia bì Araliaceae (Đỗ Tất Lợi, 2004) [17]. Cây Đinh lăng có nguồn gốc từ Polynesie (Thái Bình Dương), thuộc họ Ariliaceae, chi Polyscias Forst và Forst.f, chi này gần 100 loài trên thế giới phân bố rải rác ở vùng nhiệt đới và cân nhiệt đới, nhiều nhất là ở vùng đảo Thái Bình Dương (Đỗ Huy Bích và cs, 2004) [1]. Đinh lăng có nhiều loài thuộc chi Polyscias, như Đinh lăng lá trổ, Đinh lăng lá ráng, Đinh lăng lá tròn và Đinh lăng lá nhỏ…. Trong đó loài đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) là loài được dân gian sử dụng rộng rãi làm thuốc tăng cường sức khỏe và hoạt huyết dưỡng não từ rất lâu đời (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [6]. Đinh lăng là một loài thực vật được sử dụng nhiều trong y học dân gian Viê ̣t Nam và Trung Quố c (Nguyễn Ngọc Dung, 1998) [4]. Cây Đinh lăng có chứa hai hơ ̣p chấ t chin n, các hợp chất này ́ h quan tro ̣ng là polyacetylen và saponi có nhiều ở rễ và lá (Phạm Thị Tố Liên và cs, 2007) [12]. Saponin trirtepen có tác dụng tích cực chố ng oxy hóa, chố ng stress. Ngoài ra trong Đinh lăng còn chứa 20 acid amin và các loại acid amin không thay thế được như lysine, methionin, tryptophan, cysteine (Ngô Ứng Long, 1985) [15]. Nhiều nghiên cứu cho thấy ở rễ củ của cây Đinh lăng có chứa nhiều chất có tác dụng bồi bổ sức khoẻ và chữa bệnh. Đặc biệt, trong cây Đinh lăng chứa các hợp chất saponin tương tự như trong nhân sâm (Ninh Thi Phím, 2013) [20]. ̣ Năm 1961, các khoa dược lý, dươ ̣c liê ̣u và giải phẫu bê ̣nh lý Viê ̣n y ho ̣c quân sự Viê ̣t Nam nghiên cứu tác du ̣ng của Đinh lăng làm tăng cường sức dẻo dai của cơ thể và mô ̣t số tác du ̣ng khác. Trên cơ sở kế t quả nghiên cứu dươ ̣c ly,́ Viê ̣n y ho ̣c quân sự Viê ̣t Nam năm 1964 cho thử nghiê ̣m trên người thấ y với 2 0,23g đến 0,50g bô ̣t Đinh lăng mô ̣t ngày dưới dạng thuốc sắc hay ngâm rượu nhẹ độ (30 đô ̣) thì có kết quả tăng sức dẻo dai của cơ thể n hư khi nghiên cứu trong phòng thí nghiệm. Trong dân gian, ngoài công dụng ăn gỏi ca,́ có nơi dùng Đinh lăng chữa ho, ho ra máu , thong tiể u, thong sữa, kiế t lỵ nă ̣ng. Tại Ấn Độ, theo K. M. Naikairai, Đinh lăng đươ ̣c dùng chữa số t , làm săn da (Đỗ Tất Lợi, 2004) [17]. Đã từ lâu, y học cổ truyền nước ta đã dùng Đinh lăng lá nhỏ dưới dạng thuốc sắc, rượu ngâm hoắc bột khô để chữa ho, đau tức cú, tắc tia sữa, làm lợi sữa, làm thuốc chữa kiết lỵ, thuốc tăng lực cho các đô vật trong dịp hội hè. Đặc biệt rượu và nước sắc rễ Đinh lăng lá nhỏ ngày xưa được các lương y dùng để chữa chứng suy nhược cơ thể, làm thuốc bổ tăng lực. Hiện nay, công tác sản xuất giống phần lớn cây Đinh lăng được trồng bằng phương pháp giâm hom, vì vậy cây giống có độ đồng đều không cao, hệ số nhân giống thấp, chất lượng thấp không đáp ứng được yêu cầu của thị trường. Trong khi đó cây Đinh lăng giống được sản xuất bằng công nghệ nguôi cấy mô tế bào cho hệ số nhân giống cao, sạch bệnh, đồng đều và giữa được tính trạng ưu việt của giống gốc. Việc ứng dụng phương pháp này để nhân giống cây Đinh lăng là một phương pháp mang lại hiệu quả kinh tế cao. Nhằm đáp ứng được nhu cầu thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tái sinh cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) chất lượng cao bằng kỹ thuật in vitro” nhằ m góp phầ n hoàn thiê ̣n quy triǹ h nhân nhanh cây Đinh lăng. 1.2. Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến hiệu quả vô trùng mẫu cây Đinh lăng bằ ng kĩ thuật invitro. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng. 3 1.3. Yêu cầ u của đề tài Xác định ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến hiệu quả vô trùng mẫu cây Đinh lăng bằng kỹ thuật in vitro Xác định được ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến hiệu quả tái sinh chồi Đinh lăng. 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiến của đề tài 1.4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài Quá trình nghiên cứu sẽ đưa ra được một số kĩ thuật góp phần xây dựng và hoàn thiện tái sinh giống Đinh lăng bằng kỹ thuật in vitro. Từ đó đánh giá được ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến kỹ thuật tái sinh giống cây Đinh lăng bằng kỹ thuật in vitro. Kết quả nghiên cứu góp phần phát triển việc nghiên cứu kỹ thuật nhân giống cây dược liệu nói chung và cây Đinh lăng nói riêng. 1.4.2. Ý nghĩa thực tiến của đề tài Từ các kết quả nghiên cứu bổ sung nguồn tài liệu tham khảo phục vụ cho các nghiên cứu, giảng dạy và kỹ thuật tái sinh giống Đinh lăng có chất lượng cao bằng kỹ thuật in vitro. Góp phần nhân giống cây Đinh lăng, tạo ra một số lượng cây giống lớn, đồng đều có chất lượng cao để cung c ấp phu ̣c vu ̣ cho s ản xuất và thị trường tiêu dùng ngày mô ̣t lớn. 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về cây Đinh lăng 2.1.1. Đặc điểm thực vật học của cây Đinh lăng Đinh lăng là cây dạng bụi, cao 1,5-2m. Thân ngắn, không có gai, ít phân nhánh, các nhánh có nhiều lỗ bì lồi, Rễ phù như củ. Lá kép 3 lần, mọc so le, có bẹ, phiến lá xẻ lông chim, dài 20-40cm, không có lá kèm rõ. Lá chép có cuống dài 3-10mm, phiến lá chép có răng cưa không đều, chóp nhọn, các đoạn đều có cuống, lá có mùi thơm. Cụm hoa hình chùy ngắn 7-18mm ở ngọn, gồm nhiều tán, mang nhiều hoa nhỏ, màu trắng xám, tràng 5, nhị 5 với chỉ nhị gầy, bầu hạ ngăn có 2 đĩa trắng nhạt. Quả hình trứng dẹp, dài 3-4mm, dày 1mm, màu trắng bạc (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [6]. 2.1.2. Nguồn gốc và phân bố Cây Đinh lăng có nguồn gốc từ Polynesie (Thái Bình Dương), thuộc họ Ariliaceae, chi Polyscias Forst và Forst.f, chi này gần 100 loài trên thế giới phân bố rải rác ở vùng nhiệt đới và cân nhiệt đới, nhiều nhất là ở vùng đảo Thái Bình Dương (Đỗ Huy Bích và cs, 2004) [1]. Ở Việt Nam, hiện có 10 loài Đinh lăng (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [6], đa số Đinh lăng hiện nay được trồng làm cảnh, chỉ có một vài loài được sử dụng làm thuốc, loài Đinh lăng được sử dụng làm thuốc phổ biến nhất là Polyscias fruticosa (L.) Harms. Đây là loài có tác dụng dược lý giống Nhân sâm (Nguyễn Ngọc Dung, 1998) [4]. Rễ Đinh lăng có vị ngọt, tính bình, lá có vị nhạt, hơi đắng, tính bình. Có thể thu hoạch rễ ở những cây trồng 3 năm trở lên (trồng càng nhiều năm thì hệ rễ càng phát triển và lượng hợp chất thu càng được nhiều). Có thể thu rễ vào mùa đông sau đó rửa sạch phơi khô và bảo quản ở chỗ mát. Có thể thu lá quanh năm, thường dùng tươi (Đỗ Huy Bích và cs, 2004) [1], (Nguyễn Thị Thu Hương và cs, 2004) [8]. 5 2.1.2.3. Phân loại Nghành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Lớp phụ: Rosidae Bộ: Apiales Họ: Araliaceae Loài: Polyscias fruticosa (L.) Harms Tên thông thường: Đinh lăng lá nhỏ, cây gỏi cá, Nam dương lâm, Đinh lăng lá xẻ, Đinh lăng hương (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [6]. 2.1.2.4. Thành phần hóa học Trong rễ Đinh lăng có glycoside, alkaloild, vitamin (B1, B2, B6, C), các phytostrol và 20 acid amin, trong đó các acid amin không thể thay thế (lysin, methionin, trytophan, cystein) (Ngô Ứng Long, 1985) [15]. Qua phân tích sơ bộ thành phần hóa học trong lá, thấy có saponin, coumarin, tinh dầu, phytosterol, tanin, acid hữu cơ, đường khử và hợp chất uronic. Từ rễ và lá Đinh lăng, 11 saponin triterpen có thành phần aglycon và acid oleanolic đã được xác định, trong đó có 8 hợp chất mới được đặt tên là polysioside A-H (Võ Duy Huấn, 1998) [28]. Có 5 hợp chất polyacetilen trong rễ Đinh lăng cũng được phân lập, trong đó panaxynol, panaxydol và heptadecaien-dyindyol là những chất có trong Nhân Sâm (Trần Công Luận, 1996) [18] và 2 polyacetilen chủ yếu được phân lập từ lá cũng là panaxynol, heptadecaiendyin-duol (Trần Công luận và cs, 2000) [19]. 2.1.3. Giá trị của cây Đinh lăng 2.1.3.1. Giá trị dinh dưỡng Đinh lăng có chứa các hợp chất như alkaloid, glycoside, saponin, và các acid a min tan trong nước như B1, B2, B6, C và các phytosterin. 6 Ở tất cả các bộ phận như rễ, và thân lá đều chứa saponin nhưng nhiều nhất là ở vỏ rễ và lá (Đỗ Huy Bích và cs, 2004) [1]. Ngoài ra trong Đinh lăng còn chứa 20 acid amin và có các loại acid amin không thay thế như lysin, methionin, trytophan, cystein (Ngô Ứng Long, 1985) [15]. Trong lá: Trong lá, Đinh lăng có chưa saponin triterpen (chiếm 1,65%), tinh dầu, phytosterol, tamin, acid hữu cơ, đường khử và hợp chất uronic. Saponin triterpen có thành phần aglycon và acid oneanolic, đây là một chất có tác dung dược liệu (Wenck A. R., 1988) [29]. Có 5 hợp chất polyacetylen được phân hóa từ lá cây Đinh lăng là: Panaxydol, panoxydol, heptadeca – 1,8 (E) dien – 4,6 diyn – 3,4 diol, Heptadeca – 1,8 (E) – dien – 4,6 diyn – 3ol – 10on và Heptadeca – 1,8 (Z) – 4,6diyn – 3ol – 10on (Đỗ Huy Bích và cs, 2004) [1]. Trong rễ: Trong rễ, Đinh lăng có chứa 5 hợp chất polyacetylen, bao gồm: Panaxydol, panoxydon, heptadeca – 1,8 (E) – dien – 3,10 diol và 3 hợp chất giống trong lá, các hợp chất này có tác dụng kháng khuẩn mạnh và chống một số dạng ung thư (Đỗ Huy Bích và cs, 2004) [1]. 2.1.3.2. Giá trị dược liệu. Đinh lăng có tác dụng bồi bổ cơ thể, tăng thể trọng, thúc đẩy sự hình thành và củng cố trí nhớ đặc hiệu trên động vật có trí nhớ kém, tang lực, tăng sức dẻo dai của cơ thể, có tác dụng liên hệ nội tiết. Lá đinh lăng chống bệnh co giật cho trẻ em, lấy lá non và lá già phơi khô đem lót vào gối hoặc trải giường cho trẻ nằm. Thân cành đinh lăng sắc uống chữa được bệnh đau lưng, mỏi gối, tê thấp, dùng phối hợp với rễ cây xấu hổ, cúc tần, cam thảo dây. Đinh lăng có tác dụng chống stress. Đing lăng có tác dụng kháng viêm, giảm đau, chống sơ vữa động mạch, dựa trên tác dụng hạ cholesterol toàn và lipid toàn phần trong huyết thanh. 7 Có tác dụng chống khuẩn tốt trên vi khuẩn Gram (+) như Staphylococus. Kích thích sự hoạt động của K+, Na+, ATPase (Phạm Thị Tố Liên và cs, 2007) [11], (Nguyễn Thị Thu Hương và cs, 2001) [9]. 2.1.4. Saponin Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật. Saponin cũng có trong một số động vật như hải sâm, cá sao (Trần Hùng, 2003) [7]. Saponin có một số tính chất đặc biệt: - Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hoá và tẩy sạch. - Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng. - Ðộc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên. - Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu; liều cao gây nôn mửa, đi lỏng. - Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-bhydroxysteroid khác. - Saponin còn gọi là saponosid do chữ latin sapo = xà phòng (vì tạo bọt như xà phòng). Dựa vào cấu chúc người ta chia Saponin thành 2 nhóm là saponin triterpen (Có 30 chất cấu tạo bởi 6 nhóm Hemiterpen) và saponon steroid có 27 chất. Trong họ Nhân sâm thường chứa saponin triterpen (Trần Công Luận, 1996) [18]. Saponin là một nhóm hợp chất thứ cấp có vai trò quan trọng trong thực vật, saponin hiện diện ở cả cây một lá mầm và cây hai lá mầm. Quá trình tổng hợp saponin trong thực vật phụ thuộc vào sự di truyền, các loại mô khác nhau, tuổi của thực vật và các yếu tố môi trường xung quanh 8 Saponin có nhiều tác dụng dược lý như có tính phá huyết, tạo phức hợp với cholesterol, kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm, chống tạo khối u, nhiều saponin có tác dụng diệt các loài nhuyễn thể,… Nhiều saponin có tính chất tạo bọt khi gia nhiệt, tính chất này có thể áp dụng để định tính saponin (Ngô Văn Thu, 1990) [24]. 9 10 2.2. Tình hình nghiên cứu cây Đinh lăng ở trong nƣớc Theo (Nguyễn Ngọc Dung, 1998) [4] tiến hành đề tài: “Nhân giống cây Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms thông qua con đường tạo phôi soma trong nuôi cấy in vitro” và cho kết quả như sau: cây con được tạo thành từ mô phân sinh của cây Đinh lăng trong môi trường có thành phần là MS có bổ sung BAP 2,0 mg/l, sau 60 ngày từ mô phân sinh tạo thành chồi và chồi nách. Theo (Trần Thị Liên và cs, 2005) [13] tiến hành nghiên cứu nhân nhanh cây Đinh lăng Polyscias fruticosa L. Harms bằng phương pháp in vitro và cho kết quả như sau: Vật liệu sử dụng là chồi đỉnh và chồi bên còn non của cấy Đinh lăng. Môi trường sử dụng là môi trường MS có bổ sung vitamin Morel, nước dừa 10%, sucrose 30g/l và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Cây con được tái sinh qua con đường tạo phôi soma. Theo (Lê Thiên Thư và cs, 2005) [25] tiến hành: “Nghiên cứu sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro cây Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms” và đưa ra kết quả như sau: Mô sẹo được hình thành từ các chồi in vitro trên môi trường MS có bổ sung 2,4 – D2,0 mg/l các mô sẹo phát triển tốt nhất trển môi trường này và từ đó tạo phôi trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng ngoại sinh, những vật liệu này có thể phát hiện saponin bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hay khả năng tạo bọt. 2.3. Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.3.1. Sơ lược lịch sử nuôi cây mô tế bào thực vật Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức Schleiden và Schwan đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ: “Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ, các tế bào hợp thành. Các tế bào phân hóa đều mang các thông tin di truyền có trong các tế bào đầu tiên, đó là trứng sau thụ tinh, và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể” (Nguyễn Đức Thành, 2000) [22]. 11 Năm 1902, Harberland là người đầu tiên đã quan niệm rằng bất kì một tế bào nào của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Ông đã cho rằng “Bằng nuôi cấy mô tế bào đã phân lập, người ta có thể tạo ra các phôi nhân tạo từ các tế bào sinh dưỡng”. Ông cũng đã tiến hành nuôi cấy mẫu lá của một số cây lá mầm như: Erythronium, Tradescantia, tuy nhiên đã không thành công (Vũ Văn Vụ và cs, 2009) [27]. Năm 1922, Kotte, học trò của Harberland và Robbins, người Mỹ, lặp lại thực nghiệm của Haberland với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hoà thảo. Trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trưởng khá mạnh, tạo nên một hệ rễ nhỏ mang cả rễ phụ. Tuy nhiên, sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm dần và dừng lại, mặc dù các tác giả đã chuyển sang môi trường mới (Nguyễn Đức Thành, 2000) [22]. Năm 1934, được xem là giai đoạn thứ hai của nuôi cấy mô và tế bào thực vật khi White thành công trong việc duy trì mô rễ cây cà chua trong môi trường lỏng có chứa muối khoáng, đường saccarozơ và dịch chiết nấm men. Qua thí nghiệm, ông thấy rằng có thể thay dịch chiết nấm men bằng các vitamin nhóm B (B1, B3, B6) (Dodd J. H., Roberts L. W, 1999) [32]. Năm 1939, độc lập với Nobercourt, Gautheret cũng đã duy trì được sinh trưởng của mô sẹo cà rốt trong một thời gian dài. Năm 1941, Van Overbeek và cộng sự đã phát hiện thấy nước dừa có ảnh hưởng tích cực đến sự phát sinh phôi và tạo mô sẹo ở cây họ cà (Dodd J. H., Roberts L. W, 1999) [32]. Cũng trong thời gian này, nhiều chất điều hoà sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin như NAA, 2,4-D đã được tổng hợp. Nhiều tác giả xác nhận cùng với nước dừa, 2,4-D và NAA đã giúp tạo mô sẹo thông qua phân chia tế bào ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó nuôi cấy (Nguyễn Kim Thanh, 2005) [21]. Năm 1954, Skoog bổ sung chế phẩm ADN chiết từ tinh dịch cá bẹ vào môi trường nuôi cấy mô thân cây thuốc lá. Ông nhận thấy chế phẩm này có