Tài liệu Nghiên cứu nhân nhanh giống giảo cổ lam (gynostemma pentaphyllum) bằng kỹ thuật in vitro.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ----------------------- ĐỖ NGỌC HÂN Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH GIỐNG GIẢO CỔ LAM (Gynostemma pentaphyllum) BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo Chuyên ngành Khoa Khoá học : Chính quy : Công nghệ sinh học : CNSH - CNTP : 2011 - 2015 Thái Nguyên, 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ----------------------- ĐỖ NGỌC HÂN Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH GIỐNG GIẢO CỔ LAM (Gynostemma pentaphyllum) BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2011 - 2015 Giảng viên hƣớng dẫn: 1. ThS. Dương Mạnh Cường Khoa CNSH - CNTP, Trường ĐHNL Thái Nguyên 2. ThS. Lê Thị Hảo Viện Khoa học Sự Sống - Trường ĐHNL Thái Nguyên Thái Nguyên, 2015 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được khóa luận này em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa CNSH và CNTP cùng các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ tế bào đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo ThS. Dương Mạnh Cường và Th.S Lê Thị Hảo đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài. Em xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, đến những người thân đã luôn động viên và giúp đỡ tạo điều kiện cho em về cả vật chất lẫn tinh thần trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên còn nhiều thiếu sót, em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến chân thành từ các thầy cô và các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2015 Sinh viên Đỗ Ngọc Hân ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của H2O2 (20%) đến khả năng vô trùng mẫu Giảo cổ lam (sau 15 ngày) .............................................................. 23 Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của HgCl2 (0,1%) đến khả năng vô trùng mẫu Giảo cổ lam (sau 15 ngày nuôi cấy) .............................. 25 Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng môi trường MS, B5, WPM, N6 đến khả năng tái sinh chồi Giảo cổ lam (sau 20 ngày nuôi cấy) ................................ 28 Bảng 4.4. Kết quả ảnh hưởng của kinetin (mg/l) đến khả năng tái sinh chồi Giảo cổ lam (sau 20 ngày nuôi cấy) ............................................... 30 Bảng 4.5. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam (sau 30 ngày) ...................................................... 33 Bảng 4.6. Kết quả ảnh hưởng của kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam (sau 30 ngày) ....................................................................... 35 Bảng 4.7. Kết quả ảnh hưởng kết hợp của BAP và IAA đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam (sau 30 ngày) ........................................... 38 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 4.1. Biểu đồ thể ảnh hưởng của H2O2 (20%) đến khả năng vô trùng mẫu Giảo cổ lam (sau 15 ngày nuôi cấy) ............................................... 24 Hình 4.2. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của HgCl2 (0,1%) đến khả năng vô trùng mẫu Giảo cổ lam (sau 15 ngày nuôi cấy) .............................. 26 Hình 4.3. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM, N6 đến khả năng tái sinh chồi Giảo cổ lam (sau 20 ngày nuôi cấy) ........... 28 Hình 4.4. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của kinetin (mg/l) đến khả năng tái sinh chồi Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) (sau 20 ngày nuôi cấy) ............. 31 Hình 4.5. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam (sau 30 ngày nuôi cấy) ............................. 34 Hình 4.6. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam (sau 30 ngày nuôi cấy) ....................................... 36 Hình 4.7. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng kết hợp của BAP và IAA đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam (sau 30 ngày nuôi cấy) .................... 38 iv DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT 2,4 D : 2,4 Diclorophenoxy acetic acid B5 : Gamborg Medium BA : 6-Benzylaminopurine BAP : BAP bezylamino purine Cs : Cộng sự CT : Công thức CV : Coeficient of Variation ĐC : Đối chứng GA3 : Gibberellic acid IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole butyric acid Kinetin : 6-Furfurylaminopurine LSD : Least Singnificant Difference Test MS : Murashige & Skoog (1962) MT : Môi trường N6 : Chu Medium WPM : McCown woody Plant Medium v MỤC LỤC PHẦN 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................1 1.2. Mục đích của đề tài ..........................................................................................2 1.3. Yêu cầu của đề tài ............................................................................................2 1.4. Ý nghĩa của đề tài .............................................................................................2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 2.1. Giới thiệu chung về cây Giảo cổ lam ...............................................................3 2.1.1. Đặc điểm thực vật học của chi Gynostemma ............................................3 2.1.2. Đặc điểm thực vật học của loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino ................................................................................................................3 2.1.3. Nguồn gốc và phân bố ..............................................................................4 2.1.4. Thành phần hóa học của Giảo cổ lam .......................................................4 2.1.5. Giá trị dược liệu của Giảo cổ lam .............................................................5 2.2. Tình hình nghiên cứu về Giảo cổ lam trong nước và trên thế giới ..................6 2.2.1. Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây Giảo cổ lam trên thế giới .........6 2.2.2. Tình hình nghiên cứu Giảo cổ lam trong nước .........................................6 2.3. Khái quát về nuôi cấy mô-tế bào thực vật........................................................7 2.3.1. Khái niệm về nuôi cấy ..............................................................................7 2.3.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô-tế bào thực vật ....................................8 2.4. Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống cây Giảo cổ lam ................10 2.4.1. Môi trường nghiên cứu ...........................................................................10 2.4.2. Các điều kiện nghiên cứu và vật liệu nghiên cứu ...................................14 PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......16 3.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu ........................................................16 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................16 3.1.2. Hóa chất sử dụng .....................................................................................16 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................................................16 vi 3.2.1.Địa điểm nghiên cứu ................................................................................16 3.2.2. Thời gian nghiên cứu ..............................................................................16 3.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ...........................................................17 3.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng vô trùng mẫu Giảo cổ lam ........................................................................17 3.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường và chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi Giảo cổ lam ...................................18 3.3.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam ....................................................20 3.4. Điều kiện thí nghiệm ......................................................................................22 3.5. Phương pháp xử lý số liệu ..............................................................................22 PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................... 23 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng vô trùng mẫu Giảo cổ lam ..........................................................................................23 4.1.1. Kết quả ảnh hưởng của H2O2 (20%) đến khả năng vô trùng mẫu Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) .....................................................................23 4.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của HgCl2 (0,1%) đến khả năng vô trùng mẫu Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) ...............................................25 4.2. Kết quả ảnh hưởng của một số môi trường và chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi Giảo cổ lam .......................................................................27 4.2.1. Kết quả ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM, N6 đến khả năng tái sinh chồi Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) .......................................27 4.2.2. Kết quả ảnh hưởng của kinetin (mg/l) đến khả năng tái sinh chồi Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) .....................................................................30 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam .......................................................................32 4.3.1. Kết quả ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) ............................................................................33 vii 4.3.2. Kết quả ảnh hưởng của kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) .....................................................................35 4.3.3. Kết quả ảnh hưởng kết hợp của BAP và IAA đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) ...............................................38 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................... 41 5.1. Kết luận ..........................................................................................................41 5.2. Kiến nghị ........................................................................................................41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Giảo cổ lam hay còn gọi là Thất diệp đảm, có tên khoa học là Gynostemma pentaphyllum thuộc họ bầu bí (cucurbitaceae). Có nguồn gốc từ các vùng núi của miền nam trung Quốc, Nhật Bản và Đông Nam Á (Hà Thanh Bình, 2002) [3]. Ở Việt Nam, Giảo cổ lam được tìm thấy ở một số địa phương thuộc vùng đồi núi phía bắc như Hòa Bình, Sa Pa,… Các nhà khoa học đã chứng minh được công dụng thần kỳ của Giảo cổ lam đối với sức khỏe con người và nó đã trở thành cây thuốc quý có giá trị. Giảo cổ lam làm hạ cholesterol toàn phần trong máu, làm tăng miễn dịch và nâng cao sức đề kháng của cơ thể, có tác dụng kìm hãm sự phát triển của khối u một cách rõ rệt, giúp bình ổn huyết áp. Sử dụng Giảo cổ lam giúp dễ ngủ và ngủ sâu giấc, giảm béo phì, nhuận tràng, giúp tăng cường máu não mạnh, giảm các cơn đau tim (Phạm Thanh Kỳ, 2007) [18]. Trong tự nhiên Giảo cổ lam thường mọc ở các sườn vách đá có độ ẩm cao, nhưng hệ số nhân giống thấp, tốc độ phát triển phụ thuộc vào nhiều yếu tố ngoại cảnh. Do nhu cầu sử dụng dược liệu này tăng mạnh trong thời gian gần đây dẫn đến nguồn nguyên liệu không thể đáp ứng đủ nhu cầu của thị trường. Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật việc ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống Giảo cổ lam đã trở nên có ý nghĩa. Vì vậy nghiên cứu kỹ thuật nhân giống cây Giảo cổ lam bằng phương pháp nuôi cấy mô sẽ cung cấp những cơ sở khoa học thực tiễn để tạo ra hàng loạt những cây con ổn định về mặt di truyền nhằm bảo tồn và phát triển loài dược liệu quý này. Xuất phát từ cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu nhân nhanh giống Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) bằng kỹ thuật in vitro”. 2 1.2. Mục đích của đề tài Nghiên cứu nhân nhanh giống Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) bằng kỹ thuật in vitro. 1.3. Yêu cầu của đề tài Xác định ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng vô trùngmẫu Giảo cổ lam. Xác định được ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi Giảo cổ lam. Xác định ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam. 1.4. Ý nghĩa của đề tài - Ý nghĩa khoa học: + Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học. + Giúp sinh viên rèn luyện kỹ năng, học tập nghiên cứu khoa học. Xử lý và phân tích số liệu, cách trình bày một bài báo khoa học. + Bổ sung nguồn tài liệu cho việc sản xuất Giảo cổ lam. + Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần hoàn thiện quy trình nhân nhanh giống Giảo cổ lam bằng phương pháp nuôi cấy mô. Sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào nhằm nâng cao hệ số nhân và chất lượng giống. - Ý nghĩa thực tiễn: Nâng cao hiệu quả nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, làm giảm chi phí giá thành, tăng năng suất, chất lượng và đáp ứng nhu cầu cung cấp giống ra thị trường. 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về cây Giảo cổ lam 2.1.1. Đặc điểm thực vật học của chi Gynostemma Gynostemma Blume bao gồm những cây thân thảo, hoa đơn tính khác gốc, thân leo mảnh, nhẵn hoặc hơi có lông mịn. Có từ 3 đến 5 lá chét, có tua cuốn. Cụm hoa đực thành chùy mảnh rất dài, nhiều hoa. Hoa nhỏ, hình sao, ống bao hoa ngắn, cánh hoa rời nhau. Cụm hoa cái tương tự hoa đực nhưng dài hơn. Chứa 2 noãn, vòi nhụy 3, đầu nhụy 2-3. Quả mọng chứa 2-3 hạt, hình tròn, không mở, đường kính 5-9mm, hạt hình tim, hơi dẹt và sần sùi. Gồm 4-5 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á (Võ Văn Chi, 2004) [24]. 2.1.2. Đặc điểm thực vật học của loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino: Giảo cổ lam 5 lá, Cổ yếm, thư tràng hay còn gọi là “Ngũ diệp sâm” (Phạm Hoàng Hộ, 2005) [16]. Thuộc loài cây thân thảo mọc leo yếu. Không có lông, vòi đơn, lá kép có cuống chung dài 3-4cm, 5-7 lá chét, mép có răng cưa, dài 3-9cm, rộng 1,53cm. Cây khác gốc, hoa nhỏ hình sao. Ống bao phấn rất ngắn (cao 2,5mm) bao phấn dính thành đĩa, bầu có 3 vòi nhụy. Quả khô, trong đường kính 57mm. Màu đen, có từ 2-3 hạt, treo, to 4mm có vân lăn tăn. Ra hoa tháng 7 đến tháng 8, cho quả vào tháng 9 đến tháng 10 (Phạm Hoàng Hộ, 2005) [16]. Hoa đực mọc thành chùm, hình nón dài 10 – 15 (có khi dài tới 30cm). Tràng hoa năm cánh màu xanh nhạt hoặc trắng. Hoa cái có hình dạng như hoa đực nhưng nhỏ hơn nhiều. Bầu nhuỵ có 2 – 3 khoang hình cầu. Vòi nhuỵ có 3 núm nhuỵ ngắn và chẻ ra 2 phần. Quả nhẵn, hình cầu, dạng quả mọng nhỏ, đường kính 5 – 6mm và đen khi chín. Hai hạt bên trong màu nâu xám hoặc 4 nâu sẫm, đường kính 4mm. Đỉnh của hạt tù, có đáy hình tim. Mùa ra hoa ở vùng phía Bắc bán cầu là từ tháng 3 đến tháng 11; kết quả từ tháng 4 đến tháng 12 (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [15]. 2.1.3. Nguồn gốc và phân bố Gynostemma pentaphyllum có nguồn gốc từ các vùng núi của miền nam trung Quốc, Nhật Bản và Đông Nam Á (Lê Đình Bích, 2005) [4]. Gynostemma pentaphyllum phân bố ở độ cao từ 300 – 3000m so với mực nước biển ở các vùng đồng bằng, sườn dốc và dưới tán cây trên núi của Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Myanmar, Nê – Pan, Sri Lanka, Thái Lan và Việt Nam (Hà Thanh Bình, 2002) [3]. Gynostemma pentaphyllum phân bố tự nhiên ở vùng rừng núi, thung lũng núi, rừng cây gỗ, rừng cây bụi, những dải đất ven suối, ven đường, những nơi tối, ẩm, có độ cao từ 300 – 3200m (Nguyễn Thị Hòa, 2001) [13]. Ở Việt Nam đã phát hiện được hai loài Giảo cổ lam là loài có 5 lá chét và loài có 7 lá chét. Cả hai loài này đều phân bố khắp các vùng núi thuộc miền bắc và miền trung, cây chủ yếu phát triển trên các vùng có núi đá vôi (Viện Dược liệu, 1996) [21]. Gynostemma laxum (Wall) Cogn: Cổ yếm lá bóng, thư tràng thưa. Cây mọc ở Ba Vì, Lạng Sơn, SaPa, Ninh Bình, Hoà Bình (Lê Đình Bích, 2005) [4]. 2.1.4. Thành phần hóa học của Giảo cổ lam - Chi Gynostemma nổi tiếng với thành phần saponin trong đó nhiều loại saponin rất giống với thành phần saponin có trong nhân sâm, có tác dụng rất tốt cho sức khỏe về phòng ngừa và chữa bệnh. Khi so sánh hàm lượng saponin giữa một số loài cùng chi, loài G.pentaphyllum được biết đến với hàm lượng saponin cao nhất trong chi này, kế đến là G. pubescens và thấp nhất là G. longipes (Võ Văn Chi, 2004) [24]. 5 - Có chứa nhiều Flavonoid, chất có tác dụng sinh học cao và chống lão hóa mạnh. - Chứa nhiều acid amin tan trong nước, nhiều vitamin các nguyên tố vi lượng như Zn, Fe, Se. Số Saponin của Giảo cổ lam nhiều gấp 3 đến 4 lần so với nhân sâm. Trong đó một số có cấu trúc hóa học giống như cấu trúc trong nhân sâm (ginsenozit). Ngoài ra Giảo cổ lam còn chứa các vitamin, các chất khoáng như selen, kẽm, sắt, mangan, phospho,… (Võ Văn Chi, 1997) [23]. 2.1.5. Giá trị dược liệu của Giảo cổ lam Giảo cổ lam được dùng trong các bệnh tăng lipid máu, đánh trống ngực, chứng chóng mặt, đau đầu, ù tai, chứng tự ra mồ hôi, cơ thể suy nhược; các chứng bệnh tâm tỳ khí kém, đàm huyết ứ trệ (Phạm Thanh Hương, 2003) [17]. Giảo cổ lam được đưa vào hầu hết các từ điển thảo dược Trung Quốc, dùng để giải độc, làm thuốc ho, chữa trống ngực, các triệu chứng mệt mỏi, viêm phế quản cấp và mãn tính và làm thuốc giảm ho (Phạm Thanh Hương 2003) [17]. Ở Nhật Bản Giảo cổ lam được dùng để lợi tiểu, điều trị đi tiểu ra máu, chống viêm và làm thuốc bổ (Phạm Thanh Hương, 2003) [17]. Theo tác giả Phạm Hoàng Hộ và Võ Văn Chi Giảo cổ lam có vị đắng tính hàn; có tác dụng tiêu viêm, giải độc, chữa ho và long đờm. Ở Trung Quốc được dùng làm thuốc tu bổ cường tráng. Có nơi như ở Quảng Tây, người ta dùng để trị ỉa chảy và dùng ngoài trị rắn cắn; còn ở vùng Vân Nam, cây được sử dụng như cây Cỏ Yếm lá bóng: Chữa viêm khí quản mãn tính, viêm gan truyền nhiễm, viêm thận, loét dạ dày và hành tá tràng, phong thấp đau nhức khớp, bệnh về tim. Theo tài liệu Cây thuốc phòng trị bệnh ung thư, dược liệu Giảo cổ lam có tác dụng hạ huyết áp, hạ mỡ trong máu, tăng sức khoẻ, chống lão suy, kháng ung thư, trị ung thư, viêm phế quản mãn tính, viêm gan truyền nhiễm, 6 viêm bể thận, viêm dạ dầy ruột, cao huyết áp, lipid máu cao, bệnh mạch vành, bệnh béo phì, trúng gió, sỏi mật, loét dạ dầy, tiểu đường (Dược điển Việt Nam IV, 2009) [21]. 2.2. Tình hình nghiên cứu về Giảo cổ lam trong nƣớc và trên thế giới 2.2.1. Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây Giảo cổ lam trên thế giới Năm 2006, Narumon Mongkolchaipak, Thidarat Boonruad và cộng sự, đã tiến hành nghiên cứu nhân giống cây Giảo cổ lam bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào và đưa ra một số kết quả sau: Môi trường nhân nhanh thích hợp là: MS bổ sung 0,1mg/l BAP, 5mg/l GA3 , 150mg/l axit citric cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 4,3 lần, chiều cao 2,4cm. Môi trường ra rễ thích hợp: MS bổ sung 1mg/l IAA sau 30-45 ngày có số rễ đạt 7,4 rễ/cây, chiều dài rễ đạt 4,2cm, tỷ lệ ra rễ cao nhất đạt 92,8%. Tỷ lệ sống của cây trong vườn ươm sau 1 tháng theo dõi là 94,25%, cây sinh trưởng phát triển tốt (Narumon Mongkolchaipak, Thidarat Boonruad, 2006) [26]. Năm 2012, Anchaleejala và Wassamon Patchpoonporn, đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của BAP, NAA và 2.4-D trong vi nhân giống cây Giảo cổ lam và đưa ra một số kết quả như sau: Sử dụng môi trường nền MS có bổ sung 1,0mg BAP/l, sau 12 tuần hệ số nhân chồi cao nhất đạt 7,28 lần và chiều cao trung bình chồi đạt 2,22cm. Tác giả đã nghiên cứu tạo mô sẹo từ lá bổ sung 2,4-D với nồng độ 1,0mg/l, kết quả mô sẹo hình thành với đường kính là 0,9375cm. Khi bổ sung kết hợp giữa 1,0mg/lBAP và 0,1mg/l NAA cho hệ số nhân chồi đạt 6,8 lần (Anchaleejala và Wassamon Patchpoonporn, 2012) [27]. 2.2.2. Tình hình nghiên cứu Giảo cổ lam trong nước Gần đây do phát hiện nhiều hợp chất mới có hoạt tính sinh dược học cao có trong cây Giảo cổ lam nên nhiều nhà khoa học trong nước quan tâm nghiên cứu về cây này. Các công trình nghiên cứu hóa học của tác giả Viện Dược liệu Phạm Thanh Kỳ và cộng sự (2000) (Phạm Thanh Kỳ, 2007) [18] đã 7 chứng minh dịch chiết từ dược liệu Giảo cổ lam có nhóm hợp chất saponin của nhân sâm (panax ginseng) và một lượng flavonoid đáng kể. Các tác giả khác Nguyễn Tiến Dẫn (1999) ( Nguyễn Tiến Dẫn, 1999) [14] và Ngô Quốc Luật (2008) (Ngô Quốc Luật, 2008) [7] còn chứng minh được hàm lượng saponin và flavonoid dao động từ 0,01 đến 0,36% . Lê Văn Nhân (2010) đã thực thiện đề tài: “ nghiên cứu phương thức nhân giống cây giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb)) tại Sa Pa – Lào Cai” với mục đích xác định phương thức nhân giống cây giảo cổ lam hữu tính và vô tính đã thu được những kết quả: - Gieo hạt có đãi vỏ và phơi khô cho kết quả cao nhất về các chỉ tiêu thời gian mọc (27 ngày), gieo hạt tươi không đãi vỏ có số lá cao nhất (4,2 lá/cây). - Loại hom giâm 4 mầm trên một hom cho kết quả cao nhất về thời gian mọc, tỷ lệ bật mầm, số lá, chiều cao cây, số cây xuất vườn cho kết quả nhân giống cao nhất (tỷ lệ cây xuất vườn đạt 76,67%). - Loại hom trên cây mẹ cách vị trí gốc 110cm cho kết quả cao nhất về thời gian nảy mầm. Tỷ lệ hom bật mầm (84,44%), số lá (6,47 lá/cây), tỷ lệ cây xuất vườn đạt (84,44%) (Lê Văn Nhân, 2010) [6]. 2.3. Khái quát về nuôi cấy mô-tế bào thực vật 2.3.1. Khái niệm về nuôi cấy Nhân giống vô tính là hình thức nhân giống thông qua các cơ quan dinh dưỡng (thân, lá, vỏ, củ…) bao gồm các phương pháp giâm cành, chiết cành, mắt ghép và nuôi cấy mô in vitro. Nhân giống vô tính in vitro được tiến hành trên nguyên tắc cắt nuôi đoạn thân có mang chồi ở nách lá, đoạn rễ hay mảnh củ, cánh hoa, có kích thước nhỏ phù hợp với điều kiện vô trùng của ống nghiệm (Ngô Xuân Bình, 2003) [9]. 8 Nuôi cấy mô tế bào thực vật là thuật ngữ dùng để chỉ quá trình nuôi cấy in vitro các nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng. Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền, sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh, bệnh thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý…. (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006) [10]. 2.3.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô-tế bào thực vật  Tính toàn năng (Totipotence) của tế bào Nguyên lí cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng của tế bào thực vật. Năm 1902, Nhà Sinh Lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến hành nuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng. Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Ông nhận thấy, mỗi tế bào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình phân bào nguyên nhiễm. Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh. Khi gặp điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Năm 1953, Miller và Skoog (Notingham.Unio) đã thành công khi thực hiện tái sinh cây con từ tế bào lá, chứng minh được tính toàn năng của tế bào. Thành công trên tạo ra Công nghệ Sinh học ứng dụng trồng nhân giống vô tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu (Vũ Văn Vụ, 2009) [29]. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của hệ gen (genome) của thực vật đó. Kiểu hình là kết quả tương tác giữa kiểu gen và môi trường. Do đó, khi gặp điều kiện thuân lợi cơ quan, mô, tế bào đều 9 có thể phát triển thành một cơ thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ (Lê Trần Bình, 1997) [5].  Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào Cơ thể thực vật hình thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó, từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau (Trịnh Đình Đạt, 2009) [20]. Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau. Quá trình phân hóa tế bào có thể biểu thị như sau: Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào. Phân hoá tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Phản phân hoá tế bào Tế bào chuyên hoá 10 Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào (Trịnh Đình Đạt, 2009) [20]. 2.4. Các nhân tố ảnh hƣởng tới quá trình nhân giống cây Giảo cổ lam 2.4.1. Môi trường nghiên cứu Môi trường dinh dưỡng là điều kiện cần thiết cho mẫu nuôi cấy sinh trưởng và phát sinh hình thái, quyết định đến thành công của quá trình nuôi cấy. Thành phần và nồng độ các chất trong môi trường dinh dưỡng đa dạng tùy thuộc loại mẫu và mục đích nuôi cấy nhưng đều gồm các thành phần chính sau:  Nguồn Cacbon Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng mặc dù chúng có thể sống bán dị dưỡng trong điều kiện ánh sánh nhân tạo và lục lạp vẫn có khả năng quang hợp. Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc. Nguồn cacbon thông dụng nhất hiện nay là saccharose, ngoài ra có thể sử dụng glucose, maltose (Trần Thị Lệ, 2008) [19].  Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng - Nguyên tố đa lượng: Quan trọng nhất là các nguyên tố N, P, K, Mg, Ca, Na, S (Trần Thị Lệ, 2008) [19]. 11 Nguyên tố Dạng sử dụng Thường được sử dụng ở dạng NO3- hoặc NH4+ , hầu hết các Nitơ loại thực vật sẽ sử dụng nguồn nitơ này để đồng hóa và tổng hợp nên các sản phẩm hữu cơ. Phospho Kali Nhu cầu phospho của mô và tế bào nuôi cấy là rất cao, P có tác dụng như hệ thống đệm giúp ổn định pH môi trường Thường dùng ở dạng KNO3, KH2PO4, KCl.6H2O Canxi Sử dụng chủ yếu là CaNO3.4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O Magie Sử dụng chủ yếu là MgSO4 Lưu huỳnh Chủ yếu là SO4- - Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu là Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni… các nguyên tố vi lượng tuy bổ sung với lượng nhỏ vào môi trường nhưng có vai trò quan trọng đối với quá trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động phân bào của mô, tế bào nuôi cấy.  Vitamin Hầu hết các tế bào nuôi cấy có khả năng tổng hợp vitamin nhưng không đủ về lượng nên cần bổ sung, nhất là nhóm vitamin B. - Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho môi trường nuôi cấy, có vai trò trong trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp amino acid. - Vitamin B6 (Pyridocine): Là coenzyme quan trọng trong nhiều phản ứng trao đổi chất. - Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp. - Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào, tham gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi hydratcacbon (Vũ Văn Vụ, 2009) [25].