Tài liệu Luan van2.10

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Rừng là tài nguyên vô cùng quý giá của mỗi quốc gia - rừng là nơi sản sinh, dự trữ và tái tạo vật chất. Rừng Việt nam khá đa dạng và phong phú, nhưng nguồn tài nguyên này đã và đang bị khai thác không hợp lý dẫn đến những hậu quả nguy hại như lũ lụt, hạn hán, xói mòn, rửa trôi…Để giảm thiểu những tác hại đó việc trồng rừng phủ xanh đất trống đồi núi trọc, nâng cao chất lượng rừng hiện có là một công việc rất quan trọng. Đảng và nhà nước ta đã có chủ trương luôn khuyến khích, quan tâm đầu tư xây dựng các chương trình dự án trồng rừng, cải tạo và tái sinh phục hồi rừng nhằm phục hồi lại tài nguyên rừng đang bị suy thoái trầm trọng. Theo thống kê hiện nay của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, nước ta có khoảng 21 triệu ha đất canh tác nông - lâm nghiệp. Trong đó phần lớn là đất có hàm lượng dinh dưỡng thấp, đặc biệt có tới 9,34 triệu ha đất hoang hoá, trong đó có khoảng 7,85 triệu ha chịu tác động mạnh bởi sa mạc hoá, chủ yếu là đất trống, đồi núi trọc, bạc màu [9]. Trong canh tác, việc bón phân vô cơ cho cây trồng vùng lập địa khô cằn nghèo chất dinh dưỡng đã làm cho đất ngày càng bị suy kiệt và thoái hoá, cây trồng suy giảm về năng suất, chất lượng sản phẩm thấp. Đặc biệt rừng trồng thường được trồng trên các lập địa có pH thấp, vi sinh vật có lợi thì nghèo, ngược lại vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng lại nhiều. Bạch đàn và thông là hai loài cây đã được chọn và trồng thuần loài khá phổ biến ở nước ta, là những cây chủ lực trong trồng rừng phủ xanh đất trống đồi núi trọc và trồng rừng nguyên liệu. Thông là loài cây đa tác dụng, ngoài việc lấy gỗ thông còn cho nhựa, về mặt sinh thái môi trường thông có hình dáng tán đẹp nên thích hợp trồng ở các vùng du lịch sinh thái, khu di tích, đền chùa….Chính vì vậy diện tích trồng thông chiếm tỷ lệ cao nhất trong tổng diện tích rừng trồng ở nước ta [9]. Bạch đàn là loài cây mọc nhanh, ưa sáng 2 có chu kỳ kinh doanh ngắn thích hợp cung cấp nguyên liệu gỗ nhỏ và lấy tinh dầu. Trong điều kiện khí hậu nóng ẩm ở nước ta dịch bệnh đối với thông và bạch đàn đang lan rộng ở hầu hết các tỉnh, thêm vào đó chúng lại được trồng thuần loài trên các lập địa nghèo thoái hóa, càng tạo điều kiện cho sâu bệnh phát triển. Vì vậy việc chăm sóc bảo vệ rừng thông và bạch đàn đang được đặc biệt quan tâm, nhằm tìm ra những biện pháp phòng trừ có hiệu quả đảm bảo về mặt kinh tế và sinh thái. Sử dụng nấm ngoại cộng sinh để tạo cây con có chất lượng cao cho trồng rừng vì nấm cộng sinh không những giúp cây sinh trưởng phát triển tốt, phân giải các chất khó tiêu thành dễ tiêu, không ảnh hưởng đến môi trường sinh thái mà còn làm tăng tính đa dạng của quần thể sinh vật [34]. Từ trước đến nay chưa có tài liệu điều tra đầy đủ về nấm ngoại cộng sinh cho bạch đàn và thông. Do vậy việc điều tra thành phần loài nấm cộng sinh cho bạch đàn và thông, phân lập thuần khiết một số loài nấm ngoại cộng sinh để tuyển chọn loài, chủng có hiệu lực cộng sinh cao và ứng dụng sau chúng trong sản xuất cây con và trồng rừng trên các lập địa thoái hóa nghèo chất dinh dưỡng là rất cần thiết.[14] Từ những lý do trên tác giả tiến hành đề tài “Nghiên cứu các loài nấm ngoại cộng sinh với Bạch đàn và Thông tại Đại Lải – Vĩnh Phúc” để có thể đưa ra danh lục các loài nấm ngoại cộng sinh và danh lục các loài cộng sinh có thể phân lập nuôi cấy trên môi trường nhân tạo, nhằm đáp ứng được nhu cầu tạo ra những cây con chất lượng cao cho công tác trồng rừng. 3 Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Trên thế giới Trên thế giới đã và đang có rất nhiều nước quan tâm nghiên cứu ứng dụng nấm ngoại cộng sinh vào sản xuất nông lâm nghiệp. Theo kết quả các nghiên cứu cho thấy vai trò và ý nghĩa của nấm ngoại cộng sinh đối với sinh trưởng và phát triển của cây con trong các điều kiện có khác nhau. Ở Mỹ, từ hai thập kỷ qua, các nhà khoa học Nông-Lâm thuộc Viện Nghiên cứu và phát triển nấm (IRMD) đã tiến hành nghiên cứu xác định vai trò và ý nghĩa của nấm ngoại cộng sinh với sinh trưởng và phát triển của cây con trong các điều kiện khác nhau. Hầu hết các công trình đều tập trung nghiên cứu về nấm Pisolithus tinctorius bởi lẽ tính thích ứng của nó với nhiều vùng sinh thái, nhiều loài cây chủ, có khả năng chống chịu tốt với điều kiện bất lợi của môi trường và hệ sợi của nó dễ nuôi cấy trong môi trường nhân tạo (Schramm, 1966; Marx, 1980, 1981; Marx và cộng sự 1984).[24] Chế phẩm nấm cộng sinh Pt được sản xuất theo công thức đã được thương mại hóa và việc nhiễm chế phẩm cho cây con đã được sử dụng trên quy mô lớn. Các công trình nghiên cứu mới đây khẳng định các loại chế phẩm này có khả năng cộng sinh cao và làm tăng sinh trưởng của cây trồng. Theo Marx và cộng sự năm 1989: Bào tử nấm Pt thu được từ thể quả của nấm ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, cộng sinh với nhiều loài cây chủ đã tạo cho chế phẩm bằng bào tử có tính đa dạng về mặt sinh học hơn chế phẩm bằng hệ sợi. Năm 1989 hơn 8 triệu cây con đã được nhiễm chế phẩm bằng hệ sợi và nhiều triệu cây con đã được nhiễm chế phẩm bằng bào tử.[18] Ở Pháp đã tiến hành nhiễm nấm ngoại cộng sinh cho các cây con vườn ươm nhằm 2 mục đích: tăng sinh trưởng của cây, nâng cao hiệu quả của việc trồng rừng và nâng cao khả năng sản xuất nấm ăn (Le Tacon và cộng sự năm 4 1988). Quy trình sản xuất chế phẩm và nhiễm nấm cho cây con cũng tương tự như ở Mỹ. Từ năm 1973 các cây con được nhiễm nấm cộng sinh phục vụ cho việc trồng rừng đã được sản xuất ở các vườn ươm quy mô lớn và mang tính thương mại. Quy trình lên men công nghiệp đã áp dụng thành công trong việc sản xuất chế phẩm bằng hệ sợi.[33] Các kết quả thí nghiệm nhiễm nấm cộng sinh cho các loài cây con ở vườm ươm đã được Le Tacon và cộng sự tổng kết năm 1988. Hầu hết các công trình nghiên cứu đều tập trung vào một số loài cây đặc biệt là loài cây lá kim. Các loài nấm cộng sinh được chú ý nhiều là Pisolithus tinctorius, Laccaria laccata và Laccaria bicolor. Ở Canađa các công trình nghiên cứu về sản xuất chế phẩm và nhiễm chế phẩm cho cây con ở vườn ươm cũng tập trung vào các loài cây lá kim với các loài nấm như Pisolithus tinctorius; Laccaria laccata và Laccaria bicolor. [42]Từ năm 1992 Canađa đã xây dựng một kế hoạch lớn là sản xuất đủ chế phẩm nấm cộng sinh để cung cấp cho các cơ sở sản xuất cây con trong phạm vi toàn quốc. Ở Philippin, De La Cruz và cộng sự đã sản xuất chế phẩm nấm cộng sinh dưới dạng viên nén bằng bào tử của các loại nấm Pisolithus tinctorius và Scleroderma spp. để nhiễm cho các loài cây lá kim và các loài bạch đàn. Sau 3 tháng nấm và rễ cây đã thiết lập mối quan hệ cộng sinh với tỷ lệ khá lớn. Đặc biệt với cây được trồng trên các loại đất nghèo chất dinh dưỡng và có hàm lượng nhôm tự do cao. Cây con 16-18 tháng tuổi được nhiễm chế phẩm có đường kính tăng hơn so với đối chứng là 75%.[38]Hiện nay chế phẩm bằng viên nén này đang được dùng rất phổ biến ở Philippin. Trong những năm 1970, ở Venezuela người ta sử dụng lớp đất mặt của các rừng trồng đã khép tán trộn với đất của vườn ươm để tạo ruột bầu sản xuất cây con. Nguồn nấm cộng sinh chủ yếu là Thelephora terrestric có trong tự nhiên. Từ đầu năm 1980, bào tử nấm Pisolithus tinctorius được đưa về từ 5 bang Georgia của Mỹ đã được sử dụng để nhiễm cho cây con các vườn ươm. Hiện nay thể quả nấm P.tinctorius được thu hái ở các vườn ươm đã đủ để sản xuất mỗi năm 100 triệu cây con phục vụ cho chương trình trồng rừng của quốc gia.[10] Thông thường có ba dạng chế phẩm nấm cộng sinh: - Chế phẩm từ đất rừng (soil inoculum): nguồn nấm cộng sinh hoàn toàn từ tự nhiên, tồn tại trên lớp đất mặt của rừng, người ta thu lớp đất mặt trộn với đất của vườn ươm tạo ruột bầu để gieo cây. Hình thức tạo chế phẩm này rất đơn giản, ít tốn kém song cũng có hiệu quả nhất định; tuy nhiên có rất nhiều những bất lợi được kể đến như: phá vỡ hệ sinh thái của tầng đất mặt, nguồn nấm cộng sinh không được tuyển chọn, hiệu lực thấp và mang theo nguồn bệnh từ rừng về vườn ươm. - Chế phẩm bằng bào tử (spore inoculum): Những năm 80 và đầu năm 90 các nước như Mỹ, Canađa đã sử dụng bào tử hữu tính nấm cộng sinh được trộn với chất mang tạo thành chế phẩm; chế phẩm này có hiệu quả cao trong việc tăng sinh trưởng cho cây trồng.[32] Những năm sau đó và hiện nay bào tử của nấm được trộn với chất mang và đất sét dập thành viên nén. Chế phẩm dạng viên nén này đã làm tăng tỷ lệ nhiễm nấm cộng sinh với cây chủ vì viên nén có tác dụng duy trì và đảm bảo cho bào tử của nấm cộng sinh tồn tại trong đất lâu hơn ngay cả khi gặp điều kiện khô hạn. - Chế phẩm bằng hệ sợi (mycelial inoculum): Các nước tiên tiến hiện nay đang áp dụng chế phẩm bằng hệ sợi nấm cộng sinh. Hệ sợi nấm cộng sinh được nuôi cấy trên môi trường rắn là than bùn, vermiculite được làm ẩm bằng môi trường dinh dưỡng MMN. Chế phẩm này có rất nhiều ưu điểm như có khă năng sản xuất lớn, hiệu quả cộng sinh cao, những cũng có nhược điểm là rất dễ bị các sinh vật hoại sinh tấn công chế phẩm khi bón cho cây trồng để sử dụng nguồn dinh dưỡng còn thừa khi nuôi cấy hệ sợi dẫn đến sợi nấm dễ bị chết trước khi 6 hình thành mối quan hệ cộng sinh với cây chủ.[26] Một dạng khác của chế phẩm bằng hệ sợi là chế phẩm sợi nước (mycelial sluries). Dạng chế phẩm này cũng có thể sản xuất quy mô công nghiệp bằng nuôi cấy sợi nấm trên môi trường dinh dưỡng lỏng và định kỳ lắc trên máy lắc để cắt ngắn sợi nấm. Tuy nhiên cũng giống như chế phẩm dạng rắn là dinh dưỡng của quá trình nhân sinh khối hệ sợi vẫn còn sinh vật hoại sinh dễ tấn công và giết chết sợi nấm. Một dạng khác nữa của hệ sợi là chế phẩm dạng nang (alginate beads). Nuôi cấy sợi nấm trên môi trường dinh dưỡng lỏng thu hệ sợi, xay nhỏ và trộn với dung dịch sodium alginate cố định viên trên CaCl2.[41]Sợi nấm được bao bọc trong một thể dạng keo và hoàn toàn tránh được những bất lợi dạng chế phẩm rắn và lỏng. Dạng chế phẩm nang đang được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới. 1.2. Ở Việt Nam Ở Việt Nam đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về nấm cộng sinh. Nguyễn Sỹ Giao và các đồng nghiệp trong giai đoạn 1970 đến 1985 đã thực hiện các nghiên cứu chủ yếu về thành phần loài nấm cộng sinh với các loài thông, nghiên cứu phân lập và bước đầu nghiên cứu sản xuất chế phẩm nấm cộng sinh để nhiễm cho cây con ở vườn ươm chống bệnh vàng còi.[6] Từ năm 1996 đến 2004, Phạm Quang Thu và cộng sự tiếp tục nghiên cứu về nấm cộng sinh cho cây thông và bạch đàn, đề tài đã đi vào nghiên cứu sản xuất chế phẩm nấm ngoại cộng sinh và đã xây dựng được quy trình sản xuất chế phẩm nấm ngoại cộng sinh ở dạng bột chứa bào tử hữu tính nấm Pisolithus tinctorius và một số vi sinh vật chức năng khác. Chế phẩm dạng này đã được một số cơ sở sản xuất mua và sử dụng nhiễm cho bạch đàn PN 2 gây trồng trên các lập địa thoái hoá, rất nghèo chất dinh dưỡng, cho kết quả sinh trưởng về đường kính và chiều cao khác biệt rõ rệt với công thức đối chứng. Hiện nay có khoảng hơn 1000 ha bạch đàn được nhiễm chế phẩm nấm 7 cộng sinh trồng tại một số khu vực thuộc công ty Lâm nghiệp Đông Bắc ở tỉnh Bắc Giang và Lạng Sơn.[7] Về vấn đề vai trò của nấm cộng sinh đối với cây trồng cũng được quan tâm và chú ý từ rất lâu. Quy trình kỹ thuật gieo ươm thông do Bộ Lâm Nghiệp nay là Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn ban hành năm 1983 đã quy định tiêu chuẩn, chất lượng cây thông con khi xuất vườn phải có nấm rễ. Việc ứng dụng nấm cộng sinh trong sản xuất cây thông con ở vườn ươm ở các cơ sở sản xuất đều sử dụng lớp đất mặt của các rừng trồng thông đã khép tán trộn với đất đóng bầu nhằm lây nhiễm nguồn nấm cộng sinh có trong tự nhiên. Cách thức này đơn giản song nó cũng gây ra không ít những điểm bất lợi như: khi đào bới lớp đất mặt đã ảnh hưởng đến môi trường sống của các rừng trồng đang khép tán, mang theo không ít nguồn bệnh sẵn có trong tự nhiên; nguồn nấm cộng sinh không được tuyển chọn, hiệu quả không cao. [3] Chế phẩm nấm cộng sinh đã được thử nghiệm ở vườn ươm cho cây thông, bạch đàn, keo, phi lao ở vườn ươm và cho bạch đàn ở rừng trồng bước đầu đã có kết quả tốt. Sinh trưởng về chiều cao và trọng lượng tươi, khô của cây con ở vườn ươm ở các công thức thí nghiệm đều lớn hơn so với công thức đối chứng; ở rừng trồng sinh trưởng có sự khác biệt giữa công thức thí nghiệm và công thức đối chứng được thể hiện rõ trên các lập địa rất nghèo chất dinh dưỡng. [1] 1.3. Rễ nấm cây bạch đàn Căn cứ vào thống kê chưa đầy đủ thì bạch đàn có hơn 700 loài, phân bố chủ yếu nhiều nơi ở Úc, Indonesia, Philippin, Châu Á, Nam Phi. Vào khoảng năm 1900 nước ta nhập giống bạch đàn.[44]Ngày nay bạch đàn đã được trồng khắp đất nước với nhiều loài và dòng khác nhau. Năm 1917 người ta đã phát hiện bạch đàn có nấm rễ, nhưng đến thập kỷ 50 mới được chú ý (Malajczuk, 1991).[39] Cây bạch đàn không chỉ có rễ nấm mà còn có các loại nấm ngoại cộng sinh, nấm nội cộng sinh và rễ nấm hỗn 8 hợp. Pryor (1956) phát hiện lấy đất tầng mặt để chăm sóc cây con bạch đàn hoặc dùng bột bào tử nấm cổ ngựa vỏ cứng (Scleroderma flavidum Ell.Et.) rắc lên luống cây con đều có thể xúc tiến sinh trưởng cây con. Sau đó Redell (1988) Garbaye (1988) Malacuk (1993) và Bougher (1994) đã tiến hành nghiên cứu chứng minh sự tồn tại các kiểu rễ nấm và chứng minh tác dụng xúc tiến sinh trưởng của rễ nấm bạch đàn.[23] Trung Quốc nghiên cứu rễ nấm bạch đàn vào các năm 1985, 1986, 1989, 1991, 1994 (Gong, 1998).[13] Gong đã nghiên cứu rễ nấm ngoại cộng sinh, nấm nội cộng sinh, phân lập giống nấm, công nghệ cấy nấm chế tạo chế phẩm, thí nghiệm trên vườn ươm và ứng dụng ngoài đồng ruộng đã thu được kết quả nhất định. Theo nghiên cứu của Malajzuk (1993) [25] nấm rễ bạch đàn có 400 loài thuộc 81 chi ở vùng nguyên sản Úc, trong đó có nhiều loài mới. Ở Irac đều có thông báo nghiên cứu. Ở Thái Lan đã phát hiện trong rừng trồng bạch đàn nấm rễ ngoại cộng sinh có 19 loài, 10 chi, 9 họ, chủ yếu là nấm cổ ngựa vỏ cứng (Scleroderma) nấm mỡ đỏ (Russula), và các loại khác như Tylopilus rubrobrunneus; Thelephora ramarioides; Amanita sp. Theo điều tra của Gong (1994) ở 4 tỉnh phía nam Trung Quốc có 22 loài nấm ngoại cộng sinh. Trong đó các loài Pisolithus tinctorius, Scleroderma polyrhizum, Scleroderma cepa, Cantharellus minor và Laccaria amethystea, thường thấy ở Quảng Đông, Quảng Tây, ở Vân Nam thường có Rhizopogon luteolus và Pisolithus microcarpus.[22] Garbaye (1988) đã dùng 6 loài nấm rễ nhiễm cho cây con bạch đàn, sau 4 năm lượng sinh trưởng tăng 26-30%. Bougher (1990) cũng cho biết trong điều kiện đất thiếu P cây con bạch đàn sau khi bón nấm mỡ sáp (Laccaria laccafae) trọng lượng khô cây con tăng 21 lần. [31]Gong (1995) cho biết dùng bột bào tử nấm cổ ngựa đậu màu (Pisolithus tinctorius) bón cho cây con bạch đàn nâu Eucalyptus urophylla sau 2 năm rừng trồng cao hơn đối chứng 9 14,3%, đường kính tăng 13,7%, mỗi ha rừng tăng lên 3,12m 3 so với đối chứng.[19] Chế phẩm nấm rễ đã được sản xuất ở dạng dịch thể bằng phương pháp thủ công tại phòng nấm của trung tâm môi trường và phát triển lâm nghiệp bền vững, trường Đại học Lâm Nghiệp, đã bón cho cây con thông và bạch đàn. Trong 2 năm nghiên cứu đã bước đầu thấy hiệu quả tăng lên trung bình là 1,5 lần sau 2 tháng thí nghiệm.[6] Các loài nấm được sử dụng là nấm cổ ngựa vỏ cứng nhiều rễ (Scleroderma polyrhizium) nấm cổ ngựa đậu màu (Pisolithus tinctorius) nấm mỡ sáp tím (Laccaria amethystea). Các loài nấm này mọc rất phổ biến trong rừng thông và bạch đàn ở nước ta. Điều này hy vọng rằng, dùng nấm cộng sinh ở địa phương tạo ra chế phẩm bón cho cây con ở vườm ươm có thể làm tăng sinh trưởng cây trồng, phát huy tác dụng chống chịu bệnh và chống chịu khô hạn trong điều kiện Việt Nam.[7] Rõ ràng nấm cộng sinh có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng cây con và có tiền đề phát triển, nhiều vấn đề cần được tiếp tục nghiên cứu, công nghiệp rễ nấm cộng sinh bạch đàn ở nước ta sẽ được phát huy tác dụng trong thực tiễn sản xuất. 1.4. Rễ nấm thông Căn cứ vào thống kê các loài cây: thông đuôi ngựa, thông Caribaea, thông eliotii, thông 3 lá đã có 168 loài nấm rễ. Trong đó chi nấm đỏ (Russula); nấm sữa (Lactarius); nấm gan bò (Boletus); nấm gan bò sữa (Suillus); nấm màng sợi (Cortinarius) đều là những loài nấm mọc trên rễ thông.[17] Ngày nay việc nghiên cứu nấm cộng sinh Thông caribaea đã được tiến hành, chủ yếu có các loài nấm cổ ngựa vỏ cứng (Scleroderma cepa); nấm cổ ngựa vỏ cứng nứt hình sao (S. polyrhizum); nấm bụng đen bóng (Rhizopogon piceus). Trên cây thông 3 lá (Pinus kesiya) có nấm nhung thông (Tricholoma 10 matsutake); nấm trải (Thelephora ganbajun); nấm hồng (Russula virescens) và các loài thuộc chi Lactarius; Amanita; Cantharellus; Rhizopogon.[37] Tóm lại: Nấm cộng sinh đã được ứng dụng rộng rãi trong lâm nghiệp và các ngành trồng trọt khác. Hiệu quả của chúng đã và đang được nghiên cứu ở rất nhiều nước trên thế giới. Bạch đàn và thông là hai loài cây chủ đạo được lựa chọn rất nhiều trong các chương trình và dự án trồng rừng. Đã có nhiều công trình nghiên cứu mang lại kết quả cao công tác ứng dụng nấm cộng sinh vào trồng rừng và tạo chế phẩm nấm cộng sinh rất phát triển. Ở Việt Nam hiện nay đã có một số tác giả nghiên cứu về nấm ngoại cộng sinh và đã có nhiều kết quả nghiên cứu khả quan. Nhưng việc điều tra chưa đi sâu và phạm vi điều tra chưa rộng. Chưa tìm ra được nhiều loài nấm ngoại cộng sinh. Các công trình nghiên cứu có kết quả cần được áp dụng rộng rãi trong trồng rừng. Đề tài nghiên cứu nhằm mục đích thu thập lưu trữ nguồn nấm ngoại cộng sinh cho việc sản xuất chế phẩm sau này. 11 Chương 2 MỤC TIÊU - ĐỐI TƯỢNG - ĐỊA ĐIỂM - THỜI GIAN NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu - đối tượng - thời gian và địa điểm nghiên cứu 2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu - Lập khóa phân loại lên danh mục nấm ngoại cộng sinh với bạch đàn và thông. - Bước đầu tìm hiểu sự hình thành rễ nấm của một số loài nấm phân lập được với cây chủ bạch đàn. - Tuyển chọn được loài nấm ngoại cộng sinh có hiệu lực với bạch đàn. 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là các loài nấm ngoại cộng sinh với cây bạch đàn và thông. (loài bạch đàn nghiên cứu ở đây là bạch đàn uro (Eucalyptus urophylla); loài thông nghiên cứu ở đây là thông mã vĩ (Pinus massoniana) và thông nhựa (Pinus merkusii)). 2.1.3. Giới hạn phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu - Điều tra nấm ngoại cộng sinh với bạch đàn và thông ở Đại Lải – Vĩnh Phúc. - Địa điểm nghiên cứu: Thu thập mẫu tại Đại Lải – Vĩnh Phúc. Những mẫu thu thập được mang về Phòng thí nghiệm Nghiên cứu bảo vệ thực vật rừng của Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam phân lập, giám định, tuyển chọn và lưu trữ. - Thời gian nghiên cứu thực hiện từ 01/12/2006 đến 15/9/2007. 2.2. Nội dung nghiên cứu - Điều tra thành phần loài nấm ngoại cộng sinh với bạch đàn và thông. - Một số đặc điểm hình thái, giải phẫu của nấm ngoại cộng sinh. - Phân lập nuôi cấy nấm ngoại cộng sinh thuần khiết trong phòng thí nghiệm trên môi trường MMN và PDA. 12 - Đặc điểm sinh trưởng của hệ sợi các loài nấm cộng sinh trong nuôi cấy thuần khiết. - Đặc điểm hình thành rễ nấm đối với một số loài nấm phân lập được đối với cây chủ bạch đàn trong thí nghiệm invitro. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Điều tra thu mẫu 2.3.1.1. Điều tra chung Điều tra chung là một phương pháp áp dụng khi tài liệu không nhiều, tình hình thành phần loài nấm cộng sinh không rõ. Yêu cầu điều tra không cần chính xác, tính ngẫu nhiên lớn, nhưng diện điều tra phải rộng, có tính đại diện tương đối. Loài điều tra này có thể kết hợp với điều tra tài nguyên rừng, tài nguyên thực vật, điều tra đất. Thời gian điều tra nên chọn vào đầu mùa mưa, mùa hình thành nhiều thể quả, để thu nhiều thể quả nấm. Nội dung điều tra bao gồm loài nấm, độ nhiều và tình hình nhiễm nấm rễ các cây, các số liệu liên quan như điều kiện lập địa, địa mạo, địa chất, thực bì rừng, loài cây chủ... đều phải ghi đầy đủ, lúc cần phải thu một ít mẫu nấm ghi vào biểu điều tra (phụ biểu 2.1) Điều tra chung mang tính khái quát giúp cho việc chọn điểm để điều tra có tư liệu cụ thể và có thể thu một số mẫu có thể.[5] 2.3.1.2. Điều tra trọng điểm Trên cơ sở điều tra chung tiến hành điều tra trọng điểm, điều tra trọng điểm cần thiết lập ô tiêu chuẩn, độ lớn ô tiêu chuẩn tuỳ theo diện tích rừng; nếu diện tích rừng trên 5ha nên thiết kế ô dạng bản 2x2m. Nói chung tổng diện tích ở dạng bản không nhỏ hơn ô tiêu chuẩn 1%. Cách sắp xếp ô dạng bản có thể ngẫu nhiên, ô bàn cờ hay kiểu hoa mai, các ô dạng bản đều được đánh số thứ tự. Điều tra trọng điểm được tiến hành định kỳ, theo mùa nói chung mùa không mưa thì 15-20 ngày quan sát lấy mẫu 1 lần, mùa mưa rút ngắn 5-10 ngày 13 một lần. Bởi vì thể quả nấm thường xuất hiện vào mùa mưa, biến đổi chủng loại rất lớn, thời gian tồn tại trên đất ngắn, thời gian giãn cách dài sẽ ảnh hưởng đến kết quả.[5] Nội dung điều tra thành phần loài cần điều tra chủng loại thể quả, tập tính sinh trưởng sinh thái, độ nhiều quan hệ với bộ rễ, loài cây chủ, tuổi cây là những nội dung quan trọng, trong đó việc xác lập quan hệ rễ nấm là rất quan trọng; bởi vì thể quả nấm trong rừng không nhất thiết là nấm cộng sinh, có cả hoại sinh và ký sinh, muốn xác định quan hệ rễ nấm phải tiến hành kiểm tra dấu vết bó sợi, phải đào từ gốc thể quả bỏ đất cát, căn cứ vào bó sợi đào tiếp cho đến khi phát hiện chúng nối liền với rễ cây mới chứng minh bước đầu có quan hệ cộng sinh. [1] Cũng có nấm không hình thành bó sợi hoặc có hình thành bó sợi nhưng khó phát hiện bằng mắt thường, thì phải tiến hành giải phẫu rễ để quan sát, đối với mẫu nấm thu hái được cần phải ghi chép các mục ở phụ biểu 2.2 Tần suất xuất hiện của loài nấm cộng sinh được chia làm 3 cấp: rất phổ biến (ký hiệu +++) có trên 50% số lần điều tra thu được mẫu, khá phổ biến (ký hiệu ++) có từ 30 đến 50% số lần điều tra thu được mẫu của nấm và ít phổ biến (ký hiệu +) có dưới 30% số lần điều tra thu được mẫu nấm của loài. Nội dung điều tra là mô tả những đặc điểm nhận biết nấm, đặc điểm phân bố, loài cây chủ, tuổi cây là quan trọng, trong đó việc xác lập quan hệ nấm với cây chủ thông qua kiểm tra dấu vết bó sợi.[46] 2.3.2. Giám định mẫu Quan sát dưới kính hiển vi và kính soi nổi mô tả đặc điểm hình dạng, màu sắc, kích thước bào tử, sợi nấm, sẹo, thể sợi nấm đối chiếu với mô tả của các tác giả Mark Brundrett, Neale Bougher, Bernie Dell, Tim Grove và Nick Malajczuk, năm 1996, [30] để định danh các loài nấm ngoại cộng sinh. Lập khóa phân loại lên danh lục dựa theo cách phân loại của các tác giả Kendrick (1992) [35]và Hawksworth et al. (1995). [45] 14 2.3.3. Nghiên cứu hình thái, giải phẫu rễ nấm Dưới kính soi nổi tiến hành chụp ảnh, mô tả đặc điểm hình thái bên ngoài về mầu sắc tán nấm, phiến nấm, cuống nấm, các dấu hiệu như vòng nấm, bao nấm, tàn dư trên tán nấm,...[36][12] Sử dụng các dụng cụ như kính hiển vi, lam kính, lamen, dung dịch shear để soi bào tử, chụp ảnh và mô tả bào tử của nấm. 2.3.4. Phân lập nấm ngoại cộng sinh - Môi trường phân lập nấm ngoại cộng sinh là môi trường MMN, PDA Môi trường MMN (Modified Melin Norkans medium) (Marx 1969)[30] Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) (Difco Laboratories 1953) [41] - Máy móc để phân lập: Tủ cấy nấm Sanyo, tủ định ôn Sanyo, tủ lạnh Sanyo, tủ sấy, bếp điện, nồi hấp Hyrayama, máy ảnh Olympus 3.3, kính hiển vi soi nổi Olympus SZ-PT, kính hiển vi olympus BX50. - Dụng cụ để phân lập: Đèn cồn, que cấy nấm, hộp petri, ống nghiệm, bông, băng cuốn hộp petri, dao, bút ghi thủy tinh… - Môi trường cần thiết để phân lập dựa trên hai môi trường MMN và môi trường PDA. Với các môi trường này sau khi pha xong được hấp khử trùng ở 121oC trong thời gian 20 phút sau đó mới đổ vào các hộp lồng vô trùng.[27] Phân lập từ thể quả nấm ngoại cộng sinh: Chọn mô nấm thường ở nối cuống và tán, chọn tươi mới, non chưa xoè tán, không bị sâu bệnh. Sau khi thể quả thu hái về được phân lập ngay, những mẫu không làm có điều kiện phân lập được phải gói mẫu và bảo quản trong tủ định ôn ở nhiệt độ 10 oC, không để quả 2-3 ngày phân lập sẽ không thành công. Khi cấy dùng 70% cồn rửa bề mặt trước lúc cấy, các dụng cụ cấy đều phải khử trùng, quá trình cấy phải thực hiện trên ngọn đèn cồn và trong tủ vô trùng. Sau khi cấy xong cất giữ mẫu trong tủ định ôn ở nhiệt độ 25oC.[11] (Marx & Kenney 1982, Marx 1991, Castellano 1994, Kuek 1994) 15 Nuôi cấy trong môi trường thuần khiết: Sau khi phân lập sợi nấm có thể mọc nhanh hoặc chậm tuỳ theo loài nấm. Khả năng bị nhiễm khuẩn là rất cao nên trong khi cấy, phải dùng cồn khử trùng tay, vô trùng dụng cụ và tủ cấy. Khi sợi nấm mọc được tách ra để tránh nấm tạp, vi khuẩn… Sau khi tách sợi nấm 2- 3 lần, sợi nấm không bị nhiễm khuẩn, nấm tạp, và sợi nấm mọc đồng nhất lúc đó mới được sợi nấm thuần khiết.[43](Fries 1987, 1983a 1983b, 1978) Tiến hành theo dõi chụp ảnh, mô tả các đặc điểm của hệ sợi và đo tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm, tiến hành đo lần đầu tiên sau 5 ngày bắt đầu cấy, tiếp sau đó là đo sau 10 ngày và đo sau 20 ngày. Độ dầy của hệ sợi được đánh giá theo Schwantes năm 1971.[15] 2.3.5. Nghiên cứu sự hình thành rễ nấm với bạch đàn trong phòng thí nghiệm Lựa chọn các loài nấm ngoại cộng sinh chính của bạch đàn bằng cách thí nghiệm: - Tiến hành thí nghiệm trên môi trường nhân tạo để kiểm tra khả năng cộng sinh giữa nấm và rễ cây. Sử dụng đĩa Petri (140x20cm); ống nghiệm hoặc bình tam giác. Môi trường sử dụng để kiểm tra này có chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho cây phát triển như nitơ, photpho, canxi, magie, sufat, kali, bo, kẽm, mangan, đồng, mo… trong đó sử dụng 0,8% agar để làm đông môi trường, và 0,01% glucose để cho nấm phát triển.[20] - Xử lý hạt bằng một số hóa chất: theo Normand & Fortin (1982) sử dụng 30% H2O2; có thể sử dụng cồn 70% hoặc NaOCl 5%.[29] Để đạt hiệu quả cao đã tiến hành khử trùng bề mặt bằng phương pháp kép, lần đầu sử lý hạt bằng H2O2 30% từ 5-30 phút và sau đó dùng HgCl 2 1% khử trùng trong 5 phút. Rửa sạch lại bằng nước cất 2-3 lần, rồi tiến hành cấy hạt trên môi trường. [Malajczuk &Hartney 1986, Burgess et al. 1994] 16 - Khi hạt đã được khử trùng sử dụng các dụng cụ vô trùng đưa hạt vào các đĩa petri có sẵn môi trường PDA, nhằm loại bỏ nấm tạp và vi khuẩn xâm hại trước khi đưa vào các bình tam giác hoặc ống nghiệm đã được cấy nấm. Sau khoảng 2-3 ngày hay có thể lâu hơn tùy điều kiện môi trường lựa chọn những hạt nứt nanh không nhiễm nấm và khuẩn cho vào bình tam giác đã cấy sẵn nấm. [30] 2.3.6. Đánh giá hiệu quả sử dụng nấm ngoại cộng sinh Quá trình thực hiện trồng cây vào bình như trên, làm thí nghiệm với 8 mẫu quan sát và một mẫu đối chứng, để đánh giá khả năng sinh trưởng của chúng so với đối chứng, nhằm tuyển chọn loài có hiệu lực với bạch đàn. Với mỗi mẫu thử nghiệm thì dung lượng quan sát là 30 mẫu, tiến hành đo chiều cao vút ngọn để so sánh giữa các mẫu và mẫu đối chứng. Số lần đo là 3 lần ở các thời điểm khác nhau sau 15 ngày; 25 ngày; và 35 ngày tiếp nấm. Kết quả thu được được xử lý trên phần mềm SPSS 15.0 [8] 17 Chương 3 ĐIỀU KIỆN TỰ NHIÊN – KINH TẾ - XÃ HỘI KHU VỰC NGHIÊN CỨU 3.1. Điều kiện tự nhiên khu vực nghiên cứu 3.1.1. Vị trí địa lý Khu vực nghiên cứu thuộc trung tâm khoa học sản xuất Lâm Nghiệp Đông Bắc Bộ, thuộc địa bàn xã Ngọc Thanh - huyện Mê Linh - tỉnh Vĩnh Phúc cách Thành phố Hà Nội 50km về phía Tây Bắc. Khu vực trung tâm nằm ở vị trí vĩ độ 21º22’B; kinh độ 105º45’ Đ. Phía Bắc và phía Tây giáp huyện Bình Xuyên, phía Tây và phía Nam giáp Hồ Đại Lải, phía Đông giáp xã Minh Trí - huyện Sóc Sơn. 3.1.2. Địa hình Toàn bộ trung tâm thuộc vùng đồi núi thấp, độ cao trung bình so với mực nước biển là 25m – 30m, cao nhất là đỉnh Tam Tương cao 396m. Ở các đỉnh núi cao, sườn có độ dốc 20o – 30o, còn lại là dốc dưới 20o, địa hình nhìn chung chịu sự chi phối của 4 dãy núi chạy dọc theo hướng Đông Bắc và Tây Nam, bị chia cắt thành những thung lũng hẹp. 3.1.3. Điều kiện khí hậu khu vực nghiên cứu Theo tài liệu thu thập của trạm khí tượng thuộc Trung tâm Khoa học sản xuất Lâm nghiệp Đông Bắc Bộ đặt tại trung tâm thì khu vực nghiên cứu nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới mưa mùa, mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 10, mùa khô từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau, chịu ảnh hưởng của hai loại gió chính là gió mùa Đông - Bắc và gió mùa Đông – Nam. Số liệu các yếu tố khí tượng được trình bày ở Biểu 3.1 18 Biểu 3.1: Tổng hợp các yếu tố khí tượng tại Trung tâm khoa học sản xuất Lâm nghiệp Đông Bắc Bộ Nhiệt độ không khí Tháng TB Tối Tối cao thấp TB TB Nhiệt độ đất TB Tối Tối cao thấp TB TB Bốc Mưa P(mm) hơi Số ngày Độ ẩm KK (mm) (%) 1 16,2 17,9 14,5 18,3 23,1 10,9 9,6 3,8 71,5 86 2 17,7 19,1 15,9 19,9 22,7 12,3 32,1 5,3 65,9 87 3 19,7 21 18,1 21,8 25,2 14,5 52,7 5,9 63,4 88 4 23,9 25,2 20,2 25,8 29,8 18,2 84,6 11,8 66,4 90 5 27,2 29,4 25,4 30 36,2 20,6 165,6 11,3 92,8 88 6 29,3 31,5 27,1 33 38,2 22,8 311,4 16,8 93 86 7 29,4 31,5 27 32,6 37,5 23,8 313,1 19,5 84,6 89 8 28,3 30,5 26,1 31,8 36 22,2 203 12 75,3 91 9 27,5 29,6 25,1 31,2 37 20 163,1 10 92,8 88 10 25,6 27,1 22,2 29,1 34,6 17,8 71,7 6 115,1 84 11 21,9 24 19,2 25,2 30,1 15,1 40,7 4,2 96,1 83 12 17,7 20,2 15,3 20,8 25,3 11,5 16,9 2,8 93,1 82 TB 23,6 25,6 21,5 26,6 31,3 17,5 1456,6 130 84,2 87 Từ biểu tổng hợp số liệu trên cho ta thấy nhiệt độ không khí trung bình năm là 23.6ºC, nhiệt độ tối cao trung bình năm là 25,6ºC, tháng có nhiệt độ tối cao trung bình lớn nhất là tháng 6 và tháng 7 (31,5ºC). Nhiệt độ không khí tối thấp trung bình năm là 21,5ºC, tháng có nhiệt độ không khí tối thấp trung bình năm là tháng 1 (14,5ºC). 19 - Chế độ mưa: Lượng mưa bình quân năm là 1.456,6mm, phân bố không đồng đều trong năm. Tổng số ngày mưa trong năm là 130 ngày, lượng mưa cao nhất vào tháng 6 và tháng 7. Lượng mưa thấp nhất vào các tháng 1, 2 và 3 trong đó tháng 1 có lượng mưa thấp nhất là 9,6mm. Mùa mưa từ tháng 4 đến tháng 10 chiếm 80% lượng mưa cả năm. - Lượng bốc hơi: Tháng có lượng bốc hơi lớn nhất là tháng 10 (115,1mm). Tháng có lượng bốc hơi nhỏ nhất là tháng 3 (63,4mm), lượng bốc hơi trung bình tháng là 84,3mm, tổng lượng bốc hơi là 1.016,6mm. Các tháng có lượng bốc hơi lớn hơn lượng mưa là 1, 2, 3, 10, 11 và 12. Mưa tập trung theo mùa trên bề mặt địa hình dốc và chia cắt nên lượng nước giữ lại trong đất không lớn, nước thường bị thiếu nhất là những tháng mùa khô, điều này ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển và cung cấp nhựa của cây thông nhựa. - Chế độ gió: Gió mùa Đông Bắc là gió chính hoạt động từ tháng 11 đến tháng 3 năm sau, gió mùa Đông Nam thường thổi từ tháng 4 đến tháng 10. Mang theo hơi nước, ẩm, thời gian này cũng chính là mùa mưa nóng thuận lợi cho cây sinh trưởng phát triển. Khí hậu là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến phân bố tự nhiên, sinh trưởng, phát triển của cây trồng không những vậy khí hậu còn ảnh hưởng đến việc sản xuất và tích luỹ các chất hữu cơ, nhựa của nhiều loài thực vật. Qua tài liệu về khí hậu của khu vực Đại Lải ta thấy về cơ bản khí hậu thuận lợi cho thông nhựa sinh trưởng, phát triển. 3.1.4. Điều kiện đất đai Nền địa chất bao gồm các đá mẹ phiến thạch, phiến sa, sa thạch có những tảng thạch xen kẽ nhau tạo thành một lớp phủ phong hoá không đều. Theo tài liệu của Nguyễn Xuân Quát đất ở đây chủ yếu là: Đất Feralit vàng đỏ hoặc đỏ 20 vàng phát triển trên đá mẹ phiến thạch sét, sa thạch. Tầng đất từ mỏng đến trung bình ít nơi có tầng dày trên 1m. Thành phần cơ giới từ thịt nhẹ đến sét, đất bị xói mòn mạnh, thường có kết von từ 31 – 70%. 3.1.5. Tình hình thực bì khu nghiên cứu Theo Nguyễn Xuân Quát cách đây hơn 40 năm toàn bộ khu vực Đại Lải có rừng tự nhiên che phủ nối liền với rừng tự nhiên của dãy núi Tam Đảo. Do khai thác quá mức rừng bị cạn kiệt, thảm thực bì còn lại chủ yếu là cây bụi cỏ dại. Tổ thành loài cây đơn giản, đều là những cây có giá trị thấp như: Me rừng, Thành ngạnh, Thẩu tấu, Sim, Mua... Hiện nay đất của trung tâm quản lý đã xây dựng được hơn 600ha rừng, phần lớn là các mô hình rừng trồng thí nghiệm và trình diễn tiến bộ khoa học công nghệ lâm sinh trong đó có gần 400ha rừng thông các loại, cây rừng sinh trưởng, phát triển tốt. Loại thông được trồng chủ yếu ở đây là thông nhựa, thông mã vĩ, thông caribea sinh trưởng đạt từ 4 – 5m3/ha/năm. Với bạch đàn hiện nay có khoảng 40- 50 ha chủ yếu là mô thử nghiệm. Như vậy tình hình điều kiện tự nhiên tại khu vực Đại Lải đều thuận lợi cho quá trình sinh trưởng và phát triển loài thông. Khả năng sinh trưởng phát triển đạt mức độ trung bình so với các vùng trồng thông khác. 3.2. Tình hình dân sinh kinh tế Địa bàn hoạt động nghiên cứu sản xuất của Trung tâm nằm trên địa phận xã Ngọc Thanh, phần lớn người dân là người dân tộc Sán Dìu, trình độ văn hoá còn thấp, nghề chủ yếu là làm ruộng, trồng lúa nước một vụ và trồng màu một vụ trên các chân ruộng thấp, thung lũng. Do trình độ tập quán canh tác lạc hậu, cuộc