Tài liệu Nghiên cứu nhân giống cây bạch đàn lai u6 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào.

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐỖ THÚY LINH NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY BẠCH ĐÀN LAI U6 BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2011 - 2015 Thái Nguyên, năm 2015 ii ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐỖ THÚY LINH NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY BẠCH ĐÀN LAI U6 BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K43 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khoá học : 2011 - 2015 Giảng viên hƣớng dẫn : 1. ThS. Dƣơng Mạnh Cƣờng 2. ThS. Lê Thị Hảo Thái Nguyên, năm 2015 i LỜI CẢM ƠN Qua 6 tháng thực tập tại Bộ môn Công Nghệ Tế Bào, Viện Khoa học Sự Sống đến nay em đã hoàn thành đề tài. Để đạt được kết quả như ngày hôm nay, em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa, Viện Khoa Học Sự Sống, đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong thời gian qua. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo Th.S Dương Mạnh Cường, Th.S Lê Thị Hảo người thầy, người cô trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu, học tập và hoàn thành đề tài. Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Em xin chân thành cảm ơn! Thái nguyên, ngày tháng năm 2014 Sinh viên thực hiện Đỗ Thúy Linh ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân chồi bạch đàn lai U6. (sau 25 ngày nuôi cấy) ......................................................... 32 Bảng 4.2. Kết quả ảnh hưởng của kinetin đến khả năng nhân chồi bạch đàn lai U6. (sau 25 ngày nuôi cấy) ..................................................................... 35 Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng của sự kết hợp giữa kinetin và IAA đến khả năng nhân chồi bạch đàn lai U6. (sau 25 ngày nuôi cấy) ....................... 37 Bảng 4.4. Kết quả ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ chồi bạch đàn lai U6. (sau 20 ngày nuôi cấy) ............................................................... 39 Bảng 4.5. Kết quả ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ chồi bạch đàn lai U6. (sau 20 ngày nuôi cấy) ............................................................... 41 Bảng 4.6. Kết quả ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ chồi bạch đàn lai U6. (sau 20 ngày nuôi cấy) ..................................................................... 42 Bảng 4.7.Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến tỉ lệ sống của cây bạch đàn lai. (sau 60 ngày trồng) ..................................................... 45 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 4.1. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi bạch đàn .................................................................................................. 33 Hình 4.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi bạch đàn lai U6...... 34 Hình 4.2. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi bạch đàn........................................................................................... 35 Hình 4.2. Ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân chồi bạch đàn lai U6. 36 Hình 4.3. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của Kinetin kết hợp với IAA đến khả năng nhân nhanh chồi bạch đàn .............................................................. 37 Hình 4.3. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa kinetin và IAA đến khả năng nhân chồi bạch đàn lai U6................................................................................ 38 Hình 4.4. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ chồi bạch đàn .................................................................................................. 40 Hình 4.5. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của IAA đến khả năng ra rễ chồi bạch đàn .................................................................................................. 41 Hình 4.6. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ chồi bạch đàn. 43 Hình 4.6. Ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng ra rễ chồi của giống cây bạch đàn lai U6. ....................................................... 44 iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-diclorophenolxy acetic acid BAP : Benzyl amino purin ĐC : Đối chứng Cs : Cộng sự CT : Công thức CV : Coeficient of Variation ĐTST : Điều tiết sinh trưởng Đất tầng B: Đất sạch IBA : Indole - 3 - butylric acid Kinetin : 6-Furfurylaminopurine LSD : Least Singnificant Difference Test MS : Murashige & Skoog (1962) NAA : 1- Napthalene acetic acid NXB : Nhà xuất bản TB : Trung bình TDZ : Thidiazuron WPM : Woody Plant Medium v MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU.......................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................. 1 1.2. Mục đích của đề tài ................................................................................ 2 1.3. Yêu cầu của đề tài .................................................................................. 2 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................... 3 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 4 2.1. Giới thiệu chung về cây Bạch đàn ......................................................... 4 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây Bạch đàn ................................................ 4 2.1.2. Đặc điểm thực vật học......................................................................... 4 2.2. Giá trị kinh tế cây cây bạch đàn urophylla ............................................ 5 2.3. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật .............................................. 6 2.3.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật ....................................... 6 2.3.2. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật .............................................. 9 2.3.3. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ......... 9 2.4. Các giai đoạn trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................. 11 2.4.1. Chuẩn bị mẫu .................................................................................... 11 2.4.2. Khử trùng mẫu cấy ............................................................................ 11 2.4.3. Tạo chồi và nhân nhanh .................................................................... 12 2.4.4. Tạo cây mô hoàn chỉnh ..................................................................... 13 2.4.5. Chuyển cây in vitro ra ngoài vườn ươm ........................................... 14 2.5. Các nhân tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống bạch đàn urophylla . 14 2.5.1. Môi trường nghiên cứu ..................................................................... 14 2.4.2. Các điều kiện nghiên cứu .................................................................. 19 2.4.3. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................... 20 2.4.4. Điều kiện vô trùng ............................................................................. 20 2.4.5. Buồng nuôi cấy ................................................................................. 21 2.5. Tình hình nghiên cứu về cây bạch đàn trong nước và trên thế giới .... 21 2.5.1. Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây bạch đàn trên thế giới ...... 21 vi 2.5.2. Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây bạch đàn trong nước ........ 22 PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................................................ 25 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ........................................................ 25 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu: ...................................................................... 25 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ........................................................................... 25 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ........................................ 25 3.2.1. Địa điểm nghiên cứu ......................................................................... 25 3.2.2. Thời gian tiến hành ........................................................................... 25 3.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 25 3.4. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 26 3.5. Các chỉ tiêu theo dõi............................................................................. 31 3.6. Phương pháp xử lý số liệu.................................................................... 31 PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................... 32 4.1. Kết quả ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân chồi cây bạch đàn lai U6. ................................................................... 32 4.2. Kết quả ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng ra rễ chồi bạch đàn lai U6. .......................................................................... 39 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến tỷ lệ sống của 44 cây bạch đàn lai ........................................................................................... 44 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................... 47 5.1. Kết luận ................................................................................................ 47 5.2. Kiến nghị .............................................................................................. 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 48 I. Tiếng Việt ................................................................................................ 48 II. Tiếng Anh ............................................................................................... 50 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trong những năm gần đây, nền công nghiệp của Việt Nam ngày càng phát triển nhanh, trong đó có ngành sản xuất giấy và đồ gỗ gia dụng. Một số cây công nghiệp lâu năm đã được chú trọng phát triển và đem lại nhiều lợi ích kinh tế cho người nông dân trong đó có cây bạch đàn lai U6 (hay còn gọi là cây bạch đàn nâu). Bạch đàn lai U6 có tên khoa học là Eucalyptus urophylla S.T. Blake, thuộc họ Sim Myrtaceae (Hoàng Thị Sản và cs, 2009) [13].Là loại cây mọc tự nhiên và có nguồn gốc từ châu Úc, chúng có thể sinh trưởng dưới một phổ sinh thái rộng như tập trung ở các vùng thấp ven biển, nhưng cũng có thể mọc ở những vùng cao (2000m so với mặt biển) hay vùng khô cạn (sa mạc hoặc bán sa mạc). Ở Việt Nam đã gây trồng bạch đàn từ những năm 1930 ở cả hai miền Nam, Bắc. Hiện nay bạch đàn đang được trồng phổ biến ở nhiều nơi, nó mang lại nhiều lợi ích cho con người như: Tăng hiệu quả kinh tế, nâng cao thu nhập của nhiều người dân và cũng góp phần xóa đói giảm nghèo ở một số tỉnh miền núi của Việt Nam (Lê Đình Khả và cs, 2002) [5]. Giống bạch đàn urophylla là loại cây có khả năng sinh trưởng nhanh, có biên độ sinh thái rộng, dễ trồng trên nhiều loại địa hình khác nhau, có khả năng chịu gió bão có thể sử dụng để làm rừng phòng hộ, chống xói mòn đất đai. Ngoài ra, giống bạch đàn này có dạng thân thẳng, thon đẹp, tỉa cành tự nhiên tốt, không để lại vết sẹo trên thân cây nên thu hút nhiều người trồng hơn một số giống bạch đàn khác (Lê Đình Khả, 2003) [6]. Bạch đàn lai là cây công nghiệp dài ngày ở nước ta và ở một số quốc gia khác. Ở nước ta, bạch đàn lai được trồng sau 7-8 năm có thể cho thu hoạch gỗ để làm nguyên liệu chế biến bột giấy. Sau 15 năm, Bạch đàn có thể 2 khai thác làm gỗ gia dụng, gỗ xây dựng (Lê Sơn và cs, 2005) [14]. Hiện nay, nhu cầu sử dụng của con người ngày càng cao làm cho lượng gỗ và giấy tiêu thụ ngày càng nhiều nhưng việc sản xuất vẫn chưa đáp ứng đủ yêu cầu do diện tích trồng bạch đàn ngày càng thu hẹp dần và lượng cây giống đưa ra ngoài thị trường cũng chưa đáp ứng đủ yêu cầu của người trồng (Đoàn Thị Mai và cs, 2010) [10]. Do đó, để đáp ứng cho thị trường sản xuất giấy và sản xuất đồ gia dụng, cần phải có số lượng cây giống với chất lượng đảm bảo, ổn định và đồng đều. Trong khi đó, việc sản xuất cây giống bằng hạt hay bằng công nghệ giâm hom cho hiệu quả sản xuất không cao do các nguyên nhân như: Hệ số nhân giống chưa cao, cây giống sản xuất ra không hoàn toàn sạch bệnh, sản xuất phụ thuộc vào thời vụ, khó khăn trong việc vận chuyển đi các nơi khác nhau… gây ảnh hưởng đến cây giống và năng suất của cây sau này (Nguyễn Đức Thành, 2000) [18]. Nhằm đáp ứng các nhu cầu thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu nhân giống cây bạch đàn lai U6 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào” 1.2. Mục đích của đề tài Nghiên cứu nhân giống cây bạch đàn lai U6 bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào 1.3. Yêu cầu của đề tài + Xác định ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân chồi bạch đàn lai U6. + Xác định ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng ra rễ chồi bạch đàn lai U6. + Xác định ảnh hưởng của một số giá thể đến tỉ lệ sống của cây bạch đàn lai U6 trong vườn ươm. 3 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài - Ý nghĩa khoa học: + Giúp sinh viên củng cố và hệ thống các lại kiến thức đã học. + Giúp sinh viên rèn luyện và học tập khả năng nghiên cứu khoa học. + Biết được các phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý và phân tích số liệu, cách trình bày một bài báo khoa học. + Sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào nhằm nâng cao hệ số nhân và chất lượng cây bạch đàn lai mới. - Ý nghĩa thực tiễn: Nâng cao hiệu quả nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, làm giảm chi phí giá thành, tăng năng suất, chất lượng và đáp ứng nhu cầu cung cấp giống bạch đàn mới ra thị trường. 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về cây Bạch đàn 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây Bạch đàn 2.1.1.1. Nguồn gốc Bạch đàn là chi thực vật có hoa Eucalyptus trong họ Myrtus, Myrtaceae. Các thành viên của chi này có xuất xứ từ Australia. Có hơn 700 loài bạch đàn, hầu hết có bản địa tại Australia, và một số nhỏ được tìm thấy ở New Guinea và Indonesia và một ở vùng viễn bắc Philippines và Đài Loan. Các loài bạch đàn đã được trồng ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới gồm châu Mỹ, châu Âu, châu Phi, vùng Địa Trung Hải, Trung Đông, Trung Quốc, bán đảo Ấn Độ...(Lê Đình Khả, 2003) [6] 2.1.1.2. Phân loại Giới (Kingdom): Plantae Bộ(ordo): Myrtales Họ (familia): Myrtaceae Phân họ (subfamilia): Myrtoideae Chi (genus): Eucalyptus Loài (species) : Eucalyptus urophylla (Hoàng Thị Sản, 2009) [13] 2.1.2. Đặc điểm thực vật học Cây gỗ lớn, cao 2-25 m, đường kính có thể tới 100 cm. Thân thẳng, vỏ long mảng nhỏ,màu nâu vàng. Tán hình tháp, phân cành thấp. Cành và lá non có màu đỏ tía. Cây mọc khá nhanh, là cây ưa sáng, ưa đất ẩm nên ở những nơi đất tốt hoặc trung bình cây phát triển rất nhanh. Tuy nhên do là loài cây không kén đất nên có thể trồng bạch đàn Urophyla trên các loại đất đồi khô, trọc, đất chua, nghèo dinh dưỡng (Lê Đình Khả, 2003) [6]. 5 2.1.2.1. Thân Thân cây cao to, thẳng, tăng trưởng nhanh, có thể đạt kích thước rất lớn, tỉa cành tự nhiên tốt. Vỏ cây thường tồn tại ở hai dạng vỏ trên một thân, dạng vỏ sần sùi, ráp dày có màu nâu đỏ, các cây non có vỏ màu nâu khi già chuyển sang xám (Hoàng Thị Sản và cs, 2009) [13]. 2.1.2.2. Lá Có hai loại lá: Trên cây non hay cành non: Lá mọc đối, gần như không có cuống, phiến lá hình trứng hoặc giống hình trái tim, sắc lục, mỏng, giống như có sáp, dài 10 - 15 cm, rộng 4 - 8 cm. Trên cành cây già lá mọc riêng biệt, so le, hình liềm, cuống ngắn, cong, phiến lá hẹp dài 16 - 25 cm, rộng 2 - 5 cm, cành già tròn, không cạnh (Hoàng Thị Sản và cs, 2009) [13]. 2.1.2.3. Hoa Từ kẽ lá có những nụ hoa hình núm oản ngửa, có bốn cạnh tương ứng với bốn lá đài. Cụm hoa dạng tán mọc ở nách lá, mang 4 - 8 hoa, hoa màu trắng vàng hoặc trắng xanh (Hoàng Thị Sản và cs, 2009) [13]. 2.1.2.4. Quả Quả hình chén có bốn ngăn trong có chứa ít hạt, hình trứng hoặc gần hình cầu, đường kính 6 - 8 mm (Nguyễn Kim Thanh, 2005)[19]. 2.2. Giá trị kinh tế cây cây bạch đàn urophylla Bạch đàn U6 là sản phẩm của quá trình nghiên cứu khoa học chọn giống cây rừng, các cây đầu dòng được tiến hành nuôi cấy mô để duy trì nguồn gen, có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt. Trong điều kiện bình thường năng suất rừng trồng bạch đàn U6 bình quân là 25-30m3/ha/năm, nếu được chăm sóc tốt rừng cây bạch đàn có thể cho năng suất 40 m350m3/ha/năm (Nguyễn Thị Lý Anh và cs, 2008)[1]. Loài bạch đàn nói chung rất mau lớn, tán lá hẹp thưa, trồng trong vòng 5, 6 năm thì có chiều cao trên 7m và đường kính thân cây khoảng 9-10 cm. Trước năm 6 1975, người ta đã nhầm lẫn trồng rừng Bạch đàn tập trung thuần loại ở Miền Trung Việt Nam nhằm mục đích phủ xanh và phủ nhanh đất trống đồi trọc nhưng kinh nghiệm cho thấy, cây Bạch đàn là loài dễ trồng, ít kén đất tăng trưởng nhanh nhưng hấp thụ nhiều nước và dưỡng chất trong đất nên nếu trồng tập trung thành rừng thuần loại trên đất trống đồi trọc vô tình sẽ làm khô cằn và nghèo nàn đất đai sau một vài chu kì. Do đó, nếu cần phủ xanh đất trống đồi trọc thì chỉ nên trồng hỗn giao với loài bạch đàn bằng cách loài cây họ Ðậu như Keo lá tràm, Keo tai tượng hoặc Keo giậu để bù đắp chất đạm cho đất. Ở Việt Nam, gỗ bạch đàn thường đốn chặt khoảng 5-7 năm để làm cây chống trong xây dựng và làm bột giấy hay ván dăm bào gọi là ván okal (panneau de copaux). Bạch đàn có tuổi trên 70-80 năm, cây cao đến 50-60 mét, đường kính trung bình đến cả mét và gỗ được sử dụng đa năng từ làm bột giấy, ván ép, ván dăm bào, trụ cột cho đến dồ mộc gia dụng, xây cất nhà cửa cũng như công trình xây dựng nặng (Lê Sơn và cs, 2005)[14]. Đối với trồng rừng sản xuất, tiêu chuẩn quan trọng nhất để chọn cây trồng rừng là hiệu quả kinh tế. Đối với bạch đàn, tuy có giá trị kinh tế kém hơn một số cây gỗ quý như cẩm lai, gỗ mật, sao, dầu, giáng hương... song gỗ dễ tiêu thụ, đưa lại hiệu quả kinh tế nhanh. Ngoài ra chúng còn có một số ưu điểm khác: Một số cơ sở chế biến gỗ sử dụng gỗ Bạch đàn trong việc trang trí và đóng các đồ gỗ dùng ở ngoài trời rất bền và tốt, một số loài đoạn thân dưới cành thẳng, dài, không bị mối mọt, nên được dùng trong xây dựng, ngành công nghiệp sản xuất giấy (Lê Đình Khả, 2002) [5]. 2.3. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.3.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức Schleiden và Schwann đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ : “Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ, các tế bào hợp thành. Các tế bào phân hoá đều mang các thông tin di truyền có 7 trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể” (Nguyễn Đức Thành, 2000) [18]. Năm 1902, Harberland là người đầu tiên đã quan niệm rằng bất kì một tế bào nào của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Ông đã cho rằng “Bằng nuôi cấy tế bào đã phân lập, người ta có thể tạo ra các phôi nhân tạo từ các tế bào sinh dưỡng”. Ông cũng đã tiến hành nuôi cấy mẫu lá của một số cây một lá mầm như: Erythronium, Tradescantia, tuy nhiên đã không thành công (Vũ Văn Vụ và cs, 2008) [22]. Năm 1922, Kotte, học trò của Harberland và Robbins, người Mỹ, lặp lại thực nghiệm của Haberland với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hoà thảo. Trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trưởng khá mạnh, tạo nên một hệ rễ nhỏ mang cả rễ phụ. Tuy nhiên, sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm dần và dừng lại, mặc dù các tác giả đã chuyển sang môi trường mới (Nguyễn Đức Thành, 2000) [18]. Năm 1934, được xem là giai đoạn thứ hai của nuôi cấy mô và tế bào thực vật khi White thành công trong việc duy trì mô rễ cây cà chua trong môi trường lỏng có chứa muối khoáng, đường saccarozơ và dịch chiết nấm men. Qua thí nghiệm, ông thấy rằng có thể thay dịch chiết nấm men bằng các vitamin nhóm B (B1, B3, B6) (Dodd J. H., Roberts L. W, 1999) [24]. Năm 1939, độc lập với Nobercourt, Gautheret cũng đã duy trì được sinh trưởng của mô sẹo cà rốt trong một thời gian dài. Năm 1941, Van Overbeek và cộng sự đã phát hiện thấy nước dừa có ảnh hưởng tích cực đến sự phát sinh phôi và tạo mô sẹo ở cây họ cà (Dodd J. H., Roberts L. W, 1999) [24]. Cũng trong thời gian này, nhiều chất điều hoà sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin như NAA, 2,4-D đã được tổng hợp. Nhiều tác giả xác nhận cùng với nước dừa, 2,4-D và NAA đã giúp tạo mô sẹo thông qua phân chia tế 8 bào ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó nuôi cấy (Nguyễn Kim Thanh, 2005) [19]. Năm 1954, Skoog bổ sung chế phẩm ADN chiết từ tinh dịch cá bẹ vào môi trường nuôi cấy mô thân cây thuốc lá. Ông nhận thấy chế phẩm này có tác dụng kích thích sinh trưởng mô nuôi cấy rõ rệt. Một năm sau, Skoog và cộng sự đã xác nhận chất gây ra hiện tượng trên là 6-furfuryl amino purine và đặt tên là kinetin. Sau đó người ta đã tìm ra và tổng hợp một số chất có tác dụng kích thích phân bào tương tự như kinetin và cùng với kinetin gọi chung là nhóm cytokinin. Cytokinin được tách chiết từ thực vật bậc cao đầu tiên là zeatin có trong mầm ngô. Các hợp chất này có khả năng kích thích sự phân chia tế bào của các mô đã biệt hoá cao như tế bào thịt lá hoặc nội nhũ của hạt đã phơi khô (Dodd J. H., Roberts L. W, 1999) [24]. Nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Morel (1960) đã tạo ra được các protocorm (mô sẹo) từ địa lan. Khi để trong các điều kiện nhất định, các protocorm có thể phát triển thành cây lan con và hoàn toàn sạch bệnh. Cùng năm đó, Cocking ở trường đại học tổng hợp Nottingham đã thu được các tế bào trần (protoplast) dùng cho nuôi cấy từ mô thực vật được xử lý với enzym xenlulaza. Năm 1966, Guha và cộng sự đã tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn của cây cà độc dược (Datura inoxia). Việc tạo cây đơn bội thành công ở nhiều loài thực vật thông qua nuôi cấy bao phấn và hạt phấn đã đóng góp rất lớn cho các ngiên cứu di truyền và lai tạo giống (Vũ Văn Vụ và cs, 2008) [22]. Từ những năm 1970 trở đi, các nhà khoa học đã chú ý vào triển vọng của kỹ thuật nuôi cấy protoplast, khi hai tác giả người Nhật Bản là Nagata và Takebe đã thành công trong việc làm cho protoplast thuốc lá tái tạo được xenlulozơ. Năm 1978, Melchers và cộng sự đã lai tạo thành công protoplast của cà chua với protoplast của khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai xa ở thực vật (Vũ Văn Vụ và cs, 2008) [22]. 9 2.3.2. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật (plan tissue culture) là kỹ thuận đưa một mô, bộ phận hoặc tế bào của thực vật vào trong một hệ thống vô trùng có thể kiểm soát về thành phần chất khoáng, điều hoà sinh trưởng, các chất hữu cơ cung cấp cho cây, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm để mô, bộ phận đó sinh trưởng, phát triển theo mục đích của người nuôi cấy (Nguyễn Quang Thạch và cs, 2009)[20]. Các bộ phận được dùng để nuôi cấy có thể là chồi đỉnh, chồi bên, chồi bất định, bao phấn, bao hoa, phôi và các bộ phận khác như vỏ cây, lá non, thân mầm… Ưu điểm chính của nuôi cấy mô là cây mô được trẻ hóa cao độ và có rễ giống như cây mọc từ hạt, thậm chí không có sự khác biệt đáng kể so với cây mọc từ hạt. Một ưu điểm khác của nhân giống bằng nuôi cấy mô là có hệ số nhân giống cao hơn nhân giống bằng hom. Từ một cụm chồi sau một năm nuôi cấy mô liên tục có thể sản xuất hàng triệu cây con. Hơn nữa, nuôi cấy mô cũng là một trong những biện pháp làm sạch bệnh. Mặc dù nuôi cấy mô đòi hỏi kỹ thuật phức tạp, giá thành cao, song vẫn được nhiều nơi áp dụng, đặc biệt là phối hợp giâm hom, tạo thành công nghệ mô - hom đang được sử dụng khá phổ biến trong lâm nghiệp (Lê Đình Khả, 2002)[5] 2.3.3. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.3.3.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật Năm 1902, Nhà Sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến hành nuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng. Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Ông nhận thấy, mỗi tế bào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình phân bào nguyên nhiễm. Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh. Khi gặp 10 điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Năm 1953, Miller và Skoog (Notingham. Unio) đã thành công khi thực nghiệm tái sinh cây con từ tế bào lá, chứng minh được tính toàn năng của tế bào. Thành công trên đã tạo ra công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vô tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu (Vũ Văn Vụ và cs, 2008) [22]. Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến nay, con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Cơ thể thực vật hình thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó, từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau (Nguyễn Đức Thành, 2000) [18]. Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau. Quá trình phân hóa tế bào có thể biểu thị: Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệt Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào. 11 Phân hóa tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hóa Phản phân hóa tế bào Sơ đồ các giai đoạn phân hóa tế bào Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào (Nguyễn Đức Thành, 2000), [18]. 2.4. Các giai đoạn trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.4.1. Chuẩn bị mẫu Mục đích của giai đoạn này là tạo nguồn mẫu sạch để phục vụ cho các bước tiếp theo. Cây giống được đưa ra khỏi môi trường phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với môi trường mới, đồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy và chủ động trong công tác nhân giống. Trong điều kiện cần thiết có thể tác động các biện pháp trẻ hóa vật liệu nhân giống hoặc thụ phấn nhân tạo cho những loài khó thụ phấn trong điều kiện tự nhiên (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2000) [12]. 2.4.2. Khử trùng mẫu cấy Mục đích của giai đoạn này là tạo ra các chồi mới từ các mô nuôi cấy. Khi đã có nguồn nguyên liệu nuôi cấy, cần tiến hành lấy mẫu và xử lý mẫu bằng hóa chất khủ trùng. Tùy thuộc vào từng loại vật liệu mà chọn hóa chất, 12 nồng độ, thời gian khử trùng thích hợp. Theo nguyên tắc thì lấy bất kỳ bộ phận nào của cây cũng có thể dùng làm mô nuôi cấy. Nhưng thường lấy mô ở các phần non (chồi đỉnh, chồi bên) của cây thì cho tỷ lệ nuôi cấy thành công cao hơn so với lấy mô ở các bộ phận trưởng thành khác (Bhat K. M and H, 2002) [23]. Mẫu trước khi được cấy vào môi trường được rửa nhiều lần bằng nước sạch, rồi ngâm trong dung dịch khử trùng ở nồng độ và thời gian thích hợp để làm sạch nguồn bệnh. Trong quá trình khử trùng mẫu phải đảm bảo không làm ảnh hưởng đến sức sống của mẫu cấy. Tiếp đó cấy mẫu vào môi trường thích hợp cho từng loại cây. Giai đoạn này kéo dài 4 - 6 tuần (Đặng Ngọc Hùng, 2009) [4]. Ngoài ra, khi lựa chọn mô nuôi cấy cần chú ý tuổi sinh lý của mô càng thấp thì độ trẻ hóa càng cao, nuôi cấy dễ thành công. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: Mô nuôi cấy có tỷ lệ sống cao, ít nhiễm bệnh, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào việc lựa chọn bộ phận nuôi cấy, nên khi lấy mẫu cần đảm bảo các nguyên tắc nêu trên (Đoàn Thị Mai và cs, 2010) [10]. 2.4.3. Tạo chồi và nhân nhanh Một trong những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào so với các phương pháp khác là hệ số nhân giống cao. Vì vậy, có thể coi đây là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống. Hệ số nhân nhanh ở giai đoạn này biến động từ 5 - 50 lần tùy thuộc vào từng loài cây, môi trường nuôi cấy và điều kiện ngoại cảnh thích hợp (Ngô Xuân Bình, 2010) [2]. Ở giai đoạn này bao gồm nhiều lần cấy chuyền mô lên các môi trường nhân nhanh nhằm kích thích tạo cơ quan phụ hoặc cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh. Những khả năng tạo cây đó là: + Phát triển chồi nách + Tạo phôi vô tính