Tài liệu đặc điểm bệnh học bệnh trắng gan, trắng mang trên cá tra (pangasianodon hypophthalmus) giống ở đồng tháp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN HUỲNH THỊ NGỌC THANH ĐẶC ĐIỂM BỆNH HỌC BỆNH TRẮNG GAN, TRẮNG MANG TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) GIỐNG Ở ĐỒNG THÁP LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN HUỲNH THỊ NGỌC THANH ĐẶC ĐIỂM BỆNH HỌC BỆNH TRẮNG GAN, TRẮNG MANG TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) GIỐNG Ở ĐỒNG THÁP CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TỪ THANH DUNG BÙI THỊ BÍCH HẰNG 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com LỜI CẢM TẠ Lời đầu tiên con xin chân thành biết ơn cha mẹ đã sinh ra và nuôi dạy con khôn lớn! Xin chân thành gửi lời cảm ơn và lòng biết ơn sâu sắc đến cô Từ Thanh Dung đã tận tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Thủy Sản bộ môn Bệnh Học Thủy Sản. Xin gửi đến cô cố vấn Bùi Thị Bích Hằng lời biết ơn sâu sắc đã dìu dắt lớp trong suốt quá trình học tập Xin cảm ơn các anh chị trong bộ môn Bệnh Học Thủy Sản đã đóng góp những ý kiến quý báu giúp em hoàn thành luận văn. Chân thành cảm ơn Cty TNHH Minh Thành _Tp Cao Lãnh, Chi Cục thủy sản Hồng Ngự đã nhiệt tình giúp đỡ em trong suốt quá trình thu mẫu. Cuối cùng là các bạn lớp Bệnh Học Thủy Sản K31 đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn! i PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TÓM TẮT Cá tra là một trong những đối tượng nuôi thủy sản đang được nuôi công nghiệp tại các tỉnh ĐBSCL. Đồng Tháp chính là cái nôi của nghành sản xuất giống cá tra cung ứng 70% cá tra giống cho toàn vùng ĐBSCL. Trong những năm gần đây đã xuất hiện bệnh TGTM gây thiệt hại lớn đến nghề sản xuất cá giống. Chính vì vậy đề tài “Đặc điểm bệnh học bệnh trắng gan trắng mang trên cá tra (Pangasianodon hypophthamus) giống ở Đồng Tháp” được thực hiện nhằm tìm hiểu sự thay đổi về đặc điểm bệnh học trong quá trình bệnh diễn ra ở các ao ương nhằm đưa ra cơ sở khoa học cần thiết để góp phàn làm giảm thiệt hại phát sinh bệnh giúp cho việc điều trị hiệu quả hơn. Mẫu được thu định kỳ trên 4 ao ương xuất hiện bệnh trắng gan trắng mang (TGTM) tại huyện Hồng Ngự tỉnh Đồng Tháp, thu 4 - 6 lần mỗi lần thu 10 con. Mẫu cá thu được phân tích ngoại ký sinh, cấy mẫu vi sinh và cố định mẫu mô trong dung dịch formol trung tính 10%. Kết quả kiểm tra ký sinh trùng và vi sinh đã xác định được mẫu cá trong 4 ao nuôi đều phát hiện được ký sinh trùng thuộc nhóm đơn bào và 1 ao có nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophyla. Kết quả mô học ở cá TGTM, giữa các đợt thu mẫu cấu trúc không biến đổi nhiều, cá bệnh TGTM cấu trúc biến đổi nhẹ hơn cá bị TGTM kết hợp với mủ gan. Các đặc điểm thường gặp như: tế bào mất cấu trúc, hoại tử, xung huyết và xuất huyết trên gan thận tỳ tạng. Mặc dù chưa xác định được tác nhân gây bệnh TGTM nhưng các thông tin trên sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo. ii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com MỤC LỤC PHẦN I GIỚI THIỆU---------------------------------------------------------------- 1 PHẦN II TỒNG QUAN TÀI LIỆU------------------------------------------------ 3 2.1 Một số bệnh thường gặp ---------------------------------------------- 3 2.1.1 Bệnh do ký sinh trùng -------------------------------------------- 3 2.1.2 Bệnh vi khuẩn------------------------------------------------------ 4 2.2 Các nghiên cứu mô học ----------------------------------------------- 5 2.3 Tình hình xuất hiện bệnh --------------------------------------------- 7 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ------------------------------------- 9 3.1 Thời gian và địa điểm ------------------------------------------------- 9 3.2 Vật liệu nghiên cứu ---------------------------------------------------- 9 3.3 Phương pháp nghiên cứu --------------------------------------------- 9 3.3.1 Phương pháp thu mẫu--------------------------------------------- 9 3.3.2 Phương pháp kiểm tra ký sinh trùng ---------------------------- 9 3.3.3 Phương pháp định danh vi khuẩn ------------------------------- 10 3.3.4 Phương pháp mô học --------------------------------------------- 10 PHẦN IV KẾT QUẢ THẢO LUẬN ---------------------------------------------- 13 4.1 Đặc điểm cá khỏe ------------------------------------------------------ 13 4.2 Đặc điểm cá bệnh ------------------------------------------------------ 13 4.3 Kết quả ký sinh trùng ------------------------------------------------- 14 4.4 Xác định thành phần vi sinh ------------------------------------------ 16 4.5 Kết quả mô học -------------------------------------------------------- 18 4.5.1 Mang ---------------------------------------------------------------- 18 4.5.2 Gan ------------------------------------------------------------------ 21 4.5.3 Thận ----------------------------------------------------------------- 24 4.5.4 Tỳ tạng -------------------------------------------------------------- 27 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT --------------------------------------------- 30 5.1 Kết luận ----------------------------------------------------------------- 30 5.2 Đề xuất ------------------------------------------------------------------ 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO ----------------------------------------------------------- 31 PHỤ LỤC ------------------------------------------------------------------------------ 35 Phụ Lục A ------------------------------------------------------------------- 35 Phụ Lục B ------------------------------------------------------------------- 37 Phụ Lục C ------------------------------------------------------------------- 38 Phụ Lục D ------------------------------------------------------------------- 39 Phụ Lục E ------------------------------------------------------------------- 42 Phụ Lục F ------------------------------------------------------------------- 44 Phụ Lục G ------------------------------------------------------------------- 50 Phụ Lục H ------------------------------------------------------------------- 51 iii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1: Sơ đồ xử lý mẫu mô ........................................................................ 11 Hình 3.2: Sơ đồ qui trình nhuộm mẫu mô ....................................................... 12 Hình 4.1: Nội tạng cá khỏe và cá TGTM ........................................................ 13 Hình 4.2: Gan, Mang cá TGTM và cá khỏe .................................................... 13 Hình 4.3: Đĩa tách ròng vi khuẩn ................................................................... 16 Hình 4.4: Nhuộm Gram vi khuẩn E 100X ...................................................... 16 Hình 4.5: Test API 20E ................................................................................... 17 Hình 4.6: Đĩa cấy vi khuẩn trên TSA .............................................................. 17 Hình 4.7: Nhuộm Gram vi khuẩn E 100X ...................................................... 17 Hình 4.8: Test API 20E ................................................................................... 18 Hình 4.9: Mang cá khỏe .................................................................................. 19 Hình 4.10: Mang cá TGTM............................................................................. 19 Hình 4.11: Mô học mang cá khỏe (H&E) ....................................................... 19 Hình 4.12: Mô học mang cá bệnh TGTM (H&E) ........................................... 20 Hình 4.13: Mô học mang cá TGTM & MG (H&E) ........................................ 21 Hình 4.14: Mô học gan cá khỏe (H&E) .......................................................... 21 Hình 4.15: Mô học gan cá bệnh TGTM (H&E) .............................................. 23 Hình 4.16: Mô học gan cá bệnh TGTM & MG (H&E) .................................. 24 Hình 4.17: Mô học thận cá khỏe (H&E) ......................................................... 25 Hình 4.18: Mô học thận cá bệnh TGTM (H&E) ............................................. 26 Hình 4.19: Mô học thận cá TGTM & MG (H&E) .......................................... 27 Hình 4.20: Mô học tỳ tạng cá khỏe (H&E) ..................................................... 27 Hình 4.21: Mô học tỳ tạng cá bệnh TGTM & MG (H&E) ............................. 29 DANH SÁCH BẢNG Bảng 4.1: Tỉ lệ cảm nhiễm ký sinh trùng ........................................................ 14 Bảng 4.2: Cường độ cảm nhiễm ký sinh trùng................................................ 15 Bảng 4.3: Kết quả mô học trên mang .............................................................. 19 Bảng 4.4: Kết quả mô học trên gan ................................................................. 22 Bảng 4.5: Kết quả mô học trên thận ................................................................ 25 Bảng 4.6: Kết Quả mô học trên tỳ tạng ........................................................... 28 Bảng 4.7: Các chỉ tiêu sinh hóa của kit API 20E ............................................ 38 iv PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TỪ VIẾT TẮT ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long TGTM: Trắng gan, trắng mang TGTM & MG: trắng gan trắng mang kết hợp mủ gan H&E: Haematocyline & Eosin MMC: trung tâm đại thực bào sắc tố v PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHẦN I GIỚI THIỆU Cá tra là một trong những đối tượng xuất khẩu chủ lực của Việt Nam. Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), tính đến đầu tháng 12 năm 2008 kim ngạch xuất khẩu thủy sản của cả nước đạt 4 tỷ USD. Trong đó 10 tháng đầu năm, sản lượng xuất khẩu đã đạt 1.054.600 tấn, trị giá 3,828 tỷ USD, tăng 39,4% về lượng và 24,4% về giá trị so với cùng kỳ năm 2007. Đặc biệt, các nước trong khối EU vẫn đứng đầu thị trường nhập khẩu thủy sản Việt Nam, chiếm 25,3% tổng kim ngạch xuất khẩu của cả nước với gần 970 triệu USD, tăng 29,3% so với 10 tháng năm 2007.(Afasco, 2009) Hiện nay nghề nuôi cá tra ở ĐBSCL ngày càng phát triển với mức độ thâm canh hóa ngày càng tăng, để đáp ứng nhu cầu thì con giống đang là vấn đề cấp thiết. Đồng Tháp là một trong những tỉnh có nghề sản xuất cá giống phát triển mạnh, khoảng 300 cơ sở, tổng diện tích sản xuất khoảng 4.000 ha, cung ứng 65-70% cá tra giống cho toàn vùng ĐBSCL (Thanh sơn, 2008). Với tình trạng nuôi cá tra như hiện nay dẫn đến bệnh thường xuyên xảy ra như bệnh xuất huyết, bệnh mủ gan, bệnh ký sinh trùng …gây thiệt hạị nặng. Bên cạnh đó, trong những năm gần đây đã xuất hiện bệnh “trắng gan, trắng mang” gây ảnh hưởng đến sản lượng cá tra nuôi. Đặc biệt gây chết vào giai đoạn giống trầm trọng và vẫn chưa được xác định chính xác tác nhân gây bệnh. Bệnh trắng gan trắng mang thường xuất hiện ở giai đoạn cá tra giống (khoảng 1 tháng tuổi), và gây tỉ lệ chết cao từ vài trăm đến vài nghìn con/ngày, kéo dài từ 7 đến 10 ngày (thông tin từ người nuôi). Theo Huy và Tiến vào năm 2008, đã có nghiên cứu về mô học và huyết học trên cá tra bệnh trắng gan trắng mang. Và các thông tin khoa học cụ thể về bệnh trắng gan trắng mang trên đối tượng nuôi này hầu như chưa có. Chính vì vậy mà đề tài “Đặc điểm bệnh học bệnh trắng gan, trắng mang trên cá tra (pangasianodon hypophthalmus) giống ở tỉnh Đồng Tháp” được thực hiện. Mục tiêu đề tài Tìm hiểu sự thay đổi về đặc điểm bệnh học trong quá trình bệnh diễn ra ở các ao ương nhằm đưa ra cơ sở khoa học cần thiết để góp phần giảm thiệt hại phát sinh bệnh này giúp cho việc điều trị hiệu quả hơn. 1 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Nội dung Định kỳ thu mẫu và xác định thành phần loài ký sinh trùng và vi khuẩn trong 4 ao ương cá tra ở tỉnh Đồng tháp. Xác định sự thay đổi cấu trúc mô học trên cá tra bệnh trắng gan trắng mang trong 4 ao ương. 2 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Một số bệnh thường gặp trên cá tra Theo Nguyễn Trọng Bình từ năm 1996-2006, hiện nay diện tích nuôi cá tra, basa ở 3 miền: Nam, Trung và Bắc tăng gấp 7 lần, sản lượng tăng 36,2 lần. Và cá tra đã được xuất khẩu sang 80 quốc gia và vùng lãnh thổ. Để có sản lượng cao cung cấp cho xuất khẩu, bên cạnh của tăng diện tích nuôi trồng thì còn có nuôi cá tra ở mật độ cao và nuôi thâm canh đã làm xuất hiện nhiều loại bệnh như bệnh vi khuẩn, một số bệnh do nấm, ký sinh trùng gây ra.v.v. (http://www.hcmbiotech.com.vn) Bệnh được xem là một thách thức quan trọng mà người nuôi thủy sản đang phải đối mặt. Theo Từ Thanh Dung và ctv (2005), tác nhân gây bệnh trên động vật thủy sản chủ yếu là vi khuẩn, virus, nấm và nguyên sinh động vật. Bên cạnh đó, một khảo sát của Nguyễn Chính (2005), tại các vùng nuôi cá tra thâm canh ở An Giang và Cần Thơ thì cá mắc nhiều loại bệnh với các tần số xuất hiện khác nhau, bệnh thường gặp và gây thiệt hại nhiều nhất là bệnh gan thận có mủ, xuất hiện trên 82% ao và 100% bè nuôi cá đồng thời tỷ lệ cá chết có thể lên đến 80 – 90% nếu không chữa trị kịp thời. 2.1.1 Bệnh do ký sinh trùng Theo Bùi Quang Tề (2001), cho rằng ký sinh trùng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cá. Trong giai đoạn cá hương (từ 1 – 1,5 tháng tuổi) và giai đoạn gống (từ 2 – 3 tháng tuổi) gặp chủ yếu là trùng đơn bào ngoại ký sinh như nhóm trùng bánh xe (Trichodina, Trichodinella spp và Tripartiella spp) và một số loài sán lá song chủ. Ở giai đoạn giống thì cá tra thường dễ bị nhiễm các loài ký sinh trùng như: Trichodina, Dactylogyrus, Gyrodactylus, Myxobolus, Ichthyophthyrius, Henneguya,…ký sinh gây bệnh. Bệnh trùng bánh xe Tác nhân gây bệnh là một số loài kí sinh trùng thuộc họ Trichodinidea bao gồm các loài thuộc giống Trichodina ký sinh ở da và mang cá, các đối tượng cá tra giống, cá trê giống, bống tượng, mè vinh,…đều bị nhiễm trùng bánh xe gây thành dịch làm cá chết từ 50 – 90% trong ao nuôi (Bùi Quang Tề và ctv, 2004). Theo Từ Thanh Dung (2005), thì nhiệt độ thích hợp cho trùng bánh xe là từ 20 – 300 C, bệnh thường xảy ra ở thời điểm cuối mùa Xuân đến đầu mùa Thu, chúng ký sinh ở hầu hết các loài cá nhưng chủ yếu gây bệnh và làm chết cá hương và cá giống trong các ao ương có mật độ dày và điều kiện sống không tốt. 3 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Bệnh trùng quả dưa Tác nhân gây bệnh là trùng quả dưa Ichthyophthyrius multifiliis, nhiệt độ thích hợp cho trùng phát triển từ 22 – 280 C, bệnh gây thiệt hại chủ yếu ở giai đoạn cá hương và cá giống. Ở Việt Nam, bệnh phát sinh rộng trên nhiều loài cá khác nhau như cá chép, trắm cỏ, cá trê, cá tra, bống tượng…Trùng quả dưa đã gây thành dịch bệnh của cá giống ở các loài kể trên với tỷ lệ cảm nhiễm 70-100%, cường độ cảm nhiễm 5-10 trùng/lamelle được xem là nguy hiểm ( Bùi Quang Tề và ctv 2004). Theo Gratzek (1984), (trích dẫn bởi Cao Tuấn Anh, 2005) cho rằng bệnh trùng quả dưa thường bộc phát vào mùa mưa, nhiệt độ thấp kéo dài và những nơi nuôi không có ánh sáng mặt trời, chúng gây thiệt hại nặng ở cá giống. Bệnh rất khó trị nhất là ở giai đoạn cyst vì thuốc không có tác dụng. Theo Nguyễn Quang Hưng (2001), Ichthyophthyrius là một trong những ký sinh trùng nguy hiểm đối với cá tra ở giai đoạn giống. Bệnh bào tử trùng Tác nhân gây bệnh là Myxobolus, Henneguya và Thelohanellus. Theo nghiên cứu của Bùi Quang Tề (2001), thì Henneguya được tìm thấy rất nhiều trên da cá tại các ao ương cá tra giống ở Long Khánh, Hồng Ngự - Đồng Tháp. Myxobolus ký sinh ở hơn 30 loài cá nước ngọt Việt Nam, bệnh gặp ở mọi vùng miền. Mức độ cảm nhiễm Myxobolus ở một số loài cá khá cao và đã gây thành bệnh làm cá chết hàng loạt. Bệnh phát triển mạnh ở nhiệt độ nước cao 32-400C, Myxobolus có khả năng ký sinh ở nhiều cơ quan khác nhau như da, mang, ruột, nào, tủy sống, mật…của cá. Bệnh do nhóm Monogenea Tác nhân gây bệnh là Dactylogyrus và Gyrodactylus với tỷ lệ nhiễm cao (60 – 80%) bệnh xuất hiện vào những tháng mưa nhiều và gây chết cho cá giống ương trong ao lẫn bè là rất cao. Giống Dactylogyrus ký sinh trên da và mang cá nhưng chủ yếu là mang, chúng ký sinh ở nhiều loài cá nước ngọt với nhiều lứa tuổi nhưng gây bệnh nghiêm trọng nhất là đối tượng cá hương và cá giống. Bệnh này phát triển mạnh trong các ao nuôi mật độ dày, điều kiện môi trường ô nhiễm hữu cơ, nhiệt độ thích hợp cho chúng phát triển khoảng 22280C (Bùi Quang Tề, 2004). Tác giả còn cho biết cá mè hoa giai đoạn cá hương bị cảm nhiễm Dactylogyrus, có ao tỷ lệ cảm nhiễm bệnh 100%, cường độ cảm nhiễm 210-325 trùng/con cá, làm cá chết 75%. 2.1.2 Bệnh vi khuẩn Vi khuẩn là một trong những nhóm tác nhân gây bệnh trên động vật thủy sản mà chủ yếu và thường gặp nhất là nhóm vi khuẩn Gram âm. Tác nhân 4 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com vi khuẩn có thể được coi là tác nhân sơ cấp hoặc thứ cấp gây bệnh cho các loài thủy sản (Inglis et al, 1993). Theo Từ Thanh Dung và ctv (2004), đã phân lập từ 181 mẫu cá tra bệnh mủ gan thu được 108 dòng vi khuẩn Edwardsiell ictaluri. Mẫu thu được từ các vùng nuôi cá tra phát triển mạnh như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ. Từ năm 1998 bệnh mủ gan phát hiện đầu tiên trên cá tra nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) và gọi là bệnh BNP (bacillary necrosis of Pagasius) (Ferguson et al, 2001). Ngoài ra vi khuẩn này cũng là nguyên nhân gây bệnh nhiễm trùng máu cấp tính trên cá nheo Mỹ với tỷ lệ hao hụt khá cao (Autin và Autin, 1993). Một số tác giả đã tìm thấy một số bệnh phổ biến trên cá tra như: bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E. ictaluri, bệnh xuất hyết do vi khuẩn A. hydrophila, A. sobria và A. caviae. Trong đó, vi khuẩn E. ictaluri là nguyên nhân gây thiệt hại kinh tế nguy hiểm nhất trong các mô hình nuôi công nghiệp ở ĐBSCL. (Dung et al., 2008). Một loại vi khuẩn cũng gây thiệt hại không kém trên động vật thủy sản là Aeromonas, tác nhân gây nhiễm trùng máu xuất huyết ở một số loài cá như: cá basa, cá bống tượng, cá rô phi, cá trê giống,… Đây là bệnh nhiễm khuẩn nên có thể xảy ra ở các giai đoạn khác nhau từ cá giống , cá thịt và cá bố mẹ đều có thể bị tác hại bởi bệnh này. Tỷ lệ tử vong ở động vật thủy sản từ 30 – 70% nhưng ở giai đoạn giống của ba ba và cá trê có thể lên đến 100% (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004). 2.2 Các nghiên cứu mô học Từ khi học thuyết tế bào ra đời, cùng với sự hoàn thiện về việc chế tạo ra kính hiển vi và kỹ thuật hiển vi đã đưa mô học phát triển mạnh. Đến cuối thế kỉ XIX, bắt đầu thời kỳ phát triển rầm rộ của mô học mô tả. Những thành phần cấu tạo khác nhau của các cơ quan và các mô đã nghiên cứu một cách cẩn thận. Những thành công lớn lao trong kỹ thuật mô học nữa sau thế kỉ XIX, như việc chế tạo ra máy cắt lát mỏng cho phép người ta nghiên cứu tỉ mỉ cấu trúc vi thể của tế bào và mô ( Phạm Phan Địch, 1988). Theo Roberts (1995), việc phân tích mô bệnh học về vi thể là nghiên cứu những thay đổi hiển vi diễn ra trong mô cơ thể trong suốt quá trình bệnh. Những thay đổi này thường là những đặc điểm đặc trưng của cơ thể và nó góp phần không nhỏ vào việc xác định ra tác nhân gây bệnh. Đề cập đến các công trình nghiên cứu mô học đã có không ít những nhà khoa học nghiên cứu về lĩnh vực này như Chinabut và limsuwan (1983), nghiên cứu mô học trên cá trê trắng (Clarias batrachus) bị nhiễm vi khuẩn 5 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Aeromonas hydrophyla. Mô bệnh học được kiểm tra hầu hết các cơ quan theo đối tượng nghiên cứu gan, thận và tỳ tạng. Kết quả quan sát được gan, thận sau bị thoái hóa, hoại tử, tỳ tạng bị xung huyết, mô liên kết gia tăng, các tế bào lymphoi giảm đi ở một số cá bị nhiễm khuẩn, thận trước xuất huyết và hoại tử. Bên cạnh đó Nash và ctv (1986), nghiên cứu bệnh vi khuẩn có liên quan đến dịch bệnh ở cá chép và cá bống mú. Tác giả sử dụng phương pháp mô bệnh học để xác định những thay đổi vi thể trên các cơ quan khi bị vi khuẩn tấn công . Kết quả nghiên cứu cho thấy lớp biểu mô da bị thoái hóa, vẩy bị mất, lớp bì và trung tâm các bó cơ bị xuất huyết, hoại tử và các tế bào bị sưng viêm. Trên thận, tỳ tạng xuất hiện các vùng mô tạo máu bị hoại tử rải rác và các trung tâm hoại tử. Ở cả gan, thận, tỳ tạng, tuyến tụy đều cho thấy sự gia tăng của các trung tâm đại thực bào sắc tố. Supranee and Robert (1999), viết tài liệu về bệnh cá và mô bệnh học ở cá bị lở loét (EUS). Tác giả mô tả dấu hiệu bệnh lý và những thay đổi cấu trúc tế bào của đối tượng nhiễm bệnh. Do cá lở loét có nhiều tác nhân sơ cấp và cơ hội xâm nhập gây bệnh (nấm, vi khuẩn) nên tác giả đã chia thành 5 dạng biểu hiện của bệnh tương ứng với từng dạng sẽ có những biến đổi trong cấu trúc mô. Ngoài ra Chinabut (1991), cũng có những nghiên cứu về mô bệnh học trên cá trê trắng, tác giả không nghiên cứu trên cá bệnh mà chỉ nghiên cứu trên cá khỏe và khảo sát mô ở các cơ quan như hệ cơ, hệ tiêu hóa, hệ tuần hoàn, hệ bài tiết, hệ sinh dục… kết quả nghiên cứu để làm cơ sở so sánh khi nghiên cứu mô cá bệnh. Ở Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu trong lĩnh vực mô học, chủ yếu trên các đối tượng nuôi phổ biến hiện nay như theo luận văn tốt nghiệp của Nguyễn Quốc Thịnh (2002), bước đầu nghiên cứu mô bệnh học bệnh đốm trắng trong nội tạng cá tra cho thấy khi cá bị trắng gan các cơ quan bị hủy hoại nặng nhất là gan, thận và tỳ tạng kế đến là mang và cuối cùng bị ảnh hưởng nhẹ nhất là tim và cơ. Các tổn thương vi thể chủ yếu là hoại tử dạng hạt. Không ngừng ở đó Nguyễn Quốc Thịnh và ctv (2004), đã nghiên cứu mô bệnh học trên cá tra trắng gan thể hiện nhiều thay đổi về cấu trúc, đặc biệt ở gan, thận và tỳ tạng có hiện tượng xung huyết, xuất huyết và nhiều vùng bị hoại tử trầm trọng xuất hiện ở hầu hết các vùng chức năng của các cơ quan kể trên. Vi khuẩn cũng đã được tìm thấy trên mẫu mô của các cơ quan này, những vi khuẩn này tạo thành bó ở rìa các vết hoại tử. Đồng thời ở mang cá bệnh có sự dính lại của các tia mang làm cản trở hoạt động hô hấp của cá. Trần Thị Ngọc Hân (2006), khảo sát mô học cá tra bị bệnh mủ gan trong điều kiện gây cảm nhiễm kết quả cho thấy các cơ quan như gan, thận tỳ tạng đều bị biến đổi có hiện tượng xung huyết. Các cơ quan tim và dạ dày, 6 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com bóng hơi và ruột ít biến đổi. Mang cấu trúc ít biến đổi có hiện tượng dính lại và phình to của sợi mang thứ cấp. Mô da và cơ không có sự biến đổi. Đồng thời Phạm Thị Như Sang (2006), cũng đã khảo sát mô học trên một số cơ quan của cá tra nuôi ao và bè thâm canh kết quả thường gặp trong tất cả các bệnh là hiện tượng xung huyết và xuất huyết trên ba cơ quan gan, thận, tỳ tạng. Ngoài ra còn có sự xuất hiện của trùng bào tử sợi Myxozoa ký sinh ở tỳ tạng bị nhiễm nhiều nhất, sự xuất hiện giun tròn ở mô gan cá. Ngoài ra Bùi Châu Trúc Đan (2003), nghiên cứu bệnh phù mắt trên cá tra về vi thể thì các tổn thương chủ yếu là xung huyết và xuất huyết. Gan tỳ tạng, mắt là cơ quan bị tổn thương nặng nhất với cả những vùng bị hoại tử hay cấu trúc bị thay đổi. Còn những cơ quan khác hầu như không biển đổi. Tiếp theo đó, Trần Hồng Ửng (2003), cũng có nghiên cứu về sự thay đổi cấu trúc mô trên cơ quan tỳ tạng của cá bị trắng gan kết quả cho thấy tùy giai đoạn nặng nhẹ khác nhau của bệnh mà cấu trúc mô tỳ tạng có những đặc điểm như hoại tử dạng hạt, hoại tử hóa lỏng hay cấu trúc của tủy đỏ và tủy trắng khác nhau. Gần đây một nghiên cứu mô bệnh học của Phan Khắc Huy (2008), về đặc điểm mô bệnh học ở cá tra có dấu hiệu trắng gan, trắng mang cho biết đối với cá trắng gan, trắng mang đơn thuần trên cấu trúc mô không có hiện tượng xung huyết, xuất huyết, dịch viêm và có rất ít hoặc không có tế bào máu trên vùng mô. Gan bị mất liên kết giữa các tế bào, thận chủ yếu là các ống thận nở tròn, tiểu cầu thận teo. Tỳ tạng bị họa tử tạo thành khoảng không trên vùng tủy trắng. Mang có hiện tượng teo và nhiều không bào trên mang thứ cấp.Tuy nhiên, đối với cá trắng gan, trắng mang kết hợp với mủ gan trên cấu trúc mô chủ yếu là có vùng hoại tử dạng hạt, đồng thời cũng có hiện tượng xuất huyết nhẹ trên các vùng hoại tử này và có hiện tượng tế bào máu trên vùng mô. 2.3. Tình hình xuất hiện bệnh trắng gan, trắng mang trên cá tra Trong thời gian gần đây, hầu như tất cả các vùng nuôi cá tra thường xuất hiện loại bệnh phổ biến là trắng mang, trắng gan gây thiệt hại cho người nuôi. Hiện nay bệnh này tác nhân gây bệnh chưa được xác định rõ. Theo Phạm Ngọc Khỏe (2008), khi kiểm tra ký sinh trùng trên cá tra bị bệnh trắng mang, trắng gan có khả năng nhiễm các giống loài ký sinh trùng như Dactylogyrus sp, Trichodina sp, Myxobolus sp là rất cao và một kết quả phân tích khác tìm thấy các loài ký sinh trùng như Dactylogyrus, Myxobolus và Ichthyonyctus xuất hiện ở tất cả các nhóm cá khảo sát. Trong đó Balantidium chỉ thấy ở ruột cá bệnh trắng gan, trắng mang nặng (Phạm Thị Phương Tiến, 2008). 7 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Cá bị bệnh trắng gan trắng mang được quan sát có biểu hiện là mang có màu trắng nhạt, nội tạng vàng rơm, xoang bụng chứa dịch, lớp chất nhầy trên da, mang và bên trong ruột rất ít. Đặt biệt là máu chuyển sang màu hồng hơi trắng kem. Bên cạnh đó cá còn có dấu hiệu của hiện tượng thiếu máu. Tình trạng thiếu máu ngày càng nghiêm trọng khi cá có biểu hiện trắng gan, trắng mang trong thời gian dài. Theo nghiên cứu của Phạm Thị Phương Tiến (2008), kết luận trên cá tra bệnh trắng gan trắng mang nhẹ, hồng cầu giảm đi 18,7% so với cá khỏe, 26,6% so với cá bị không bệnh này trong cùng ao nuôi. Trong khi đó ở cá tra bệnh trắng gan trắng mang nặng là 4,57% và 6,48%. Theo kết quả phân tích vi sinh của Phạm Ngọc Khỏe (2008), và Phạm Thị Phương Tiến (2008), thì tác nhân gây bệnh trắng gan trắng mang trên cá tra không phải là vi khuẩn. Đây cũng là vấn đề còn phải tìm hiểu sâu hơn để tìm ra tác nhân gây nên bệnh trắng gan trắng mang trên cá tra nuôi để có biện pháp phòng trị thích hợp. 8 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/2009 đến tháng 05/2009 Địa điểm thực hiện: Thu mẫu: Ao ương cá tra ở tỉnh Đồng Tháp Phân tích mẫu: Phòng thí nghiệm Khoa Thủy Sản – trường Đại Học Cần Thơ. 3.2 Vật liệu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Cá tra giống nuôi thâm canh ở tỉnh Đồng Tháp. Dụng cụ Dụng cụ tiểu phẫu, đĩa Petri, que cấy, đèn cồn, bình xịt cồn, quẹt lửa, pipet, khai nhựa, ống nghiệm, bao tay tiệt trùng, khẩu trang, lame, lamelle, cân trọng lượng, thước đo chiều dài, máy ảnh, kính hiển vi quang học, khuôn inox, máy xử lý mẫu, máy đúc khối, máy cắt lát, máy nhuộm mẫu, tủ hút, tủ lạnh, máy sấy… Hóa chất Hóa chất kiểm tra ký sinh trùng và vi sinh: Nước cất, nước muối sinh lý, môi trường TSA (Trypticase Soy Agar), EIA (Edwardsilla ictaluri agar) (EIA, Merck), cồn 70o, cồn đốt, hóa chất nhuộm gam, môi trường O/F, bộ test API 20E,… Hóa chất phân tích mô học: cồn, dung dịch formol 10%, Xylen, Parafin, sáp ong, dung dịch Mayer’s albumin, dung dịch Haematocyline & Eosin (H & E), keo dán Enterlan. 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp thu mẫu Tiến hành thu mẫu cá tra (10 con/ao) tại 4 ao được theo dõi để kiểm tra ký sinh trùng và vi sinh. Định kỳ 4 ngày thu mẫu một lần. Thu 6 lần trong suốt chu kỳ theo dõi. Kích thước cá giống trung bình là 10±1cm. 3.3.2 Phương pháp phân tích ký sinh trùng (theo tài liệu thực tập Giáo Trình Bệnh 1, Khoa Thủy Sản trường Đại Học Cần Thơ, 2008). 9 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Phương pháp kiểm tra ký sinh trùng Kiểm tra ngoại ký sinh trùng: dùng dao cạo nhẹ lớp nhớt trên da, vây, mang để lên lam, thêm 1 giọt nước muối sinh lý. Đậy lamelle lại và quan sát ký sinh trùng dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 10X-40X. Xác định tỷ lệ cảm nhiễm (TLCN) và cường độ cảm nhiễm (CĐCN) Số cá nhiễm ký sinh trùng Tổng số cá kiểm tra TLCN(%) = CĐCN = X 100 Số trùng Con cá/ cơ quan/ lame/ thị trường Với: CĐCN = Số trùng / con cá (trùng lớn và ít) CĐCN = Số trùng / cơ quan (trùng lớn và nhiều) CĐCN = Số trùng / lame (trùng nhỏ và ít) CĐCN = Số trùng / thị trường (trùng nhỏ và nhiều) 3.3.3 Phương pháp định danh vi khuẩn (theo Frerichs and Millar, 1993). Phân tích vi sinh Quan sát dấu hiệu bên ngoài, mổ cá và ghi nhận dấu hiệu của các cơ quan nội tạng mẫu cá còn sống và lờ đờ. Phân lập vi khuẩn từ 3 cơ quan gan, thận, tỳ tạng trên môi trường thạch TSA. Áp dụng nguyên tắc vô trùng để tránh tạp nhiễm. Ủ các đĩa môi trường đã cấy vi khuẩn ở 28-30oC. Sau 18-24 giờ quan sát và ghi nhận đặc điểm hình thái phát triển của khuẩn lạc. Tiếp tục tách ròng, theo dõi để đạt đĩa cấy thuần. Định danh vi khuẩn Sau khi có đĩa cấy thuần tiến hành kiểm tra các chi tiêu cơ bản trên tất cả các chủng vi khuẩn: nhuộm Gram, quan sát tính di động, phản ứng Catalase, Oxidase, phản ứng O/F (Phụ lục B), kiểm tra qua môi trường EIA (Edwardsiella ictaluri agar). Sau đó tiến hành định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20E của hãng BIO MÉRIEUX ( phụ lục C). Theo Popovic et al., (2007) việc dùng bộ test API 20E để định danh là thích hợp. 3.3.4 Phương pháp mô học Cố định mẫu 10 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Mẫu cá cho phân tích phải còn sống hoặc gần chết, cố định mẫu bằng dung dịch Formol trung tính 10%. Sau 24-48 giờ tiến hành rửa dưới vòi nước sau đó chuyển sang cồn 70% để bảo quản và xử lý mẫu. Cắt tỉa và định hướng Mẫu trước khi đưa vào qui trình mẫu phải cắt tỉa và định hướng cho mẫu đạt kích cỡ phù hợp và đưa mẫu vào catsset tiến hành xử lý. Xử lý mẫu (được thực hiện trên máy) Cồn 80% 30phút Cồn 95% 40 phút Xylen 40 phút Cồn 95% 30 phút Xylen 30 phút Paraffin + Xylen (1:1) 1h Cồn100% 40 phút Cồn 100% 1h Paraffin + Sáp ong (1:1) 1h Cồn 100% 40 phút Cồn 100% 1h Paraffin + Sáp ong (7:3) 1h Hình 3.1 Sơ đồ qui trình xử lý mẫu mô Đúc khối Việc đúc khối được tiến hành với paraffin nóng chảy (57- 60oC). Cho một ít paraffin vào khuôn. Sau đó cho mẫu bỏ vào khuôn, đặt mẫu ngay ngắn và ấn mẫu sát với đáy khuôn, tiếp tục đổ paraffin đầy khuôn và để trên bàn lạnh để khối paraffin rắn lại và tách ra khỏi khuôn, mẫu được giữ cố định. Cắt mẫu Sử dụng máy microtome để cắt mẫu với độ dày từ 4-6µm. Để có được mẫu đẹp mẫu phải được làm lạnh trước khi cắt. Mẫu được cắt thành băng dài và cho vào chậu nước nóng từ 45-50oC cho paraffin căng ra dùng kim mũi giáo tách riêng từng đoạn mẫu theo yêu cầu. Dán mẫu lên lame Đặt một đầu lame dính vào lát cắt trong chậu nước ấm nghiêng một góc 45 C và nâng từ từ lên, lát cắt sẽ được dán chặt vào phiến kính. Sau khi dán, làm khô phiến kính bằng cách sấy khô ở nhiệt độ 45oC-50oC trong 24 giờ. o Nhuộm mẫu (Harris’s Haematoxylin & Eosin). 11 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Quá trình nhuộm mẫu được thực hiện trên máy và tiến hành theo qui trình sau: Xylen 1 5 phút Xylen 2 5 phút Rửa nước 5 phút 1% acid alcohol 10 giây Xylen 5 phút Xylen 3 5 phút Cồn 100% 5 phút Cồn 100% 5 phút Haematocylin 1 phút Rửa nước 5 phút Cồn 70% 2 phút Rửa nước 1 phút Eosin 2 phút Cồn 95% 5 phút Xylen 5 phút Cồn 100% 5 phút Cồn 100% 5 phút Hình 3.2 Sơ đồ qui trình nhuộm mẫu mô (H&E) Dán mẫu Để đảm bảo mẫu được giữ lâu và tăng tính chiết quang của mẫu, dùng keo Enterlan phủ lên mẫu và dán lamelle lên mẫu. Nhỏ một giọt keo lên mẫu, đặt lamelle nghiêng 45o và tiếp xúc với giọt keo, hạ lame xuống từ từ để tránh bọt khí Quan sát tiêu bản và đọc kết quả Đọc kết quả theo Ferguson, 2006. Sử dụng kính hiển vi quang học để đọc kết quả. Đầu tiên quan sát mẫu ở độ phóng đại 10X để nhìn tổng quát tiêu bản. Sau đó chuyển qua độ phóng đại 40X, 100X. Chụp hình các tiêu bản đặc trưng. 12 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHẦN IV KẾT QUẢ THẢO LUẬN Trong quá trình theo dõi đã tiến hành thu 4 ao trong đó có 2 ao TGTM, 1ao TGTM kết hợp có xuất hiện mủ gan và 1 ao cá khỏe không bị TGTM tại Hồng Ngự tỉnh Đồng Tháp, cá có chiều dài trung bình là 10±1cm. Tổng cộng thu được 108 mẫu cá, trong đó có 62 mẫu cá bệnh gồm 50 mẫu cá TGTM đơn thuần và 12 mẫu cá TGTM kết hợp với mủ gan. Theo thông tin ghi nhận được từ hộ nuôi nơi thu mẫu cá bị TGTM thường xuất hiện ở giai đoạn cá giống, mức thiệt hại khá cao từ vài trăm đến vài nghìn con/ngày, kéo dài trong khoảng 7-14 ngày. 4.1 Đặc điểm cá khỏe Cá khỏe bơi lội nhanh nhẹn, linh hoạt phản ứng nhanh với tiếng động, bắt mồi mạnh, da trơn láng, cơ thể không bị tổn thương, phần bụng có màu trắng bạc phần lưng có màu xám đen. Khi quan sát bên trong nội tạng bình thường, màu sắc đồng nhất trên từng cơ quan, không có các dấu hiệu sưng hoặc nhũn, không có chất dịch trong xoang nội quan. 4.2 Đặc điểm cá bệnh Khi cá có dấu hiệu TGTM, màu sắc cơ thể cá có những thay đổi rõ rệt như da trắng nhạt, da và mang rất ít chất nhầy, các hoạt động của cá giảm dần như bơi lội yếu, lờ đờ trên mặt nước, phản ứng chậm đối với tiếng động, đôi khi kèm theo hiện tượng tụ huyết dưới miệng, mang màu trắng nhạt. Khi giải phẩu quan sát nội quan của cá, toàn bộ bên trong xoang nội quan cá có màu trắng nhạt như gan trắng, thận trắng nhạt, tỳ tạng nhạt màu, dạ dày không có thức ăn, dạ dầy trướng hơi và có nhiều chất dịch màu vàng nhạt. b b a a Hình 4.1.a. Nội tạng cá khỏe màu sắc đồng nhất Hình 4.2. a. Gan, mang cá TGTM, có màu trắng nhạt b. Nội tạng cá TGTM, toàn bộ có màu trắng nhạt b. Gan, mang cá khỏe, có màu đỏ tươi 13 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com