Tài liệu Báo cáo thí nghiệm vi sinh thực phẩm

MỞ ĐẦU Thực tập VI SINH THỰC PHẨM nhằm vừa cung cấp những kiến thức cơ bản vừa cung cấp những kiến thức chuyên sâu trong lĩnh vực kiểm tra, phân tích sự hiện diện của vi sinh vật trong thực phẩm từ đó giúp sinh viên có được khả năng làm việc trong phòng thí nghiệm, có khả năng phân tích và đánh giá chất lượng thực phẩm nhanh với độ tin cậy cao. Nắm được các phương pháp và thao tác sinh viên có thể độc lập trong nghiên cứu ở phòng thí nghiệm. 1 BÀI 1. CHUẨN BỊ DỤNG CỤ và MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY I. MỤC ĐÍCH Điều kiện sống của các loại vi sinh vật khác nhau thường không giống nhau, sự tồn tại và phát triển của vi sinh vật bị ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố như nhiệt độ, aw, pH, ánh sáng, các chất tẩy rửa, muối kim loại, cồn…Vì vậy mục đích của bài thí nghiệm này là giúp rèn luyện kỹ năng rửa dụng cụ, bao gói, khử trùng, pha các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật cũng như khử trùng, bảo quản các môi trường nuôi cấy vi sinh vật II. PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 2.1 Nguyên vật liệu: Hoá chất và dụng cụ được chuẩn bị để sử dụng cho các bài thực tập từ 1 đến 6 - Cồn 5 lít - Bông không thấm nước 0,5 kg - Bông thấm nước 0,5 kg - Nước cất vô trùng 15 lít - Giấy báo - Xà bông 1,0kg - Găng tay y tế (sử dụng 1 lần) 20 đôi ( 1 sinh viên / 1 đôi) - Băng keo 4 cuồn - Diêm quẹt 1 cái quẹt gas - Chổi rửa dụng cụ lớn 10 cây - Chổi rửa dụng cụ nhỏ 10 cây 2.2 Hóa chất Các môi trường nuôi cấy dùng trong các bài thực tập 2, 3, 4, 5 và 6 Bảng 1.1. Các loại môi trường cần chuẩn bị Môi trường nuôi cấy Khối lượng / 2 nhóm - Nutrient Agar 0,25kg - VRBL Agar 0,125kg - Brilliant Green Bile Lactose 0,125kg - Desoxycholate Agar 0,125kg - Canh MRVP 0,125 kg 2 - Nước pepton đệm 0,125lit - Canh tetrathionate 0,125kg - Sabouraud 0,125 kg - Mannitol Salt Broth (MSB) 0,125 kg - Tellurite Glycerin Agar (TGA) 0,125 kg - Brain Heart Infusion (BHI) 0,125 kg - Eosine Methylene Blue Agar (EMB) 0,125 kg - Tryptic soy broth (TSB) 0,125 kg - Iron Sulphite Agar 0,25 kg - Xanh methylen 0, 010g - Dầu soi kính 100 ml 2.3 Dụng cụ thí nghiệm - Hộp đựng phiến kính, lá kính, đĩa petri - Ống nghiệm, ống hút, ống đong các loại - Đũa thuỷ tinh, que gạt, que cấy, đèn cồn - Bình tam giác các loại - Cốc (beaker) các loại - Giá để ống nghiệm - Bình chứa môi trường - Dao, kẹp inox, bếp gas, bếp điện - Viết không xoá - Nhãn dán mẫu 2.4 Thiết bị sử dụng - Tủ cấy - Nồi hấp tiệt trùng III. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Xử lý dụng cụ Nguyên tắc Các loại dụng cụ dùng để nuôi cấy vi sinh vật phải đạt độ trung tính, sạch. Vì vậy khâu xử lý dụng cụ bao gồm hai giai đoạn: trung tính dụng cụ và rửa dụng cụ. 3 Phương pháp a. Trung tính dụng cụ - Đổ vào bên trong dụng cụ nước có pH= 7 để kiểm tra độ trung tính. - Nếu pH > 7 ngâm vào trong dung dịch HCl 2%, rửa lại thật kỹ bằng nước sạch. - Nếu pH<7 ngâm vào trong xà bông, rửa lại thật kỹ bằng nước sạch. b. Rửa dụng cụ - Nếu dụng cụ có dính dầu, mỡ hoặc vazơlin thì phải dùng vải chùi sạch, sau đó ngâm vào trong nước xà bông, đun sôi khoảng 15 phút. Sau đó rửa lại bằng nước sạch, để ráo rồi ngâm vào trong cồn 900, lấy ra lau khô. - Nếu dụng cụ bị nhiễm khuẩn, phải tiệt trùng ở 1210C trong 30 phút, sau đó đổ hết các vật phẩm (nếu có), ngâm vào trong nước ấm, rửa lại bằng xà bông và bằng nước sạch, cuối cùng sấy khô ở 370C. 3.2 Bao gói dụng cụ Nguyên tắc Dụng cụ sử dụng trong kiểm tra vi sinh vật phải thật sạch và khô. Nên việc bao gói dụng cụ phải được thực hiện, bao gói phải thật kín và cẩn thận để dụng cụ sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự vô trùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng. Phương pháp Làm nút bông: sử dụng bông không thấm nước để làm nút bông. Nút bông có kích thước, độ chặt vừa phải, đầu nút tròn, gọn, phần ngoài lớn hơn phần trong nút lấy ra hay đóng lại dễ dàng Giấy bao phải chặt và kín. Sử dụng giấy dầu với dụng cụ khử trùng nhiệt ướt và giấy báo với các dụng cụ khử trùng nhiệt khô. 3.3 Khử trùng dụng cụ Nguyên tắc Vật phẩm và dụng cụ cần phải đạt được độ vô trùng tuyệt đối, không làm thay đổi chất lượng mẫu vật. Phương pháp a. Khử trùng nhiệt khô Dụng cụ được bao gói cẩn thận. Sấy ở nhiệt độ 1600C trong 2 giờ hay 1800C trong 30 phút. Tắt tủ sấy, để nguội đến 600C rồi mới lấy dụng cụ. b. Khử trùng nhiệt ướt Thường dùng để khử trùng môi trường nuôi cấy vi sinh vật. - Cho nước vào ngập điện trở của autoclave. - Xếp dụng cụ vào hộp inox và đưa vào thiết bị tiệt trùng. - Điều chỉnh nhiệt độ, thời gian khử trùng, thời gian sấy (thông thường nhiệt độ khử trùng là 1210C, thời gian 15 phút, thời gian sấy là 15 phút). 4 - Sau khi khử trùng xong chờ kim áp kế về 0 mới mở nắp thiết bị khử trùng rồi lấy dụng cụ, vật liệu đã khử trùng ra. 3.4 Pha các môi trường đông khô - Cân chính xác lượng môi trường theo hướng dẫn trên bao bì. - Dùng bình định mức để đong thể tích nước cần sử dụng - Sử dụng một lượng nhỏ nước để hoà tan lượng môi trường vừa cân, chuyển huyền phù này vào trong bình đựng môi trường. Phần nước còn lại dùng để tráng dụng cụ chứa môi trường nhiều lần sao cho không còn môi trường dính trên thành dụng cụ. - Đun cách thuỷ môi trường trong bình chứa đến khi tan hoàn toàn. - Chuyển môi trường vừa pha vào các bình chứa với thể tích thông thường khoảng 300ml rồi đem đi khử trùng. IV. TƯỜNG TRÌNH THÍ NGHIỆM 1 Trình bày các nguyên tắc cơ bản của việc xử lý , bao gói các dụng cụ 2. Thực hành rửa và bao gói các loại dụng cụ: ống nghiệm, ống hút, que gạt, đĩa Petri, bình tam giác, phiến kính…. 3. phân tích cơ sở vi sinh vật học của các phương pháp khử trùng: Pasteur, Tyndal, tủ sấy. 4. Tóm tắt cách sử dụng nồi hấp áp suất cao 5. Thực hành lọc khử trùng môi trường bằng bình lọc Seilz và kiểm tra độ vô trùng của dịch lọc 6. Trình bày nguyên tắc hoạt động và cấu tạo của tủ cấy vô trùng 7. Trình bày các bước tiến hành khi pha môi trường nuôi cấy vi sinh vật 8. Trình bày phương pháp khử trùng và bảo quản môi trường nuôi cấy vi sinh vật 5 BÀI 2. KIỂM TRA SỐ LƯỢNG VÀ QUAN SÁT HÌNH DẠNG TẾ BÀO NẤM MEN BẰNG KÍNH HIỂN VI I. MỤC ĐÍCH Một trong những phương pháp định lượng vi sinh vật là sử dụng kính hiển vi, phương pháp này được áp dụng rất nhiều khi kiểm tra mật số vi sinh vật trong quá trình lên men nhằm cho kết quả nhanh, tạo điều kiện cho nhà sản xuất có phương pháp xử lý thích hợp. Vì vậy mục đích của bài thực tập này giúp sinh viên hiểu và nắm được cấu tạo, chức năng của các bộ phận chính của kính hiển vi quang học và nắm được các kỹ năng như kỹ năng sử dụng kính hiển vi quang học, đặc biệt là sử dụng vật kính dầu; kỹ năng bảo quản thường xuyên và định kỳ kính hiển vi; kỹ năng xác định số lượng vi sinh vật trên đơn vị mẫu bằng buồng đếm hồng cầu (Goriaep); kỹ năng xác định số lượng vi sinh vật trên đơn vị mẫu bằng cách đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa. II. PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 2.1 Nguyên vật liệu: - Khóm - Đường - Nấm men Saccharomyces cerevisiae 2.2 Hóa chất - Xanh methylen - Dầu soi kính - Cồn 2.3 Dụng cụ thí nghiệm - Đĩa Petri, ống nghiệm, bình tam giác 250ml - Buồng đếm hồng cầu - Micropipette 1ml, 5ml - Cối, chày sứ, quẹt gas, que gạt…. 2.4 Thiết bị sử dụng - Kính hiển vi quang học III. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Chuẩn bị mẫu - Chuẩn bị dịch nuôi cấy Khóm  Xử lý Ép  Lọc  Phối chế  Thanh trùng  Lên men. Kiểm tra mật số nấm men, tỉ lệ tế bào nảy chồi, tỉ lệ tế bào chết theo thời gian 6 3.2 Thực hành sử dụng kính hiển vi quang học thông thường Nguyên tắc Ảnh thực của mẫu vật mà ta quan sát được thông qua vật kính và thị kính có độ phóng đại của ảnh bằng tích số giữa độ phóng đại của vật kính với độ phóng đại của thị kính. Ví dụ: - Độ phóng đại của thị kính là 10 lần (X 10) - Độ phóng đại của vật kính là 40 lần (X 40) - Như vậy độ phóng đại của ảnh là 10 X 40 = 400 lần Cấu tạo (hình 2.1) Kính hiển vi quang học thông thường gồm có 2 bộ phận chính Bộ phận cơ học Có cấu tạo khá đơn giản gồm 3 phần chính: giá kính, ống kính và bàn kính - Giá kính: có cấu tạo vững chắc để làm chỗ dựa chủ yếu cho rất nhiều bộ phận như ống kính, trụ mang ống kính và bàn kính - Ống kính là một ống tròn (kính 1 mắt) hay hai ống tròn (kính 2 mắt). Ống này có thể di động theo hướng của người sử dụng. Phía trên ống kính là 1 hoặc 2 thị kính. Phần dưới ống kính là một bàn quay có gắn nhiều vật kính khác nhau. Ống kính có thể di chuyển lên hay xuống nhờ các ốc điều chỉnh theo hai chiều ngược nhau + Ốc di chuyển nhanh (ốc chỉnh thô): có nhiệm vụ tìm ảnh của vật + Ốc di chuyển chậm (ốc chỉnh tinh): sau khi thấy ảnh của vật mới điều chỉnh ốc này để thấy ảnh rõ nét hơn - Bàn kính: bàn kính dùng để đặt tiêu bản. trên bàn có 2 ốc để di chuyển tiêu bản theo 2 chiều khác nhau và có 2 kẹp bằng thép để giữ tiêu bản. 7 Thị kính Ống kính Tay cầm Vật kính Bàn kính Kẹp Ốc chỉnh thô Kính tụ quang Ốc chỉnh tinh Nguồn sáng Bệ đỡ Hình 2.1. Sơ đồ cấu tạo của kính hiển vi quang học thông thường Bộ phận quang học Bộ phận quang học là bộ phận quan trọng nhất của kính hiển vi. Cấu tạo của nó gồm : vật kính, thị kính, kính tụ quang và gương phản chiếu . - Vật kính Gồm nhiều thấu kính ghép lại có vai trò phóng đại mẫu vật. Có 4 loại vật kính với 4 độ phóng đại khác nhau là (X 10), (X 20), (X 40), (X 100). Các chỉ số này được ghi rõ trên vật kính, (X 10 là độ phóng đại 10 lần,… X 100 là độ phóng đại 100 lần ). Vật kính dầu là những vật kính có độ phóng đại lớn (X100). Khi quan sát tiêu bản phải sử dụng dầu, Vật kính khô (X 10,X 20, X 40) là vật kính khi quan sát không phải sử dụng dầu. Muốn có ảnh rõ và sáng thì khi quan sát mẫu vật trên kính hiển vi ở bội giác lớn thì cần bổ sung một loại dầu có độ chiết quang tương đương với độ chiết quang của thuỷ tinh. Nhỏ một giọt dầu lên tiêu bản, dầu sẽ chiếm khoảng không gian giữa tiêu bản và vật kính thay cho không khí. Nhờ đó, giữa thuỷ tinh và dầu tạo thành một 8 môi trường tương đối đồng nhất nên ánh sang đi qua không bị khúc xạ mà chiếu thẳng vào kính - Thị kính Được lắp ở phần đầu của ống kính, thị kính được cấu tạo từ hai thấu kính. Mỗi loại thị kính có độ phóng đại khác nhau, được ghi ở ngoài của thị kính (7X, 15X). Ảnh quan sát được là ảnh ảo và ngược của vật với độ phóng đại bằng tích số giữa độ phóng đại của vật kính và thị kính đang dùng. - Kính tụ quang Kính này nằm dưới bàn kính, gồm 1 hệ thống thấu kính ghép lại có tác dụng tập trung ánh sang nên rất cần khi sử dụng vật kính dầu. Kính tụ quang có thể điều chỉnh lên hoặc xuống. Đây là hệ thống chắn ánh sáng cho phép ta điều chỉnh lượng ánh sang đi vào nhiều hay ít - Gương phản chiếu Lắp dưới kính tụ quang, có nhiệm vụ hướng chùm tia sáng vào kính tụ quang. Gương này gồm hai mặt lõm và phẳng, có thể quay các hướng để thu ánh sang từ nguồn sáng Cách sử dụng Các thao tác điều chỉnh nguồn ánh sáng - Đưa vật kính vào vị trí có thể nhận được nguồn sáng - Cắm điện và bật công tắc đèn - Mắt nhìn vào thị kính đồng thời dùng tay phải để điều chỉnh gương phản chiếu để tập trung nguồn ánh sang vào tâm điểm của thị trường quan sát - Điều khiển kính tụ quang bằng tay trái Các thao tác điều chỉnh vật kính và quan sát tiêu bản - Đặt tiêu bản lên bàn kính và kẹp chặt lại - Nhìn vào thị kính, điều chỉnh tiêu bản để chọn được vùng quan sát Cách bảo quản kính sau khi sử dụng - Bảo quản kính sau khi sử dụng kính - Bảo quản định kỳ trong năm 3.3 Tiến hành thí nghiệm: xác đinh trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật bằng phiến kính có khung đếm Goriaep (phòng đếm hồng cầu) 1. Pha loãng dịch nấm men đã được nuôi cấy thuần chủng sau 0, 1, 2, 3 và 4 ngày lên men 2. Quan sát hình dạng, đo kích thước và đếm mật số tế bào nấm men 3. Đếm số tế bào nảy chồi 4. Đếm số tế bào chết 9 IV. TƯỜNG TRÌNH THÍ NGHIỆM 1. Trình bày cấu tạo và chức năng của các bộ phận chủ yếu trong kính hiển vi quang học 2. Vẽ và chú thích hình dạng, kích thước của nấm men theo thời gian lên men 3. Áp dụng công thức để tính số lượng nấm men trong huyền phù nuôi cấy chúng ở các ngày lên men khác nhau, từ đó vẽ đường cong sinh trưởng của nấm men theo thời gian lên men. 4. Tính số lượng tế bào nấm men nảy chồi và số lượng tế bào nấm men chết ở các ngày lên men khác nhau. Thảo luận kết quả thu được. 10 BÀI 3. KIỂM TRA MỘT SỐ LOẠI VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM RẮN I. MỤC ĐÍCH Giúp cho sinh viên làm quen, nắm được các thao tác cũng như áp dụng lý thuyết đã học vào trong quá trình kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh có trong thực phẩm. Nội dung bài thực tập giúp sinh viên biết phương pháp chuẩn bị môi trường, mẫu, cách lấy mẫu, phương pháp nuôi cấy, kiểm tra vi sinh vật trong các sản phẩm thực phẩm. Từ đó xác định mức độ nhiễm của vi sinh vật trong thực phẩm. II. PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 2.1 Nguyên vật liệu: - Thịt - Cá - Đồ hộp - Cồn - Bông gòn - Nước cất vô trùng - Muối tinh khiết 2.2 Hóa chất - Môi trưòng Nutrient Agar - Môi trường Endo - Môi trường Sabouraud - Mannitol Salt Broth (MSB) - Tellurite Glycerin Agar (TGA) - Brain Heart Infusion (BHI) 2.3 Dụng cụ thí nghiệm - Đĩa petri - Đèn cồn. - Que cấy - Bình cầu 200ml - Kính hiển vi - Kéo cắt mẫu và cây gắp mẫu. - Ống đong, pipette 5ml - Ống nghiệm. 2.4 Thiết bị sử dụng - Tủ cấy 11 - Tủ ủ III. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Chuẩn bị môi trường Cân các môi trường nuôi cấy và hòa tan trong nước cất với hàm lượng xác định trong bình cầu (hoặc bình tam giác). Dùng bông gòn bịt kín miệng bình cầu. Đun nóng môi trường để hòa tan hoàn toàn các thành phần môi trường trong nước. Pha loãng dung dịch nước muối 0,85%. Dùng ống đong đong 90ml nuớc muối đã pha loãng cho vào bình cầu. Bịt kín miệng bình cầu bằng bông gòn. Rửa sạch các đĩa petri, ống nghiệm, pipette. Dùng giấy bịt kín (chuẩn bị thanh trùng) Thanh trùng các môi trường, dụng cụ thủy tinh, bình chứa mẫu pha loãng. 3.2 Chuẩn bị mẫu Tiến hành cân 10g mẫu từ các nguồn nguyên liệu. Cho mẫu đã cân vào bình cầu đựng 90ml nước muối 0,85%(Pha loãng mẫu theo tỉ lệ 1/10). 3.3 Tiến hành thí nghiệm a. Tổng số vi sinh vật Đây là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá mức độ nhiễm vi sinh vật. Thường sử dụng phương pháp đếm đĩa (Total Plate Count) để xác định chỉ tiêu này. - Nguyên tắc: Đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào duy nhất. - Môi trường nuôi cấy: Nutrient Agar - Tiến hành Dùng pipet vô trùng lấy 1ml mẫu pha loãng cho vào giữa đĩa petri. Rót vào mỗi đĩa khoãng 15ml thạch dinh dưỡng. Lắc tròn xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 5 lần. Đặt đĩa trên mặt phẳng ngang cho đông tự nhiên. Khi môi trường đông, lật úp đĩa và đặt vào tủ ấm ở chế độ nhiệt 37 0C trong thời gian 24-48h. - Đọc kết quả: Đếm số khuẩn lạc trên các đĩa, tính giá trị trung bình của các nồng độ pha loãng và qui ra lượng vi sinh vật trong 1 ml (hay một gam) mẫu. b. Coliforms Coliforms là những trực khuẩn đường ruột gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi, có khả năng sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở 370C trong vòng 24h. - Môi trường nuôi cấy: Môi trường Endo. - Cấy mẫu: Dùng pipet vô trùng lấy 1ml mẫu đã pha loãng cho vào giữa đĩa petri. Rót vào mỗi đĩa khoãng 15ml môi trường. Có thể sử dụng 2 nồng độ pha loãng liên tiếp. Lắc tròn xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 5 lần. Đặt đĩa trên mặt phẳng ngang cho đông tự nhiên. Lật úp đĩa và ủ ở 370C trong 24-36h. 12 - Đọc kết quả Sau 24 h nuôi cấy trên môi trường, các khuẩn lạc coliforms có màu đỏ đặc trưng, đường kính khoãng 0.5mm. Đếm các khuẩn lạc đặc trưng trên điã có số đếm phù hợp. Tính giá trị trung bình từ các nồng độ pha loãng để qui về số coliforms trong 1ml (hay một gam) mẫu . Hình 3.1. Khuẩn lạc Coliforms trên môi trường dinh dưỡng c. Staphylococcus aureus Định nghĩa: Staphylococcus aureus là cầu khuẩn gam dương đường kính khoảng 0,7m, không sinh bào tử, không di động, thường tụ thành chùm hoặc ghép đôi, lên men mannitol sinh sắc tố vàng, chịu mặn 7,5% NaCl và có khả năng đông huyết tương. Nguyên tắc: S. aureus được xác định trên cơ sở thử phản ứng đông huyết tương những dòng thuần từ những khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập. Môi trường nuôi cấy - Môi trường tăng sinh chọn lọc: Mannitol Salt Broth (MSB) chỉ dùng trong trường hợp kiểm tra định tính. - Môi trường phân lập: Tellurite Glycerin Agar (TGA) hoặc Baird Parker. - Môi trường phục hồi: Brain Heart Infusion (BHI) Kiểm tra định tính - Cấy 2 ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 8 ml môi trường MSB. Trộn đều dịch mẫu và môi trường, ủ ở 370C, 24 giờ. - Sau 24 giờ cấy ria dịch mẫu từ ống dương tính (môi trường chuyển màu từ đỏ sang vàng ) lên môi trường phân lập và ủ ở 370C, 24 giờ. - Khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập có màu đen nhánh, sáng, tròn, lồi, đường kính từ 1-1,5 mm được bao quanh bởi một quầng sáng. Các khuẩn lạc không đặc trưng có kích thước và màu sắc tương tự nhưng không có quầng sáng. - Chọn một số khuẩn lạc đặc trưng cấy chúng vào một ống nghiệm chứa môi trường BHI, ủ ở 370C, 24 giờ. 13 - Sau 24 giờ cấy vi sinh vật từ môi trường BHI vào ống nghiệm nhỏ chứa khoảng 0,3 ml huyết tương và ủ ở 370C, 24 giờ để thử phản ứng đông kết. Phản ứng được coi là dương tính khi có bất kỳ sự đông kết nào xuất hiện trong ống huyết tương chứa vi sinh vật thử và đồng thời ống đối chứng không đông. Kết luận mẫu có chứa Staphylococcus aureus khi có phản ứng đông huyết tương dương tính. Hình 3.2 Staphylococcus aureus trên môi trường nuôi cấy (Staphylococcus aureus lên men mannitol) d. Đếm nấm mốc và nấm men tổng số Tiêu chuẩn này dùng để đếm nấm men và nấm mốc trong thực phẩm bằng kỹ thuật đểm khuẩn lạc ở 25oC. - Nguyên tắc: nấm men và nấm mốc là những vi sinh vật tạo ra những khuẩn lạc ở 25oC trong môi trường chọn lọc phù hợp. Nuôi cấy hiếu khí các đĩa ở 25 oC trong 3-5 ngày. Đếm số khuẩn lạc xác định được trên đĩa ở nồng độ pha loãng đã chọn. - Môi trường nuôi cấy: Sabouraud có nồng độ Cloramphenicol 0,1g/l hoặc các môi trường dinh dưỡng phù hợp. - Tiến hành: Dùng pipet vô trùng lấy 1ml mẫu pha loãng cho vào giữa đĩa petri. Sử dụng 2 lần pha loãng liên tiếp. Rót vào mỗi đĩa khoảng 15ml môi trường thạch dinh dưỡng. Lắc tròn xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 5 lần. Đặt đĩa trên mặt phẳng ngang cho đông tự nhiên. Khi môi trường đông, đặt đĩa ở 25oC ( nhiệt độ phòng) trong thời gian 3-5 ngày. - Đọc kết quả: Nhận diện các khuẩn ty của nấm mốc và các tế bào nấm men có trên đĩa petri 14 IV. TƯỜNG TRÌNH THÍ NGHIỆM - Theo dõi sự phát triển của vi sinh vật trên môi trường theo thời gian - Xác định mức độ nhiễm vi sinh vật trên các mẫu đã phân tích. 15 BÀI 4. KIỂM TRA MỘT SỐ LOẠI VI SINH VẬT TRONG NƯỚC VÀ THỰC PHẨM LỎNG I. MỤC ĐÍCH Giúp cho sinh viên làm quen, nắm được các thao tác cũng như áp dụng lý thuyết đã học vào trong quá trình kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh có trong nước và thực phẩm lỏng. Nội dung bài thực tập giúp sinh viên biết phương pháp chuẩn bị môi trường, mẫu, cách lấy mẫu, phương pháp nuôi cấy, kiểm tra vi sinh vật trong nước và các sản phẩm thực phẩm lỏng. Từ đó xác định mức độ nhiễm của vi sinh vật trong thực phẩm này. II. PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 2.1 Nguyên vật liệu: - Nước rau má - Sữa tươi - Cồn - Bông gòn - Nước cất vô trùng - Muối tinh khiết 2.2 Hóa chất - Môi trưòng Nutrient Agar - Môi trường EMB - Môi trường Fluid Lastose Medium - Nước pepton đệm (Buffered Pepton Water) - Canh Tetrathionate (Muller –Kauffmann) - Desoxycholate Agar (XLD) 2.3 Dụng cụ thí nghiệm - Đĩa petri - Đèn cồn. - Que cấy - Bình cầu 200ml - Kính hiển vi - Kéo cắt mẫu và cây gắp mẫu. - Ống đong, pipette 5ml - Ống nghiệm. 2.4 Thiết bị sử dụng - Tủ cấy, tủ ủ III. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Chuẩn bị môi trường - Cân các môi trường nuôi cấy và hòa tan trong nước cất với hàm lượng xác định trong bình cầu (hoặc bình tam giác). Dùng bông gòn bịt kín miệng bình cầu. 16 - Đun nóng môi trường để hòa tan hoàn toàn các thành phần môi trường trong nước. - Pha loãng dung dịch nước muối 0,85%. Dùng ống đong đong 90ml nuớc muối đã pha loãng cho vào bình cầu. Bịt kín miệng bình cầu bằng bông gòn. - Rửa sạch các đĩa petri, ống nghiệm, pipette. Dùng giấy bịt kín (chuẩn bị thanh trùng) - Thanh trùng các môi trường, dụng cụ thủy tinh, bình chứa mẫu pha loãng. 3.2 Chuẩn bị mẫu Tiến hành cân 10g mẫu từ các nguồn nguyên liệu. Cho mẫu đã cân vào bình cầu đựng 90ml nước muối 0,85% (Pha loãng mẫu theo tỉ lệ 1/10). 3.3 Tiến hành thí nghiệm a. Tổng số vi sinh vật Đây là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá mức độ nhiễm vi sinh vật. Thường sử dụng phương pháp đếm đĩa (Total Plate Count) để xác định chỉ tiêu này. - Nguyên tắc: Đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào duy nhất. - Môi trường nuôi cấy: Nutrient Agar - Tiến hành Dùng pipet vô trùng lấy 1ml mẫu pha loãng cho vào giữa đĩa petri. Rót vào mỗi đĩa khoãng 15ml thạch dinh dưỡng. Lắc tròn xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 5 lần. Đặt đĩa trên mặt phẳng ngang cho đông tự nhiên. Khi môi trường đông, lật úp đĩa và đặt vào tủ ấm ở chế độ nhiệt 37 0C trong thời gian 24-48h. - Đọc kết quả Đếm số khuẩn lạc trên các đĩa, tính giá trị trung bình của các nồng độ pha loãng và qui ra lượng vi sinh vật trong 1 ml mẫu. b. Escherichia coli Là một dạng coliform có nguồn gốc từ phân phát triển được ở 44+/-0.50C. Sinh indol, sinh nhiều acid, không sinh aceton và không dùng citrate làm nguồn carbon duy nhất. E. coli được phát hiện do khả năng lên men lactose sinh hơi ở 44+/-0.50C - Môi trường nuôi cấy: Môi trường tăng sinh: Fluid Lactose Medium. Môi trường phân lập: EMB (Eosine Methylene Blue Agar) - Tiến hành: Tăng sinh: Cấy 1ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường tăng sinh. Dùng 2 ống nghiệm cho mỗi mẫu. Phân lập: Sau 24h dùng que cấy cấy dịch mẫu từ ống có phản ứng dương tính (có sinh hơi, làm đục môi trường màu vàng ) lên môi trường phân lập, ủ ở 370C trong 24h. Nhận dạng khuẩn lạc E.coli: 17 Trên môi trường EMB khuẩn lạc có màu đỏ tía, thường có ánh kim, tròn, bờ đều, đường kính khoảng 0,5mm. c. Salmonella Định nghĩa: Salmonella là trực trùng gam âm kích thước khoảng o,6 X 2m, hiếu khí, có khả năng di động, không tạo bào tử, không sinh indol hoặc acetoin, không có khả năng lên men sucrose, lactose, hoặc phân giải urea, không có khả năng tách amine từ triptophan. Nguyên tắc: Salmonella được phát hiện bằng những phản ứng sinh hoá phù hợp. Môi trường nuôi cấy - Môi trường tiền tăng sinh: Nước pepton đệm (Buffered Pepton Water) - Môi trường tăng sinh: canh Tetrathionate (Muller –Kauffmann), canh Selenite hoặc canh Rappaport-Vassiliadis (RV) - Môi trường phân lập: Brilliant Green Agar (BGA), Xylose-LysineDesoxycholate Agar (XLD), Bismuth Sulfite Agar (BSA) Tiến hành: a. Lấy mẫu: Đối với Salmonella tuỳ theo loại nguyên liệu mà ta có phương pháp lấy mẫu khác nhau. Ví dụ: + Đối với thịt đông, thuỷ sản đông lấy mẫu trên vùng bề mặt càng rộng càng tốt. + Đối với bột khô hoặc ngũ cốc nên lấy từ nhiều bao gói khác nhau và chú ý khối lượng mẫu. b. Tiền tăng sinh: về nguyên tắc là trộn một phần mẫu với 9 phần nước pepton đệm, sau đó ủ ở 370C, 24 giờ (ví dụ: nếu dùng 25 g mẫu thì hoà đều mẫu đó với 225 ml nước pepton đệm). c. Tăng sinh: lắc kỹ canh tiền tăng sinh trước khi cấy chuyển 0,1 ml canh đó vào 10 ml môi trường tăng sinh và ủ ở 370C, 24 giờ d. Phân lập: dùng khuyên cấy chuyển khuẩn dịch (canh tăng sinh) lên bề mặt môi trường phân lập sao cho có thể tạo được những khuẩn lạc tách rời. Lật ngược đĩa ủ ở 370C, 24 giờ. Trên môi trường XLD, khuẩn lạc Salmonella điển hình trong, hơi nhuốm đỏ do sự thay đổi của chất chỉ thị trong môi trường, đôi khi có tâm đen. Bao giờ cũng có thể nhận thấy một vùng môi trường đỏ lớn hoặc nhỏ quanh khuẩn lạc. Trên môi trường BGA Salmonella điển hình trong, hơi nhuốm đỏ và cũng có vùng môi trường đỏ quanh khuẩn lạc. Trên môi trường BSA khuẩn lạc Salmonella dẹt, khô, đen nhánh, có vùng môi trường nâu đen bao quanh và thường tạo ánh kim bạc phớt trên bề mặt môi trường. e. Thử phản ứng sinh hoá: có thể kết luận mẫu Salmonella khi có chứa những trực khuẩn gam âm tạo khuẩn lạc đặc trưng trên những môi trường phân lập và cho những kết quả sinh hoá sau: Lactose (-), Sucrose (-), Glucose (+), Urea (-), Indol (-), VP (-), TDA (-), Mannitol (+). 18 IV. TƯỜNG TRÌNH THÍ NGHIỆM. - Theo dõi sự phát triển của vi sinh vật trên môi trường theo thời gian - Xác định mức độ nhiễm vi sinh vật trên các mẫu đã phân tích. 19 BÀI 5 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TIÊU DIỆT VI SINH VẬT BẰNG NHIỆT I. MỤC ĐÍCH Trong chế biến thực phẩm, nhiệt là một trong những phương pháp phổ biến nhất được sử dụng để ức chế hoặc tiêu diệt các vi sinh vật, đặc biệt là những loại vi sinh vật gây hư hỏng sản phẩm. Hai yếu tố quan trọng là nhiệt độ và thời gian xử lý. Mục đích của bài thí nghiệm này là khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian xử lý đến khả năng tiêu diệt vi sinh vật. II. PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 2.1 Nguyên vật liệu - Cồn - Bông gòn - Nước cất vô trùng - Muối tinh khiết 2.2 Hóa chất - Môi trường Fluid Lastose Medium - Môi trường TSB, pH = 7 (Tryptic soy broth) - Môi trường VRBL (Crystal Violet Neutral Red Bile Lactose Agar) 2.3 Dụng cụ thí nghiệm - Đĩa petri - Đèn cồn. - Bình cầu 200ml - Kéo cắt mẫu và cây gắp mẫu. - Ống đong, pipette 5ml - Ống nghiệm. - Que cấy - Viết không xoá - Nhãn dán mẫu 2.4 Thiết bị sử dụng - Tủ cấy - Tủ ủ - Water bath III. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Chuẩn bị môi trường và dụng cụ - Sử dụng các môi trường và dụng cụ đã được chuẩn bị trong bài 1 3.2 Chuẩn bị mẫu Chọn và phân lập các khuẩn lạc coliforms trong bài thí nghiệm 3 (hoặc 4), sau đó cấy tăng sinh trong môi trường Fluid Lastose Medium, ủ ở 370C, 24 giờ. 20