Tài liệu Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu mạch môn radix ophiopogonis japonici

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH -------- LÊ NGUYỄN PHÚC HIỀN XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU MẠCH MÔN Radix Ophiopogonis japonici LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH -------- LÊ NGUYỄN PHÚC HIỀN XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU MẠCH MÔN Radix Ophiopogonis japonici Ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền Mã số: 8720206 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. HUỲNH NGỌC THỤY Thành phố Hồ Chí Minh – 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Lê Nguyễn Phúc Hiền TÓM TẮT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ dược học – Khóa 2017 – 2019 Ngành: Dược liệu – Dược học cổ truyền; Mã: 8720206 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN DƯỢC LIỆU MẠCH MÔN Radix Ophiopogonis japonici Học viên: Lê Nguyễn Phúc Hiền Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Huỳnh Ngọc Thụy Đặt vấn đề Rễ củ Mạch môn (Radix Ophiopogonis japonicus) đã được sử dụng lâu đời trong các bài thuốc y học cổ truyền ở Trung Quốc và Việt Nam. Hiện nay, rất khó để phân biệt và xác định đúng Mạch môn với các chi khác trên thị trường vì chúng có đặc điểm hình thái giống nhau. Đề tài thực hiện nghiên cứu thành phần hóa học và đề xuất quy trình định lượng acid ursolic trong rễ củ Mạch môn, bước đầu góp phần xác định và kiểm soát chất lượng nguồn nguyên liệu, các bán thành phẩm trên thị trường, đồng thời làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong thử hoạt tính sinh học. Phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu: Rễ củ Mạch môn được thu mua ở những cửa hàng khác nhau ở quận 5, TPHCM. Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng phương pháp chiết xuất ngấm kiệt, các phương pháp sắc ký để phân lập các chất. Cấu trúc chất phân lập được xác định bằng phổ MS và NMR. Xây dựng quy trình định lượng: Khảo sát điều kiện UPLC, khảo sát điều kiện xử lý và chuẩn bị mẫu, đề xuất quy trình thẩm định. Kết quả Thành phần hóa học của rễ củ Mạch môn có sự hiện diện của các nhóm hợp chất saponin, triterpenoid, polyuronic, flavonoid, anthranoid, acid hữu cơ. 4 kg bột rễ củ Mạch môn được chiết ngấm kiệt với EtOH 96% thu được 450 g cao chiết đậm đặc. Tiến hành lắc phân bố lỏng - lỏng với lần lượt các dung môi có độ phân cực tăng dần thu được 32 g cao cloroform và 5 g cao ethyl acetat. Tiến hành chiết lỏng – rắn cao cloroform thu được: 10,3 g n-hexan extract (OJH), 5,1 g cao n-hexan – cloroform (OJHC), 9,7 g cao cloroform (OJC), 2,4 g cao cloroform – ethyl acetat (OJCE), 1,6 g cao ethyl acetat (OJE). Bằng các kỹ thuật sắc ký là sắc ký cột cổ điển và sắc ký điều chế, tiến hành phân lập các cao phân đoạn: OJH, OJHC, OJC thu được 4 hợp chất lần lượt xác định là: Acid ursolic (90,5 mg), chrysophanol (3 mg), β-sitosterolglucosid (6 mg), nolinospirosid – F (5,6 mg). Xây dựng quy trình định lượng acid ursolic trong rễ củ Mạch môn với điều kiện sắc ký như sau: chương trình rửa giải gradient H2O (1 % acid formic) – ACN, tốc độ dòng 0,3 ml/phút, bước sóng định lượng 205 nm. Kết quả thống kê cho thấy quy trình thẩm định có hệ số tương quan cao (R2 ≥ 0,995), độ lặp lại thể hiện qua giá trị độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic (RSD = 3,2 < 5,3%), độ đúng thể hiện qua tỉ lệ hồi phục nằm trong khoảng 94,1 – 100,2 %. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) lần lượt là: 0,2 ppm, 0,68 ppm. Hàm lượng acid ursolic trong các mẫu rễ củ Mạch môn thay đổi đáng kể giữa các địa điểm thu mua, các mẫu Mạch môn có kích thước củ to, tròn, màu vàng sẫm, vị ngọt cho kết quả định lượng hàm lượng acid ursolic trung bình là 0,034 %. Kết luận Đề tài đã phân lập 4 hợp chất từ cao các phân đoạn OJH, OJHC, OJC và xác định cấu trúc 4 hợp chất bằng các phương pháp phổ học. Từ các kết quả trong xây dựng quy trình định lượng có thể bước đầu gợi ý lựa chọn nguồn nguyên liệu rễ củ Mạch môn có hàm lượng acid ursolic ≥ 0,03 % làm nguồn nguyên liệu đạt chất lượng để sử dụng làm thuốc trong các bài thuốc y học cổ truyền hoặc sản xuất các chế phẩm có tác dụng sinh học. ABSTRACT Thesis of Master of Pharmacy – Course: 2017 – 2019 Major: Traditional Pharmacy; Code: 8720206 DEVELOPMENT MEDICINAL PLANT STANDARDS OF RADIX OPHIOPOGONIS JAPONICI Student: Le Nguyen Phuc Hien Instructor: PhD. Assoc. Prof. Huynh Ngoc Thuy Introduction Ophiopogon japonicus root is widely known as a traditional medicine and also a longstanding functional food ingredient in China and Vietnam to cure many diseases, but it is difficult to distinguish between Ophiopogon species in the herbal market because of their similar morphological characteristics. The purpose of this study is to investigate the chemical composition and quantification of ursolic acid in Ophiopogon japonicus by UPLC/PDA method. This method can be used for quality control of raw materials, semi-finished products and finished products containing it on the main herb market. The results are the first step to further studies of the biological effects of plants. Material and method Raw material: Ophiopogon japonicus root is collected from various shops in the herb market in Ho Chi Minh City. Methods: Liquid-liquid and liquid-solid distribution and various chromatographic techniques are used for extraction and isolation. The structure of isolates was determined by MS and NMR spectroscopy. Quantitative method using UPLC/PDA system is surveyed step by step, surveying UPLC conditions, testing plant materials and preparing samples, proposing validation procedures for developed methods… Results Chemical composition analysis revealed the presence of saponins, triterpenoids, flavonoids, anthranoite and oganic acid. 4 kg of dry root powder is percolate with 96% ethanol to obtain 450 g of concentrated extract, then a liquid-liquid distribution to obtain 32 g of chloroform and 5 g of ethyl acetate extraction. Liquid-solid distribution of chloroform to obtain 10,3 g of n-hexane extract (OJH), 5.1 g of n-hexane-chloroform extract (OJHC), 9.7 g of chloroform extract (OJC), 2.4 g of chloroform-ethyl acetate extract (OJCE), 1.6 g of ethyl acetate extract (OJE). Three fractions OJH, OJHC, OJC were further separated and 4 elucidated compounds were obtained: ursolic acid (90.5 mg), chrysophanol (3 mg), β-sitosterolglucoside (6 mg), nolinospiroside - F (5,6 mg). Development of a method for the quantitative ursolic acid in Ophiopogon japonicus by UPLC/PDA to investigate chromatographic conditions: gradient elution with 0.1% acetonitril and formic acid, flow rate 0.3 ml/min, column temperature 30 ºC with a wavelength of 205 nm. Acceptable linearity (R2 ≥ 0.995) and recovery (about 94.1 - 100.2%). Detection limit (LOD) and quantitative limit (LOQ): 0.2 ppm; 0.68 ppm, respectively. The results showed that the ursolic acid content was different among samples, the average ursolic content in the samples was 0.034%. Conclusion In this study, 4 compounds were isolated from OJH, OJHC, OJC extract and 4 structures were determined by spectrometry methods. The quantitive method can be used for the analysis of the root of Ophiopogon japonicus in herb market. Results showed that the mean percentage contents of ursolic acid must be greater than or equal to 0.03 %. MỤC LỤC MỤC LỤC............................................................................................................................................. i DANH MỤC BẢNG .......................................................................................................................... v DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................................... vi DANH MỤC SƠ ĐỒ ....................................................................................................................... vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... viii ĐẶT VẤN ĐỀ ..................................................................................................................................... 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU ......................................................... 2 1.1. TỔNG QUAN THỰC VẬT HỌC ....................................................................2 1.1.1. Đặc điểm chung họ Thiên môn (Asparagaceae) .........................................2 1.1.2. Đặc điểm thực vật chi Ophiopogon Ker Gawl. ...........................................2 1.1.3. Phân biệt các chi có đặc điểm tương đồng ..................................................2 1.1.4. Các tên gọi đồng danh của loài Ophiopogon japonicus .............................. 3 1.1.5. Vị trí phân loại .............................................................................................4 1.1.6. Đặc điểm cây Mạch môn (Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl.) .........4 1.2. TỔNG QUAN HÓA HỌC ................................................................................5 1.2.1. Saponin steroid ............................................................................................5 1.2.2. Homoisoflavonoid .......................................................................................9 1.2.3. Triterpenoid ............................................................................................... 10 1.2.4. Anthranoid .................................................................................................10 1.2.5. Polysaccharid ............................................................................................. 11 1.2.6. Glycosid .....................................................................................................11 1.3. TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ ..................................................11 1.3.1. Theo y học cổ truyền .................................................................................11 1.3.2. Theo y học hiện đại ...................................................................................11 1.4. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM MẠCH MÔN ......16 1.4.1. Các nghiên cứu trong nước........................................................................16 1.4.2. Các nghiên cứu ở nước ngoài ....................................................................16 1.4.3. Kiểm nghiệm dược liệu Mạch môn theo tiêu chuẩn của DĐVN V [2].....17 1.5. TỔNG QUAN VỀ ACID URSOLIC ............................................................. 20 1.5.1. Đặc tính lý hóa...........................................................................................20 1.5.2. Tác dụng ....................................................................................................20 1.5.2.1. Chống ung thư .......................................................................................21 1.5.2.2. Phòng ngừa béo phì/đái tháo đường .....................................................21 1.5.2.3. Bảo vệ cơ tim .........................................................................................22 1.5.2.4. Bảo vệ tế bào thần kinh .........................................................................23 1.5.2.5. Bảo vệ gan ............................................................................................. 23 1.5.2.6. Phòng ngừa bệnh thiểu cơ và tăng khả năng vận động ........................23 1.5.3. Các phương pháp định lượng acid ursolic trong dược liệu .......................23 1.6. CÔNG DỤNG, LIỀU DÙNG ..........................................................................25 1.7. CÁC BÀI THUỐC DÂN GIAN......................................................................25 1.8. MỘT SỐ CHẾ PHẨM CHỨA MẠCH MÔN ...............................................26 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 29 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................29 2.1.1. Nguyên liệu ............................................................................................... 29 2.1.2. Dung môi, hóa chất....................................................................................29 2.1.3. Dụng cụ và trang thiết bị ...........................................................................30 2.1.4. Nơi thực hiện đề tài ...................................................................................31 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................31 2.2.1. Kiểm tra nguyên liệu .................................................................................31 2.2.1.1. Khảo sát nguyên liệu .............................................................................31 2.2.1.2. Thử tinh khiết .........................................................................................32 2.2.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật ...................................................32 2.2.3. Nghiên cứu thành phần hóa học của rễ củ Mạch môn .............................. 32 2.2.3.1. Tiêu chí lựa chọn nguyên liệu nghiên cứu.............................................32 2.2.3.2. Chiết xuất cao dược liệu bằng phương pháp ngấm kiệt........................33 2.2.3.3. Phân tách phân đoạn cao toàn phần .....................................................33 2.2.3.4. Tinh chế các chất phân lập được ..........................................................35 2.2.3.5. Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập được .....................................35 2.2.3.6. Xác định cấu trúc...................................................................................35 2.2.4. Xây dựng quy trình định lượng .................................................................35 2.2.4.1. Xây dựng phương pháp định lượng chất chính. ....................................35 2.2.4.2. Thẩm định quy trình định lượng ............................................................ 36 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .............................................................................. 40 3.1. KIỂM TRA NGUYÊN LIỆU .........................................................................40 3.1.1. Khảo sát nguyên liệu .................................................................................41 3.1.1.1. Đặc điểm vi phẫu rễ củ ..........................................................................41 3.1.1.2. Đặc điểm bột dược liệu .........................................................................42 3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết ................................................................................44 3.1.2.1. Xác định độ ẩm ......................................................................................44 3.1.2.2. Xác định độ tro ......................................................................................44 3.1.2.3. Xác định hàm lượng chất chiết được.....................................................44 3.2. PHÂN TÍCH SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT ...........................45 3.3. CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN TÁCH CAO CHIẾT TOÀN PHẦN ............................ 46 3.3.1. Chiết xuất...................................................................................................46 3.3.2. Phân tách cao chiết toàn phần ...................................................................46 3.4. PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ CAO PHÂN ĐOẠN.......................................48 3.4.1. Phân lập các chất tinh khiết từ cao OJHC .................................................48 3.4.1.1. Tinh chế tủa từ phân đoạn OJHC-1 ......................................................49 3.4.1.2. Tinh chế tủa từ phân đoạn OJHC-4 ......................................................50 3.4.1.3. Tinh chế tủa từ phân đoạn OJHC-16 ....................................................50 3.4.2. Phân lập chất tinh khiết từ cao OJH ..........................................................51 3.4.2.1. Tinh chế tủa từ phân đoạn OJH-8 .........................................................53 3.4.3. Phân lập chất tinh khiết từ cao OJC ..........................................................54 3.4.3.1. Tinh chế tủa từ phân đoạn OJC-21 .......................................................56 3.5. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC ........................58 3.5.1. Xác định cấu trúc chất OJ-1 ......................................................................58 3.5.2. Xác định cấu trúc chất OJ-2 ......................................................................60 3.5.3. Xác định cấu trúc chất OJ-3 ......................................................................63 3.5.4. Xác định cấu trúc chất OJ-5 ......................................................................65 3.6. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ACID URSOLIC TRONG RỄ CỦ MẠCH MÔN .........................................................................................................69 3.6.1. Khảo sát điều kiện sắc ký ..........................................................................69 3.6.2. Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu ............................................................... 72 3.6.3. Đề xuất phương pháp định lượng .............................................................. 76 3.6.4. Đề xuất quy trình thẩm định ......................................................................77 3.6.5. Ứng dụng quy trình định lượng .................................................................81 3.7. ĐỀ NGHỊ TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU MẠCH MÔN (Radix ophiopogonis japonici) .....................................................................................82 3.8. BÀN LUẬN ......................................................................................................86 CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................... 91 4.1. KẾT LUẬN ......................................................................................................91 4.2. KIẾN NGHỊ .....................................................................................................92 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................................. 93 PHỤ LỤC ......................................................................................................................................... 107 PHỤ LỤC 1. DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT OJ-1 ...................................................... PL-1 PHỤ LỤC 2. DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT OJ-2 .................................................... PL-19 PHỤ LỤC 3. DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT OJ-3 .................................................... PL-38 PHỤ LỤC 4. DỮ LIỆU PHỔ CỦA HỢP CHẤT OJ-5 .................................................... PL-38 PHỤ LỤC 5. SẮC KÝ ĐỒ UPLC – KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ .................... PL-71 PHỤ LỤC 6. SẮC KÝ ĐỒ UPLC – THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG .. PL-78 PHỤ LỤC 7. CHẤT CHUẨN................................................................................................. PL-78 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Đặc điểm của ba chi Ophiopogon, Liriope, Peliosanthes ................................... 3 Bảng 1.2. Đặc điểm phân biệt chi Ophiopogon và Liriope................................................... 3 Bảng 1.3. Vị trí phân loại của loài Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl. ..................... 4 Bảng 1.4. Một số saponin steroid mới được phân lập từ loài O.japonicus ......................... 6 Bảng 1.5. Danh sách 15 dẫn xuất homoisoflavonoid............................................................. 9 Bảng 1.6. Công thức cấu tạo của 15 chất homoisoflavonoid..............................................10 Bảng 1.7. Thành phần cấu tạo các polysaccharid. ................................................................11 Bảng 1.10. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư của 3 saponin steroid mới. ...........................13 Bảng 1.11. Hoạt tính ức chế NO của các homoisoflavonoid..............................................15 Bảng 1.8. Tác dụng của acid ursolic trong ức chế tế bào ung thư ......................................21 Bảng 1.9. Tác dụng của acid ursolic trong điều trị bệnh tim mạch ....................................22 Bảng 2.12. Đánh giá độ chính xác theo nồng độ chất phân tích.........................................38 Bảng 2.13. Mối liên quan giữa tỷ lệ phục hồi và nồng độ chất phân tích .........................39 Bảng 3.14. Kết quả thử tinh khiết mẫu dược liệu nghiên cứu. ...........................................44 Bảng 3.15. So sánh độ tinh khiết của mẫu nghiên cứu với các tiêu chí của chuyên luận Mạch môn ở DĐVN V .............................................................................................................45 Bảng 3.16. Kết quả phần tích sơ bộ thành phần hóa thực vật rễ củ Mạch môn ...............45 Bảng 3.17. Khối lượng các phân đoạn cao thu được từ cao CHCl3..................................46 Bảng 3.18. Khối lượng các phân đoạn phân tách được từ phân đoạn OJH-8 ..................53 Bảng 3.19. Dữ liệu phổ 13C, 1H–NMR và HMBC của OJ-1............................................59 Bảng 3.20. Dữ liệu phổ 13C, 1H–NMR và HMBC của OJ-2.............................................61 Bảng 3.21. Dữ liệu phổ 13C, 1H-NMR của OJ-3 .................................................................64 Bảng 3.22. Dữ liệu phổ 13C, 1H-NMR và HMBC của OJ-5..............................................66 Bảng 3.23. Chương trình rửa giải gradient được lựa chọn ..................................................70 Bảng 3.25. Kết quả khảo sát phương pháp chiết (n=3)........................................................74 Bảng 3.26. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống trên mẫu thử (n = 6)...................77 Bảng 3.27. Tương quan nồng độ và diện tích pic của acid ursolic.....................................79 Bảng 3.28. Kết quả khảo sát độ lặp lại (n=6) ........................................................................80 Bảng 3.29. Kết quả khảo sát tỷ lệ hồi phục (n=9).................................................................81 Bảng 3.30. Kết quả định lượng acid ursolic trong một số mẫu thu thập được .................81 Bảng 3.31. So sánh liều có tác dụng sinh học của các nhóm hợp chất..............................87 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Một số saponin steroid có trong rễ củ Mạch môn................................................. 9 Hình 1.2. Công thức cấu tạo 2 homoisoflavonoid.................................................................. 9 Hình 1.3. Công thức cấu tạo của các triterpenoid.................................................................10 Hình 1.4. Công thức cấu tạo của các anthranoid ..................................................................10 Hình 1.5. Công thức cấu tạo của các glycosid ......................................................................11 Hình 1.6. Công thức cấu tạo của acid ursolic........................................................................20 Hình 1.7. Một số chế phẩm chứa Mạch môn trên thị trường .............................................28 Hình 2.8. Các mẫu rễ củ Mạch môn ......................................................................................29 Hình 3.9. Sắc ký đồ 11 mẫu nghiên cứu................................................................................40 Hình 3.10. Sắc ký đồ UPLC - so sánh mẫu nghiên cứu với mẫu định danh....................41 Hình 3.11. Một số hình ảnh rễ củ Mạch môn. ......................................................................41 Hình 3.12. Chi tiết rễ củ Mạch môn .......................................................................................43 Hình 3.13. Một số thành phần bột rễ củ Mạch môn ............................................................44 Hình 3.14. Kết quả sắc ký 2 phân đoạn phân tách từ cao EtOH. .......................................46 Hình 3.15. Kết quả sắc ký 5 phân đoạn phân tách từ cao CHCl3.......................................47 Hình 3.16. Sắc ký đồ tổng kết các phân đoạn sắc ký cột cổ điển cao OJHC. .................48 Hình 3.17. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của OJ-1. .......................................................50 Hình 3.18. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của OJ-2 ........................................................50 Hình 3.19. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của OJ-3 ........................................................51 Hình 3.20. Sắc ký đồ tổng kết các phân đoạn sắc ký cột cổ điển cao OJH .....................52 Hình 3.21. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của OJ-4 ........................................................53 Hình 3.22. Sắc ký đồ tổng kết các phân đoạn sắc ký cột cổ điển cao OJC .....................54 Hình 3.23. Sắc ký đồ tổng kết sau khi phân tách phân đoạn OJC-21 ...............................56 Hình 3.24. Sắc ký điều chế phân đoạn OJC-21.12 ..............................................................57 Hình 3.25. Sắc ký đồ tổng kết sau khi phân tách phân đoạn OJC-21.12F ......................57 Hình 3.26. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của OJ-5 ........................................................58 Hình 3.28. Phổ khối ESI-MS (positive) của OJ-1 ...............................................................58 Hình 3.29. Cấu trúc OJ-1 và các tương tác HMBC quan trọng ........................................60 Hình 3.30. Phổ khối ESI-MS (negative) của OJ-2..............................................................60 Hình 3.31. Cấu trúc OJ-2 và các tương tác HMBC quan trọng. .......................................62 Hình 3.32. Phổ khối ESI-MS (positive) của OJ-3 ...............................................................63 Hình 3.33. Cấu trúc OJ-3 và phần đường .............................................................................65 Hình 3.34. Phổ khối ESI-MS (negative) của OJ-5..............................................................65 Hình 3.35. Cấu trúc OJ-5 và các tương tác HMBC quan trọng. .......................................68 Hình 3.36. Phổ UV của các mẫu ............................................................................................69 Hình 3.37. Sắc ký đồ của chất chuẩn ở các bước sóng khác nhau.....................................69 Hình 3.38. Sắc ký đồ mẫu thử với chương trình pha động được chọn. ............................70 Hình 3.39. Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng. ..........................................................................71 Hình 3.40. Sắc ký đồ khảo sát nhiệt độ cột ...........................................................................72 Hình 3.41. Sắc ký đồ mẫu thử trong điều kiện sắc ký đã chọn ..........................................72 Hình 3.42. Diện tích pic của acid ursolic trong 3 dung môi khảo sát (n = 3) ...................73 Hình 3.43. Diện tích pic của acid ursolic ở 2 phương pháp chiết (n = 3)..........................74 Hình 3.44. Kết quả khảo sát thời gian chiết...........................................................................75 Hình 3.45. Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống....................................................78 Hình 3.46. Sắc ký đồ khảo sát tính đặc hiệu. ........................................................................78 Hình 3.47. Đường biểu diễn phương trình hồi quy của acid ursolic..................................79 Hình 3.48. Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại ................................................................................80 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Quy trình chiết xuất và phân lập dự kiến.............................................................33 Sơ đồ 3.2. Kết quả quy trình chiết xuất – phân tách các phân đoạn từ cao EtOH 96 % ..................................................................................................................................................47 Sơ đồ 3.3. Kết quả phân lập các chất từ cao OJHC.............................................................49 Sơ đồ 3.4. Kết quả phân lập các chất từ cao OJH................................................................52 Sơ đồ 3.5. Kết quả phân lập các chất từ cao OJC ................................................................55 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ tắt Ý nghĩa Chữ nguyên 1 ACN Acetonitril 2 13 13 3 1 4 br Broad 5 COSY Correlation spectroscopy 6 CHCl3 Cloroform 7 d Doublet 8 DĐVN Dược điển Việt Nam 9 DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer 10 DMSO Dimethyl sulfoxyd 11 EtOAc Ethyl acetat 12 EC50 Effective concentration 50% 13 EtOH Ethanol 14 ESI Electrospray ionization Phép đo phổ khối ion hóa điện hóa 15 Fuc Fucose Đường Fucose 16 Fruc Fructose Đường Fructose 17 Glu Glucose Đường Glucose 18 HMBC Heterronuclear Correlation 19 HSQC Heterronuclear Single Quantum Correlation C-NMR H-NMR 1 C-Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân C13 H-Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân proton Đỉnh rộng Đỉnh đôi Multiple Nồng độ mà tại đó đạt 50% hiệu lực đỉnh Bond STT Chữ tắt Ý nghĩa Chữ nguyên 20 J Coupling constant Hằng số ghép 21 m Multiplet Nhiều đỉnh 22 MDA Malonyl dialdehyd 23 MHz Mega hertz 24 MS Mass Spectroscopy 25 NOESY Nuclear Overhauser spectroscopy 26 NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân 27 ppm Parts per million Phần triệu 28 PDA Photodiode Array Đầu dò diod quang 29 RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối 30 Rha Rhamnose Mạch đường 31 SD Standard deviation Độ lệch chuẩn 32 s Singlet Đỉnh đơn 33 SKC Sắc ký cột 34 SKLM Sắc ký lớp mỏng 35 t Triplet 36 TB Trung bình 37 TT Thuốc thử 38 UV-Vis Ultraviolet and Visible 39 UA Acid ursolic 40 UHPLC Ultra High Performance Liquid Hệ thống sắc ký lỏng siêu Chromatography hiệu năng 41 VS Vanillin-acid sulfuric 42 Xyl Xylose Phổ khối effect Đỉnh ba Tử ngoại khả kiến Đường xylose Luận văn Thạc sĩ Dược học Đặt vấn đề ĐẶT VẤN ĐỀ Mạch môn (Ophiopogon japonicus (L.f) Ker–Gawl) là dược liệu phổ biến có mặt trong rất nhiều bài thuốc y học cổ truyền với mục đích chữa ho, long đờm, ho lao, đái tháo đường, táo bón, thổ huyết, chảy máu cam. Các nghiên cứu trước đây về thành phần hóa học chỉ ra rằng Mạch môn chứa các hợp chất saponin steroid, polysaccharid, homoisoflavonoid và glycosid [5] [135]… Đây là những thành phần có nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý như kháng viêm [50], chống oxy hóa [111], điều hòa miễn dịch [138], giảm nguy cơ nhồi máu cơ tim, chống tăng sinh khối u [127], chống kết tập tiểu cầu [30], phòng và ngăn ngừa bệnh đái tháo đường [84], bảo vệ gan [118] [70]… Trong quá trình trồng và sử dụng Mạch môn, người ta thấy có sự nhầm lẫn về đặc điểm hình thái rễ củ Mạch môn với một số loài thuộc chi khác như Liriope, Peliosanthes, Aspidistra dẫn đến việc rất nhiều loài khác nhau được dân gian trồng với tên gọi “Mạch môn” cũng như trên thị trường cũng xuất hiện nhiều loại củ với tên gọi chung là “Mạch môn”. Ở Việt Nam, hiện nay dược liệu này chủ yếu được nhập khẩu, việc trồng vẫn còn chưa phổ biến, việc nhập khẩu dược liệu có nguồn gốc không rõ ràng và tình trạng các dược liệu đã bị ngâm chiết hết thành phần dược chất, chỉ còn bã dược liệu vẫn là các vấn đề tồn đọng. Việc kiểm soát chất lượng là vấn đề nan giải đối với các dược liệu, các tiêu chí đánh giá dựa trên tiêu chuẩn của DĐVN V vẫn còn sơ sài, hiện chưa có phương pháp định lượng Mạch môn trong DĐVN V nên không đánh giá hết được chất lượng dược liệu. Vì vậy, việc xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu là hết sức cần thiết. Từ những lý do trên, để có thể sử dụng được hiệu quả các dược tính quý của Mạch môn, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu Mạch môn – Radix Ophiopogonis japonici (L.f) Ker. – GawL.” Đề tài được thực hiện với các mục tiêu sau: Mục tiêu tổng quát: 1. Kiểm tra nguyên liệu. 2. Khảo sát thành phần hóa học, chiết xuất và phân lập thành phần chính trong dược liệu Mạch môn. 3. Xây dựng quy trình định lượng thành phần chính của Mạch môn. 4. Đề nghị tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu. Mục tiêu cụ thể: - Kiểm tra nguyên liệu - Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học rễ củ Mạch môn. - Chiết xuất cao toàn phần, phân tách các phân đoạn, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ cao phân đoạn. - Xây dựng quy trình định lượng chất chính: Khảo sát điều kiện sắc ký, khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu, đề xuất quy trình thẩm định. - Đề nghị bổ sung một số tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu. Luận văn Thạc sĩ Dược học Tổng quan tài liệu nghiên cứu CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1. TỔNG QUAN THỰC VẬT HỌC 1.1.1. Đặc điểm chung họ Thiên môn (Asparagaceae) Thân cỏ, sống nhiều năm nhờ thân rễ, hành, củ. Ngoài ra, còn có một số loài cây thân gỗ như Lô hội, Ngọc giá, Huyết dụ do sự phát triển của các lớp cấp 2 đặc biệt. Smilax có thân quấn và dây leo.[3]. Lá đơn, mọc cách, ít khi mọc đối hay mọc vòng. Cụm hoa: Hoa đôi khi riêng lẻ và đính ở ngọn, nhưng thường hoa tụ thành từng chùm, xim ở ngọn thân. Tán của các cây Hành, Tỏi thật ra chỉ là những xim một ngả thu gọn và bao bọc bởi một mo. Hoa đều, lưỡng tính. Hoa đơn tính vì trụy hiếm gặp. Thông thường hoa mẫu 3, hiếm gặp mẫu 2 hay mẫu 4 [3]. 1.1.2. Đặc điểm thực vật chi Ophiopogon Ker Gawl. Chi Ophiopogon có các đặc điểm thực vật như sau: Cây thân cỏ nhiều năm. Thân rễ mập hay mảnh, mọc trườn và có thể phân nhánh. Rễ chùm dạng sợi, đôi khi rễ chùm nổi lên mặt đất thành rễ chống, có lông phủ hoặc không. Thân trên mặt đất mọc đơn độc hoặc mọc thành cụm, có đốt hoặc không. Lá mọc tập trung ở ngọn. Lá có cuống hoặc không; phiến lá hình dải, hình mũi giáo, hình trứng hoặc hình tim, chất dai, mỏng. Hoa mọc đơn độc hoặc tập hợp thành cụm hoa chùm, bông, mọc ở đầu cành hoặc nách lá. Hoa nhỏ, đều, lưỡng tính. Bao hoa 6 hoặc 4 mảnh, một số ít có 9 mảnh, rời hoặc phần dưới dính nhau thành ống, hình chuông, phần trên có 6 thùy, xếp 2 vòng, bằng nhau hoặc gần bằng nhau. Nhị 6, một số ít 4 hoặc 8 đính ở gốc mảnh bao hoa hoặc trên vòng tràng phụ hoặc trên họng ống bao hoa, thò ra ngoài hoặc ẩn trong bao hoa; chỉ nhị rời, dạng sợi hoặc dạng bản dính liền nhau thành một vòng; trung đới không kéo dài hoặc kéo dài thành dạng màu; bao phấn đính gốc hoặc đính lưng, 2 ô, hướng trong, mở dọc. Bầu trên hoặc bầu giữa, 3 hoặc 4 ô, mỗi ô có 2 hay nhiều noãn; vòi nhụy dạng cột hoặc sợi, mảnh, một số ít gần như không có; núm nhụy dạng đầu, đĩa hoặc chia 3 thùy. Quả mọng, vỏ quả dai, một số nứt trước khi chín để lộ hạt ra ngoài. Hạt 1 hoặc nhiều, một số ít mọng nước, hình cầu, hình trứng, nội nhũ to, phôi nhỏ hơn [4]. 1.1.3. Phân biệt các chi có đặc điểm tương đồng Có sự tương đồng về hình thái của ba chi Ophiopogon, Liriope, Peliosanthes nếu mẫu không có hoa đã được rất nhiều tác giả nghiên cứu. Các đặc điểm của ba chi được tóm tắt trong bảng 1.1 [4]. Luận văn Thạc sĩ Dược học Tổng quan tài liệu nghiên cứu Bảng 1.1. Đặc điểm của ba chi Ophiopogon, Liriope, Peliosanthes Đặc điểm Ophiopogon Liriope Peliosanthes Các loài trong cả ba chi đều có thân rễ ngắn, dày với các sợi, đôi khi mọng nước. Rễ củ Thường hẹp, có khi giống như cỏ; tuy nhiên với lá của loài O. dracaenoides có thể rộng đến 50 mm Lá Chiều rộng khoảng 8 – 60 mm, có thể lên tới 85 mm, có hình mũi giáo Chùm, bông hoặc hỗn hợp Cụm hoa Hoa Hoa rủ xuống, bao hoa rời, bầu giữa, chỉ nhị tự do Hoa mọc hướng thẳng đứng, hướng lên trên, bao hoa rời, bầu trên, chỉ nhị tự do Hoa hướng lên trên hoặc uốn ngược lại, bao hoa dính nhau, bầu giữa, chị nhị dính nhau thành hình chuông Quả Nang Nang Mọng Các đặc điểm về hình thái ít có sự khác biệt giữa chi Liriope và Ophiopogon. Tác giả Nguyễn Thị Đỏ đã phân biệt hai chi này dựa vào đặc điểm của bầu và chỉ nhị, trong đó Liriope có chỉ nhị dài hơn hoặc bằng bao phấn và bầu trên còn Ophiopogon thì chỉ nhị ngắn hơn bao phấn và bầu giữa [4]. Còn theo Guy L. Nesom và các cộng sự đã dựa vào đặc điểm của hoa và quả để phân biệt hai chi này. Những đặc điểm này được trình bày cụ thể ở bảng 1.2 [25]. Bảng 1.2. Đặc điểm phân biệt chi Ophiopogon và Liriope Đặc điểm Hoa Quả Ophiopogon Liriope Hình dạng Hoa rũ xuống Hoa thẳng đứng Vị trí Nằm trên một cuống hoa/ống hoa uốn ngược Nằm ở phần cuối cùng của cuống hoa Màu sắc Hoa màu trắng Hoa màu tím Tràng hoa Tràng hoa hình chuông, nằm ở bầu dưới hoặc bầu giữa Tràng hoa xếp xen kẽ nằm ở bầu trên Bao phấn Bao phấn đồng sinh, hình mũi mác hẹp, đỉnh nhọn và hẹp, nứt dọc Bao phấn tự do, thuôn dài, đỉnh tù, nứt ở đỉnh Chỉ nhị Chỉ nhị ngắn hơn nhiều so với bao phấn Chỉ nhị dài hơn hoặc bao phấn Đầu nhị Đầu nhụy chia làm 3 thùy Đầu nhụy liền thành một khối Màu xanh, đen Màu đen 1.1.4. Các tên gọi đồng danh của loài Ophiopogon japonicus Chi Ophiopogon bao gồm 53 loài [106]. Loài Ophiopogon japonicus có 8 tên gọi đồng danh, bao gồm [106]:    Ophiopogon japonicus (Thunb.) Ker Gawl. Ophiopogon japonicus var. caespitosus Okuyama. Ophiopogon japonicus var. elevatus Kuntze. Luận văn Thạc sĩ Dược học      Tổng quan tài liệu nghiên cứu Ophiopogon japonicus var. intermedius (D.Don) Maxim. Ophiopogon japonicus var. umbraticola (Hance) C.H.Wright. Ophiopogon japonicus var. umbraticolus (Hance) C.H. Wright. Ophiopogon japonicus var. umbrosus Maxim. Ophiopogon japonicus var. wallichianus (Kunth) Maxim. Tên khoa học được chấp nhận là: Ophiopogon japonicus (Thunb.) Ker Gawl. Tên khác: Tóc tiên, lan tiên, xà thảo, duyên giới thảo, mạch môn đông. Tên nước ngoài: Japanese snake’s beard (Anh); Ophiopogon (Pháp) [10]. 1.1.5. Vị trí phân loại Bảng 1.3. Vị trí phân loại của loài Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl. Giới Plantae Ngành Magnoliophyta Lớp Liliopsida Bộ Asparagales Họ Asparagaceae Chi Ophiopogon Loài O. japonicus 1.1.6. Đặc điểm cây Mạch môn (Ophiopogon japonicus (L.f.) Ker-Gawl.) Đặc điểm thực vật: Mạch môn thân cỏ (thân thảo) sống lâu năm, cao 10 cm đến 40 cm, rễ chùm, trên rễ có những chỗ phát triển thành củ mẫm. Lá mọc từ gốc, hẹp dài, như lá lúa dài 15 – 40 cm, rộng 1 – 4 mm, phía cuống hơi có bẹ, gốc có bẹ to có màng bao màu trắng ôm các bẹ lá bên trong. Cán hoa dài 10 – 20 cm, màu xanh nhạt, cuốn 3 – 5 mm, tụ thành 1 – 3 hoa ở kẽ các lá bắc trắng nhạt. Quả mọng, màu tím đen nhạt, đường kính 6 mm, có 1 – 2 hạt [5]. Đặc điểm sinh thái và phân bố: Mạch môn là loài cây phân bố rộng khắp Trung Quốc. Cây mọc riêng lẻ hay thành từng bụi trên đất ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nơi ẩm và bóng, thường mọc dưới tán rừng kín, rừng tre nứa, trên núi đất hoặc núi đá granit ở độ cao 800 – 1300 m so với mặt nước biển. Cây ra hoa và quả hàng năm, tái sinh bằng hạt. Thời kỳ ra hoa vào khoảng tháng 6 -7, quả tháng 9 -12 [101]. Chi Ophiopogon phân bố rải rác từ vùng ôn đới ấm đến vùng nhiệt đới thuộc khu vực Đông Á và Đông Nam Á, trong đó tập trung nhiều ở Đông Nam Á [4]. Ở nước ta, mạch môn mọc hoang và được trồng để lấy củ dùng làm thuốc, nhiều nhất ở Hà Tây, Nghĩa Trai (Hưng Yên), Ninh Hiệp (Hà Nội) [5]. Luận văn Thạc sĩ Dược học Tổng quan tài liệu nghiên cứu Lá Hoa Rễ củ Quả Nguồn: https://infonet.vietnamnet.vn và https://wikiduoclieu.org/ Bộ phận dùng: Rễ củ của cây (Radix Ophiopogonis) 2 – 3 năm tuổi, thu hái vào tháng 6, cắt bỏ rễ con, rửa sạch đất, củ nhỏ để nguyên, củ to bổ đôi, phơi khô [10]. Thu hái, chế biến: Mạch môn thường được thu hái vào tháng 6 – 7 ở những cây đã được 2 – 3 năm. Chọn những củ già, cắt bỏ sạch rễ con, rửa sạch đất. Củ to trên 6 mm bổ làm đôi, củ nhỏ để nguyên phơi khô tước bỏ lõi trước khi dùng. Có khi hái về, dùng móng tay rạch củ, tách bỏ lõi, rang với gạo cho đến khi gạo có màu vàng nhạt, bỏ gạo lấy mạch môn mà dùng. Củ mạch môn hình thoi, màu vàng nhạt, hơi trong, dài 10 – 15 mm. Mùi đặc biệt, vị ngọt. Củ to bằng đầu đũa, mềm, vỏ trắng vàng, thịt ngọt, không mốc, không bị teo là tốt. Củ cứng, vị đắng thì không nên dùng [5]. 1.2. TỔNG QUAN HÓA HỌC Thành phần hóa học trong rễ củ Mạch môn (Ophiopogon japonicus (Thunb.) Ker Gawl.) gồm có đường, chất nhầy, tinh bột, chất khoáng, saponin steroid [135] [130] [131], triterpenoid [100], homoisoflavonoid [17] [19] [72], polysaccharid [45], glycosid [92], anthraquinone [143], sesquiterpen, β - sitosterol, stigmasterol, β – sitosterol – β - D glucosid... [73] [5] [71] [29]. 1.2.1. Saponin steroid Đây là nhóm hợp chất quan trọng trong rễ củ Mạch môn loài Ophiopogon japonius được nhiều tác giả nghiên cứu. Nổi bật trong số đó là nolinospirosid F [51], ophiopogonin A, B, C, D. Ophiopogonin A, B và D khi thủy phân cho phần aglycon là ruscogenin [130]. Từ năm 2000 đến 2013, nhiều tác giả đã phân lập được 25 saponin steroid mới bao gồm các saponin furospirostanol và saponin furostanol, tên gọi của các hợp chất được thể hiện ở bảng 1.4. Luận văn Thạc sĩ Dược học Tổng quan tài liệu nghiên cứu Bảng 1.4. Một số saponin steroid mới được phân lập từ loài O.japonicus Saponin steroid Tên hợp chất Cixi-ophiopogons A 3-O-α-L-rhamnopyranosyl (12)-[β-D-xylopyranosyl-(13]-βD-glucopyranosid [110] Cixi-ophiopogons B [109] ophiogenin 3- O -α-L rhamnopyranosyl (12) [β-Dxylopyranosyl (13]-[β-D-glucopyranosyl (14)]-β-Dglucopyranosid Ophiopojaponin A Pennogenin-3-O-[2’-O-acetyl-α-L rhamnopyranosyl (12)]-β-Dxylopyranosyl (13)β-D-glucopyranosid Ophiopojaponin B [22] (25R)-3β, 14α, 2ξ, 26-tetrahydroxyfurost-5-ene-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(12)-β-D-glucopyranosid]-26-O-β-Dglucopyranosid Ophiopojaponin C [28] Ophiopogonin E [140] Ophiopogenin 3- O- [α-L-rhamnopyranosyl (12)]-β-Dxylopyranosyl-(14)-β-D-glucopyranosid Pennogenin-3-O-β-D-xylopyranosyl-(14)-β-D- glucopyranosid Ophiofurospisid A [110], B [109] 26-O-β-D-glucopyranosyl-(22S, 25R)-furospirost-5-ene-3β, 17α, 26-triol-3- O- [α-L- rhamnopyranosyl-(12)]-[β-Dxylopyranosyl(14)]-glucopyranosid Saponin C27-steroidal glycosid Pennogenin-3-O-α-L-r hamnopyranosyl-(12)-β- Dxylopyranosyl-(14)-β- D-glucopyranosid [39] Saponin steroidal glycosid 26-O-β-D-glucopyranosyl (25S)-furost-5-ene-1β, 3β, 22α, 26tetraol-1-O-β-D-xylopyranosyl-(13)-[α-L-rhamnopyranosyl(12)]-β-D-fucopyranosid Saponin steroidal glycosid (25R) spirost-5-ene-3-β, 14α-diol-3-β-O-β-L-rhamnopyranosyl (12)-[β-D-xylopyranosyl-(14)]-β-D-glucopyranosid [121] Saponin steroidal glycosid (25R)-14α, 17α hydroxyspirost-5-en-3β-yl-3-O-α-Lrhamnpyranosyl-(12)-β-D-glucopyranosyl-(13)-β-Dglucopyranosid [133] Saponin steroidal glycosid 25(S)-ruscogenin-1-O-β-D-xylopyranosyl-(12)-[β-Dxylopyranosyl-(13)]-β-D-fucopyranosid, Saponin steroidal glycosid Neo-ruscogenin-1-O-α-l-rhamnopyranosyl-(13)-α-L-rhamnopyranosyl-(12)-β-D-fucopyranosid Saponin steroidal glycosid 25(S)-ruscogenin-1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(12)-[β-Dxylopyranosyl-(13)]-4-O-acetyl-β-D-fucopyranosid [128]. Ophiopogonin F (25R)-26-[(O-β-D-glucopyranosyl(12)-β- D -glucopyranosyl)]22α-hydroxyfurost-5-ene-3-O-β-D-xylopyranosyl-(14)-O[α-Lrhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucopyranosid