Tài liệu Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men trong bánh men lá và bước đầu ứng dụng trong chế biến rượu

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN THỊ PHƯƠNG NGA PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MEN TRONG BÁNH MEN LÁ VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG TRONG CHẾ BIẾN RƯỢU LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm HUẾ - 2019 ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN THỊ PHƯƠNG NGA PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MEN TRONG BÁNH MEN LÁ VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG TRONG CHẾ BIẾN RƯỢU LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 8540101 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. NGUYỄN ĐỨC CHUNG HUẾ - 2019 i LỜI CAM ĐOAN Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Đức Chung.Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là hoàn toàn trung thực từ kết quả nghiên cứu có được và chưa được ai công bố trong bất cứ một công trình nào khác. Các thông tin trích dẫn đều được ghi rõ địa chỉ, nguồn gốc. Người cam đoan Trần Thị Phương Nga ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi luôn nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ của các quý thầy cô cùng bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Trước tiên tôi xin bày tỏ lời cảm ơn âu sắc và kính trọng đến thầy giáo hướng dẫn TS. Nguyễn Đức Chung đã tận tình giảng dạy, định hướng và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và làm luận văn tốt nghiệp. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Huế; cùng tập thể quý thầy, cô giáo khoa Cơ khí Công nghệ đã tận tình giảng dạy, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Chủ nhiệm Khoa, quý thầy cô giáo, các sinh viên nghiên cứu khoa học trong khoa Cơ khí - Công nghệ, trường Đại học Nông Lâm Huế đã luôn quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài luận văn. Cuối cùng tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè những người đã luôn ở bên để động viên, khích lệ, tạo mọi điều kiện, ủng hộ tôi trong suốt thời gian học tập, giúp đỡ tôi vượt qua những khó khăn trong thời gian vừa qua. Tôi xin chân thành cảm ơn! Huế, ngày…tháng…năm 2019 Học viên thực hiện Trần Thị Phương Nga iii TÓM TẮT Nghiên cứu này nhằm phân lập, tuyển chọn được một số chủng nấm men có hoạt lực cao sử dụng nguyện liệu là bánh men lá tại huyện Đá Bang, tỉnh Quảng Trị và bước đầu ứng dụng vào sản xuất rượu, đánh giá chất lượng rượu thành phẩm sau khi bổ cung các chủng nấm men đã phân lập và tuyển chọn được trong quá trình lên men. Các phương pháp được sử dụng trong quá trình nghiên cứu: phương pháp phân lập nấm men; phương pháp vi sinh (nuôi cấy trên 02 môi trường và khảo sát khả năng lên men của các dòng nấm men bằng đo chiều cao cột khí sinh ra trong ống Dur Ham trên 02 môi trường; Định danh các chủng nấm men có hoạt lực cao bằng phương pháp CTAB –PCI; phương pháp xác định hóa sinh (xác định hàm lượng đường khử, đường tổng bằng phương pháp Bertrand; xác định hàm lượng acid bằng dung dịch kiềm chuẩn NaOH; xác định độ cồn bằng cồn kế; xác định độ pH bằng máy đo pH Thermo Scientific Orion 3 Star), phương pháp đánh giá cảm quan, phương pháp xử lý số liệu. Nghiên cứu cho thấy kết quả phân lập được 14 dòng tế bào và tuyển chọn được 12 dòng tế bào có khả năng lên men, khảo sát được 07 dòng nấm men có hoạt lực cao mang đi định danh và chúng tôi đặt tên cho các chủng lần lượt là Cystobasidium calyptogenae NML01, NML02 (Pichia guilliermondii), Dirkmeia churashimaensis NML03, Candida metapsilosis NML04, Sacchromyces cerevisiace NML01 (2), Sacchromyces cerevisiace NML05 và Sacchromyces cerevisiace NML17. Sử dụng 02 dòng tế bào NML02 (Pichia guilliermondii), NML04 (Candida metapsilosis) bổ sung vào quá trình sản xuất rượu. Nghiên cứu thời gian lên men đối với các công thức phối trộn (CT1: 0,6g/1000 g; CT2: 0,7/1000 g; CT3: 0,8/1000g; CT4: 0,9/1000g; CT5: 10/1000g; CT6: 11/1000g; CT7: 12 g/1000 g). Kết quả nghiên cứu cho thấy thời gian lên men ẩm (ủ) thích hợp là 4 ngày cho hàm lượng đường tổng giảm nhanh và hàm lượng đường khử tăng nhanh và đột biến ở các công thức. Xác định được các điều kiện thích hợp để lên men rượu. Thời gian ủ là 4 ngày, nhiệt độ lên men là 25 oC, tỷ lệ phối trộn bánh men/nguyên liệu là 0,8g/1000g, thời gian lên men lỏng là 9 ngày cho sản phẩm rượu có độ rượu cao. Sau khi xác định được tỷ lệ phối trộn bánh men/ nguyên liệu, nhiệt độ, thời gian lên thích hợp tiến hành bổ sung 01 chủng nấm men NML04 vào quá trình lên men rượu với tỷ lệ 0,2g/1000g cho độ rượu cao nhất 46,8v/v, cho kết quả đánh giá cảm quan cao nhất; sau đó tiến hành bổ sung kết hợp 02 chủng NML04 và NML02 vào quá trình lên men, xác định được tỷ lệ bổ sung 02 chủng là 0,2g: 0,2g /1000 g nguyên liệu cho độ rượu cao 46,4v/v, cho kết quả đánh giá cảm quan cao nhất. Rượu thành phẩm sau khi bổ sung 02 chủng nấm men cho độ rượu cao, thời gian lên men ngắn đạt hiệu quả kinh tế, không phát hiện sự có mặt của methanol phù hợp với tiêu chuẩn TCVN 7043:2013, tuy nhiên lại có sự hiện diện của andehyt và furfural iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................... ii TÓM TẮT .......................................................................................................... iii MỤC LỤC ......................................................................................................... iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT .......................................................... viii DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................... x DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................. xii MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 1. Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1 2. Mục tiêu của đề tài .......................................................................................... 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu ......................................... 2 3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài ........................................................................... 2 3.2 Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................... 2 Chương 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ..................................... 3 1.1 Tổng quan về bánh men ................................................................................. 3 1.1.1 Khái quát về bánh men lá ............................................................................ 3 1.1.2 Khái quát về bánh men thuốc Bắc ................................................................ 6 1.2 Tổng quan về nấm men ................................................................................. 7 1.2.1 Hình thái, kích thước của nấm men .............................................................. 7 1.2.2 Cấu tạo tế bào nấm men .............................................................................. 7 1.2.3 Thành phần hóa học của tế bào nấm men ..................................................... 8 1.2.4 Dinh dưỡng nấm men ................................................................................ 10 1.2.5 Phân loại nấm men . .................................................................................. 10 1.2.6 Vai trò của nấm men ................................................................................ 11 1.2.7 Ứng dụng của nấm men ............................................................................. 12 1.3 Tổng quan về rượu ....................................................................................... 13 v 1.3.1 Giới thiệu về rượu ..................................................................................... 13 1.3.2 Một số sản phẩm rượu: .............................................................................. 15 1.3.3. Quy trình sản xuất rượu truyền thống ........................................................ 18 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu ......................................... 19 1.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ ............................................................................ 19 1.4.2 Ảnh hưởng của pH môi trường .................................................................. 19 1.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ dịch đường .......................................................... 19 1.4.4 Ảnh hưởng của oxy hòa tan - độ hiếu khí ................................................... 20 1.4.5 Ảnh hưởng của các nguồn nitơ tới quá trình lên men .................................. 20 1.5 Cơ sở lý thuyết quá trình lên men rượu ......................................................... 21 1.6 Quy trình sản xuất rượu men lá .................................................................... 21 1.7 Quá trình chưng cất...................................................................................... 23 1.8 Tình hình tiêu thụ rượu trên thế giới và trong nước ....................................... 23 1.9 Các công trình ngiên cứu trong và ngoài nước về men lá. .............................. 25 1.9.1 Nghiên cứu trong nước .............................................................................. 25 1.9.2 Nghiên cứu nước ngoài. ............................................................................ 26 Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................. 28 2.1 Đối tượng nghiên cứu. ................................................................................. 28 2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu. ................................................................ 28 2.3 Hóa chất, thiết bị, dụng cụ sử dụng ............................................................... 28 2.3.1 Hóa chất ................................................................................................... 28 2.3.2 Thiết bị, dụng cụ sử dụng .......................................................................... 28 2.4 Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 29 2.5 Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 30 2.5.1 Phương pháp lấy mẫu ................................................................................ 30 2.5.2 Phương pháp phân lập nấm men ................................................................ 30 2.5.3 Khảo sát khả năng lên men của các dòng nấm men đã phân lập trên các môi trường khác nhau ............................................................................................... 31 2.5.4 Định danh các dòng nấm men có hoạt lực cao ............................................ 31 vi 2.5.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm ................................................................... 34 2.6 Phương pháp xác định chỉ tiêu nghiên cứu .................................................... 37 2.6.1 Phương pháp hóa lý .................................................................................. 37 2.6.2 Phương pháp hóa sinh ............................................................................... 38 2.6.3 Phương pháp cảm quan ............................................................................. 39 2.6.4 Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................... 39 Chương 3: KẾT QUẢN NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................ 40 3.1 Phân lập nấm men từ bánh men lá. ............................................................... 40 3.1.1 Đặc điểm các chủng nấm men khi nuôi tăng sinh ở môi trường Hansen lỏng 46 3.2 Khảo sát khả năng lên men của các chủng nấm men trên các môi trường ....... 49 3.2.1 Kết quả khảo sát khả năng lên men của các chủng nấm men NML01, NML02, NML03, NML04 ............................................................................................... 49 3.2.2 Khảo sát khả năng lên men của các dòng nấm men NML01(2), NML02(2) NML05(2) NML06(2), NML07(2), NML08(2), NML09(2), NML02(2), NML3, NML15, NML17 trên MT1. ............................................................................... 51 3.2.3 Khảo sát khả năng lên men của các dòng nấm men NML01(2), NML02(2) NML05(2) NML06(2), NML07(2), NML08(2), NML09(2), NML02(2), NML3, NML15, NML17 trên MT2. ............................................................................... 53 3.3 Kết quả định danh một số chủng nấm men đã phân lập .................................. 55 3.4 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men sản xuất rượu men lá ... 70 3.4.1 Khảo sát hàm lượng đường trong thời gian lên men ẩm .............................. 70 3.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ bánh men/ nguyên liệu đến khả năng sản xuất rượu .................................................................................................................. 73 3.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men ........................................... 77 3.4.4 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình lên men.......................................... 82 3.4.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ bổ sung chủng nấm men NML04 đến khả năng sản xuất rượu ............................................................................................ 87 3.4.6 Kết quả phân tích hàm lượng methanol, aldehyde, furfurol ......................... 93 3.4.7 Kết quả đánh giá cảm quan ........................................................................ 95 3.5 Đề xuất quy trình sản xuất rượu men lá ở quy mô phòng thí nghiệm .............. 96 3.5.1 Sơ đồ quy trình chế biến rượu men lá quy mô phòng thí nghiệm ................. 96 vii 3.5.2 Thuyết minh quy trình ............................................................................... 97 3.6 Tiến hành thử nghiệm trên mẫu lớn 8 kg gạo .............................................. 100 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 101 Kết luận .......................................................................................................... 101 Kiến nghị ........................................................................................................ 101 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 103 PHỤ LỤC viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ANOVA : Analysis of Variance A. niger : Aspergillus niger A. awamori : Aspergillus awamori A. flavus : Aspergillus flavus A. usami : Aspergillus flavus ATP : Adenosine Triphosphate ADP : Adenosine diphosphat S. cerevisive : Saccharomyces cerevisive M. circinilloides : Mucor circinilloides TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam CT : Công thức %v/v : Phần trăm thể tích AOAC : Association of Official Analytical Chemists - Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thống APC : Mức tiêu thụ rượu trên đầu người DNA : Deoxyribonucleic acid ĐC : Đối chứng EMP : Embden - Meyerhof – Parnas PTN : Phòng thí nghiệm TCN : Trước công nguyên TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam VSV : Vi sinh vật WHO : World Health Organization - Tổ chức Y Tế Thế Giới CoA : Coenzyme A CTAB : Cetryl trimethylammonium bromide DTA : Ethylene diamine tetra – acetic acid ix EtBr : Ethidium bromide ITS : Internal transcribed spacer MEGA : Molecular Evolutionary Genetics Analysis PCI : Phenol chloroform isoamine PCR : Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction) PDA : Potato D-glucose agar RNA : Ribonucleic acid Rnase : Ribonuclease SDS : Sodium dodecyl sulfate TEA 1X : Tris – acetat EDTA 1X NML 01 : Nấm men 1 (2) NML 05 : Nấm men 5 (2) NML 17 : Nấm men 17 x DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng nấm men phân lập được trên môi trường Hasen lỏng (30 0 C, 72 giờ)....................................................................... 41 Bảng 3.2. Đặc điểm nấm men khi tăng sinh trong môi trường Hansen lỏng (30 0C, 48 giờ) .............................................................................................................. 48 Bảng 3.3. Thời gian lên men của chủng nấm men NML04 .................................. 50 Bảng 3.4. Chiều cao cột khí CO2 (cm) sinh ra trong ống Durham sau 12, 14, 16,18 giờ nuôi cấy trên môi trường 1. .......................................................................... 52 Bảng 3.5. Chiều cao cột khí sinh CO2 (cm) sinh ra trong ống Durham sau 12, 14, 16, 18 giờ nuôi cấy trên môi trường 2. ................................................................ 54 Bảng 3.6. Kết quả trình tự các nucleotide của các chủng nấm nen NML01, NML02, NML03 NML04, NML01(2), NML05(2), NML17 .............................................. 57 Bảng 3.7. Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn gen ITS4-5 của chủng nấm NML01 phân lập được và trình tự nucleotide đoạn gen ITS4-5 công bố trên ngân hàng GenBank. .................................................................................................. 65 Bảng 3.8. Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn gen ITS4-5 của chủng nấm NML02 phân lập được và trình tự nucleotide đoạn gen ITS4-5 công bố trên ngân hàng GenBank ................................................................................................... 66 Bảng 3.9. Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn gen ITS4-5 của chủng nấm NML03 phân lập được và trình tự nucleotide đoạn gen ITS4-5 công bố trên ngân hàng GenBank. .................................................................................................. 67 Bảng 3.10. Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn gen ITS1-4 của chủng nấm NML04 phân lập được và trình tự nucleotide đoạn gen ITS1-4 công bố trên ngân hàng GenBank. .................................................................................................. 67 Bảng 3.11 Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn gen ITS4-5 của các dòng tế bào nấm men NML01(2), NML05(2), NML17 và trình tự nucleotide đoạn gen ITS4-5 công bố trên ngân hàng GenBank. ...................................................................... 68 Bảng 3.12. Hàm lượng đường khử theo thời gian của các công thức (%)............ 71 Bảng 3.13. Kết quả đánh giá cảm quan của sản phẩm rượu.................................. 76 Bảng 3.14. Kết quả đánh giá cảm quan của sản phẩm ......................................... 90 Bảng 3.15. Kết quả cảm quan của sản phẩm ....................................................... 92 Bảng 3.16. Kết quả phân tích các chỉ tiêu rượu thành phẩm ................................. 94 Bảng 3.17. Kết quả đánh giá cảm quan ............................................................... 95 xi Bảng 3.18. Kết quả thử nghiệm mẫu 8 kg gạo so với mẫu ở PTN ...................... 100 xii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Bánh men lá của vùng Ba Nang, Quảng Trị. .......................................... 3 Hình 1.2. Quy trình sản xuất bánh men lá ở Ba Nang, Quảng Trị........................... 5 Hình 1.3. Sơ đồ quy trình sản xuất rượu theo phương pháp truyền thống đã được thực hiện ở các vùng .......................................................................................... 19 Hình 1.4. Sơ đồ quy trình sản xuất rượu men lá .................................................. 22 Hình 2.1. Quy trình phân lập nấm men từ bánh men lá ........................................ 30 Hình 2.2. Quy trình sản xuất rượu men lá ........................................................... 33 Hình 3.1. Khuẩn lạc nấm men phân lập từ bánh men lá trên môi trường Hasen .... 40 Hình 3.2. Hình ảnh khuẩn lạc phân lập từ bánh men ở nồng độ 10-4 (A), nồng độ 10-5(B) và phân lập từ cơm ủ ở nồng độ 10-6 (C) sau khi nuôi cấy 48 giờ ở 300C ..................... 41 Hình 3.3. Hình dạng khuẩn lạc và tế bào của các dòng tế bào nấm men phân lập được. ................................................................................................................ 46 Hình 3.4. Các chủng nấm men khi nuôi ở môi trường Hansen lỏng (30 0C, 48 giờ); A. Chủng NML03, B. Chủng NML01, C. Chủng NML03, D. Chủng NML02. ..... 48 Hình 3.5. Các hình thức sinh sản của các chủng nấm men ................................... 49 Hình 3.6. Khảo sát các chủng nấm men trên các môi trường MT1, MT2, MT3 ..... 50 Hình 3.7 Chiều cao cột khí CO 2 (cm) sinh ra trong ống Durham sau 12, 14, 16, 18 giờ nuôi cấy trên môi trường 1 (theo thứ tự từ trên xuống dưới, từ trái sang phải). 51 Hình 3.8. Chiều cao cột khí CO2 (cm) sinh ra trong ống Durham sau 12, 14, 16, 18 giờ nuôi cấy trên môi trường 2 (theo thứ tự từ trên xuống dưới, từ trái sang phải). 53 Hình 3.9. Kết quả điện di tách chiết DNA tổng số ............................................... 56 Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen ITS4-5 và ITS1-4: hình A. sản phẩm PCR đoạn ITS4-5: giếng 1. chủng nấm NML01, giếng 2. chủng nấm NML02, giếng 3. chủng nấm NML03; hình B: sản phẩm PCR đoạn ITS1-4 giếng 4. chủng nấm NML04 ; hình C điện di sản phẩm PCR đoạn gen ITS4-5. giếng M. khối thượng thang chuẩn DNA; giếng NC. đối chứng âm không có khuôn mẫu DNA; giếng 1. dòng tế bào nấm men NML01(2); giếng 2. dòng tế bào nấm men NML05(2) và giếng 3. dòng tế bào nấm men NML17. ........................................ 56 Hình 3.11. Cây phả hệ di truyền của chủng NML01 so với một số chủng nấm men đăng kí trên ngân hàng GenBank ........................................................................ 69 xiii Hình 3.12. Cây phả hệ di truyền của chủng nấm men NML02 so với một số chủng nấm men đăng kí trên ngân hàng GenBank ......................................................... 69 Hình 3.13. Cây phả hệ di truyền của chủng nấm men NML03 so với một số chủng nấm men đăng kí trên ngân hàng GenBank ......................................................... 70 Hình 3.14. Cây phả hệ di truyền của chủng nấm men NML04 so với một số chủng nấm men đăng kí trên ngân hàng GenBank ......................................................... 70 Hình 3.15. Cây thể hiện mối quan hệ di truyền được xây dựng theo thuật toán Neighbor-Joining method (Saitou N. and Nei M. (1987) với độ lặp lại 1000 lần trên phần mềm Mega 7.0 .......................................................................................... 70 Hình 3.16. Biểu đồ thể hiện hàm lượng đường tổng trong quá trình lên men lỏng. 72 Hình 3.17. Ảnh hưởng của tỷ lệ bánh men đến sự thay đổi hàm lượng đường tổng và đường khử .................................................................................................... 73 Hình 3.18. Ảnh hưởng của tỷ lệ bánh men đến sự thay đổi nồng độ rượu ............. 74 Hình 3.19. Ảnh hưởng của tỷ lệ bánh men đến sự thay đổi acid và acid amin ....... 75 Hình 3.20. Hàm lượng đường tổng số và đường khử ở các mức nhiệt độ .............. 78 Hình 3.21. Hàm lượng acid tổng và acid amin ở các mức nhiệt độ ....................... 79 Hình 3.22. Hàm lượng rượu ở các mức nhiệt độ .................................................. 81 Hình 3.23. Sự biến đổi của hàm lượng đường tổng số và đường khử .................... 82 Hình 3.24. Sự biến đổi của hàm lượng acid tổng số và acid amin......................... 84 Hình 3.25. Sự biến đổi của giá trị pH theo thời gian lên men ............................... 85 Hình 3.26. Sự biến đổi hàm lượng rượu theo thời gian lên men ........................... 86 Hình 3.27. Ảnh hưởng của tỷ lệ bổ sung chủng nấm men NML04 đến sự thay đổi hàm lượng đường tổng và độ rượu...................................................................... 88 Hình 3.28. Ảnh hưởng của tỷ lệ bổ sung chủng nấm men NML04 đến sự thay đổi hàm lượng acid và acid amin .............................................................................. 89 Hình 3.29. Ảnh hưởng của tỷ lệ bổ sung nấm men đến sự thay đổi hàm lượng đường tổng và nồng độ rượu .............................................................................. 91 Hình 3.30. Ảnh hưởng của tỷ lệ bổ sung hai chủng nấm men đến sự thay đổi hàm lượng acid và acid amin ..................................................................................... 92 Hình 3.31. Quy trình sản xuất rượu men lá ......................................................... 96 Hình 3.32. Gạo Khang Dân ................................................................................ 97 Hình 3.33. Bánh men lá ..................................................................................... 97 Hình 3.34. Rượu thành phẩm ............................................................................. 99 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Uống rượu gắn liền với nét văn hóa ẩm thực của không chỉ người dân Việt Nam. Nếu như xứ Scotland tự hào về dòng wishky, người Pháp có cognac, Nga có vodka, Trung Quốc có Mao Đài, Nhật Bản có rượu Sake, Hàn Quốc có rượu Sochou thì Việt Nam chúng ta cũng rất tự hào về loại rượu nấu theo cách cổ truyền như: rượu nếp, rượu cần, rượu ngô, rượu sắn... Ở Việt Nam, nghề nấu rượu đã có từ lâu đời trong nhân dân. Ở miền núi, đồng bào dân tộc dùng gạo, ngô, khoai, sắn, nấu chín rồi lên men. Men giống được nuôi với một số lá rừng được gọi là men lá. Sau quá trình lên men và tiến hành cất rượu thì thu được sản phẩm là rượu trắng và nếu không qua chưng cất sản phẩm được gọi là rượu cần, một sản phẩm nổi tiếng ở vùng núi. Nghề nấu rượu ở nước ta từ trước đến nay vẫn dùng men giống ở dạng bánh men hoặc men lá. Trong các men này là một tập hợp các loại vi sinh vật có khả năng đường hóa tinh bột và lên men đường thành rượu. Mãi đến cuối thế kỷ XIX, các nhà sinh vật học Pháp Calmette, Boidin đã phân lập được một loài nấm mốc trong bánh men thuốc bắc, đặt tên là Murcor rouxii. Loài nấm mốc này phát triển tốt trên môi trường có gluxit, nhất là gạo, tích lũy phức hệ enzyme tương đối hoàn chỉnh, nên không những có khả năng phân giải tinh bột đạt hiệu suất cao mà còn có khả năng lên men đường thành rượu. Ở nước ta rượu được sản xuất ra theo nhiều phương pháp khác nhau (lên men khô tạo sản phẩm là rượu cần, sản xuất rượu không qua chưng cất tạo ra sản phẩm rượu vang, rượu qua chưng cất), trong đó phương pháp lên men rượu truyền thống bằng bánh men hiện nay vẫn được dân gian sử dụng nhiều tuy nhiên hiệu suất lên men cũng như chất lượng rượu ở nhiều vùng, nhiều địa phương còn chưa ổn định [12]. Một trong những nguyên nhân quan trọng gây lên sự không ổn định đó chính là chủng vi sinh vật lên men trong sản xuất rượu. Vì vậy cần thiết phải tuyển chọn những chủng vi sinh vật có hoạt lực đường hoá cao, hoạt lực lên men mạnh đồng thời bổ sung các loại lá với hàm lượng thích hợp để nâng cao hiệu suất lên men và chất lượng rượu thu được. Do vậy tôi thực hiện đề tài này để “Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men trong bánh men lá và bước đầu ứng dụng trong chế biến rượu”. Từ đó có cơ sở tạo ra loại rượu truyền thống mang đậm hương vị Việt Nam và sánh tầm với các loại rượu truyền thống của các nước trên thế giới. 2 2. Mục tiêu của đề tài  Phân lập được các chủng nấm men từ bánh men lá ở bản Đá Bàn thuộc tỉnh Quảng Trị.  Tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt lực cao trong sản xuất rượu đặc sản từ các chủng đã phân lập được.  Định danh chủng nấm men có hoạt lực cao.  Khảo sát khả năng lên men của chủng nấm men đã tuyển chọn.  Bổ sung nấm men đã tuyển chọn vào chế biến rượu men lá.  Đánh giá chất lượng rượu thành phẩm sau khi bổ sung nấm men đã được chọn vào quá trình lên men rượu truyền thống. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu 3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài Cung cấp thông tin về một số chủng nấm men có mặt trong bánh men lá địa phương và mô tả được hình thái, định danh một số chủng. 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Tạo cơ sở cho việc sản xuất bánh men lá và ứng dụng chủng nấm men vào sản xuất rượu men lá. 3 Chương 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan về bánh men Trong sản xuất rượu đặc sản dân tộc, bánh men cổ truyền đã được nhân dân ta sử dụng từ rất lâu ở các tỉnh đồng bằng để sản xuất “rượu ngang” (bằng bánh men thuốc bắc), ở các tỉnh miền núi để sản xuất rượu cần (bằng bánh men lá) từ nguyên liệu ngô, gạo, sắn. Men thuốc bắc được làm từ các vị thuốc bắc, còn men lá làm từ các cây thuốc nam 1.1.1 Khái quát về bánh men lá Bánh men lá được làm từ thành phần chính là lá rừng (trung bình sử dụng 10-12 loài cây trong men lá gồm: Riềng nếp, Kinh giới núi, Sài đất giả, Cà, Thiên niên kiện, Hoa sói, Nhân trần, Tu hú lá to, Lưỡi đắng bầu, Trầu không rừng, Dây dất, Bạch tu lá quế, Găng, Xuyên tiêu, Dây mật…) là những thành phần chính và cốt lõi để hình thành nên quả men. Các loại lá rừng khác nhau sẽ mang đến hệ vi sinh vật trong bánh men khác nhau và đưa đến mùi vị của sản phẩm rượu khác nhau. Chính vì thế, dù được gọi chung là “Rượu men lá” nhưng rượu được sản xuất ở các vùng miền khác nhau lại mang nét đặc trưng rất riêng của chúng. Vi sinh vật trong bánh men là cộng đồng phong phú của hệ vi sinh vật chuyển hóa đường, lên men rượu và các vi sinh vật khác. Hình 1.1. Bánh men lá của vùng Ba Nang, Quảng Trị. Vi sinh vật trong bánh men là cộng đồng phong phú của hệ vi sinh vật chuyển hóa đường, lên men rượu và các vi sinh vật khác, bao gồm: Nấm mốc gồm có Aspergillus oryzae, A. flavus, A. awamorii, A. usami, A. niger 4 (giống Aspergillus chiếm phần lớn), Mucor (M. Circinilloides), Rhizopus, Penicillium và Amylomyces rouxii... Nấm mốc đóng vai trò sinh enzyme amylase đường hóa tinh bột. Khi đường hóa hệ enzyme trong nấm mốc thường ít α - amylase và nhiều β - amylase, vì vậy đường tạo thành chủ yếu là maltose và các dextrin cuối (cũng có thể lên men được). Một số chủng Mucor có khả năng sinh tổng hợp hai hệ enzyme diastase đường hóa tinh bột và lên men rượu từ đường. Vì vậy,chúng ta có thể lên men trực tiếp từ tinh bột thành rượu. Mucor rouxii sinh ra nhiều rượu hơn một số loài khác và được dùng nhiều trong men rượu. Hơn nữa, khi có mặt Mucor và Rhizopus thì lên men rượu có mùi thơm rất dễ chịu.. Nấm men chủ yếu là Saccharomyces cerevisiae. Ngoài ra còn thấy có Hyphopichia burtonii, Pichia anomada, Candida...những men này coi như là men dại, men tạp có lẫn trong bánh men và chúng ta không mong muốn. Nấm men rượu chuyển hóa đường thành rượu. Trong bánh men ta còn thấy có loài men giả là Endomycopsis fibuliger. Giống Endomycopsis tương tự như nấm men nhưng có thể mọc sợi, có khả năng sinh nhiều glucoamylase và thủy phân tinh bột thành đường glucose. Đặc biệt trong hệ enzyme do giống này sinh ra ưu việt hơn nấm mốc là có ít enzyme transglucosidase. Có mặt enzyme này một phần glucose chuyển thành acid gluconic. Hơn nữa, enzyme lấy từ chế phẩm nuôi Endomycopsis không có mùi mốc làm cho hương vị của rượu thành phẩm thơm ngon. Vì vậy trong nghề làm rượu người ta rất muốn giống này để cùng Aspergillus, Mucor và Rhizopus đường hóa tinh bột theo Lương Đức Phẩm (2009) [19]. Vi khuẩn: thường thấy có mặt vi khuẩn lactic, vi khuẩn acetic... Nói chung, vi khuẩn có mặt ở đây đều là vi khuẩn tạp nhiễm, ta không mong muốn. 5  Quy trình sản xuất bánh men lá: Gạo nếp Rễ , lá cây Ngâm Vỏ Để ráo Giã nhuyễn Xay Trộn Bột nếp Vo viên Phơi Xâu dây Bánh men Hình 1.2. Quy trình sản xuất bánh men lá ở Ba Nang, Quảng Trị  Thuyết minh quy trình Nguyên liệu để sản xuất bánh men lá bao gồm những loại lá cây như: Riềng nếp, Kinh giới núi, Sài đất giả, Cà, Thiên niên kiện, Hoa sói, Nhân trần, Tu hú lá to, Lưỡi đắng bầu, Trầu không rừng, Dây dất, Bạch tu lá quế, Găng, Xuyên tiêu, Dây mật, tán tiêu, mặt cờn, piêng prase... và rễ cây như: a moi, a sơn, pum loác... Bằng kinh nghiệm đúc rút qua nhiều thế hệ người dân đã đưa ra được cách lấy số lượng của các loài cây một cách phù hợp nhất để có thể làm được men lá có chất lượng tốt nhất. Theo những người có kinh nghiệm lâu năm trong việc sử dụng men lá cho biết thì tất cả các loài cây khác đều được lấy theo tỉ lệ 1:1 (tính theo khối lượng) Các loại lá, quả, thân, vỏ của cây rừng dùng làm men lá sau khi đào hái mang về rửa thật sạch hong khô sau đó phân loại thành từng nhóm khác nhau tùy theo bộ