Tài liệu Chọn hỗn hợp vi khuẩn bacillus đối kháng vibrio

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THỊ NGỌC HUYỀN CHỌN HỖN HỢP VI KHUẨN Bacillus ĐỐI KHÁNG Vibrio LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2012 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THỊ NGỌC HUYỀN CHỌN HỖN HỢP VI KHUẨN Bacillus ĐỐI KHÁNG Vibrio LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN 2012 LỜI CẢM TẠ Đầu tiên tôi xin chân thành gởi lời tri ân đến các quý Thầy cô khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ, đã truyền đạt những kiến thức quý báo trong suốt quá trình học và nghiên cứu tại trường. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Phạm Thị Tuyết Ngân đã tận tình hướng dẫn cũng như luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Đồng thời xin gởi lời cảm ơn đến cô cố vấn học tập Trần Thị Tuyết Hoa, cùng với Thầy cô và các anh chị bộ môn Thủy sinh học ứng dụng đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Và tôi cũng xin chân thành biết ơn sâu sắc gia đình và những người thân đã tạo mọi điều kiện, tình yêu thương, sự động viên về vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời gian học và hoàn thành luận văn. Gửi lời cảm tạ đến tập thể lớp BHTS – K35 đã hết lòng ủng hộ, quan tâm, giúp đỡ trong suốt thời gian qua. Chân thành cảm ơn! i TÓM TẮT Đề tài được thực hiện nhằm chọn lọc các hỗn hợp vi khuẩn Bacillus có khả năng đối kháng nhóm Vibrio gây bệnh. Vi khuẩn khảo sát gồm 9 dòng Bacillus: B2, B7, B8, B9, B17 B37, B38, B41, B67 có nguồn gốc từ ao nuôi tôm sú thâm canh ở tỉnh Sóc Trăng, có khả năng cải thiện chất lượng nước và nâng cao tỉ lệ sống của tôm. Phương pháp đục lỗ thạch được áp dụng để kiểm tra đặc tính tương thích giữa các dòng vi khuẩn Bacillus, những dòng vi khuẩn không đối kháng lẫn nhau đã được kết hợp lại tạo hỗn hơp. Tượng tự đối với thí nghiệm kiểm tra khả năng đối kháng nhóm Vibrio của các dòng/hỗn hợp Bacilus tìm được với chỉ tiêu đánh giá là đường kính vòng vô khuẩn xung quanh các lỗ thạch. Kết quả tìm được 9 hỗn hợp trong 4 nhóm vi khuẩn sau đây thể hiện sự tương thích lẫn nhau: (B2, B7, B41), (B2, B8, B41), (B9, B41), (B8, B67). Kết quả khảo sát cho thấy có 5 trong tổng số 9 dòng vi khuẩn Bacillus (B2, B8, B9, B41, B67) có khả năng đối kháng vi khuẩn Vibrio. Có 6 hỗn hợp được tuyển chọn H2 (B2, B8, B41), H4 (B2, B8), H5 (B2, B41), H7 (B8, B41), H8 (B9, B41), H9 (B8, B67) dựa trên hai tiêu chí đặc tính tương thích giữa các dòng vi khuẩn Bacillus và khả năng đối kháng Vibrio. Tất cả 6 hỗn hợp được chọn lọc đều thể hiện đặc tính đối kháng Vibrio, tuy nhiên ở các mức độ khác nhau. Trong đó khả năng kháng Vibrio harveyi 30953 mạnh nhất là các hỗn hợp H7 (0,56 cm), H2 (0,70 cm); đối với Vibrio harveyi 0986 có H9 (0,67 cm), H2 (0,57 cm), H5 (0,48 cm) có kích thước đường kính vòng vô khuẩn cao. Riêng chủng Vibrio V(x) có nguồn gốc từ trại thực nghiệm khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ cho kết quả hai hỗn hợp H5 (0,73 cm) và H9 (0,60 cm) có khả năng đối kháng vượt trội hơn hẳn các hỗn hợp còn lại. ii MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ........................................................................................................................... i TÓM TẮT................................................................................................................................ ii MỤC LỤC .............................................................................................................................. iii DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................................ iv DANH SÁCH HÌNH.............................................................................................................. iv DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT............................................................................................... iv Phần 1: GIỚI THIỆU .............................................................................................................. 1 1.1 Giới thiệu..................................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu đề tài:............................................................................................................ 1 1.3 Nội dung đề tài:........................................................................................................... 2 1.4 Thời gian thực hiện đề tài:.......................................................................................... 2 Phần 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ......................................................................................... 3 2.1 Đặc điểm và vai trò của nhóm vi khuẩn Bacillus........................................................ 3 2.1.1 Đặc điểm sinh học ................................................................................................. 3 2.1.2 Vai trò ..................................................................................................................... 3 2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do Vibrio gây ra trên động vật thủy sản ........................ 6 2.3 Một giải pháp mới thay thế kháng sinh - Probiotic..................................................... 8 2.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Bacillus ứng dụng trong thủy sản ............................ 9 Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................... 12 3.1 Vật liệu nghiên cứu.................................................................................................... 12 3.1.1 Thiết bị và dụng cụ .............................................................................................. 12 3.1.1 Nguồn vi khuẩn.................................................................................................... 12 3.1.3 Môi trường nuôi.................................................................................................. 12 3.1.1 Hóa chất................................................................................................................ 13 3.2 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................... 13 3.2.1 Khảo sát đặc tính tương thích giữa các dòng Bacillus chọn lọc ...................... 13 3.3.2 Khảo sát khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh của các dòng vi khuẩn Bacillus chọn lọc.......................................................................................................................... 16 3.3.3 Khảo sát khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh của các hỗn hợp Bacillus ....... 18 3.3.3 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn ............................................................ 20 3.4 Phương pháp xử lí số liệu........................................................................................... 20 4.1 Kết quả khảo sát đặc tính tương thích giữa các dòng Bacillus chọn lọc........... 22 4.2 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Vibrio của các dòng Bacillus................. 23 4.3 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Vibrio của các hỗn hợp Bacillus. .......... 24 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.................................................................................... 30 5.1 Kết luận........................................................................................................................ 30 5.2 Đề xuất......................................................................................................................... 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................... 32 PHỤ LỤC............................................................................................................................... 35 iii DANH SÁCH BẢNG Bảng 4.1: Đặc tính tương thích của 9 dòng vi khuẩn Bacillus chọn lọc............................ 22 Bảng 4.2: Đường kính vòng vô khuẩn (cm) của Vibrio đối kháng các dòng vi khuẩn Bacillus................................................................................................................................... 23 Bảng 4.3: Đường kính vòng vô khuẩn (cm) của Vibrio đối kháng các hỗn hợp vi khuẩn Bacillus................................................................................................................................... 25 DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1: Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn trong môi trường TSB ............................. 14 Hình 3.2: Sơ đồ xác định đặc tính tương thích bằng phương pháp đục lỗ thạch ............. 15 Hình 3.3: Sơ đồ xác định hoạt tính kháng khuẩn của từng dòng vi khuẩn riêng lẻ bằng phương pháp đục lỗ thạch ........................................................................................ 17 Hình 3.4: Sơ đồ xác định hoạt tính kháng khuẩn của hỗn hợp vi khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch ............................................................................................................... 19 Hình 3.5: Dụng cụ và qui trình đục lỗ thạch........................................................................ 21 Hình 4.1: Đường kính vòng kháng khuẩn............................................................................ 26 Hình 4.2: Phân lập vi khuẩn trên môi trường TCBS........................................................... 28 Hình 4.3: Dịch khuẩn sau khi ly tâm.................................................................................... 28 Hình 4.4: Kích thước vòng vô khuẩn ................................................................................... 29 DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT ĐBSCL: CFU: OD: TSB: TSA: TCBS: NA V. harveyi B. subtillis B. cereus Đồng bằng sông Cửu Long Colony forming unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc) Optical Density Tryptic Soya Broth Tryptic Soya Agar Thiosulphate citrate bile salt agar Nutrient Agar Vibrio harveyi Bacillus subtillis Bacillus cereus iv Phần 1: GIỚI THIỆU 1.1 Giới thiệu Tôm sú (Penaeus monodon) là một trong những đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế cao ở Việt Nam, đặc biệt là vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL). Tuy nhiên tỉ lệ sống của đối tượng này thường không ổn định, việc nhiễm bệnh do vi khuẩn (chủ yếu là nhóm Vibrio) gây ảnh hưởng lớn đến năng suất nuôi. Hiện nay tình hình sử dụng kháng sinh bừa bãi trong phòng trị bệnh cho tôm nuôi đã gây hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh. Vì vậy, chế phẩm vi sinh (probiotic) đã trở thành một trong những cách tiếp cận mới thay thế cho việc sử dụng kháng sinh. Tuy nhiên phần lớn các chế phẩm vi sinh sử dụng trong nước hiện nay đều có nguồn gốc ngoại nhập hoặc không rõ thành phần, chủng loại. Các chế phẩm vi sinh phân lập và sản xuất trong nước vẫn còn hạn chế. Việc nghiên cứu chọn lựa những hỗn hợp các dòng vi khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh, có nguồn gốc tại địa phương làm cơ sở cho việc sản xuất đại trà chế phẩm vi sinh là một vấn đề cần thiết trong giai đoạn hiện nay. Bacillus là một trong các nhóm vi khuẩn được nghiên cứu nhiều nhất, nó có vai trò quan trọng vì khả năng sản sinh nhiều sản phẩm biến dưỡng thứ cấp như kháng sinh, thuốc trừ sâu sinh học, hóa chất và enzyme. Một số dòng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus: B37, B41, B67,...được phân lập từ ao nuôi tôm thâm canh ở tỉnh Sóc Trăng đã được chọn lựa nghiên cứu vì tính thích nghi với điều kiện sinh thái vùng ĐBSCL. Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài “Chọn hỗn hợp vi khuẩn Bacillus đối kháng Vibrio” đã được thực hiện. 1.2 Mục tiêu đề tài: Xác định hỗn hợp vi khuẩn Bacillus chọn lọc có khả năng đối kháng nhóm Vibrio gây bệnh từ các dòng vi khuẩn có đặc tính tương thích lẫn nhau. 1 1.3 Nội dung đề tài: Khảo sát đặc tính tương thích (không đối kháng lẫn nhau) giữa các dòng Bacillus chọn lọc. Đánh giá khả năng đối kháng Vibrio của các dòng vi khuẩn Bacillus chọn lọc Đánh giá khả năng đối kháng Vibrio các hỗn hợp vi khuẩn đã tuyển chọn. 1.4 Thời gian thực hiện đề tài: Từ 09/2012 đến 12/2012. Tại phòng phân tích vi sinh - Bộ môn Thủy Sinh Học Ứng Dụng, Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ. 2 Phần 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm và vai trò của nhóm vi khuẩn Bacillus 2.1.1 Đặc điểm sinh học Bacillus là những vi khuẩn gram dương, catalase dương tính, nhóm vi khuẩn này thường tìm thấy trong môi trường có độ pH biến động cao, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, sử dụng khí oxy làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất. Thuộc chi Bacillaceae, đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi hay thành sợi. Chúng có khả năng tạo ra bào tử khi xảy ra các điều kiện khắc nghiệt như thiếu chất dinh dưỡng, nhiệt độ cao,...phần lớn tế bào này có bào tử trong, hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Bào tử có tính kháng nhiệt cao, kháng bức xạ, kháng hóa chất, kháng áp suất thẩm thấu. Khi gặp điều kiện thuận lợi có thể nảy mầm, phát triển thành tế bào sinh dưỡng. Qua kính hiển vi Bacillus đơn lẻ có hình dạng giống những chiếc que, phần lớn những chiếc que này có bào tử trong hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Thường thì người ta quan sát thấy tập đoàn của giống sinh vật này rất rộng lớn, có hình dạng bất định và đang phát triển lan rộng. Một đặc điểm nữa của vi khuẩn Bacillus là có bao nhầy (giác mạc), bao nhầy có cấu tạo polypeptit. Việc hình thành bao nhầy giúp cho vi khuẩn B. Subtilis có khả năng chịu được các điều kiện khắc nghiệt là do bao nhầy có khả năng dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh bị tổn thương khi gặp khô hạn (Trần Thị Thu Hiền, 2010). 2.1.2 Vai trò 3 Từ rất lâu Bacillus đã được sử dụng như một chế phẩm sinh học giúp cải tiến chất lượng nước vì có một số đặc tính probiotic: + Enzym protease: Vi sinh vật tiết ra các enzym ngoại bào phân giải protein và chuyển hóa thành các phân tử có khối lượng phân tử nhỏ (các polypeptide, oligopeptid). Các chất này hoặc tiếp tục phân hủy thành các axit amin nhờ các peptidaza ngoại bào hoặc xâm nhập ngay vào tế bào rồi mới chuyển hóa thành axit amin. Một phần các axit amin này được vi sinh vật sử dụng để tổng hợp nên protein của chúng, phần khác được tiếp tục phân giải tạo thành NH3 và các sản phẩm khác. Quá trình này gọi là sự khoáng hóa hay amon hóa, đó là quá trình chuyển hóa các hợp chất hữu cơ thành dạng vô cơ (NH3). NH3 được chuyển hóa thành NO3- nhờ nhóm vi khuẩn nitrat hóa. Các hợp chất nitrat lại chuyển thành dạng nitơ phân tử nhờ các nhóm vi khuẩn khử nitrat. Các vi khuẩn tham gia vào quá trình amon hóa là Bacillus mycoides, B. subtillis, B. cereus, Pseudomonas. Aerurinosa, P. flourescens… Như vậy, vi khuẩn có khả năng tổng hợp protease mạnh là các vi khuẩn thuộc giống Bacillus và Pseudomonas. + Enzym amylase: Các amylase có nguồn gốc khác nhau thường khác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối. Nhiều vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn nhưng α-amylase chủ yếu tổng hợp từ Bacillus như Bacillus subtillis, B. licheniformis… Enzym amylase của Bacillus subtillis có khối lượng phân tử là 9. 900Da. Enzym amylase của Bacillus subtillis không đòi hỏi phải có chất hoạt hóa, pH tối ưu cho enzym amylase của Bacillus subtillis là 5,0-6,0. Enzym amylase của Bacillus subtillis được đông khô bền với canxi axetat và natri axetat. Enzym α-amylase được dùng cho giai đoạn thủy phân đầu tiên trong trao đổi chất của tinh bột. Các vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh enzym α-amylase cao. Ngày nay việc thu enzym α-amylase và protease từ các vi khuẩn chịu mặn chịu kiềm rất được quan 4 tâm vì những ưu điểm có được từ các loại enzym thu trong việc ứng dụng: bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản, làm nước mắm, tạo chế phẩm sinh học. + Enzym cellulase: Enzym này xúc tác sự phân hủy cellulose thành các sản phẩm trung gian là cellubiose và sản phẩm cuối cùng là glucose. Sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân hữu cơ nhờ hệ enzym protease, amylase, cellulase là các acid amin và glucose. Đó là nguồn thức ăn cho nhiều loại vi sinh vật có ích, giúp cho chúng phát triển mạnh và làm cải thiện chất lượng nước. Bacillus tồn tại khắp nơi trong tự nhiên. Tính dễ sống, dễ tồn tại cũng là lợi thế để sử dụng Bacillus sản xuất chế phẩm sinh học. Trong quá trình hình thành bào tử, Bacillus thường sản sinh những chất có hoạt tính sinh học, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Verschuere (2000) đã nghiên cứu và công bố vi khuẩn Bacillus sp đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện chất lượng nước do vi khuẩn này đạt hiệu quả cao trong việc chuyển đổi vật chất hữu cơ thành CO2. Do vậy, Bacillus sp làm giảm tích lũy chất hữu cơ và các chất hòa tan (trích dẫn bởi Phạm Thị Tuyết ngân, 2007). Một số loài của nhóm vi khuẩn Bacillus sp (B. Subtilis, B. Licheniformis, B. Megaterium,...) dùng để làm sạch môi trường nhờ khả năng sinh các enzyme (proteaza, amylaza, xenlulaza, kitinaza) phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh do cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng giữ cho môi trường luôn ở trạng thái cân bằng sinh học (Tăng Thị Chính và Đinh Thị Kim, 2006). Bacillus còn có khả năng tổng hợp chất kháng khuẩn làm giảm số lượng vi sinh vật phát triển quá mức như Vibrio, Aeromonas,.. Theo nghiên cứu của Xiang-Hong et al. (1998) thì nhóm vi khuẩn có lợi này bao gồm các cơ chế tác động như: có thể ngăn chặn sự phát triển của nhóm vi khuẩn gây bệnh hoặc sản sinh ra các chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh; cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng của vật nuôi; cung cấp một số enyme cần thiết làm nâng cao khả năng tiêu hóa của vật nuôi; và cuối cùng là các nhóm vi khuẩn có lợi này có thể hấp thu hoặc đẩy mạnh quá trình 5 phân hủy chất hữu cơ, các chất gây độc trong môi trường nước làm cải thiện chất lượng môi trường nước. 2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do Vibrio gây ra trên động vật thủy sản Cùng với việc thâm canh hóa nghề nuôi tôm trong những năm gần đây, tôm nuôi của toàn thế giới đang chịu ảnh hưởng của dịch bệnh, bao gồm cả bệnh do vi khuẩn và bệnh do virus. Đa số các bệnh nhiễm khuẩn xảy ra là do tác nhân gây bệnh Vibrio spp (V. harveyi, V. splendida, V. alginolyticus, V. paraheamolyticus) và một số loài khác (Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và ctv, 2010). Theo Đỗ Thị Hòa (2004) giống Vibrio spp thuộc họ Vibrionaceae, có một số đặc điểm chung như sau: có dạng hình que hay hình dấu phẩy, kích thước tế bào 0,3-0,5 µm x 1,42,6 µm. Chúng không tạo bào tử và có khả năng di động bởi một hoặc nhiều roi. Là các vi khuẩn bắt màu gram âm, đa số phản ứng oxidase dương tính, có khả năng oxy hóa và lên men trong môi trường O/F Glucose, không có khả năng sinh H2S và mẫn cảm với (O/129). Hầu hết các giống Vibrio spp đều phân bố trong môi trường nước mặn. Môi trường Thiosulphate citrate bile salt agar (TCBS) là môi trường chọn lọc của Vibrio spp. Dựa vào màu sắc khuẩn lạc trên môi trường này, Vibrio spp được chia thành hai nhóm: nhóm có khả năng lên men đường Sucrose có khuẩn lạc màu vàng và nhóm không có khả năng lên men đường Sucrose có khuẩn lạc màu xanh lá cây trên môi trường TCBS. Nhóm vi khuẩn Vibrio là nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội chúng tồn tại trong môi trường nước nuôi như một thành phần của quần thể vi sinh vật tự nhiên trong ao nuôi. Khi gặp điều kiện môi trường bất lợi chúng trở thành vi khuẩn có khả năng gây bệnh. Khi bị nhiễm vi khuẩn này tôm thay đổi tập tính như bơi ven bờ hay gần mặt nước, lờ đờ, bỏ ăn, đổi màu đỏ hoặc xanh. Nếu môi trường tiếp tục xấu đi, hay số lượng vi khuẩn phát triển mạnh, tôm sẽ chết trong một thời gian ngắn hoặc bệnh sẽ chuyển thành nhiễm khuẩn mãn tính. Để ngăn ngừa bệnh này thì phải chú ý đến việc cải thiện môi trường ao nuôi. Hiện nay người ta đã phân lập và định danh được 172 chủng vi khuẩn từ tôm bệnh và tìm thấy khoảng 90% chủng vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio (Nguyễn 6 Thị Tĩnh và ctv, 2010). Ở Việt Nam đã phân lập được các loài V. alginolyticus, V. harveyi, V. vulnificus, V. cholerae, V. mimicus trên cá, tôm nhiễm bệnh (Oanh et al., 1999). Những biểu hiện của bệnh bao gồm bơi lờ đờ, hoại tử mô và phụ bộ, tăng trưởng chậm, biến thái chậm, dị hình, phát sáng sinh học, đục cơ hoặc đốm đen trên thân (Aguirre-Guzman et al., 2001). Bệnh phát sáng trên tôm sú giai đoạn trứng, ấu trùng và tôm giống gây chết nhanh và hàng loạt, từ 80-100%. Tôm nhiễm bệnh thân có màu trắng đục, quan sát vào ban đêm thấy có hiện tượng phát sáng trong bể ương là do V. harveyi gây ra. V. harveyi là vi khuẩn gây bệnh chủ yếu ở các loài tôm biển và tôm càng xanh, V. harveyi phát triển mạnh trong môi trường có độ mặn từ 20-30‰, mật độ vi khuẩn giảm rõ rệt khi ở môi trường có nồng độ muối từ 5-7‰ (Từ Thanh Dung và ctv, 2005). Vi khuẩn Vibrio là một thảm họa cho nghề nuôi tôm khi việc sử dụng kháng sinh để trị không còn tác dụng nhiều mà ngược lại còn có thể làm cho vi khuẩn kháng thuốc (Moriarty, 1999). Theo Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv (2006) một nhóm vi khuẩn thuộc giống Vibrio spp đã gây thiệt hại kinh tế trong nuôi tôm công nghiệp ở Philippin, Ấn Độ và Indonesia là nhóm vi khuẩn phát sáng. Bệnh phát sáng do một số vi khuẩn có khả năng phát sáng gây ra như Vibrio harveyi, V. splendida, V. orientalis, V. ifscheri, V. vulnificus. Ở Việt nam, những dạng nhiễm vi khuẩn phát sáng thường thấy ở trại sản xuất hoặc ương tôm giống. Khi vi khuẩn phát sáng hiện diện trong cơ thể tôm với số lượng lớn có thể làm tôm nhiễm bệnh phát sáng trong bóng tối. Vibrio phát sáng có thể phát thành dịch và gây chết đến 100% ấu trùng tôm, tôm giống và kể cả tôm trưởng thành. Theo Đỗ Thị Hòa (1996) bệnh do vi khuẩn có thể gây ra 45,3% hiện tượng chết ở tôm nuôi, trong đó hai nhóm gây tác hại lớn nhất là nhóm vi khuẩn dạng sợi và nhóm Vibrio spp. Trong nhóm Vibrio spp, loài V. harveyi là loài quan trọng nhất gây ra bệnh phát sáng trong các trại giống và trong ao nuôi tôm. Kết quả phân lập các chủng Vibrio harveyi kháng kháng sinh từ ấu trùng tôm sú nhiễm bệnh trong các trại giống ở Ấn Độ của Karunasagar và ctv (1994) đã chứng minh các chủng vi khuẩn này đề kháng với bốn loại kháng sinh mạnh: co-trimoxazole, erythromycin, streptomycin 7 và chloramphenicol. Nhầm ngăn ngừa những tổn thất do bệnh Vibriosis gây ra trên tôm cả về mặt môi trường và kinh tế xã hội, cần phải có những giải pháp nhầm tăng sức đề kháng đối với mầm bệnh đồng thời giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh và hóa chất (trích dẫn bởi nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và ctv, 2010). 2.3 Một giải pháp mới thay thế kháng sinh - Probiotic Quá trình nuôi thâm canh với mật độ cao của tôm, cá sẽ dẫn đến sự tích lũy chất hữu cơ và vi khuẩn trong hệ thống nuôi do chúng được đưa vào cùng lượng lớn thức ăn. Theo nguyên lí về mặt sinh thái học, việc cung cấp chất hữu cơ không thường xuyên có khuynh hướng làm mất cân bằng hệ vi sinh theo hướng tăng tỉ lệ vi khuẩn cơ hội. Vì vậy việc quản lí hệ vi sinh là rất quan trọng trong nuôi trồng thủy sản nhất là trong hệ thống nuôi thâm canh. Trong các phương pháp thuộc chiến lược chung để kiểm soát hệ vi sinh trong ương nuôi của Vadstein và ctv (1993) thì việc sử dụng probiotic thay thế cho việc sử dụng kháng sinh đã trở nên đầy hứa hẹn. Thuật ngữ probiotic được đề xuất năm 1965 để mô tả những chất sinh ra từ vi sinh vật có tác dụng tăng trưởng vi sinh vật hoặc các vi sinh vật khác. Năm 1969, R. Fuller định nghĩa rõ hơn: Probiotics hay vi sinh vật probitic là những vi sinh vật sống, bổ sung vào thức ăn có tác dụng cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột và có tác dụng hữu ích cho động vật chủ.. Theo Phạm Thị Tuyết Ngân (2007) probiotic là hỗn hợp bổ sung mang bản chất của các vi sinh vật sống tác động có lợi đối với vật chủ nhờ cải thiện hệ vi sinh liên kết với vật chủ hoặc sống tự do trong môi trường, nó giúp cải thiện việc sử dụng thức ăn hoặc tăng cường giá trị dinh dưỡng của thức ăn, ngoài ra probiotic còn giúp tăng khả năng đề kháng của vật chủ đối với mầm bệnh hoặc nhờ vào sự cải thiện chất lượng của môi trường sống. Probiotic là công nghệ thân thiện với môi trường và đang có xu hướng được ứng dụng rộng rãi trên thế giới và ở Việt Nam. Nghiên cứu của Lê Đình Duẩn và ctv (2007) về nuôi thử nghiệm tôm sú bằng chế phẩm sinh học cho kết quả rất khả 8 quan, các chế phẩm sinh học không những làm tăng khả năng phân giải chất hữu cơ, làm sạch và ổn định môi trường nước mà còn tăng năng suất gấp hai lần so với đối chứng. Một số nghiên cứu khác về việc ứng dụng các chế phẩm sinh học vào môi trường thủy sản cho kết quả rất khả quan, vừa có thể cải thiện chất lượng nước, giảm lượng dùng kháng sinh, giảm mầm bệnh trong ao mà còn có thể nâng cao năng suất nuôi và chất lượng của sản phẩm (Xiang-Hong et al., 1998). Ở Philippin, nghiên cứu cho thấy rằng có thể cứu sống 80% tôm bệnh khi trong ao nuôi có sử dụng chế phẩm sinh học (Moriarty, 1999). Sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản sẽ hạn chế dùng một lượng lớn chất kháng sinh và hóa chất vào ao nuôi thủy sản. Đặc biệt là hạn chế đáng kể khả năng gây bệnh của một số loại vi khuẩn có hại trên đối tượng nuôi. Đây là biện pháp tăng hiệu quả sản xuất có ý nghĩa thực tiễn (Xiang-Hong et al., 1998, trích dẫn Mai Bé Túy, 2011). Tuy nhiên, việc sử dụng chế phẩm probiotic trong nuôi trồng thủy sản mới chỉ bắt đầu trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây, việc sử dụng các chế phẩm này chủ yếu theo kinh nghiệm. Người ta cho rằng, bất kỳ một chế phẩm sinh học phải đạt được 3 quá trình sau: Khống chế sinh học: Những dòng vi khuẩn có ích trong chế phẩm có khả năng sinh các chất kháng khuẩn để tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh trong ao. Tạo sức sống mới: Các vi khuẩn trong chế phẩm khi đưa vào ao sẽ phát triển mạnh mẽ cả về số lượng và hoạt tính, có khả năng tồn tại cả trong môi trường và trong đường ruột, ảnh hưởng có lợi đối với vật nuôi. Xử lý sinh học: Khả năng phân giải các chất hữu cơ trong nước giải phóng axít amin, glucose, cung cấp thức ăn có vi sinh vật có ích, giảm thiểu thành phần nitơ vô cơ như amôni, nitrit, nitrat, giảm mùi hôi thối, cải thiện chất lượng nước. 2.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Bacillus ứng dụng trong thủy sản Kết quả đã phân lập từ mẫu bùn trong ao nuôi tôm sú thâm canh ở Sóc Trăng có 9 chủng Bacillus, 10 chủng Nitrosomonas và Nitrobacter. Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa cho thấy 6 dòng chọn định danh có đặc điểm giống Bacillus. 9 Kết quả giải trình tự cho thấy: B8, B9, B37, B38 đồng hình với dòng B. Cereus. Dòng B41 đồng hình với dòng B. Amyloliquefaciens và dòng B67 đồng hình với dòng B. Subtilis (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2011). Năm 1992, Nogami et al. nghiên cứu và báo cáo rằng trong môi trường nước có độ mặn tương đối cao thì các nhóm vi khuẩn có lợi cũng có thể làm tăng tốc độ sinh trưởng và tỉ lệ sống của ấu trùng cua, ngăn chặn sự sinh trưởng của các vi khuẩn gây bệnh khác như nhóm Vibrio spp. Nhưng lại ít tác động đến các quá trình sinh trưởng của thực vật phù du. Theo Rengpipat và ctv (1998) các dòng chọn lọc Bacillus spp đã được sử dụng qua thực nghiệm để kiềm chế sự lây nhiễm của các loài Vibrio. Một nghiên cứu của Rengpiat et al., (1998) khi ngâm tôm sú (PL30) 10 ngày với V. harveyi có sử dụng probiotic (Bacillus S11) cho thấy sự tăng trưởng và tỉ lệ sống của tôm là 100% cao hơn nhiều so với đối chứng (không sử dụng probiotic) 26% (trích dẫn bởi Phạm Thị Tuyết Ngân, 2011). Theo Moriarty (1998) mầm bệnh do Vibrio sp. đã được xem là một trong những nguyên nhân làm tôm chết hàng loạt. Tuy nhiên, nghiên cứu tế bào Bacillus subtilis BT23 cho thấy hiệu quả cao trong việc chống lại sự tăng trưởng của V. harveyi phân lập từ tôm sú bệnh đen mang, tỉ lệ chết của tôm giảm 90%. Nghiên cứu của Vaseehara và Ramasamy (2003) cho thấy mầm bệnh Vibrio bị kiểm soát bởi Bacillus trong điều kiện phòng thí nghiệm và ngoài thực tế. Vijayabaskar et al. (2008) ứng dụng thành công các vi sinh vật có lợi mà cụ thể là nhóm vi khuẩn Bacillus sp trong nuôi cá rô phi nhầm hạn chế mầm bệnh do vi khuẩn A. Hyrophila gây ra. Sugama và Tsumura (1998) đã sử dụng chủng Bacillus BY-9 bổ sung vào bể (18 m3) nuôi ấu trùng tôm sú với mật độ 106 CFU/mL. Kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này có khả năng ức chế được vi khuẩn Vibrio harveyi và tỉ lệ sống của tôm ở giai đoạn PL-10 ở bể bổ sung vi khuẩn đạt cao hơn (46,1%) so với đối chứng (10,6%). Nghiên cứu của Phạm Thị Tuyết Ngân (2011) về quần thể vi khuẩn chuyển hóa đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú cho thấy chất lượng nước ao nuôi được cải thiện đồng thời mật độ Vibrio ở các nghiệm thức bổ 10 sung Bacillus thấp hơn so với đối chứng. Graslund et al., cho thấy 86% cho thấy 86% người nuôi tôm ở Thái Lan đã sử dụng chế phẩm vi sinh hoặc dẫn xuất men vi sinh để cải thiện chất lượng nước và bùn đáy ao nuôi. 11 Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu 3.1.1 Thiết bị và dụng cụ Nước cất, cồn 96o, cồn 70o Nồi hấp tiệt trùng, máy li tâm Cân điện tử, vortex, bếp điện, micropipette 10-100 L, pipette 100-1000 L Tủ cấy vô trùng, tủ ấm, tủ lạnh, tủ sấy Các dụng cụ thí nghiệm: đĩa petri, ống balcon, que cấy, đèn cồn, ống nghiệm, bình tam giác, bình định mức, ống đong, đầu cole... 3.1.1 Nguồn vi khuẩn Vi khuẩn Bacillus đã được phân lập từ ao nuôi tôm sú thâm canh ở ấp Tân Tĩnh, xã Vĩnh Hiệp, huyện Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng vào năm 2008. Sau khi phân lập vi khuẩn được lưu trữ trong 20% glycerol ở tủ đông (-80oC). Vi khuẩn khảo sát gồm 9 dòng vi khuẩn Bacillus: B2, B7, B8, B9, B17 B37, B38, B41, B67. Vi khuẩn Vibrio gồm 3 chủng: chủng Vibrio harveyi gồm 2 dòng (Vibrio harveyi 30953 và Vibrio harveyi 0986) có nguồn gốc từ trung tâm khảo cứu Artermia (ARC) khoa nông nghiệp trường Đại học Gent của Bỉ và chủng Vibrio chưa định danh được phân lập từ nước bể nuôi tôm ở trại thực nghiệm của khoa Thủy sản, Đai học Cần Thơ. 3.1.3 Môi trường nuôi Môi trường chuyên biệt cho Bacillus, môi trường TSB (Tryptic Soya Broth) (bổ sung 1,5 % NaCl), môi trường TSA (Tryptic Soya Agar) (bổ sung 1,5 % NaCl), Môi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose), Nutrient Agar (NA) (bổ sung 1,5 % NaCl). 12 3.1.1 Hóa chất NaCl, NaOH 0,1N, K2HPO4, KH2PO4, NH4Cl, Na2SO4, MgSO4.7H2O, MnSO4.4H2O, FeSO4.H2O, CaCl2,... 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Khảo sát đặc tính tương thích giữa các dòng Bacillus chọn lọc Mục đích của thí nghiệm này nhằm đánh giá những dòng vi khuẩn có khả năng tương thích (không đối kháng lẫn nhau). Chỉ có những dòng vi khuẩn tương thích mới có thể được sử dụng kết hợp lại trong cùng một hỗn hợp trong thí nghiệm kiểm tra khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh của hỗn hợp Bacillus. Phục hồi vi khuẩn Bacillus: 9 dòng vi khuẩn gồm B2, B7, B8, B9, B17 B37, B38, B41, B67 sau khi rã đông đã được phục hồi trong môi trường TSB trên máy lắc. Sau 24 giờ phục hồi trên máy lắc các dòng vi khuẩn được nuôi tăng sinh trong ống balcon để tiến hành thí nghiệm. 13 A B C D Hình 3.1: Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn trong môi trường TSB (A, C: Phục hồi vi khuẩn trong ống nghiệm; B, D: Nuôi tăng sinh trong ống balcon.) 14