Tài liệu Xác định đột biến gen alpha globin gây bệnh thalassemia bằng kỹ thuật pcr đa mồi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------- Trần Tuấn Anh XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN ALPHA GLOBIN GÂY BỆNH THALASSEMIA BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------- Trần Tuấn Anh XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN ALPHA GLOBIN GÂY BỆNH THALASSEMIA BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán bộ hướng dẫn: PGS. TS. Võ Thị Thương Lan Hà Nội - 2014 LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thành luận văn này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS. TS. Võ Thị Thương Lan, người đã chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình em thực hiện đề tài. Cô không chỉ truyền thụ cho em nhiều kiến thức về chuyên môn mà còn giúp em bồi đắp lòng say mê, sự nghiêm túc, tính cẩn thận trong nghiên cứu khoa học. Đó là nền tảng cho quá trình thực hiện luận văn, là hành trang giúp em tự tin vững bước trên con đường khoa học sau này. Em cũng xin trân trọng cảm ơn ThS. Tạ Bích Thuận. Cô đã luôn động viên, dành cho em nhiều lời khuyên quý báu trong những lúc em gặp khó khăn. Về phía nhà trường, em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo Khoa Sinh học đã giảng dạy cho em nhiều kiến thức quý báu; em xin cảm ơn Bộ môn Di truyền học, Phòng sau đại học, Phòng công tác chính trị Học sinh - Sinh viên đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn thạc sỹ. Em cũng xin cảm ơn Phòng thí nghiệm Sinh Y, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym - Protein là nơi em thực hiện đề tài nghiên cứu cho luận văn thạc sỹ. Về phía cơ quan, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể Khoa Di truyền & SHPT, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương là nơi em đang công tác. Các anh chị luôn chia sẻ với em trong công việc, thường xuyên động viên về tinh thần giúp em vững tin trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Những kiến thức chuyên môn anh chị chia sẻ đã giúp em hoàn thiện luận văn tốt nhất có thể. Em xin chân thành cảm ơn NCS. Ngô Thị Hà và các bạn sinh viên Phòng thí nghiệm Sinh Y đã giúp đỡ và cổ vũ em trong suốt thời gian qua. Đặc biệt em xin cảm ơn ThS. Nguyễn Thị Thu Hường đã luôn kề bên động viên tinh thần, giúp đỡ tận tình mỗi khi em gặp khó khăn trong quá trình thực hiện luận văn cũng như những vấn đề trong cuộc sống. Lời cuối em xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, người thân và bạn bè luôn ủng hộ, giúp đỡ em rất nhiều về cả vật chất lẫn tinh thần để em có thể hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2014 Học viên Trần Tuấn Anh BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Viết đầy đủ Viết tắt ADN : Acid Deoxyribonucleic ARN : Acid Ribonucleic bp : Base pair dNTP : Deoxynucleotide Triphosphates G6PD : Glucose-6-phosphate dehydrogenase kb : Kilobase MCH : Mean Cell Hemoglobin MCV : Mean Corpuscular Hemoglobin PCR : Polymerase Chain Reaction WHO : World Health Organization DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1. Cấu trúc cụm gen α-globin nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 16 (16p13.3) 9 Hình 2. Những mất đoạn ADN là nguyên nhân gây α+-thalassemia 10 Hình 3. Cơ chế hình thành 2 mất đoạn phổ biến gây α+-thalassemia 11 Hình 4. Những mất đoạn gây αo -thalassemia và vùng đứt gãy trên cụm gen α-globin 12 Hình 5. Sơ đồ xét nghiệm sàng lọc bệnh thalassemia 15 Hình 6. Sơ đồ thiết kế mồi phát hiện 5 mất đoạn phổ biến trong bệnh alpha thalassemia 23 Hình 7. Sơ đồ nghiên cứu 26 Hình 8. Kết quả điện di ADN tổng số trên gel agarose 1% 32 Hình 9. Kết quả tối ưu điều kiện cho đoạn α2 và đoạn nội kiểm LIS 33 Hình 10. Kết quả sàng lọc đột biến -- SEA 34 Hình 11. Kết quả sàng lọc đột biến --T HAI 35 Hình 12. Kết quả sàng lọc và tối ưu điều kiện phản ứng PCR đơn khuếch đại đoạn -α3.7 (A) và đoạn -α4.2 (B) 36 Hình 13. Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn SEA bằng cặp mồi vector M13-F/R 38 Hình 14. Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn SEA bằng cặp mồi SEA-F/R 39 Hình 15. Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn 4.2 bằng cặp mồi vector M13-F/R 39 Hình 16. Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn 4.2 với cặp mồi 4.2-F/R 40 STT Tên hình Trang Hình 17. Kết quả tách plasmid tái tổ hợp 40 Hình 18. Kết quả so sánh đoạn SEA với ngân hàng dữ liệu NCBI 41 Hình 19. Kết quả so sánh đoạn 4.2 với ngân hàng dữ liệu NCBI 42 Hình 20. Kết quả tối ưu điều kiện phản ứng PCR với hai cặp mồi LIS và α2 44 Hình 21. Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng ba cặp mồi LIS, α2, SEA 45 Hình 22. Kết quả tối ưu điều kiện phản ứng PCR sử dụng ba cặp mồi LIS, α2, SEA 46 Hình 23. Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng bốn cặp mồi LIS, α2, SEA và 4.2 48 Hình 24. Kết quả tối ưu điều kiện phản ứng PCR với mồi α2/3.7-F mới thiết kế 49 Hình 25. Kết quả kiểm tra tính ổn định của mồi α2/3.7-F mới thiết kế 49 Hình 26. Kết quả tối ưu điều kiện PCR với 4 cặp mồi có bổ sung DMSO 51 Hình 27. Kết quả sàng tối ưu PCR với 5 cặp mồi LIS, α2, SEA, α4.2 và α3.7 52 Hình 28. Kết quả PCR một số mẫu mang đột biến với quy trình PCR đa mồi tối ưu 53 DANH MỤC CÁC B ẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1. Trình tự các cặp mồi dùng trong nghiên cứu và kích thước sản phẩm PCR tương ứng 24 Bảng 2. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đơn mồi LIS, α2, SEA, THAI, α4.2, α3.7 28 Bảng 3. Thành phần và điều kiện nối đoạn đột biến vào vector pTZ5T-R/T 37 Bảng 4. Bảng 5. Bảng 6. Bảng 7. Bảng 8. Bảng 9. Bảng 10. Bảng 11. Thành phần và điều kiện sàng lọc khuẩn lạc với cặp mồi vector M13-F/R Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sử dụng hai cặp mồi LIS và α2 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sử dụng ba cặp mồi LIS, α2 và SEA Thành phần và điều kiện phản ứng PCR tối ưu sử dụng ba cặp mồi LIS, α2 và SEA Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sử dụng bốn cặp mồi LIS, α2, SEA, và α4.2 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đa mồi có bổ sung DMSO Thành phần và điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR sử dụng 5 cặp mồi LIS, α2, SEA, α4.2 và α3.7 Tổng hợp số liệu đột biến 38 43 45 46 47 50 52 66 MỤC LỤC M Đ U..............................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................3 1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH ALPHA THALASSEMIA.............................................3 1.1.1. Sơ lược về bệnh thalassemia ...................................................................................3 1.1.2. Cơ chế sinh bệnh.......................................................................................................3 1.1.3. Bệnh alpha thalassemia, đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng ............................5 1.1.4. Cơ sở phân tử bệnh alpha thalassemia ...................................................................8 1.1.4.1. Cấu trúc và tổ chức cụm gen globin ở người .....................................................8 1.1.4.2. Cơ chế phát sinh đột biến .....................................................................................9 1.2. SÀNG LỌC NGƯỜI MANG GEN VÀ CHẨN ĐOÁN BỆNH ALPHA THALASSEMIA ...............................................................................................................13 1.2.1. Chiến lược sàng lọc người mang gen bệnh thalassemia ....................................13 1.2.2. Các phương pháp sàng lọc và chẩn đoán bệnh ...................................................16 1.2.2.1. Phương pháp huyết học ......................................................................................16 1.2.2.2. Phân tích thành phần hemoglobin .....................................................................17 1.2.2.3. Phân tích tỷ lệ tổng hợp chuỗi alpha/beta-globin ............................................17 1.2.2.4. Phương pháp sinh học phân tử...........................................................................18 1.3. PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ALPHA THALASSEMIA ...............................................................................................................19 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................22 2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ .......................................................22 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu.............................................................................................22 2.1.2. Hóa chất ...................................................................................................................22 2.1.3. Các cặp mồi .............................................................................................................23 2.1.4. Thiết bị .....................................................................................................................24 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................25 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu ....................................................................................................25 2.2.2. Phương pháp xác định nồng độ ADN bằng đo quang phổ ................................27 2.2.3. Kỹ thuật PCR đa mồi .............................................................................................27 2.2.4. Phương pháp điện di...............................................................................................28 2.2.5. Phương pháp tách dòng..........................................................................................28 2.2.5.1. Biến nạp bằng sốc nhiệt ......................................................................................29 2.2.5.2. Sàng lọc khuẩn lạc và nuôi tế bào bão hòa ......................................................29 2.2.5.3. Tách plasmid ........................................................................................................30 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...............................................................31 3.1. ĐẶC ĐIỂM NHÓM BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU .............................................31 3.2. KẾT QUẢ SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN ĐƠN ..............................................................32 3.2.1. Sàng lọc mất đoạn SEA .........................................................................................33 3.2.2. Sàng lọc hai mất đoạn THAI, FIL ........................................................................34 3.2.3. Sàng lọc mất đoạn -α4.2 và -α3.7 .........................................................................35 3.3. BIẾN NẠP, TÁCH DÒNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ ĐOẠN ĐỘT BIẾN ...............37 3.3.1. Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn đột biến SEA .........................................37 3.3.2. Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn đột biến α4.2 ........................................39 3.3.3. Kết quả giải trình tự đoạn đột biến .......................................................................40 3.4. KẾT QUẢ TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG PCR ĐA MỒI...................43 3.4.1. Tối ưu PCR với cặp mồi LIS và α2 ..................................................................43 3.4.2. Tối ưu PCR với 3 cặp mồi LIS, α2 và SEA ........................................................44 3.4.3. Tối ưu PCR với 4 cặp mồi LIS, α2, SEA và α4.2 ..............................................47 3.4.4. Tối ưu PCR với 5 cặp mồi LIS, α2, SEA, α4.2 và α3.7 .....................................51 3.5. KẾT QUẢ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN BẰNG PCR ĐA MỒI ............................53 3.6. THẢO LUẬN ............................................................................................................54 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..............................................................61 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................62 Tiếng Việt ...........................................................................................................................62 Tiếng Anh ...........................................................................................................................62 Phụ lục 1 - Kết quả giải trình tự đoạn đột biến SEA.....................................................69 Phụ lục 2 - Kết quả giải trình tự đoạn đột biến α4.2 .....................................................70 Phụ lục 3 - Kết quả phát hiện đột biến trên 100 mẫu bằng kỹ thuật PCR đa mồi .....71 Phụ lục 4 - Bảng tổng hợp kết quả xét nghiệm cận lâm sàng ......................................74 Phụ lục 5 - Những đột biến điểm gây α-thalassemia ....................................................79 Phụ lục 6 - Những đột biến alpha-thalassemia trong khu vực Đông Nam Á.............80 M Đ U Hàng năm ước tính khoảng 7,9 triệu trẻ em (chiếm khoảng 6%) trên toàn thế giới sinh ra với di tật bẩm sinh nghiêm trọng có nguồn gốc di truyền. Theo thống kê năm 2001 có 5 dị tật bẩm sinh nghiêm trọng có nguồn gốc di truyền phổ biến nhất là: (1) bệnh tim bẩm sinh (1.040.835 trẻ), (2) dị tật ống thần kinh (323.904 trẻ), (3) rối loạn hemoglobin gồm thalassemia và bệnh hồng cầu hình liềm (307.897 trẻ), (4) hội chứng Down (217.293 trẻ), (5) thiếu hụt G6PD (177.032 trẻ). Năm dị tật bẩm sinh này chiếm 25% trong tổng số 7.000 dị tật bẩm sinh do di truyền. Trong những năm gần đây, nhiều công trình nghiên cứu về mô hình bệnh trên trẻ em Việt Nam cho thấy các bệnh ung thư và bệnh di truyền ngày càng phát hiện nhiều và có xu hướng gia tăng. Đặc biệt nghiêm trọng là bệnh thalassemia, ước tính khoảng 5,3 triệu người mang gen bệnh, với 2.400 trẻ sinh ra mang gen bệnh hàng năm. Đây là nguyên nhân gây giảm chất lượng dân số và tăng gánh nặng chi tiêu ngân sách cho y tế. Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đã xây dựng “Chương trình thalassemia quốc gia” nhằm hạn chế sự phổ biến của gen bệnh trong cộng đồng và giảm số trẻ sinh ra mang bệnh. Theo chương trình này, việc sàng lọc trước hôn nhân và sàng lọc trước sinh với đối tượng nguy cơ cao là bắt buộc. Với đặc trưng dân số theo khu vực địa lý mà phác đồ sàng lọc ở mỗi quốc gia có thể khác nhau. Trong đó, xét nghiệm gen sẽ cho biết chính xác những đột biến và kiểu gen bệnh lý. Một trong những trở ngại lớn nhất là việc xác định đồng thời nhiều đột biến gen rất tốn kém chi phí và thời gian. Từ năm 2000 đến nay đã có nhiều nghiên cứu công bố về việc phát hiện đồng thời nhiều mất đoạn lớn trên cụm gen α-globin trong một phản ứng PCR đa mồi. Tuy nhiên những nghiên cứu này không đề cập đến cách thức tối ưu hóa phản ứng PCR đa mồi cho vùng giàu trình tự GC như cụm gen α-globin. 1 Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Xác định đột biến gen alpha globin gây bệnh thalassemia bằng kỹ thuật PCR đa mồi” với mục đích tìm hiểu sâu hơn về nguyên lý kỹ thuật như vấn đề thiết kế nhiều cặp mồi cho một phản ứng, việc tối ưu phản ứng PCR trên những vùng trình tự giàu GC và trên cơ sở quy trình tối ưu để đánh giá tỷ lệ đột biến trên đối tượng nghiên cứu. Đề tài nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y thuộc Khoa Sinh học của Trường Đại học Khoa học Tự nhiên và Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ BỆNH ALPHA THALASSEMIA 1.1.1. Sơ lược về bệnh thalassemia Thalassemia là một trong những rối loạn di truyền nhiễm sắc thể thường, gây thiếu hụt tổng hợp một trong hai chuỗi alpha globin (α-globin) hoặc beta globin (β-globin). Bệnh thalassemia được bác sĩ Thomas Cooley mô tả lâm sàng lần đầu tiên vào năm 1925 trên một số trẻ em người Ý, Hy Lạp và Xy-ri - với hồng cầu nhỏ, nhược sắc cùng hiện tượng tan máu mãn tính [10]. Do đó, bệnh được đặt tên là bệnh thiếu máu Cooley (hay bệnh thalassemia thể nặng sau này). Đến năm 1932, Wipple và Bradford đã đổi tên bệnh thiếu máu Cooley thành bệnh “Thalassemia” – bởi vì đến thời điểm đó bệnh chủ yếu được phát hiện ở vùng ven biển Địa Trung Hải (“thalassemia” có nguồn gốc từ chữ “thalasa” - trong tiếng Hy Lạp có nghĩa là “the sea” hay là bệnh vùng biển). Thalassemia được coi là hệ quả của một loạt các đột biến gen nhằm chống lại bệnh sốt rét. Theo ưu thế dị hợp tử thì những người mang gen đột biến hay dị hợp tử đột biến có sức sống và khả năng kháng ký sinh trùng sốt rét tốt hơn người bình thường. Do đó bệnh rất phổ biến ở các vùng sốt rét lưu hành, các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới như Địa Trung Hải, Đông Nam Á, Ấn Độ, Đông Nam Trung Quốc, Bắc Mỹ [13]. 1.1.2. Cơ chế sinh bệnh Hemoglobin (Hb) là phân tử có vai trò mang và vận chuyển oxy trong cơ thể. Một phân tử Hb bình thường (HbA) được cấu thành từ 2 chuỗi α-globin liên kết với 2 chuỗi β-globin và bốn nhân Hem có khả năng vận chuyển được bốn phân tử oxy. Trong bệnh thalassemia có sự mất cân bằng tổng hợp giữa chuỗi α-globin và chuỗi β-globin. Do quá trình tổng hợp một trong hai chuỗi bị rối loạn gây thiếu hụt một loại chuỗi và thừa lượng chuỗi còn lại làm thay đổi tỷ lệ của các phân tử huyết sắc 3 tố và xuất hiện tình trạng bệnh lý. Số lượng chuỗi globin thừa sẽ trùng hợp tạo nên các thể vùi huyết sắc tố. Những thể vùi này không có tác dụng vận chuyển oxy mà chúng lắng xuống màng hồng cầu và nguyên sinh chất của hồng cầu. Với hồng cầu ở máu ngoại vi, thể vùi huyết sắc tố làm thay đổi tính thấm, tính mềm dẻo của màng. Mặt khác nó cũng làm cho màng hồng cầu tăng diện tích tiếp xúc và dễ bị phá hủy bởi các tác nhân oxi hóa. Những tác hại trên của thể vùi huyết sắc tố làm hồng cầu bị vỡ sớm gây nên hiện tượng tan máu. Còn ở tủy xuơng, các thể vùi trên gắn lên nguyên sinh chất và màng của các hồng cầu non, làm hồng cầu bị chết trước khi trưởng thành, dẫn đến tăng sinh mạnh các hồng cầu non trong tủy, gây nên các biến dạng xương, tăng hấp thụ sắt gây ra nhiễm sắt cho cơ thể. Đây là cơ chế chủ yếu gây ra những biến đổi về lâm sàng và huyết học ở những bệnh nhân thalassemia thể nặng [65]. Do vậy mà người mắc bệnh thalassemia thể nặng đòi hỏi phải được điều trị bằng truyền hồng cầu thay thế suốt đời và thải sắt định kỳ. Điều trị này khá tốn kém và dai dẳng làm số đông người bệnh hiện nay không được điều trị đầy đủ, đặc biệt tại các nước đang phát triển. Ngày nay, bệnh thalassemia được xem là một trong những nhóm bệnh di truyền đơn gen phổ biến nhất trong dân số thế giới. Bệnh tập trung chủ yếu trong khu vực địa lý trải dài từ vùng biển Địa Trung Hải qua nhiều nước nhiệt đới bao gồm các nước Châu Phi cận Sahara, Trung Đông, Ấn Độ, Đông Nam Á và Indonesia [65]. Tần suất người mang gen bệnh dao động từ khoảng 3 – 10 % dân số, một số tộc người Ấn Độ tần suất mang gen rất cao 80 – 90 % dân số [25]. Theo số liệu của eatherall và Clegg năm 2001, số người mang gen bệnh chiếm khoảng 7 % dân số thế giới; mỗi năm có xấp x 300.000 trẻ em sinh ra bị mắc bệnh t halassemia, trong đó 80 % ở các nước thu nhập thấp và trung bình [65, 66]. Việt Nam, bệnh thalassemia được phát hiện lần đầu vào năm 1960 tại Bệnh viện Bạch Mai. Những nghiên cứu được tiến hành từ đó đến nay cho t hấy tần suất mang gen bệnh thalassemia ở Việt Nam khá cao: alpha thalassemia (αthalassemia) xấp x 2,1 %, beta thalassemia (β-thalassemia) xấp x 1,4 % dân số 4 [48]. Việt Nam hiện đứng thứ 2 trong khu vực Đông Nam Á về số người mang gen với 5,3 triệu người mang gen bệnh và có tới 2.400 trẻ mang gen bệnh trong tổng số 1,4 triệu trẻ mới sinh hàng năm (430 mang β-thalassemia, 520 β-thalassemia/HbE, 1,050 HbH, 435 Hb Bart) [48]. 2,1 % dân số mang gen bệnh α-thalassemia và 62 % trẻ mang gen bệnh α-thalassemia (trong số 2.400 trẻ sinh ra mang gen thalassemia) là một cảnh báo nghiêm trọng về sự phổ biến của gen bệnh α-thalassemia trong cộng đồng. 1.1.3. Bệnh alpha thalassemia, đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng Người bình thường có 4 alen trên 2 nhiễm sắc thể tương đồng được kí hiệu là αα/αα, bốn alen này chịu trách nhiệm tổng hợp nên chuỗi α-globin. Chuỗi α-globin được tổng hợp tham gia cấu thành một số phân tử hemoglobin bao gồm: HbA ở người trưởng thành (alpha2 beta2), HbF trong bào thai (alpha2 gamma2) và một lượng nhỏ HbΑ2 (alpha2 delta2). Đột biến xảy ra trên cụm gen α-globin làm giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi α-globin là nguyên nhân gây ra bệnh α-thalasemia. Đặc điểm lâm sàng của bệnh α-thalassemia được báo cáo lần đầu tiên vào cuối những năm 1950 và đầu năm 1960 với những bất thường về hemoglobin liên quan tới bệnh thiếu máu hồng cầu nhỏ, hồng cầu nhược sắc trong trường hợp không thiếu sắt [41, 46, 53]. Căn cứ vào đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và số lượng alen bị đột biến, bệnh α-thalassemia được chia thành 4 thể bệnh, cụ thể như sau: Người mang α-thalassemia thể ẩn phần lớn là do mất một alen (-α/αα). Đặc điểm cận lâm sàng ở trẻ sơ sinh là huyết sắc tố Hb Bart (γ 4) tăng nhẹ (1 - 2 %) do chuỗi gamma (γ) dư thừa so với chuỗi alpha. Còn ở người trưởng thành có đặc trưng hồng cầu nhỏ và nhược sắc vừa phải, lượng HbΑ2 và HbF bình thường. Do đó, người mang α-thalassemia thể ẩn không phải sử dụng các liệu pháp điều trị. Bệnh α-thalassemia thể nhẹ là trường hợp còn hai alen có chức năng. Hai alen còn lại có thể trên cùng một nhiễm sắc thể (cis α-thalassemia) - phổ biến ở Châu Á và Trung Đông hoặc trên hai nhiễm sắc thể (trans α-thalassemia) - phổ 5 biến ở Châu Phi [32]. Bệnh có biểu hiện thiếu máu nhẹ và đặc trưng bởi lượng Hb Bart (γ 4) tăng ở trẻ sơ sinh; tỷ lệ HbΑ2, HbF bình thường ở người trưởng thành và tỷ lệ tổng hợp chuỗi α/β-globin giảm còn 0,7 - 0,8. Các trường hợp mắc bệnh αthalassemia thể nhẹ thường có kiểu gen đồng hợp tử một đột biến điểm hoặc dị hợp tử một đột biến điểm kết hợp với mất đoạn 1 gen [20]. Đôi khi bệnh nhân mang một đột biến điểm đồng hợp tử có đặc trưng lâm sàng của bệnh HbH thể nhẹ như trường hợp đồng hợp tử đột biến Hb Constant Spring là đột biến điểm phổ biến ở các nước châu Á [19, 52]. Bệnh HbH là tình trạng ch còn lại một alen có chức năng, thường do đột biến mất 3 alen (--/-α) hoặc mất 2 gen α kết hợp với một đột biến điểm (--/αNDα), dẫn đến dư thừa chuỗi β-globin và hình thành nên huyết sắc tố bất thường HbH (β4 ). Dạng bệnh có đột biến điểm kết hợp thường có đặc điểm lâm sàng nặng hơn dạng mất 3 gen. Theo báo cáo thống kê từ hơn 500 bệnh nhân tại bệnh viện Siriraj (Thái Lan), tần suất bệnh HbH do đột biến điểm (60 %) cao hơn đột biến mất đoạn (40 %) [63]. Đặc điểm lâm sàng của bệnh HbH từ nhẹ đến rất nặng là hội chứng phù thai HbH. Hội chứng này được quan sát ở số ít trường hợp mang đột biến mất đoạn 2 gen kết hợp với một đột biến điểm tại codon 31 (GA) hoặc codon 59 (GA), tuy nhiên chưa có những hiểu biết rõ ràng về hội chứng này. Cấu trúc phân tử huyết sắc tố HbH không ổn định và chủ yếu bị tủa trong tế bào hồng cầu (ở dạng thể vùi) sau đó bị phá hủy sớm ở lách gây nên tình trạng tan máu [49]. Đặc điểm cận lâm sàng của bệnh HbH là thiếu máu, tan máu hồng cầu nhỏ, nhược sắc; các thông số tế bào máu: MCH ~ 18 pg, MCV khoảng 58 fl ở trẻ em và 64 fl ở người lớn, nồng độ hemoglobin 7 - 10 g/dL và tỷ lệ hồng cầu lưới 5 – 10 %; tỷ lệ tổng hợp chuỗi alpha/beta globin giảm còn 0,2 – 0,6 [19, 26]. Đặc điểm lâm sàng của bệnh là gan to, lách to, có biến dạng xương ở những bệnh nhân quá tải sắt. Tuy nhiên, trường hợp quá tải sắt ch gặp ở những người bệnh lớn tuổi do việc truyền máu lặp lại hoặc do tăng hấp thu sắt. Khi người bệnh mang thai, tình trạng thiếu máu có thể xấu đi do tăng mức độ tan máu, có nguy cơ nhiễm trùng cao khi sử dụng thuốc oxi hóa. Vì vậy thai phụ phải tránh việc dùng thuốc oxi hóa trong thai kỳ [39]. 6 Hội chứng phù thai Hb Bart thường gắn liền với sự vắng mặt cả 4 alen (--/--). Do đó máu thai nhi không có HbF và HbA mà chủ yếu là huyết sắc tố Hb Bart (γ 4) và một lượng nhỏ Hb Portland 1 và Hb Portland 2 (zeta2 gamma2 và zeta2 beta2). Bệnh đặc trưng bởi thiếu máu rất nghiêm trọng (lượng Hb khoảng 3 – 8 g/dL); đặc điểm lâm sàng gan to, lách to, phù thai và suy tim [67]. Trẻ sơ sinh không thích ứng được với tình trạng này nên thường chết ngay sau khi sinh [67]. Một số biến chứng của sản phụ bao gồm tiền sản giật, đa ối (Polyhydramnios) hoặc thiểu ối (Oligohydramnios) do tăng hoặc giảm tích tụ dịch ối, xuất huyết, thiếu máu và nhiễm trùng huyết. Với mức độ nghiêm trọng của hội chứng này và những biến chứng của người mẹ trong thời kỳ mang thai, việc chấm dứt thai kỳ được khuyến cáo. Hội chứng Hb Bart tương đối phổ biến ở khu vực Đông Nam Á, trong khi hiếm gặp ở Địa Trung Hải do tần suất mang αo-thalassemia thấp [19, 21, 37]. Tuy nhiên, sự di dân trên thế giới và tập quán kết hôn đang làm gia tăng hội chứng Hb Bart ở nhiều quốc gia và hiện tại chưa có điều trị đặc hiệu cho hội chứng này. Phân tích các thể bệnh trong α-thalassemia cho thấy tương quan giữa kiểu gen với đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng bệnh rất phức tạp. Mối tương quan này không ch đơn giản là kiểu gen quyết định đặc điểm lâm sàng và không ch liên quan đến 2 gen α-globin mà còn liên quan đến cả những gen khác trong cụm gen αglobin như gen zeta mã hóa cho Hb Portland và gen theta chưa rõ chức năng. Do đó, rất khó để phân biệt rõ ràng những khác biệt lâm sàng dựa vào số lượng gen bị mất hoặc không có chức năng. Ví dụ như đồng hợp tử mất đoạn –SE A (mất cả 4 gen α) là nguyên nhân gây phù thai khá phổ biến ở khu vực Đông Nam Á, tuy nhiên lượng hemoglobin bào thai (Hb Portland 1 và Hb Portland 2) vẫn đủ chức năng cho thai tiếp tục phát triển. Trong khi, dạng đồng hợp tử đột biến (--FIL hoặc --T HAI) mất 4 gen α và mất cả gen zeta do vậy mà không sản xuất được Hb Portland, cho nên phải sớm đình ch thai ngay khi xác định để tránh nguy hiểm cho thai phụ [7, 26]. 7 Với số lượng đột biến gây bệnh lớn, tổ hợp các gen đột biến hình thành nhiều đặc điểm lâm sàng đa dạng thì việc phân loại bệnh không thể ch dựa vào đặc điểm lâm sàng. Để có chẩn đoán bệnh chính xác và có những hiểu biết thấu đáo về từng trường hợp bệnh cụ thể cần phải xem xét đồng thời những biểu hiện lâm sàng và cơ sở phân tử của bệnh. 1.1.4. Cơ sở phân tử bệnh alpha thalassemia 1.1.4.1. Cấu trúc và tổ chức cụm gen globin ở người người bình thường, chuỗi α-globin được tổng hợp bởi gen α1-globin và gen α2-globin nằm cạnh nhau trên nhiễm sắc thể 16 (băng 16p13.3). Cấu trúc cụm gen α-globin được xác định lần đầu bằng kỹ thuật lai ADN (blot hybridization) từ năm 1978 [50]. Hình 1 mô tả cấu trúc cụm gen α-globin với 2 gen alpha1 và alpha2 mã hóa cho chuỗi α-globin, 1 gen zeta2 mã hóa cho chuỗi ζ-globin trong phôi, 3 gen giả (pseudo zeta1, pseudo alphal và pseudo alpha2) và 1 gen theta1 chưa rõ chức năng [40]. Các gen chức năng được sắp xếp theo thứ tự “telomer-zeta-alpha2alpha1-centromer” và được điều hòa từ xa bởi 4 vùng (được gọi là trình tự bảo tồn đa loài [MCS]-R1-R4) định vị khoảng 40 kb ở phần đầu cụm gen này [25]. Quá trình điều hòa làm cho mức độ biểu hiện của gen α2-globin gấp 2 - 3 lần mức độ biểu hiện của gen α1-globin. Sự khác biệt mức độ biểu hiện của 2 gen α-globin liên quan đến sự đa dạng về kiểu gen cũng như đặc điểm lâm sàng trong thể mang và bệnh sinh α-thalassemia [61]. Cho đến nay đã xác định được hơn 40 loại đột biến mất đoạn và hơn 100 đột biến điểm liên quan đến bệnh α-thalassemia, những đột biến này gây giảm tổng hợp (α +-thalassemia) hoặc mất tổng hợp chuỗi α-globin (αothalassemia). 8 Nhiễm sắc thể 16 Cụm gen α-globin Hình 1. Cấu trúc cụm gen α-globin nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể 16 (16p13.3) gồm 2 gen mã hóa cho chuỗi α-globin - alpha1 và alpha2, 1 gen zeta2 mã hóa cho chuỗi ζ-globin trong phôi, 3 gen giả (pseudo zeta1, pseudo alphal và pseudo alpha2) và 1 gen theta1 chưa rõ chức năng [4, 40]. 1.1.4.2. Cơ chế phát sinh đột biến a) Cơ chế phát sinh alpha +-thalassemia do đột biến mất đoạn Hai gen α-globin nằm trong 2 vùng trình tự bảo thủ và tương đồng cao, có chiều dài khoảng 4 kb [28, 40]. Các vùng tương đồng (X, Y, Z) phân cách nhau bởi các yếu tố không tương đồng (I, II, III) được mô tả trong Hình 2. Tái tổ hợp tương đồng giữa hai vùng trình tự Z sẽ hình thành một nhiễm sắc thể mất đoạn 3.7 kb (-α3.7 ) ch còn 1 gen α-globin gây α-thalassemia và một nhiễm sắc thể mang 3 gen α-globin (αααanti3.7 ) không bị thalassemia. Tương tự, tái tổ hợp tương đồng giữa hai vùng trình tự X tạo thành một nhiễm sắc thể mất đoạn 4.2 kb (-α4.2 ) gây αthalassemia và một nhiễm sắc thể mang 3 gen (αααanti4.2 ) không bị thalassemia (Hình 3) [31, 60]. Mất đoạn -α3.7 và -α4.2 là hai mất đoạn đơn gen gây α-thalassemia phổ biến nhất trong các quần thể dân số. Ngoài ra còn một số mất đoạn do tái tổ hợp tương hỗ khác, ít phổ biến hơn cũng gây α+-thalassemia được mô tả trong Hình 2 và một số ít mất đoạn do tái tổ hợp không tương đồng được mô tả trong một vài nghiên cứu khác [29]. 9