Tài liệu Công nghệ nuôi cấy tế bào sâm ngọc linh

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC KTCN TPHCM GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP - TỰ DO – HẠNH PHÚC ------------------------ NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHOA:MT & CNSH BỘ MÔN:CNSH HỌ VÀ TÊN: NGUYỄN THỊ THU NGÀNH: CNSH MSSV: 207111055 LỚP: 07CSH 1. Đầu đề Khóa luận tốt nghiệp: CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH 2. Nhiệm vụ (yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu): - Tổng quan về cây Sâm Ngọc Linh - Tìm hiểu một số qui trình nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh 3. Ngày giao Khóa luận tốt nghiệp : 05/04/2010 4. Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 28/06/2010 5. Họ tên người hướng dẫn CN. BÙI VĂN THẾ VINH Phần hướng dẫn Toàn bộ Nội dung và yêu cầu KLTN đã được thông qua Bộ môn. Ngày tháng năm 2010 CHỦ NHIỆM BỘ MÔN NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) CN. BÙI VĂN THẾ VINH PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN Người duyệt (chấm sơ bộ): ………………………………… Đơn vị:……………………………………………………… Ngày bảo vệ:………………………………………………… Điểm tổng kết:……………………………………………… Nơi lưu trữ Khóa luận tốt nghiệp: ………………………… SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH LỜI CẢM ƠN Vậy là ba năm học dưới mái trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ đã kết thúc. Trong suốt thời gian học tập em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ tận tình từ phía thầy cô, gia đình và bạn bè. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới quí thầy cô trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ nói chung cũng như quí thầy cô khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học đã giảng dạy, truyền đạt kiến thức để em có thể vững bước, tự tin với những gì đã được học. Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy Bùi Văn Thế Vinh đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn trong suốt quá trình học tập cũng như trong thời gian làm bài khóa luận tốt nghiệp. Xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ, để em có thêm nhiều động lực hoàn thành tốt khóa học. Do vẫn còn nhiều hạn chế về trình độ và kiến thức nên bài tiểu luận vẫn còn nhiều hạn chế, thiếu sót. Em mong quí thầy cô, bạn bè chỉ dạy, bổ sung và thông cảm để em có thể rút ra nhiều kinh nghiệm làm bài trong quá trình học tập. Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Thu TP.HCM, tháng 7 năm 2010. SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH MỤC LỤC NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN DANH SÁCH CÁC BẢNG BIỂU DANH SÁCH CÁC HÌNH CHƯƠNG I. ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................. 01 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 01 1.2. Mục đích của đề tài ............................................................................................... 02 CHƯƠNG II. TỔNG QUAN ........................................................................... 03 2.1. Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................... 0.3 2.1.1. Khái niệm .....................................................................................................03 2.1.2. Các kỹ thuật nuôi cấy ................................................................................... 04 2.1.3. Môi trường nuôi cấy ..................................................................................... 08 2.1.4. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ......................................................... 09 2.1.5. Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ............. 11 2.2. Giới thiệu cây Sâm Ngọc Linh .............................................................................. 15 2.2.1. Phân loại .......................................................................................................15 2.2.2. Đặc điểm hình thái ........................................................................................ 16 2.2.3. Sinh thái và phân bố ..................................................................................... 18 2.2.4. Hiện trạng và tiềm năng của cây sâm Ngọc Linh .......................................... 19 2.2.5. Thành phần hóa học ...................................................................................... 20 CHƯƠNG III. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH .... 27 3.1. Nuôi cấy mô sẹo ..................................................................................................27 3.1.1. Nguyên liệu ..................................................................................................27 3.1.2. Môi trường ...................................................................................................27 3.1.3. Thiết bị và dụng cụ ....................................................................................... 27 3.1.4. Hóa chất .......................................................................................................27 3.1.5. Qui trình thực hiện ........................................................................................ 28 SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 3.1.6. Điều kiện nuôi cấy ........................................................................................ 28 3.2. Tái sinh chồi từ mô sẹo ......................................................................................... 29 3.2.1. Nguyên liệu ..................................................................................................29 3.2.2. Môi trường ...................................................................................................29 3.2.3. Thiết bị và dụng cụ ....................................................................................... 29 3.2.4. Hóa chất .......................................................................................................29 3.2.5. Qui trình thực hiện ........................................................................................ 29 3.2.6. Điều kiện nuôi cấy ........................................................................................ 29 3.3. Nuôi cấy rễ .......................................................................................................... 30 3.3.1. Nguyên liệu ..................................................................................................30 3.3.2. Môi trường ...................................................................................................30 3.3.3. Thiết bị và dụng cụ ....................................................................................... 30 3.3.4. Hóa chất .......................................................................................................30 3.3.5. Qui trình thực hiện ........................................................................................ 31 3.3.6. Điều kiện nuôi cấy ........................................................................................ 31 3.4. Nuôi cấy sinh khối ............................................................................................... 31 3.4.1. Nguyên liệu ..................................................................................................31 3.4.2. Môi trường ...................................................................................................31 3.4.3. Thiết bị và dụng cụ ....................................................................................... 31 3.4.4. Hóa chất .......................................................................................................32 3.4.5. Qui trình thực hiện ........................................................................................ 32 3.4.6. Điều kiện nuôi cấy ........................................................................................ 32 3.5. Tái sinh cây qua con đường tạo phôi soma ............................................................ 33 3.5.1. Nguyên liệu ..................................................................................................33 3.5.2. Môi trường ...................................................................................................33 3.5.3. Thiết bị và dụng cụ ....................................................................................... 33 3.5.4. Hóa chất .......................................................................................................33 3.5.5. Qui trình thực hiện ........................................................................................ 33 3.5.6. Điều kiện nuôi cấy ........................................................................................ 34 3.6. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến nuôi cấy Sâm Ngọc Linh ........................... 35 3.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của một số loại chất khử trùng ......................................35 SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 3.6.2. Khảo sát ảnh hưởng của các tổ hợp hoocmon lên sự phát sinh hình thái........ 36 3.6.3. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng tạo mô sẹo từ lá và cuống lá .................................................................................................................................37 3.6.4. Ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy ban đầu lên sự tăng sinh mô sẹo ........... 38 3.6.5. Ảnh hưởng của auxin lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lá và cuống lá ........... 39 3.6.6. Ảnh hưởng của auxin lên khả năng tăng sinh mô sẹo Sâm Ngọc Linh .......... 40 3.6.7. Ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo ............... 41 3.6.8. Ảnh hưởng của BA lên quá trình tăng trưởng chồi Sâm Ngọc Linh invitro ...43 3.6.9. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng tăng trưởng chồi ..................... 43 3.6.10. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng chồi invitro .......... 44 3.6.11. Ảnh hưởng của IAA, IBA, NAA đến khả năng ra rễ bất định từ mô sẹo .....45 3.6.12. Ảnh hưởng của IBA và NAA đến khả năng nhân rễ bất định ...................... 46 CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................. 48 4.1. Kết luận ........................................................................................................... 48 4.2. Kiến nghị ......................................................................................................... 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH DANH SÁCH CÁC BẢNG BIỂU Bảng 2.1: Thời gian tối thiểu để hấp khử trùng môi trường nuôi cấy mô ở 1210C ................................................................................................ 13 Bảng 2.2: Nồng độ và thời gian sử dụng 1 số chất xử lí mô cấy thực vật .......... 14 Bảng 2.3: Hàm lượng một số saponin chính trong sâm ..................................... 20 Bảng 2.4: Hàm lượng saponin của Sâm Ngọc Linh so sánh với các loài Panax spp. trồng trọt. ................................................................................. 21 Bảng 2.5: Các saponin chính yếu trong thành phần saponin dẫn chất protopanaxatriol ......................................................................................................................... 21 Bảng 2.6: Acid Oleanolic .................................................................................. 22 Bảng 2.7: Ocotillol ........................................................................................... 22 Bảng 2.8: Các axid béo được tìm thấy............................................................... 23 Bảng 2.9: Thành phần acid amin chủ yếu .......................................................... 24 Bảng 2.10: Các nguyên tố vi lượng ................................................................... 25 Bảng 3.1: Ảnh hưởng của các loại nồng độ khử trùng ....................................... 35 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của các tổ hợp hoocmon lên sự phát sinh hình thái của Sâm Ngọc Linh cấy mô .............................................................................. 36 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng tạo mô sẹo từ lá và cuống lá................................................................................................ 37 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy ban đầu lên sự tăng sinh mô sẹo ....................................................................................................... 38 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của auxin lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lá và cuống lá ................................................................................................... 39 Bảng 3.6: Ảnh hường của auxin lên khả năng tăng sinh mô sẹo Sâm Ngọc Linh .......................................................................................... 40 Bảng 3.7: Khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung BA và NAA ......................................................................................... 42 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của BA lên quá trình tăng trưởng chồi Sâm Ngọc Linh invitro .............................................................................. 43 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH tăng trưởng chồi ................................................................................................ 44 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng chồi invitro ............................................................................................ 44 Bảng 3.11: Ảnh hưởng của IAA, IBA, NAA đến khả năng ra rễ bất định từ mô sẹo .................................................................................... 45 Bảng 3.12: Ảnh hưởng của IBA và NAA đến khả năng nhân rễ của mẫu có nguồn gốc từ môi trường bổ sung NAA.......................................... 47 Bảng 3.13: Ảnh hưởng của IBA và NAA đến khả năng nhân rễ của mẫu có nguồn gốc từ môi trường bổ sung IBA ........................................... 47 SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Sâm Ngọc Linh ngoài tự nhiên .......................................................... 15 Hình 2.2: Hình thái Sâm Ngọc Linh .................................................................. 16 Hình 2.3: Cây Sâm Ngọc Linh .......................................................................... 17 Hình 3.1: Mô sẹo Sâm Ngọc Linh ..................................................................... 28 Hình 3.2: Chồi Sâm Ngọc Linh ......................................................................... 30 Hình 3.3: Rễ Sâm Ngọc Linh ............................................................................ 31 Hình 3.4: Nuôi cấy trong Bioreactor ................................................................. 32 Hình 3.5: Phôi vô tính Sâm Ngọc Linh ............................................................. 34 SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Dương Tấn Nhựt và cộng sự, Đề tài “ Hoạt chất saponin từ các nguyên liệu nuôi cấy invitro của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, Trung Tâm Sâm và Dược Liệu TP. HCM. 2. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2006), Công nghệ tế bào, Nxb ĐHQG TP. HCM. 3. Nguyễn Ngọc Dung, Nhân giống Sâm Ngọc Linh bằng con đường sinh học, Nxb Nông Nghiệp. 4. Nguyễn Ngọc Duy (1995), Nhân giống Sâm Ngọc Linh bằng con đường sinh học và kinh nghiệm trồng Nhân Sâm ở Khai Thành Triều Tiên, Nxb Nông Nghiệp. 5. Nguyễn Thanh Bình, Nguyễn Ngọc Duy (1996), Thăm dò khả năng nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy mô invitro cây Sâm Ngọc Linh và một số cây trong dự án chuyên ngành lâm nghiệp, Trường Đại Học Nông Lâm Tp. HCM. 6. PGS. TS. Lê Văn Hoàng, Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật, Đại học Đà Nẵng. 7. PGS. TS. Trần Văn Minh (1994), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM. 8. Viện Dược Liệu, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam (Tập II), Nxb KH & KT. 9. Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn, Sinh lý học thực vật, Nxb GD. 10. http://www.nhasinhoctre.com/forum/viewtopic.php?f=47&t=4450 SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH PHỤ LỤC  Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962): Khoáng đa lượng (mg l-1) NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCL2.2H2O 440 Mg2SO4.7H2O 370 KH2PO4.7H2O 170 Khoáng vi lượng KI H3BO4 (mg l-1) 0.83 6.2 MnSO4.4H2O 22.3 ZnSO4.7H2O 8.6 Na2MoO4.2H2O 0.25 CuSO4.5H2O 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 Na2.EDTA 27.8 Vitamin và các chất hữu cơ khác (mg l-1) Myo-Inositol 100 Nicotinic acid 0.5 Pyridoxine HCl 0.5 Thiamine HCl 0.1 Glycine 2.0 SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH CHƯƠNG I. ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1. Đặt vấn đề: Nhân sâm Panax ginseng C. A. Meyer là cây dược liệu được sử dụng từ hàng ngàn năm nay. Những tác dụng y học của Nhân Sâm, được dùng trong y học cổ truyền, hiện đã được chứng minh theo nguyên lý của y học hiện đại. Nhân Sâm từ cây thuốc huyền thoại của phương Đông đã xuất hiện rộng rãi ở phương Tây, với những sản phẩm thương mại đa dạng. Nhân Sâm ngày nay là cây thuốc mang lại giá trị kinh tế to lớn. Việt Nam tự hào có được một loài Nhân Sâm đặc hữu là Sâm Ngọc Linh (hay còn gọi là Sâm Khu Năm) Panax vietnamensis Ha & Grutzv., được biết đến trên thế giới với tên gọi Vietnamese ginseng. Sâm Ngọc Linh có thành phần ginsenosid, dược chất chính trong Nhân sâm, được đánh giá vào loại nhiều nhất so với các loài khác của chi Panax trên thế giới. Tuy nhiên, Sâm Ngọc Linh được phát hiện khá muộn (vào năm 1985) cho nên, tuy có nhiều cố gắng để phát triển cây thuốc quý giá này nhưng tiềm năng của Sâm Ngọc Linh vẫn chưa hoàn toàn được đánh thức. Cộng với địa bàn phân bố hẹp (chỉ có ở vùng núi Ngọc Linh), lại bị khai thác bừa bãi, nên Sâm Ngọc Linh sớm đứng trước nguy cơ tuyệt chủng. Với nỗ lực của những địa phương có Sâm Ngọc Linh phân bố, hiện nay loài dược liệu này đã có thể tránh bị tuyệt diệt. Nhưng để đưa Sâm Ngọc Linh thành cây thuốc ngang hàng với các loại Nhân sâm có trên thị trường dược liệu cả về số lượng và chất lượng, cần có nhiều nghiên cứu chuyên sâu ứng dụng sản xuất hiệu quả. Trên thế giới, cây Nhân Sâm Panax ginseng C. A. Meyer đã được nhân giống và sản xuất dược chất ginsenosid thành công bằng nuôi cấy mô. Ginsenosid chiết từ mô sẹo trong nuôi cấy mô cây Nhân sâm có cùng dạng với ginsenosid thu từ rễ Nhân Sâm tự nhiên, tác dụng dược lý của dịch chiết bằng rượu hoặc bằng methanol và bột ginsenosid từ mô sẹo hầu như giống với dịch chiết và bột thu từ rễ Nhân Sâm tự nhiên. Do đó đã có các hệ thống nuôi cấy lớn như bioreactor dùng để sản xuất ginsenosid theo quy mô công nghiệp, cung cấp cho thị trường tiêu thụ ngày càng rộng lớn, khắc phục được những hạn chế trong canh tác cây Nhân Sâm như: thời gian trồng kéo dài, bị giới hạn về khí hậu, thổ nhưỡng, nhiều sâu bệnh... SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Sâm Ngọc Linh được cả thế giới biết đến với tên gọi Vietnamese ginseng nhưng không có nhiều nhà khoa học quốc tế lưu ý nghiên cứu về nó. Việt Nam cần tự nghiên cứu cũng như sản xuất, cố gắng đánh thức giá trị y học và giá trị kinh tế của Sâm Ngọc Linh. Trong các hướng nghiên cứu, hướng nuôi cấy mô đã thật sự đưa nông nghiệp lên bước phát triển tiên tiến, vì vậy muốn nghiên cứu đưa cây Sâm Ngọc Linh phát triển theo hướng hiện đại, mang lại hiệu quả kinh tế cao không thể bỏ qua kỹ thuật này. Thực tế, cây Sâm Ngọc Linh đã được nhân giống thành công từ mô sẹo. Nhưng tiến hơn một bước để sản xuất ginsenosid Sâm Ngọc Linh bằng nuôi cấy mô thì chưa có nghiên cứu nào được công bố. Với mong muốn tìm hiểu về loại cây trồng có giá trị kinh tế này cùng với những công nghệ nuôi cấy tế bào đã và đang được thực hiện nhằm mục đích nhân giống và sản xuất các hợp chất có giá trị kinh tế, tôi đã thực hiện khóa luận tốt nghiệp: “Công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) dưới sự hướng dẫn của thầy Bùi Văn Thế Vinh. 1.2. Mục đích của đề tài: - Tổng quan về Sâm Ngọc Linh. - Tìm hiểu một số công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh. SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH CHƯƠNG II. TỔNG QUAN 2.1. Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.1. Khái niệm Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật ( tế bào đơn, mô, cơ quan…) trong điều kiện vô trùng.  Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên hai nguyên tắc: - Dựa vào tính toàn năng của tế bào: Mỗi một tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi. Mỗi tế bào là một hệ thống mở, tự duy trì và tự sản xuất để tiến hành các chức năng chuyên biệt và sản sinh thế hệ tế bào mới nếu cần thiết. - Dựa vào khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào: Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi thể hiện một chức năng nào đó. Các tế bào dùng trong môi trường cấy đều có khả năng biệt hóa về cấu trúc và chức năng. Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng - tế bào phôi và quá trình đó gọi là quá trình phản biệt hóa. Vì vậy những tế bào càng gần với trạng thái của tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu.  Ý nghĩa: - Nhân nhanh giống cây trồng. - Bảo quản nguồn gen. - Tạo cây sạch bệnh. - Sản xuất các hoạt chất sinh học. - Mang tính công nghiệp  Sơ lược lịch sử phát triển: SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP - GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 1665: Robert Hooke quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra khái niệm tế bào. - 1838: Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào. - 1904: Hannig nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài họ cải. - 1934: Kogl xác định vai trò của IAA. - 1951: Skoog nghiên cứu sử dụng các hoá chất điều hoà sinh trưởng và phát sinh cơ quan. - 1952: Morel và Martin thực hiện vi ghép invitro thành công. - 1962: Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy tế bào thực vật. - 1964: Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt. - 1969: Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy tế bào dịch lỏng (huyền phù) của Hapopappus gracilis. - 1973: Phát hiện Cytokinin có khả năng phá ngủ ở Gerberas. - 1978: Marton và cộng sự xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần. - 1983: Công ty Mitsui Petrochemicals lần đầu tiên đã sản xuất chất trao đổi thứ cấp trên quy mô công nghiệp bằng nuôi cấy tế bào dịch lỏng Lithospermum spp. Mitsui .0Petrochemicals. - 1988: Klein và cộng sự tái sinh cây chuyển gen bằng phương pháp bắn gen. - 1994: Thương mại hóa giống cà chua chuyển gen FlavrSavr. 2.1.2. Các kỹ thuật nuôi cấy 2.1.2.1. Nuôi cấy phôi Phôi phát triển qua hai giai đoạn dị dưỡng và tự dưỡng. Ở giai đoạn dị dưỡng cần có các chất điều hòa sinh trưởng để phát triển. Trong nuôi cấy phôi, đường đóng vai trò rất quan trọng, đường sucrose cho nhiều kết quả tốt hơn. Ngoài ra một số chất tự nhiên như nước dừa, dịch chiết malt, casein thủy phân là những chất rất cần trong nuôi cấy phôi. Đối với các chất điều hòa sinh trưởng, auxin thường dùng ở nồng độ thấp, kinetin có vai trò đặc biệt cho sự phát triển của phôi. Nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi, thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ, ánh sáng thấp hơn phôi phát triển tự nhiên. Nhiệt độ 25 ± 2oC SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH thích hợp cho sinh trưởng và nảy mầm của phôi. Các phôi thứ cấp rất khó sinh trưởng đã hoạt động khi chúng được tách rời và nuôi ở điều kiện chiếu sáng 4.000 lux hoặc hơn trong 4 giờ chiếu sáng suốt 4 ngày nuôi đầu tiên.  Kỹ thuật nuôi cấy phôi mang lại nhiều hiệu quả như: - Nhân giống cây trồng. - Thử sức sống của phôi hạt. - Duy trì phôi yếu và cứu phôi lai xa. - Sản xuất hạt nhân tạo mà bản chất là tế bào phôi. 2.1.2.2. Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời Trong nuôi cấy mô và cơ quan tách rời, khâu chọn mẫu có tầm quan trọng đặc biệt, mẫu phải ở tình trạng sinh lý tốt và đang phát triển. Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây là khác nhau nhưng có một số yêu cầu chung như nguồn carbon, nguồn đường, nguyên tố đa lượng, vi lượng và các chất điều hòa sinh trưởng. Muốn duy trì sinh trưởng và phát triển của cơ quan nuôi cấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môi trường mới. Đối với nuôi cấy mô cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ dưới dạng acide amine, đường và inositol. Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng hơn vì các mô tách rời không có khả năng tổng hợp các chất này.  Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời được ứng dụng trong: - Nghiên cứu điều kiện sinh trưởng đối với một bộ phận hoặc một mô của cây. - Nhân cây invitro. - Tạo mô sẹo phục vụ cho các nghiên cứu như chọn dòng tế bào, đột biến soma,… 2.1.2.3. Nuôi cấy mô phân sinh SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Đặc điểm của mô phân sinh là chứa các tế bào non trẻ, phân chia mạnh, không bị virus xâm nhập, vì vậy mô phân sinh là mô duy nhất của cây sạch virus. Mô phân sinh thường là các mô đỉnh chồi và cành. Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm non, các chồi mới hình thành hoặc các cành non. Trong nuôi cấy sự cân bằng giữa các chất điều hòa sinh trưởng rất quan trọng. Muốn tạo chồi cần bổ sung cytokinin hoặc tổ hợp cytokinin với auxin, muốn tạo rễ thì bổ sung auxin.  Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng trong: - Tạo cây sạch virus. - Nhân giống invitro. - Tạo cây đa bội qua xử lý colchicin. - Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan. 2.1.2.4. Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn Ưu điểm của nuôi cấy bao phấn là đơn giản về thao tác kỹ thuật và môi trường nuôi cấy, nhưng có thể tạo ra cả cây lưỡng bội từ soma của thành bao phấn, do vậy sẽ khó phân biệt với cây tự lưỡng bội từ cây đơn bội. Hạt phấn nuôi cấy có thể phát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy invitro bằng con đường tạo phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tạo mô sẹo và tạo cơ quan. Phương pháp tạo cây đơn bội kép và phương pháp chọn lọc tạo giống có hiệu quả chọn lọc rất cao, đặc biệt nếu được kết hợp với các phương pháp tạo ra các biến dị di truyền khác nhau như lai hữu tính hoặc gây đột biến nhân tạo. Thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi tùy thuộc vào kiểu gen và tuổi của bao phấn cũng như các điều kiện mà ở đó cây cho bao phấn sinh trưởng. Quá trình sinh trưởng về sau của phôi hạt phấn đòi hỏi bổ sung các muối khoáng vào môi trường. Tần số phát sinh cây đơn bội và sinh trưởng của cây nói chung sẽ tốt hơn nếu chúng được nuôi trong điều kiện chiếu sáng, mặc dù cây hạt phấn của một số kiểu gen sinh trưởng trong cả hai điều kiện có chiếu sáng và trong tối.  Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn được dùng cho tạo các dòng thuần để: - Nghiên cứu gen lặn vì chúng không biểu hiện ở cơ thể dị hợp tử. SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP - GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Chọn các dòng đột biến. 2.1.2.5. Nuôi cấy tế bào đơn Tế bào đơn có thể nhận được bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý enzyme. Sau đó chúng được nuôi cấy dịch lỏng, có khuấy hoặc lắc tạo điều kiện thuận lợi cho sự trao đổi khí và tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng. Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trong môi trường đặc biệt và tăng sinh khối. Mỗi loại cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác nhau. Yêu cầu dinh dưỡng cho nuôi cấy tế bào đơn khá phức tạp, do chúng bị mất nhiều chất cần thiết cho sinh trưởng khi tách rời khỏi quần thể tế bào.  Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng cho các mục đích: - Chọn dòng tế bào. - Nghiên cứu cấu trúc tế bào, phát triển và phân hóa tế bào trong những điều kiện khác nhau. - Thu nhận các chất trao đổi thứ cấp. 2.1.2.6. Nuôi cấy protoplast Tế bào trần là tế bào đã được tách bỏ thành tế bào bằng phương pháp cơ học hay sử dụng enzyme. Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast có thể tái sinh thành tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Ưu thế của kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào trần là tế bào không có màng cứng, ở trạng thái đơn bào, mật độ tế bào thu được trên 1 đơn vị thể tích môi trường có thể rất cao (đạt 106 tế bào/1ml môi trường).  Ứng dụng nuôi cấy protopast: - Tạo ra cây lai soma. - Chuyển các bào quan và chuyển gen. Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài. - Quá trình sinh tổng hợp màng tế bào. 2.1.3. Môi trường nuôi cấy  Thành phần môi trường nuôi cấy gồm năm thành phần cơ bản sau: SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH - Muối khoáng đa lượng. - Muối khoáng vi lượng - Vitamin. - Nguồn carbon. - Chất điều hòa sinh trưởng. - Ngoài ra có thể bổ sung các thành phần không xác định (nước dừa, dịch chiết nấm men,…) và agar.  Môi trường nuôi cấy có thể chia thành ba loại: - Môi trường nghèo dinh dưỡng: White, Knop. - Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: Gamborg. - Môi trường giàu dinh dưỡng: MS. Cơ sở cho việc xây dựng các môi trường nuôi cấy là xem xét các thành phần cần cho sự sinh trưởng và phát triển của cây. Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy. Tế bào mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôi cấy. Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. Vì vậy cần điều chỉnh độ pH môi trường thích hợp trước khi nuôi cấy. Thường sử dụng NaOH hay HCl loãng để điều chỉnh độ pH. 2.1.4. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 2.1.4.1. Auxin SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô thực vật. IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật, còn NAA, IBA, 2,4-D là các auxin nhân tạo, thường các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn. Chúng có mặt ở các bộ phận của cây như mô phân sinh đỉnh, các bộ phận non khác của cây.  Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: - Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu. - Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy. - Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy. - Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh. - Đặc tính của auxin.  Vai trò của các chất thuộc nhóm auxin: - Kích thích phân chia và kéo dài tế bào. - Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên. - Kích thích sự phân hoá của các mô dẫn. - Ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín của quả, sự ra hoa trong mối quan hệ với điều kiện môi trường. - Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus). - Kích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp). - Tạo phôi soma (2,4-D). 2.1.4.2. Cytokinin Các cytokinin là dẫn xuất của adenine. Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là BAP, Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo. Chúng được hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng. Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các hệ thống nuôi cấy. Đối với sự phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin/ cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi và chồi nách. Cytokinin có mặt trong mô phân sinh đỉnh rễ, quả non.  Chức năng chủ yếu của các cytokinin: - Kích thích phân chia tế bào. SVTH: NGUYỄN THỊ THU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH - Tạo và nhân callus. - Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô. - Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh . - Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào. - Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài. - Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) . - Ức chế sự hình thành rễ. - Ức chế sự kéo dài chồi. - Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục. 2.1.4.3. Gibberellin Trong số hơn 20 chất thuộc nhóm gibberellin, GA3 là chất được sử dụng nhiều hơn cả trong thực tiễn. GA3 kích thích kéo dài chồi và nảy mầm của phôi vô tính.. GA3 có tính hoà tan trong nước. Gibberellin được tạo ra trong đỉnh rễ, chồi, lá non, hạt.  Gibberellin có các chức năng cơ bản sau: - Kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào. - Phá ngủ hạt giống hoặc củ giống. - Kiểm soát sự ra hoa của các cây 2 năm tuổi. - Ức chế sự hình thành rễ bất định. - Kích thích sinh tổng hợp của α-amylase ở hạt cây ngũ cốc nảy mầm. - Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ). - Kích thích sự nảy mầm của phấn hoa và sinh trưởng của ống phấn. - Có thể gây tạo quả không hạt hoặc làm tăng kích thước quả nho không hạt. - Có thể làm chậm sự hoá già ở lá và quả cây có múi. 2.1.4.4. Abscisic acid (ABA) Abscisic acid là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật tự nhiên được tạo ra trực tiếp từ acid mevalonic hoặc do sự phân giải carotenoid. Chúng được tạo ra trong lá, quả, mũ rễ, hạt.  Các tác dụng cơ bản của ABA là: - Kích thích sự rụng lá, hoa, quả ở hầu hết các cây trồng và gây ra sự nứt quả SVTH: NGUYỄN THỊ THU