Tài liệu Xác định chỉ tiêu sinh hóa và khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ huyết tương tôm càng xanh (macrobrachium rosenbergii) bị đục cơ nuôi ở thành phố cần thơ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN PHẠM MINH TRÚC XÁC ĐỊNH CHỈ TIÊU SINH HÓA VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ HUYẾT TƯƠNG TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) BỊ ĐỤC CƠ NUÔI Ở THÀNH PHỐ CẦN THƠ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com LỜI CẢM TẠ Cảm ơn tạo hóa cho con làm con của cha mẹ. Cảm ơn cha mẹ đã sinh ra con, luôn luôn bên cạnh con làm chỗ dựa tinh thần vững chắc để con có thể tự tin bước qua mọi khó khăn trong cuộc sống. Xin gởi lời cám ơn chân thành đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh, cô Nguyễn Thị Thu Hằng đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành tốt đề tài . Cám ơn cô Đặng Thụy Mai Thy, chị Nguyễn Hà Giang, chị Nguyễn Thị Thúy Liễu cùng quý thầy cô, anh chị trong bộ môn thủy sinh học và bệnh thủy sản đã tận tâm nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Cảm ơn những người bạn thân cùng tập thể lớp Bệnh học thủy sản 31 luôn ủng hộ tôi, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Cuối cùng, một lần nữa tôi xin cảm ơn tất cả. Chân thành cảm ơn! i PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TÓM TẮT Đề tài được thực hiện nhằm xác định chỉ tiêu sinh hóa và khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ huyết tương tôm càng xanh bị bệnh đục cơ nuôi ở thành phố Cần Thơ. Vi khuẩn trong đề tài là những chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu huyết tương tôm càng xanh bị bệnh đục cơ được phục hồi từ tủ -80O C của bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản – Khoa thủy sản – ĐHCT. Sau khi kiểm tra đặc tính sinh lý và một vài chỉ tiêu sinh hóa cơ bản cùng với kết quả test kit API 20E đã định danh được 3 nhóm vi khuẩn: Aeromonas gồm 12 chủng trong đó có một chủng là Aeromonas hydrophila; Enterobacter 3 chủng và Pantoea 1 chủng. Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của 16 chủng vi khuẩn với 8 loại kháng sinh thường dùng trong nuôi trồng thủy sản nhìn chung rất nhạy cảm với kháng sinh. Cả 3 nhóm vi khuẩn đều nhạy với Streptomycin, Colistin, Norfloxacin, Flofenicol, Doxycycline và Ciprofloxacin. Tuy nhiên, khả năng mẫn cảm của vi khuẩn đối với colistin không cao; oxolinic acid cũng khá nhạy chỉ duy nhất có một chủng kháng. Riêng amoxyciclin kháng hầu như hoàn toàn chiếm 93,75%. ii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com MỤC LỤC Trang PHẦN 1 GIỚI THIỆU .................................................................................................... 1 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 2 2.1 Tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản ................................. 2 2.2 Một số bệnh trên tôm càng xanh ...................................................... 2 2.2.1 Bệnh do virus ......................................................................... 2 2.2.2 Bệnh do vi khuẩn ................................................................... 3 2.2.3 Bệnh do sinh vật bám............................................................. 4 2.2.4 Bệnh do dinh dưỡng và môi trường ....................................... 4 2.3 Sơ lược về bệnh đục cơ .................................................................... 5 2.3.1 Dấu hiệu bệnh lý .................................................................... 5 2.3.2 Tác nhân ................................................................................ 5 2.3.3 Phân bố và lan truyền............................................................. 6 2.3.4 Các biện pháp phòng bệnh đục cơ do vi khuẩn ..................... 7 2.4 Sơ lược về vi khuẩn gây bệnh trên tôm............................................ 7 2.4.1 Đặc điểm vi khuẩn Aeromonas .............................................. 7 2.4.2 Đặc điểm vi khuẩn Vibrio ...................................................... 7 2.4.3 Đặc điểm vi khuẩn Pseudomonas .......................................... 8 2.4.4 Đặc điểm cầu khuẩn Lactococcus garvieae........................... 8 2.5 Các nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản.............................................................................................. 8 iii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 11 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................... 11 3.2 Nội dung .......................................................................................... 11 3.3 Vật liệu nghiên cứu ......................................................................... 11 3.3.1 Dụng cụ ................................................................................ 11 3.3.2 Hóa chất và môi trường ....................................................... 11 3.3.3 Đối tượng nghiên cứu .......................................................... 12 3.4 Phương pháp nghiên cứu ................................................................. 13 3.4.1 Phương pháp xác định chỉ tiêu sinh hóa .............................. 13 3.4.2 Phương pháp lập kháng sinh đồ ........................................... 14 PHẦN 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN.............................................................................. 16 4.1 Kết quả định danh vi khuẩn ............................................................ 17 4.2 Kết quả kháng sinh đồ ......................................................... 22 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................... 26 5.1 Kết luận ........................................................................................... 26 5.2 Đề xuất ............................................................................................ 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 27 PHỤ LỤC ...................................................................................................... 31 iv PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn nghiên cứu ------------------------ 12 Bảng 3.2: Bảng đọc kết quả bộ kit API 20E------------------------------------- 14 Bảng 3.3: Bảng đường kính tiêu chuẩn các loại thuốc kháng sinh theo NCCLS- National Committee Clinical Laboratory Standard ----------------- 15 Bảng 4.1: Các chỉ tiêu sinh lý và kết quả sinh hóa bằng kit API của Aeromonas --------------------------------------------------------------------------- 18 Bảng 4.2: Các chỉ tiêu sinh lý và kết quả sinh hóa bằng kit API của Enterobacter ------------------------------------------------------------------------- 20 Bảng 4.3: Các chỉ tiêu sinh lý và kết quả sinh hóa bằng kit API của Pantoea ------------------------------------------------------------------------------- 21 Bảng 4.4 Đường kính vòng vô trùng của vi khuẩn đối với kháng sinh ------ 24 v PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 4.1: Hình nhuộm gram của vi khuẩn Aeromonas ------------------------ 17 Hình 4.2: Khả năng lên men oxi hóa O/F của vi khuẩn Aeromonas --------- 19 Hình 4.3 : Khuẩn lạc của Aeromonas trên môi trường Aeromonas agar ---- 19 Hình 4.4: Tính kháng của Aeromonas khi kiểm tra với O/129 --------------- 19 Hình 4.5: Kết quả test sinh hóa của Aeromonas bằng kit API 20E ---------- 19 Hình 4.6: Biểu đồ thể hiện tính kháng của vi khuẩn với kháng sinh --------- 22 Hình 4.7: Tính nhạy của Enterobacter đối với kháng sinh -------------------- 23 vi PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHẦN I GIỚI THIỆU Việt Nam có nhiều tiềm năng để phát triển nuôi trồng thuỷ sản ở khắp mọi miền đất nước cả về nuôi biển, nuôi nước lợ và nuôi nước ngọt. Đến năm 2003, đã sử dụng 612.778 ha nước mặn, lợ và 254.835 ha nước ngọt để nuôi thuỷ sản. Trong đó đối tượng nuôi chủ lực là tôm với diện tích 580.465 ha. Diện tích nuôi tôm càng xanh tại các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long đã tăng nhanh trong những năm gần đây và hiện đạt gần 5.000ha, tăng gấp 10 lần so với thời điểm 5 năm trước đây (Thông tấn xã Việt Nam). Diện tích nuôi tôm càng xanh tập trung lớn nhất tại các tỉnh hai bên bờ sông Tiền và sông Hậu như An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Bến Tre và Thành phố Cần Thơ. Năm 2007 diện tích nuôi thuỷ sản của Thành Phố Cần Thơ là 15.245 ha gồm cá ao, cá tra, cá ruộng và tôm càng xanh, tăng 5% so với năm 2006. Tổng sản lượng thu hoạch 175.083 tấn, trong đó cá tra đạt 154.564 tấn vượt kế hoạch 14,4%, tôm càng xanh 268 tấn (Nguyễn Thị Đẹp). Hiện nay, thủy sản nói chung và nghề nuôi tôm nói riêng thì càng xanh luôn gặp nhiều khó khăn từ môi trường, kinh tế và một trong những đáng ngại là tình hình dịch bệnh đặc biệt là đục cơ. Bệnh này cũng gây khá nhiều thiệt hại cho người nuôi. Tại Thái Lan, đục cơ gây tỉ lệ chết cao từ 30 – 100 % ở tôm càng xanh giai đoạn hậu ấu trùng. Tại huyện Cờ Đỏ - thành phố Cần Thơ, bệnh này gây thiệt hại 10 ha diện tích nuôi tôm càng xanh và hao hụt từ 60-70% (2004), 70-100% (2005). Bệnh đục cơ ở tôm càng xanh hiện là vấn đề đang được chú trọng quan tâm trong những năm gần đây. Tác nhân bệnh đục cơ có thể là do hai loại virus MrNV ( Macrobrachium rosenbergii Nodavirus) và XSV (Extra small virus) (Hameed et al., 2004) hoặc vi khuẩn (Yang et al., 2003) gây nên. Xuất phát từ những vần đề trên đề tài “ Xác định chỉ tiêu sinh hóa và khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ huyết tương tôm càng xanh bị bệnh đục cơ nuôi ở thành phố Cần Thơ” được thực hiện nhằm mục tiêu tìm hiểu đặc điểm sinh hoá và khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn nhiễm trên tôm càng xanh bệnh đục cơ ương nuôi tại Cần Thơ. Đề tài bao gồm hai nội dung: 1. Xác định một số chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn phân lập từ huyết tương tôm càng xanh bị bệnh đục cơ. 2. Xác định khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ huyết tương tôm càng xanh bị bệnh đục cơ. 1 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản Nghề nuôi trồng thủy phát triển rất mạnh ở nước ta nói chung và ở Đồng Bằng Sông Cửu Long nói riêng trong thời gian gần đây làm cho môi trường nuôi ngày càng xấu đi, sự bùng phát của dịch bệnh xảy ra ngày càng nhiều. Sự lan truyền dịch bệnh trong thủy sản đã dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng về kinh tế - xã hội, môi trường và thương mại quốc tế khó lường được. Tại Việt Nam, mỗi năm có hàng nghìn hộ dân nuôi luân canh tôm lúa bị thua lỗ do tôm bị chết, tổng thiệt hại trên 4,5 tỉ đồng. (Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản I,1998). Ở Thái Lan, sản lượng tôm nuôi giảm từ 225.000 tấn xuống còn 16.000 tấn do dịch bệnh đốm trắng (giai đoạn 1995 – 1996). Đã làm thiệt hại 500 triệu USD và đến 1997 tình trạng này vẫn chưa được cải thiện (Triệu Thanh Tuấn, 2006) Trong số các bệnh ở động vật thuỷ sản thì nguyên nhân chủ yếu là do vi khuẩn gây ra với những vụ dịch bệnh có qui mô lớn. Thông thường, người ta sử dụng thuốc kháng sinh để kiểm soát các vi khuẩn gây bệnh. Do việc sử dụng không đúng cách và quá nhiều loại thuốc kháng sinh nên đã gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc và tích tụ dư lượng thuốc kháng sinh trong thịt thuỷ sản. Một nguyên nhân khác gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc là việc sử dụng các loại kháng sinh với hàm lượng nhỏ trong thức ăn của thuỷ sản như một chất kích thích sinh trưởng (Mai Văn Tài và ctv., 2004). 2.2 Một số bệnh trên tôm càng xanh 2.2.1 Bệnh do vi rút 2.2.1.1 Bệnh trắng đuôi.(White Tail Disease, WTD) Bệnh trắng đuôi còn gọi là bệnh trắng cơ (White Muscle Disease,WMD) do virut có tên là Macrobrachium rosenbergii Nodavirus (MrNV) và Extra Small Virus (XSV) gây ra. Bệnh này gây ra thiệt hại lớn trong các trại giống ở Ấn Độ, Trung Quốc, Đài Loan. Đối với giai đoạn hậu ấu trùng, tỉ lệ chết là 100% trong vòng 2-3 ngày khi xuất hiện dấu hiệu lâm sàng và hơn 50% đối với tôm trưởng thành (Hameed, 2003). Ở Trung Quốc, theo Xianle và Huang (2003) thì trắng đuôi còn gọi là bệnh đục thân (White Body Disease) và cho rằng bệnh này xuất hiện là do 2 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com mầm bệnh từ Thái Lan mang sang Trung Quốc. Bệnh đục cơ đã tấn công 60-90% quần đàn tôm và gây tỉ lệ chết trên 50% ở cỡ 2-8cm. Khi tôm bị bệnh thì phần thân và đuôi trở nên tái nhợt, trắng đục. Hiện tượng đục cơ xuất hiện từ telson rồi di chuyển lên phần đầu. (Bùi Quang Tề và ctv, 2004) 2.2.1.2 Bệnh Hepatopancreatic (HPV) HPV được xem là virus của tôm nuôi Châu Á, Châu Phi, Châu Mỹ. HPV tìm thấy trên tôm thuộc họ Penaeid nuôi và tự nhiên ở Australia, Trung Quốc, Hàn Quốc, Philippin, Đài Loan, Indonesia, Singapore…Vào 1990, báo cáo đầu tiên về HPV trên tôm Penaeus vanamei và P. stylirostric nuôi và tự nhiên ở bờ biển Thái Bình Dương phía tây Mexico (Lightner, 1996). Theo ông, HPV cũng đã được tìm thấy trên tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii. Đặc điểm của bệnh này là không thấy có dấu hiệu đặc trưng ở bên ngoài. Thể vùi của virus bắt màu hồng của Eosin khi bệnh ở giai đoạn sớm và bắt màu bazơ đậm khi bệnh ở giai đoạn muộn. Thể vùi được tìm thấy trong nhân phì đại của tế bào E và F trên ống gan tụy. (Lightner, 1996) 2.2.2 Bệnh do vi khuẩn 2.2.2.1 Bệnh do vi khuẩn Vibrio Tác nhân gây bệnh thường là các vi khuẩn: Vibrio anguillarium, V.alginolyticus, V.parahacmolyticus, V. harveyi và những loài khác. Khi nuôi ở mật độ quá dày, cho ăn quá nhiều và quảng lý môi trường ao nuôi không tốt sẽ làm bệnh xuất hiện. Ở Trung Quốc, theo Xianle và Huang (2003) tỉ lệ chết thường là 30-50% tôm ở giai đoạn hậu ấu trùng. Nếu giai đoạn giống bị nhiễm bệnh thì gây tổn thất nặng hơn hay mất trắng. Do vậy, các trại giống thường xử dụng thuốc kháng sinh để ngăn chặn bệnh xảy ra và điều này có thể làm xuất hiện nhiều dòng vi khuẩn kháng thuốc. 2.2.2.2 Bệnh đốm nâu Nguyên nhân gây ra bệnh này là sự liên kết của nhiều tác nhân: hóa học, dinh dưỡng, lý học. Vi khuẩn và nấm là tác nhân lây nhiễm thứ hai. Các vi khuẩn gồm: Aeromonas sp., Pseudomonas sp., Vibris sp …..Tôm bị bệnh có dấu hiệu bị hoại tử, sưng viêm, đốm đen trên thân và phụ bộ; tỉ lệ chết không đáng kể nhưng nó làm giảm giá trị kinh tế của tôm. Đây là bệnh thường xảy ra ở ao nuôi tôm đặc biệt là hệ thống nuôi tôm công nghiệp mật độ dày. (trích dẫn bởi Nguyễn Kim Cương, 2006) 3 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 2.2.2.3 Bệnh hoại tử do vi khuẩn (Bacterial Necrosis) Bệnh này ảnh hưởng đến ấu trùng của tôm càng xanh giai đoạn 4-5 và gây tỉ lệ chết 100% trong vòng 48h ở Taihiti. Dấu hiệu bệnh lý của bệnh này là cơ thể tôm hơi xanh hoặc đổi màu, ruột trắng, ấu trùng yếu và lắng xuống đáy bể, có những đốm nâu trên anten và phụ bộ (trích dẫn bởi Nguyễn Kim Cương, 2006). 2.2.2.4 Bệnh do vi khuẩn dạng sợi Bệnh này thường do các vi khuẩn dạng sợi: Leucothrix sp., Thiprix sp., Flexibacter sp., Cytophaga sp., và Flavobacterium sp gây ra. Nhiễm bệnh vào tất cả các giai đoạn phát triển của tôm. Bệnh này có thể gây chết 80% hay hơn thế nữa trong vài ngày đến vài tuần. Ở ấu trùng và tôm bột vi khuẩn phát triển trên bề mặt cơ thể, nhất là trên các lông và phụ bộ. Ở tôm lớn, vi khuẩn hiện diện trên các lông tơ của chân bụng, chân ngực, chân đuôi, vảy râu, phụ bộ miệng và mang. Tôm nhiễm nặng, mang xuất hiện màu vàng đến xanh. Vi khuẩn dạng sợi gây cản trở hô hấp, lột vỏ, bắt mồi, gây chậm lớn hay gây chết tôm. (Từ Thanh Dung, 2008) 2.2.3 Bệnh do sinh vật bám Nguyên nhân của bệnh này là do Zoothamnium, Epistylis, Vorticella, Acineta, hoặc các loại Protozoa bám trên vỏ và mang tôm làm tôm stress nếu bị nặng thường tôm sẽ không thể lột vỏ được. Kiểm tra tôm trong sàn ăn (vó), thấy vỏ tôm bị bẩn giống như có nhớt bám trên vỏ tôm và nhiều khi thấy có rong là do tảo bám trên vỏ tôm, vỏ tôm không sạch. Sau khi bị nhiễm bệnh, tôm giảm ăn, từ từ yếu đi, nằm vùi trong đống bùn ao. Nếu không trị kịp thời tôm sẽ chết vì nhiễm các tác nhân gây bệnh cơ hội (vi khuẩn). (Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1). Ở trung Quốc, bệnh này thường nghiêm trọng hơn vào mùa sản xuất giống. Các loài kí sinh trùng tấn công vào các ao ương, chúng sẽ sinh sản một cách nhanh chóng và gây chết tôm giống. Nếu gặp môi trường xấu, giàu chất dinh dưỡng thì tỉ lệ chết có thể lên đến 60-80% (Xianle và Huang, 2003). 2.2.4 Bệnh do dinh dưỡng và môi trường 2.2.4.1 Hội chứng biến dạng phụ bộ (Appendage Deformity Syndrom, ADS) Theo Kumar et al. (2004) thì đây là bệnh xuất hiện trên tôm càng xanh và cũng gây ra tỉ lệ chết cao ở vùng Andhra Pradesh, Ấn Độ. Nguyên nhân gây ra bệnh này có thể do sự thiếu hụt trong khẩu phần ăn, tác giả chứng minh rằng khi gia tăng hàm lượng carotenoid trong khẩu phần ăn thì bệnh này giảm xuống . 4 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 2.2.4.2 Bệnh đen mang Nguyên nhân gây ra bệnh đen mang là do đáy ao nuôi bị nhiễm bẩn. Khi kiểm tra thấy khí độc (Ammonia) ở đáy ao cao vì có nhiều bùn đáy và vật chất hữu cơ dư thừa ( thức ăn thừa - do thức ăn nhiều tôm ăn không hết, từ tảo chết v.v..). Bệnh này thường xuất hiện trong ao nuôi với mật độ cao, trong ao nuôi theo hệ thống không thay nước hoặc ít thay nước. Khi tôm mắc bệnh mang xuất hiện màu đen và đôi lúc có các chất hữu cơ hoặc vô cơ bám vào mang tôm. Nếu không xử lý kịp thời sẽ làm tôm nhiễm bệnh từ vi khuẩn. Bình thường bệnh đen mang xảy ra lúc tôm lớn (tôm được hai tháng rưỡi tới ba tháng trở lên). (Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1) 2.2.4.3. Bệnh tôm trắng (White Prawn Disease, WPD) Dấu hiệu đặc trưng của bệnh này là có những đốm màu trắng đục trên lớp vỏ ngoài nhưng cơ thì bình thường và WPD thường xảy ra trên tôm trưởng thành (Delves-Broughton and Poupard, 1976). Tuy nhiên bệnh này có ảnh hưởng rất thấp trong ao nuôi. Ở Thái Lan, vấn đề dinh dưỡng được xem là nguyên nhân gây ra bệnh này (trích dẫn bởi Nguyễn Kim Cương, 2006). 2.3 Sơ lược về bệnh đục cơ 2.3.1 Dấu hiệu bệnh lý Hậu ấu trùng nhiễm bệnh đục cơ có trạng thái lờ đờ, giảm ăn và phần cơ bụng có màu trắng đục. Vùng đuôi (telson) bị đục trước và hiện tượng đục thân này tấn công dần lên phần đầu của tôm. Sau cùng, tất cả các vùng cơ thuộc phần bụng và phần đầu ngực đều bị tấn công có thể quan sát rõ các vết đục dưới ánh nắng mặt trời, tôm bệnh nặng mang chuyển màu trắng đục vỏ mềm, khi luộc chính có màu hồng nhợt nhạt. Tỉ lệ chết cao, tối đa là 95% nhưng không đồng nhất. (Bùi Quang Tề và ctv, 2004). 2.3.2 Tác nhân Tác nhân của đục cơ (White tail disease- WTD hay còn gọi là bệnh đuôi trắng) hiện nay còn nhiều tranh luận. Theo Winton Cheng và Jiann- Chu Chen (19982001) thì tác nhân là do cầu khuẩn Lactococcus garvieae (Enterococcus seriolicida). Là vi khuẩn gram (+), có dạng hình cầu hay hình trứng, phát triển ở 10-40oC, độ muối thích hợp là 0.5-6ppt, pH=9.6.Theo phân lập của viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1 ở một mẫu tôm càng xanh bị bệnh đục cơ tại Hải 5 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Phòng, đã phân lập được cầu khuẩn gram (+) và trực khuẩn dung huyết mạnh, gram(-) (Bùi Quang Tề và ctv 2004). Nhưng hiện nay lại có nhiều báo cáo cho là có 2 loại virut: MrNV ( Macrobrachium rosenbergii Nodavirus) và XSV (Extra small virus) gây ra bệnh trắng đuôi xảy ra ở trại ương và ao nuôi ở Ấn Độ, Trung Quốc, Đài Loan. Cả hai loài virus này được phân lập từ tôm càng xanh có dấu hiệu bệnh đục cơ. Tuy nhiên, khả năng gây bệnh của hai loài virus này thì vẫn còn trong quá trình nghiên cứu (Hameed, 2005). Mặt khác Wang và ctv (2007) đã xác định tác nhân gây bệnh đục cơ là M. rosenbergii nodavirus (MrNV) và extra small virus (XSV). 2.3.3 Phân bố và lan truyền bệnh 2.3.3.1 Thế giới Bệnh đục cơ (White muscle disease) còn được gọi là bệnh trắng đuôi (White tail disease) ở tôm Càng Xanh (Macrobrachium rosenbergii) là một trong những bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng cho người sản xuất giống cũng như người nuôi tôm thương phẩm. Bệnh được mô tả lần đầu tiên vào năm 1997 và đến nay đã xuất hiện ở một số quốc gia trong khu vực châu Á (Bùi Việt Hùng). Bệnh đục cơ do virus gây ra được báo cáo đã xuất hiện ở các nước như: Trung Quốc, Đài Loan, Ấn độ và vùng Caribbean (Cộng hoà Dominican, French West Indies). Tại Thái Lan, bệnh đục cơ được biết là gây tỉ lệ chết cao ở tôm càng xanh giai đoạn hậu ấu trùng, dao động trong khoảng 30-100%. Tôm càng xanh sau khi chuyển sang giai đoạn hậu ấu trùng được 2-3 ngày có dấu hiệu bị đục cơ. Tỉ lệ chết bắt đầu xuất hiện và có khả năng gây chết đến 100% trong vòng 5 ngày kể từ khi phát hiện có tôm mang dấu hiệu đục cơ.(Hameed, 2005) Ngoài ra, tại Trung Quốc, Đài Loan tỷ lệ nhiễm đục cơ từ 30- 75% ở các ao nuôi tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii). (Bùi Quang Tề và ctv, 2004). Khoảng giữa tháng một đến tháng 3 năm 2006, bệnh đục thân được biết có sự hiện diện trên tôm càng xanh bột và giống tại các trại nuôi, ương ở Kaohsiung và Pingtung thuộc miền nam Đài Loan. (Hsieh và ctv, 2006) 2.3.3.2 Việt Nam Ở Việt Nam, đục cơ cũng đã xuất hiện một vài năm nay từ năm 2000 khi nhập tôm càng xanh bột có nguồn gốc từ Trung Quốc về Thanh Trì-Hà Nội, đã có hiện tượng tôm đục cơ và chết hàng loạt. Đầu năm 2002, đàn tôm bố mẹ 5-6 tạ của một trại sản xuất tôm giống ở Hải Phòng đã bị đục cơ. Sau khi cho nở ấu trùng và 6 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com ương thành tôm bột, tỷ lệ sống rất thấp chỉ đạt khoảng 1%. Tháng 5/2002, một số ao nuôi tôm càng xanh ở Thanh Trì, Hà Nội thả giống cỡ 0.2g/con nuôi sau 1520 ngày tôm đã xuất hiện bệnh đục cơ và chết rải rác. Tỷ lệ nhiễm bệnh trong đàn tôm nuôi ở Thanh Trì từ 6-90%. (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004) Riêng ở Thành Phố Cần Thơ, từ năm 2004 đến nay hiện trạng về đục cơ ngày càng gia tăng. Năm 2004 bệnh đục cơ đã gây thiệt hại 10 ha diện tích nuôi tôm càng xanh ở Cờ Đỏ và gây hao hụt từ 60-70%. Năm 2005, bệnh đục cơ gây thiệt hại một số mô hình nuôi ở Cờ Đỏ, mức độ hao hụt từ 70-100% (Theo thông tin ghi nhận từ 1 số hộ nuôi ở Cờ Đỏ). Từ đầu năm 2006 đến nay, tình hình bệnh đục cơ lại xuất hiện ở một số trại giống trên địa bàn Thành phố Cần Thơ gây hao hụt lớn cho các ao nuôi thịt và tỷ lệ hao hụt lên đến 70-100% sau 1 tuần thả nuôi. 2.3.4 Các biện pháp phòng trị bệnh đục cơ do vi khuẩn Phòng bệnh: không để tôm bị sốc vì môi trường nuôi xấu; nhiệt độ trong ao để biến thiên trong ngày quá 30C, thiếu oxy vào buổi sáng, pH=7.5-8.5; H2S=0,01mg/l. Bón vôi CaCO3 với liều lượng 1-2kg/100m3 nước ao. Cho ăn vitamin C với liều lượng 2-3g/kg thức ăn, mỗi tháng 2 đợt, mỗi đợt 1 tuần (Bùi Quang Tề và ctv, 2004) Trị bệnh: cho ăn một số kháng sinh Amikacin hoặc Ciprofloxancin liều lượng 100mg/kg tôm/ngày thứ 1 và từ ngày thứ 2-7 cho ăn liều 50mg/kg tôm/ngày. (Bùi Quang Tề và ctv, 2004). 2.4 Sơ lược về vi khuẩn gây bệnh trên tôm 2.4.1 Đặc điểm vi khuẩn Aeromonas Aeromonas hydrophila thuộc họ Aeromonadaceae có tiên mao nên có khả năng di đông, gram âm, dạng hình que ngắn, kích thước 0,5x1,0-1,5µm, hai đầu hơi tròn, yếm khí tùy tiện, có phản ứng Cytochrom oxidase dương tính, có khả năng khử nitrat, không mẫn cảm với Vibriostat 0/129 (Bùi Quang Tề và ctv, 2004). Giống Aeromonas là loài vi khuẩn phân bố rộng trong môi trường, cả ở nước ngọt và nước lợ, có trong cơ thể cá và động vật không xương sống. Có một vài báo cáo Aeromonas có tiềm năng gây bệnh trên con người (Deodhar et al., 1991) (Từ Thanh Dung và ctv.,2005). 2.4.2 Đặc điểm vi khuẩn Vibrio Vibrio spp. thuộc họ Vibrionaceae là vi khuẩn gram (-), dạng hình que hay hình dấu phẩy, kích thước tế bào từ 0,3–0,5x1,4–2,6µm, có khả năng di chuyển nhờ 7 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com tiên mao. Hầu hết vi khuẩn thuộc giống này đều cho phản ứng Oxydase dương tính, có khả năng lên men, oxy hóa trong môi trường O/F glucose, không có khả năng sinh H2S và mẫn cảm với Vibriostat (O/129). Dựa vào màu sắc khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc Thiosulphate citrate bile salt agar (TCBS) Vibrio spp. được chia thành 2 nhóm: nhóm có khả năng lên men đường sucrose có khuẩn lạc màu vàng, nhóm không lên men đường sucrose có khuẩn lạc màu xanh lá cây.(Bùi Quang Tề và ctv, 2004) 2.4.3 Đặc điểm vi khuẩn Pseudomonas Pseudomonas spp. là vi khuẩn gram âm, hình que, kích thước 0,5–1x1,5–5µm, phát triển trên môi trường đơn giản vá hiếu khí. Đa số các loài thuộc nhóm này có phản ứng oxy hóa hoặc một số ít không oxy hóa và không lên men trong môi trường O/F glucose. Giới hạn nhiệt độ từ 4-43oC. Phân bố khắp nơi trong môi trường, trong đất và trong nước. Có loài phân bố ở nước ngọt: Pseudomonas flourescens và loài phân bố nước ở biển: Pseudomonas anguilliseptica, Pseudomonas chlororaphus. (Bùi Quang Tề và ctv, 2004) 2.4.4 Đặc điểm cầu khuẩn Lactococcus garvieae Cầu khuẩn Lactococcus garvieae hay còn gọi là Enterococcus seriolicida. Là các vi khuẩn gram (+), có dạng hình cầu hay hình trứng. Vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ 10-400C, độ muối thích hợp 0,5-6,0 %o, pH 9,6 (theo Winton Cheng, Jiann-Chu Chen, 1998-2001 được trích dẫn bởi Bùi Quang Tề và ctv, 2004) 2.5 Các nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản Ở Chille, Miranda et al. (2003) đã tìm ra 25 chủng vi khuẩn khác nhau đã kháng với Oxytetraxyline từ 4 nông trại nuôi cá. Ở ĐBSCL đã phân lập được 169 dòng vi khuẩn từ các ao nuôi thủy sản và thử với 6 loại kháng sinh và kết quả cho thấy 2% kháng với Chloramphenicol, có 59% dòng vi khuẩn kháng với 4 hay 5 loại kháng sinh trong đó có Chloramphenicol. Có 34% kháng nhiều loại kháng sinh như Chloramphenicol, Ampicilline, Tetracyline, Trimethoprim + Sulfamchoxazole, Nitrofurantion (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv., 2005). Kết quả kháng sinh đồ của 26 trong số 27 dòng vi khuẩn phát sáng được thử với 6 loại thuốc kháng sinh thường dùng trong nuôi thủy sản cho thấy 100% số dòng vi khuẩn thử nghiệm kháng với ampicilin. Các dòng vi khuẩn phát sáng thử nghiệm mẫn cảm với chloramphenicol, norfloxacin và nitrofurantoin hơn so với tetracycline và trimethoprim/sulfamethoxazole. Phần lớn các dòng vi khuẩn thử 8 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com nghiệm chỉ kháng với một loại kháng sinh (77%). Có khoảng 15% dòng vi khuẩn kháng với 2 loại kháng sinh, và 4% kháng với 4 loại thuốc được thử. Có 4% số dòng vi khuẩn kháng với cả 6 loại kháng sinh thử nghiệm.(Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv, 2006). Gần đây, Pender et al. (2008) đã nghiên cứu sự kháng thuốc của Aeromonas phân lập từ môi trường nước của các ao nuôi cá da trơn, cá chình và trại sản xuất giống ở Hà Lan. Kết quả cho thấy sự kháng thuốc của Aeromonas như sau: ampicilin và oxytetracyclin là 100%, sulfamethoxazole 24%, trimethoprim 3% và ciprofloxacin và chloramphenicol là 0%. Năm 1988, khảo sát sự kháng thuốc kháng sinh Tetracycline và Oxytetracycline của vi khuẩn Aeromonas gây bệnh trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) thì đã phân lập được 146 dòng vi khuẩn của giống Aeromonas trong đó thì có 89 dòng vi khuẩn kháng với Oxytetracycline chiếm 61% và 32 dòng vi khuẩn kháng với Tetracycline chiếm 22% (Depaola et al., 1988). Và đến năm 2006 thì Mohamed et al., (2006) đã phân lập được 81 dòng vi khuẩn thuộc giống Aeromonas đã kháng với Tetracycline. Qua kết quả cho thấy sự kháng thuốc của vi khuẩn đã tăng lên về số lượng chủng vi khuẩn kháng và loại kháng sinh bị kháng. Waltman and Shotts (1986) đã kiểm tra sự kháng thuốc trên 118 chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập được ở Mỹ với 37 loại kháng sinh. Kết quả nghiên cứu cho thấy, đa số các vi khuẩn gram âm nhạy với hầu hết các loại thuốc đã thí nghiệm. Tuy nhiên, hơn 90% số chủng vi khuẩn kháng với colistin và sulfamid. Khi được kiểm tra sự nhạy cảm tự nhiên đối với 71 loài kháng sinh của 102 dòng vi khuẩn Edwarsiella (trong đó có 41 chủng E. ictaluri) cho rằng tất cả các dòng Edwarsiella đều nhạy cảm tự nhiên với nhóm kháng sinh tetracycline, β-lactamin, quinolone, chloramphenicol, nitrofurazion… Đồng thời tất cả các chủng đều kháng tự nhiên với nhóm kháng sinh macrolid và kháng sinh oxonilic acid ( Stock et al., 2001). Đối với bệnh mủ gan trên cá tra nuôi ở Việt Nam thì vi khuẩn phân lập được từ cá bệnh và được định danh là E. ictaluri và cũng đã được nghiên cứu sự kháng thuốc của loài vi khuẩn này. Kết quả nghiên cứu cho thấy loài vi khuẩn này thể hiện tính đề kháng và đa kháng với các loại kháng sinh thường được sử dụng trong điều trị bệnh. Tuy nhiên, số lượng, tỷ lệ chủng đề kháng và loại kháng sinh bị kháng khá khác nhau theo địa phương có bệnh xảy ra (Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan., 2007) điều này cũng phù hợp với, một nghiên cứu của Crumlish et al. (2002). Kết quả nghiên cứu này cho rằng Vi khuẩn E. ictaluri phân lập trên cá tra nuôi thuộc tỉnh An Giang thì chỉ kháng với Oxolinic acid 9 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com trong khi vi khuẩn được phân lập từ cá nuôi thuộc tỉnh Cần Thơ thì lại cho kết quả kháng với oxytetracyclin và sulphomamid. Đồng thời, cùng với sự nghiên cứu của Depaola et al. (1995) còn cho thấy số lượng và tỉ lệ chủng đề kháng khác nhau theo mùa vụ nuôi. Ngoài ra, thì sự kháng kháng sinh cũng rất khác nhau giữa các loài vi khuẩn gây bệnh ví dụ như sự kháng Aminoglycoside của E. coli được phân lập vào mùa xuân thì cao hơn các loài khác (Depaola et al., 1995). Theo một điều tra của Mattyar et al. (2004) sự kháng thuốc của vi khuẩn còn khác nhau tùy theo vị trí phân lập được chúng. Kết quả từ nghiên cứu cho thấy vi khuẩn phân lập từ mang của cá thì đã kháng với 7 loại kháng sinh trong khi vi khuẩn phân lập được trong nội tạng thì chỉ kháng với 5 loại kháng sinh. 10 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHẦN III VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3.1.1 Thời gian thực hiện Từ tháng 03/2009 đến tháng 05/2009 3.1.2 Địa điểm Phòng thí nghiệm, khoa thủy sản – Đại Học Cần Thơ. 3.2 Nội dung thực hiện - Xác định chỉ tiêu sinh hóa bằng kit API 20E. - Lập kháng sinh đồ 3.3. Vật liệu nghiên cứu 3.3.1 Dụng cụ - Đèn cồn, bình xịt cồn, que cấy, giấy vệ sinh, cốc thủy tinh, bút lông dầu, cân, thước đo, pipet, micropipette, hộp đầu col, đầu col, đĩa Petri, ống nghiệm, chai nấu, ống nhỏ giọt, môi trường, kính hiển vi, máy ảnh, bút chì, sổ ghi chép. - Tủ ấm, tủ cấy vi khuẩn, tủ lạnh, nồi autoclave, tủ sấy. 3.3.2 Hóa chất và môi trường - - Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: NA (Nutrient agar), Rimler – shotts , TCBS agar, môi trường OF(oxidation- fermentation medium) Nước cất, muối NaCl, cồn tuyệt đối, dầu paraffin, glucose, BaCl2, H2SO4 - Các hóa chất môi trường test sinh hóa: H2O2, giấy test oxydase thương mại, vaselin. - Bộ kit API 20E, ống McFarland 3. - Các loại đĩa thuốc kháng sinh thương mại ( Oxoid, Biorad) dùng trong nghiên cứu kháng sinh đồ: Flofenicol (30µg), Oxolinic acid (2µg), Amoxycillin (25µg), Doxycycline (30µg), Ciprofloxacin (5µg), Norfloxacin ( 10µg), Streptomycin (10µg), Colistin (50µg); đĩa 0/129 (150µg). - Hóa chất nhuộm gram: 11 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com o Dung dịch 1: crystal violet, ethanol 95 %, ammonium oxalate, nước cất. o Dung dịch 2: iodine, potassium iodide, nước cất. o Dung dịch 3: 95% ethanol:5% acetone. o Dung dịch 4: safranin, ethanol 95%, nước cất. 3.3.3 Đối tượng nghiên cứu. Những chủng vi khuẩn phân lập từ huyết tương tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) bị bệnh đục cơ. Bảng 3.1: Nguồn gốc các chủng vi khuẩn nghiên cứu STT Kí hiệu mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 P2P2N3 P2P2N12 P2P1N6 P2P2N10 P2P2N17 P2P1N3 P2P2N13 P2P2N11 P2P2N14 P2P2N16 P2P2N15 P13b1N1 P2P1N9 P2P1N12 P2P1N4 P2P2N1 P2P2N4 P2P1N1C P6M1N3 P6M1N4 P6M1N12 P3P1N16 P3P2N4 P3P2N14 P3P1N10 P6M1N10 P6M1N16 P3P2N13 P3P1N18 P3P2N19 Nguồn gốc phân lập M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii M. rosenbergii Địa điểm thu Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Thới Lai-Cần Thơ Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Thới Lai-Cần Thơ Thới Lai-Cần Thơ Thới Lai-Cần Thơ Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Thới Lai-Cần Thơ Thới Lai-Cần Thơ Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT Khu 2-Nông trường sông Hậu-CT CT: Cần Thơ 12 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Kết quả định danh Aeromonas Aeromonas Aeromonas Aeromonas Aeromonas Aeromonas Aeromonas Aeromonas Aeromonas Aeromonas A. hydrophila Aeromonas Enterobacter Enterobacter Enterobacter Pantoea - 3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Phương pháp xác định chỉ tiêu sinh hóa - Xác định hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc, tính ròng . - Thực hiện các test cơ bản: nhuộm gram, di động, Oxidase, Catalase, O/F. Phương pháp thực hiện được trình bày chi tiết ở phần phụ lục . - Định danh bằng kit API 20E theo hướng dẫn của nhà sản xuất (BioMerieux) o Cho một ít nước cất hoặc nước máy vào trong khay nhựa của bộ kit để giữ ấm trong quá trình ủ trong tủ ấm. o Đặt kit API vào khay nhựa o Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn: dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5 ml nước muối sinh lý hoặc nước cất tiệt trùng lắc trộn đều. Các bước thực hiện: o Dùng dung dịch vi khuẩn cho vào đầy các ô CIT, VP và GEL. o Tương tự chi vi khuẩn vào đầy phần tuýp các ô ADH, LCD, ODC, H2S và URE, kế tiếp cho dầu paraffin vào đầy phần lõm các ô này. o Tiếp theo dùng dung dịch vi khuẩn cho vào đầy phần tuýp các ô còn lại. o Đậy nắp khay và ủ trong tủ ấm ở 26-28oC o Đọc kết quả sau 24-48 giờ - Đọc kết quả: - Kiểm tra và ghi nhận các chỉ tiêu không cần thêm thuốc thử. - Kiểm tra kết quả test API 20E - Các chỉ tiêu cần thêm thuốc thử: - Cho một giọt thuốc thử TDA vào ô TDA, đọc kết quả sau vài giây. - Cho một gọt thuốc thử IND vào ô IND, đọc kết quả sau vài giây. - Cho một giọt thuốc thử VP1 sau đó cho tiếp giọt thuốc thử VP2 vào ô VP, đọc kết quả sau 10-15 phút. 13 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com