Tài liệu Xây dựng tiêu chuẩn cao khô dâm dương hoắc, cao khô bách bệnh và viên nén bao phim dâm dương hoắc – bách bệnh

. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ----------------- BỘ Y TẾ NGUYỄN NGỌC THẠCH XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CAO KHÔ DÂM DƯƠNG HOẮC, CAO KHÔ BÁCH BỆNH VÀ VIÊN NÉN BAO PHIM DÂM DƯƠNG HOẮC – BÁCH BỆNH Luận văn Thạc sĩ Dược học Thành Phố Hồ Chí Minh – 2018 . . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ----------------- BỘ Y TẾ NGUYỄN NGỌC THẠCH XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CAO KHÔ DÂM DƯƠNG HOẮC, CAO KHÔ BÁCH BỆNH VÀ VIÊN NÉN BAO PHIM DÂM DƯƠNG HOẮC – BÁCH BỆNH Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc và độc chất Mã số: 8720210 Luận văn Thạc sĩ Dược học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN ĐỨC HẠNH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2018 . . LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nguyễn Ngọc Thạch . . v MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN BẢN TÓM TẮT TOÀN VĂN LUẬN VĂN BẰNG TIẾNG VIỆT BẢN TÓM TẮT TOÀN VĂN LUẬN VĂN BẰNG TIẾNG ANH MỤC LỤC .................................................................................................................................. v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................... x DANH MỤC BẢNG ................................................................................................................ xii DANH MỤC HÌNH ................................................................................................................. xiv MỞ ĐẦU .................................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ DDH ................................................................................................... 3 1.1.1. Tổng quan về thực vật ............................................................................................... 3 1.1.2. Tổng quan về thành phần hóa học ............................................................................. 4 1.1.3. Tổng quan về tác dụng dược lý.................................................................................. 6 1.1.4. Tổng quan về icariin .................................................................................................. 7 1.1.5. Tổng quan về epimedin C .......................................................................................... 8 1.2. TỔNG QUAN VỀ BB ....................................................................................................... 9 1.2.1. Tổng quan về thực vật ............................................................................................... 9 1.2.2. Tổng quan về thành phần hóa học ........................................................................... 10 1.2.3. Tổng quan về tác dụng dược lý................................................................................ 11 1.2.4. Tổng quan về eurycomanon..................................................................................... 11 1.3. MỘT SỐ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT ĐIỂM CHỈ TRONG DƯỢC LIỆU DDH ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ .......................................................................................... 12 1.3.1. Phương pháp định lượng icariin trong dược liệu DDH theo DĐVN V ................... 12 1.3.2. Phương pháp định lượng epimedin C đối với dược liệu Vu sơn DDH theo DĐVN V .................................................................................................................................. 13 1.3.3. Phương pháp chiết xuất và phân tích các flavonoid trong dược liệu DDH theo quy trình công bố của X.J. Chen và cộng sự năm 2007 .................................................. 14 . . vi 1.4. MỘT SỐ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG EURYCOMANON TRONG DƯỢC LIỆU BB ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ .................................................................................................... 16 1.4.1. Phương pháp phân tích eurycomanon trong dược liệu BB và các chế phẩm chứa BB theo quy trình công bố của A. Norhidayah và cộng sự năm 2015 ........................... 16 1.4.2. Phương pháp phân tích eurycomanon trong dịch chiết nước của rễ BB theo quy trình công bố của M. Mohamad và cộng sự năm 2013 ............................................ 17 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................ 19 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ......................................................................................... 19 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................................. 19 2.1.2. Chất đối chiếu .......................................................................................................... 19 2.1.3. Dung môi, hóa chất .................................................................................................. 19 2.1.4. Dụng cụ, trang thiết bị ............................................................................................. 20 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................... 20 2.2.1. Xây dựng quy trình định lượng đồng thời epimedin C và icariin trong cao khô DDH .................................................................................................................................. 20 2.2.2. Thẩm định quy trình định lượng đồng thời epimedin C và icariin trong cao khô DDH ......................................................................................................................... 23 2.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn cao khô DDH ......................................................................... 26 2.2.4. Xây dựng quy trình định lượng eurycomanon trong cao khô BB ............................ 28 2.2.5. Thẩm định quy trình định lượng eurycomanon trong cao khô BB .......................... 30 2.2.6. Xây dựng tiêu chuẩn cao khô BB ............................................................................ 31 2.2.7. Xây dựng quy trình định lượng đồng thời eurycomanon, epimedin C và icariin trong viên nén bao phim DDH – BB ........................................................................ 33 2.2.8. Thẩm định quy trình định lượng đồng thời eurycomanon, epimedin C và icariin trong viên nén bao phim DDH – BB ........................................................................ 36 2.2.9. Xây dựng tiêu chuẩn viên nén bao phim DDH – BB .............................................. 38 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................................. 40 3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI EPIMEDIN C VÀ ICARIIN TRONG CAO KHÔ DDH .............................................................................................. 40 3.1.1. Khảo sát dung môi chiết .......................................................................................... 40 3.1.2. Lựa chọn bước sóng phát hiện ................................................................................. 40 . . vii 3.1.3. Khảo sát và lựa chọn dung môi pha động, tỉ lệ pha động, cột sắc ký ...................... 41 3.1.4. Khảo sát tỉ lệ khối lượng cao:thể tích dung môi ...................................................... 43 3.2. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI EPIMEDIN C VÀ ICARIIN TRONG CAO KHÔ DDH .............................................................................................. 45 3.2.1. Tính đặc hiệu ........................................................................................................... 45 3.2.2. Tương thích hệ thống ............................................................................................... 47 3.2.3. Tính tuyến tính ......................................................................................................... 48 3.2.4. Độ lặp lại và độ chính xác trung gian ...................................................................... 50 3.2.5. Độ đúng ................................................................................................................... 51 3.2.6. Miền giá trị .............................................................................................................. 52 3.2.7. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng .................................................................. 53 3.3. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CAO KHÔ DDH.............................................................. 54 3.3.1. Tính chất .................................................................................................................. 54 3.3.2. Định tính .................................................................................................................. 54 3.3.3. Độ ẩm....................................................................................................................... 55 3.3.4. Tro toàn phần ........................................................................................................... 55 3.3.5. Tro không tan trong acid.......................................................................................... 55 3.3.6. Định lượng ............................................................................................................... 56 3.3.7. Kim loại nặng .......................................................................................................... 57 3.3.8. Dư lượng hóa chất BVTV........................................................................................ 57 3.3.9. Giới hạn nhiễm khuẩn.............................................................................................. 58 3.3.10. Dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cao khô DDH ................................................................ 58 3.4. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG EURYCOMANON TRONG CAO KHÔ BB .................................................................................................................................... 63 3.4.1. Khảo sát dung môi chiết .......................................................................................... 63 3.4.2. Lựa chọn bước sóng phát hiện ................................................................................. 64 3.4.3. Khảo sát và lựa chọn dung môi pha động, tỉ lệ pha động, cột sắc ký ...................... 64 3.4.4. Khảo sát tỉ lệ khối lượng cao:thể tích dung môi ...................................................... 66 3.5. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG EURYCOMANON TRONG CAO KHÔ BB .................................................................................................................................... 67 . . iii 3.5.1. Tính đặc hiệu ........................................................................................................... 67 3.5.2. Tương thích hệ thống ............................................................................................... 69 3.5.3. Tính tuyến tính ......................................................................................................... 70 3.5.4. Độ lặp lại và độ chính xác trung gian ...................................................................... 71 3.5.5. Độ đúng ................................................................................................................... 72 3.5.6. Miền giá trị .............................................................................................................. 73 3.5.7. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng .................................................................. 73 3.6. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CAO KHÔ BB ................................................................. 73 3.6.1. Tính chất .................................................................................................................. 73 3.6.2. Định tính .................................................................................................................. 74 3.6.3. Độ ẩm....................................................................................................................... 74 3.6.4. Tro toàn phần ........................................................................................................... 75 3.6.5. Tro không tan trong acid.......................................................................................... 75 3.6.6. Định lượng ............................................................................................................... 76 3.6.7. Kim loại nặng .......................................................................................................... 76 3.6.8. Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật .......................................................................... 76 3.6.9. Giới hạn nhiễm khuẩn.............................................................................................. 77 3.6.10. Dự thảo tiêu chuẩn cơ sở cao khô BB ................................................................... 78 3.7. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI EURYCOMANON, EPIMEDIN C VÀ ICARIIN TRONG VIÊN NÉN BAO PHIM DDH – BB ................. 82 3.7.1. Khảo sát dung môi chiết .......................................................................................... 82 3.7.2. Lựa chọn bước sóng phát hiện ................................................................................. 83 3.7.3. Khảo sát và lựa chọn dung môi pha động, tỉ lệ pha động ........................................ 84 3.7.4. Khảo sát tỉ lệ khối lượng bột thuốc:thể tích dung môi ............................................ 85 3.8. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI EURYCOMANON, EPIMEDIN C VÀ ICARIIN TRONG VIÊN NÉN BAO PHIM DDH – BB ................. 88 3.8.1. Tính đặc hiệu ........................................................................................................... 88 3.8.2. Tương thích hệ thống ............................................................................................... 92 3.8.3. Tính tuyến tính ......................................................................................................... 94 3.8.4. Độ lặp lại và độ chính xác trung gian ...................................................................... 97 . . ix 3.8.5. Độ đúng ................................................................................................................... 98 3.8.6. Miền giá trị ............................................................................................................ 100 3.8.7. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng ................................................................ 100 3.9. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN VIÊN NÉN BAO PHIM DDH – BB ............................. 102 3.9.1. Tính chất ................................................................................................................ 102 3.9.2. Định tính ................................................................................................................ 103 3.9.3. Độ rã ...................................................................................................................... 103 3.9.4. Định lượng ............................................................................................................. 104 3.9.5. Độ đồng đều hàm lượng ........................................................................................ 105 3.9.6. Giới hạn nhiễm khuẩn............................................................................................ 107 3.9.7. Dự thảo tiêu chuẩn cơ sở viên nén bao phim DDH – BB ...................................... 107 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN...................................................................................................... 114 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 117 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................... 118 PHỤ LỤC ............................................................................................................................... 122 . . x DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ tắt Chữ nguyên Ý nghĩa ACN Acetonitrile Acetonitril AS Asymmetry Hệ số đối xứng BB Bách bệnh BVTV Bảo vệ thực vật CYP Cytochrome P DDH Dâm dương hoắc DĐVN Dược điển Việt Nam EtOH Ethanol Glc Glucose H2O Nước HPLC High Performance Liquid Chromatography The International Conference on Sắc ký lỏng hiệu năng cao các yêu cầu kỹ thuật trong đăng ký dược phẩm dùng cho người Hiệp hội hóa tinh khiết và ứng dụng quốc tế kl/kl Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use International Union of Pure and Applied Chemistry Khối lượng/khối lượng LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng lt Lý thuyết MeOH Methanol Rha Rhamnose RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối Rt Retention Time Thời gian lưu ICH IUPAC Hiệp hội quốc tế về hài hoà . . xi Độ phân giải RS Resolution STT Số thứ tự SKLM Sắc ký lớp mỏng TB Trung bình tn Thực nghiệm tR Retention Time tt/tt Thể tích/thể tích UV – Vis Ultra Violet – Visible Tử ngoại – Khả kiến WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới Xyl Xylose Thời gian lưu . . xii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các chất đối chiếu sử dụng. ........................................................................... 19 Bảng 2.2 Các dung môi sử dụng. ................................................................................... 19 Bảng 2.3 Các trang thiết bị, dụng cụ sử dụng. ............................................................... 20 Bảng 2.4 Các điều kiện sắc ký khảo sát trong xây dựng quy trình định lượng đồng thời epimedin C và icariin trong cao khô DDH. .................................................... 22 Bảng 2.5 Cách pha dãy chuẩn khảo sát tính tuyến tính quy trình định lượng đồng thời epimedin C và icariin trong cao khô DDH. .................................................... 24 Bảng 2.6 Các điều kiện sắc ký khảo sát trong xây dựng quy trình định lượng eurycomanon trong cao khô BB. ........................................................................................... 29 Bảng 2.7 Cách pha dãy chuẩn khảo sát tính tuyến tính quy trình định lượng eurycomanon trong cao khô BB. ........................................................................................... 31 Bảng 2.8 Các điều kiện sắc ký khảo sát trong xây dựng quy trình định lượng đồng thời eurycomanon, epimeidin C và icariin trong viên nén bao phim DDH – BB..35 Bảng 2.9 Cách pha dãy chuẩn khảo sát tính tuyến tính quy trình định lượng đồng thời eurycomanon, epimedin C và icariin trong viên nén bao phim DDH – BB...37 Bảng 3.1 Hàm lượng epimedin C và icariin chiết được với 2 tỉ lệ khối lượng cao khô DDH :thể tích methanol khảo sát. ............................................................................ 43 Bảng 3.2 Tính tương thích hệ thống .............................................................................. 47 Bảng 3.3 Độ lặp lại và độ chính xác trung gian. ........................................................... 50 Bảng 3.4 Kết quả độ đúng. ............................................................................................ 51 Bảng 3.5 Kết quả tiêm lặp lại các dung dịch tại nồng độ LOD, LOQ của epimedin C và icariin. ............................................................................................................. 53 Bảng 3.6 Độ ẩm của 3 lô cao khô DDH. ....................................................................... 55 Bảng 3.7 Tro toàn phần của 3 lô cao khô DDH. ........................................................... 55 Bảng 3.8 Tro không tan trong acid của 3 lô cao khô DDH. .......................................... 56 Bảng 3.9 Hàm lượng epimedin C và icariin trong 3 lô cao khô DDH. ......................... 56 Bảng 3.10 Kim loại nặng trong 3 lô cao khô DDH. ...................................................... 57 Bảng 3.11 Dư lượng hóa chất BVTV trong 3 lô cao khô DDH. ................................... 57 Bảng 3.12 Giới hạn nhiễm khuẩn 3 lô cao khô DDH. ................................................... 58 . . iii Bảng 3.13 Hàm lượng eurycomanon chiết được với 2 tỉ lệ khối lượng cao khô BB :thể tích methanol khảo sát. .......................................................................... 66 Bảng 3.14 Tính tương thích hệ thống. ........................................................................... 69 Bảng 3.15 Độ lặp lại và độ chính xác trung gian. ......................................................... 71 Bảng 3.16 Kết quả độ đúng. .......................................................................................... 72 Bảng 3.17 Kết quả tiêm lặp lại các dung dịch tại nồng độ LOD, LOQ của eurycomanon...73 Bảng 3.18 Độ ẩm của 3 lô cao khô BB ......................................................................... 74 Bảng 3.19 Kết quả tro toàn phần của 3 lô cao khô BB.................................................. 75 Bảng 3.20 Kết quả tro không tan trong acid của 3 lô cao khô BB. ............................... 75 Bảng 3.21 Hàm lượng eurycomanon trong 3 lô cao khô BB. ....................................... 76 Bảng 3.22 Kim loại nặng trong 3 lô cao khô BB. ......................................................... 76 Bảng 3.23 Dư lượng hóa chất BVTV trong 3 lô cao khô BB. ...................................... 77 Bảng 3.24 Giới hạn nhiễm khuẩn trong 3 lô cao khô BB. ............................................ 77 Bảng 3.25 Hàm lượng eurycomanon, epimedin C và icariin chiết được với 2 tỉ lệ khối lượng bột thuốc:thể tích methanol khảo sát ............................................................ 86 Bảng 3.26 Tính tương thích hệ thống. ........................................................................... 92 Bảng 3.27 Độ lặp lại và độ chính xác trung gian. ......................................................... 97 Bảng 3.28 Kết quả độ đúng. .......................................................................................... 98 Bảng 3.29 Kết quả tiêm lặp lại các dung dịch tại nồng độ LOD, LOQ của eurycomanon, epimedin C và icariin. ................................................................................. 101 Bảng 3.30 Độ rã 3 lô viên nén bao phim DDH – BB. ................................................. 103 Bảng 3.31 Hàm lượng eurycomanon, epimedin C và icariin trong 3 lô viên nén bao phim DDH – BB. ................................................................................................. 104 Bảng 3.32 Độ đồng đều hàm lượng eurycomanon, epimedin C và icariin trong 3 lô viên nén bao phim DDH – BB .................................................................................. 105 Bảng 3.33 Giới hạn nhiễm khuẩn của 3 lô viên nén bao phim DDH – BB................. 107 . . iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Một số loài DDH . ............................................................................................ 3 Hình 1.2 Một số prenylflavonoid trong DDH. ................................................................ 5 Hình 1.3 Công thức cấu tạo của icariin. .......................................................................... 7 Hình 1.4 Công thức cấu tạo của epimedin C. .................................................................. 8 Hình 1.5 Rễ BB. .............................................................................................................. 9 Hình 1.6 Một số hoạt chất trong rễ BB . ....................................................................... 10 Hình 1.7 Công thức cấu tạo của eurycomanon . ........................................................... 12 Hình 1.8 Sắc ký đồ phân tích 15 flavonoid trong một số loài DDH theo phương pháp đề xuất của X.J. Chen và cộng sự (2007). ...................................................... 14 Hình 1.9 Sắc ký đồ mẫu chuẩn eurycomanon và mẫu thử phân tích theo phương pháp đề xuất của A. Norhidayah và cộng sự (2015). .............................................. 17 Hình 3.1 SKLM phân tích dịch chiết nước, methanol, acetonitril và ethanol tuyệt đối của cao khô DDH. ........................................................................................... 40 Hình 3.2 Phổ UV – Vis của epimedin C và icariin. ...................................................... 41 Hình 3.3 Sắc ký đồ HPLC phân tích mẫu thử cao khô DDH với các điều kiện sắc ký khảo sát. .......................................................................................................... 42 Hình 3.4 Tính đặc hiệu quy trình định lượng đồng thời epimedin C (1) và icariin (2) trong cao khô DDH. ................................................................................................. 45 Hình 3.5 Mức độ tương đồng phổ UV – Vis của pic epimedin C và pic icariin trong mẫu thử cao khô DDH so với chuẩn. ............................................................................ 46 Hình 3.6 Tương quan giữa nồng độ và diện tích pic epimedin C. ................................ 49 Hình 3.7 Tương quan giữa nồng độ và diện tích pic icariin. ......................................... 50 Hình 3.8 Cao khô DDH. ................................................................................................ 54 Hình 3.9 SKLM định tính cao khô DDH. ..................................................................... 54 Hình 3.10 SKLM phân tích dịch chiết nước, methanol, acetonitril và ethanol tuyệt đối của cao khô BB. ............................................................................................ 63 Hình 3.11 Phổ UV-vis của eurycomanon. ..................................................................... 64 Hình 3.12 Sắc ký đồ HPLC phân tích mẫu thử cao khô BB với các điều kiện sắc ký khảo sát. ........................................................................................................ 65 . . xv Hình 3.13 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu quy trình định lượng eurycomanon (1) trong cao khô BB. .................................................................................................. 68 Hình 3.14 Mức độ tương đồng phổ UV – Vis của pic eurycomanon trong mẫu thử cao khô BB so với chuẩn. ............................................................................. 68 Hình 3.15 Tương quan giữa nồng độ và diện tích pic eurycomanon. ........................... 70 Hình 3.16 Cao khô BB. ................................................................................................. 74 Hình 3.17 Kết quả định tính cao khô BB bằng phương pháp SKLM. .......................... 74 Hình 3.18 Kết quả phân tích SKLM dịch chiết bột thuốc bằng nước, methanol, acetonitril và ethanol tuyệt đối. ...................................................................................... 82 Hình 3.19 Phổ UV -Vis của epimedin C, icariin và eurycomanon ............................... 83 Hình 3.20 Sắc ký đồ HPLC phân tích mẫu thử viên nén bao phim DDH – BB với các điều kiện sắc ký khảo sát. ............................................................................. 84 Hình 3.21 Tính đặc hiệu quy trình định lượng đồng thời eurycomanon, epimedin C và icariin trong viên nén bao phim DDH – BB. ................................................ 90 Hình 3.22 Độ tinh khiết các pic eurycomanon, epimedin C và icariin trong mẫu chuẩn hỗn hợp và mẫu thử. ..................................................................................... 90 Hình 3.23 Mức độ tương đồng phổ UV-Vis các pic eurycomanon, epimedin C và icariin trong mẫu thử viên nén bao phim DDH – BB so với chuẩn........................ 91 Hình 3.24 Tương quan giữa nồng độ và diện tích pic eurycomanon. ........................... 95 Hình 3.25 Tương quan giữa nồng độ và diện tích pic epimedin C. .............................. 96 Hình 3.26 Tương quan giữa nồng độ và diện tích pic icariin........................................ 96 Hình 3.27 Viên nén bao phim DDH – BB. ................................................................. 102 Hình 3.28 SKLM định tính epimedin C, icariin và eurycomanon trong viên nén bao phim DDH – BB. ................................................................................................. 103 . . 1 MỞ ĐẦU Việt Nam có rất nhiều tiềm năng để phát triển thuốc từ dược liệu do được thiên nhiên hết sức ưu đãi về đất đai, thổ nhưỡng, khí hậu, nguồn nước, địa hình, cũng như đa dạng sinh học, rất nhiều loài có thể được sử dụng làm thuốc. Dược liệu là một trong các lĩnh vực mũi nhọn cho sự phát triển của ngành Dược Việt Nam hiện nay. Tuy nhiên, do hệ thống pháp lý còn chưa hoàn thiện, công tác đảm bảo chất lượng còn nhiều thiếu sót, thị trường vẫn còn xuất hiện nhiều dược liệu, dược phẩm trôi nổi không rõ nguồn gốc, chất lượng. Do đó, việc đưa ra những tiêu chuẩn và phương pháp kiểm nghiệm chính xác, đáng tin cậy để đánh giá chất lượng dược liệu và chế phẩm từ dược liệu rất cần thiết. Những phương pháp sắc ký hiện đại so sánh với chất đối chiếu đang là lựa chọn hàng đầu. Trong đó, sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp phân tích định lượng rất phổ biến hiện nay. Với độ nhạy cao, độ đúng và độ chính xác đáp ứng các yêu cầu định tính, định lượng, chi phí đầu tư không quá tốn kém, phương pháp này đang được ứng dụng rộng rãi ở hầu hết các phòng thí nghiệm của các cơ sở sản xuất và kiểm nghiệm. Dâm dương hoắc (DDH) (Herba Epimedii) từ lâu đã được xem như “viagra thiên nhiên” với công dụng bổ thận tráng dương, cường gân cốt vốn hết sức quen thuộc trong y học cổ truyền. Bách bệnh (BB) (Eurycomae longifoliae) hay thường được gọi là Mật nhân được biết đến với tác dụng điều trị nhiều bệnh khác nhau. Thời gian gần đây, tác dụng trên các trường hợp sinh dục yếu, dương suy, tảo tiết của BB đã thu hút nhiều sự quan tâm của người dân, các nhà sản xuất cũng như giới nghiên cứu. Hiện nay, trên thị trường có nhiều chế phẩm trong và ngoài nước phối hợp cả hai dược liệu này và đã được người tiêu dùng đón nhận. Tuy nhiên, việc tìm mua và sử dụng đúng hai vị thuốc quý này trên thị trường Việt Nam không dễ dàng. Một phần do nước ta chưa chủ động được nguồn nguyên liệu, hầu hết phải nhập từ Trung Quốc, nguồn gốc xuất xứ không rõ ràng. Một lý do . . 2 khác, DDH là một chi với nhiều loài khác nhau về thành phần hóa học. Việc phối trộn các loài một cách bừa bãi đi kèm những hình thức đóng gói và chế biến khác nhau như ép bánh, xay vụn, chích mỡ dê… đặt ra một dấu hỏi lớn cho chất lượng loại dược liệu này. Dược điển Việt Nam V (DĐVN V) đã có yêu cầu định lượng đối với dược liệu DDH, nhưng việc kiểm tra chất lượng dược liệu BB mới chỉ dừng ở mức định tính. Hiện nay, chưa có tài liệu công bố tiêu chuẩn cao khô DDH, cao khô BB và quy trình định lượng đồng thời các chất điểm chỉ của cả hai dược liệu này trong cùng một chế phẩm. Nhận thấy yêu cầu của thực tế nêu trên, đề tài: “Xây dựng tiêu chuẩn cao khô Dâm dương hoắc, cao khô Bách bệnh và viên nén bao phim Dâm dương hoắc – Bách bệnh” được tiến hành với các mục tiêu cụ thể như sau:  Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao khô DDH.  Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao khô BB.  Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở viên nén bao phim DDH – BB. . . 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ DDH 1.1.1. Tổng quan về thực vật Tên khoa học: Epimedium sp. L. Họ Hoàng liên gai: Berberidaceae. Tên nước ngoài: Yin yang huo, Horny Goat Weed. (a) (b) Hình 1.1 Một số loài DDH [20]. (c) (a) Epimedium koreanum, (b) Epimedium brevicornum, (c) Epimedium sagittatum Đặc điểm thực vật Cây thân thảo, phát triển chậm, sống nhiều năm, rụng lá, lan ra bằng thân ngầm. Thân rễ ngắn, mập. Cây mọc đơn độc hoặc thành cụm, nhẵn, phân nhánh ở gốc. Lá đơn hoặc kép, cuống lá ở gốc dài hơn cuống lá trên thân. Phiến lá hình trứng, hình mác, gần tròn, hoặc giống hình tim, 2 bên thùy lá không đối xứng, thường có răng cưa, đỉnh nhọn. Cụm hoa không có lá hoặc có 1 – 4 lá, mọc đối diện hoặc luân phiên. Cụm hoa đơn hoặc phức, chùm đơn hoặc chùm kép, ít hay nhiều hoa, nhẵn hay có tuyến tiết. Hoa mẫu 2. Đài hoa gồm 8 lá đài xếp trên 2 vòng, đài trong hình cánh hoa. Tràng hoa gồm 4 cánh hoa, phẳng hoặc hình túi, phần phiến kéo dài ra phía ngoài. Bộ nhị gồm 4 nhị, . . 4 xếp đối diện cánh, chỉ nhị nhẵn, bao phấn 2 ô, hạt phấn hình elip, nhẵn, có ba rãnh. Bầu chứa 6 – 15 noãn, vòi nhụy mảnh. Quả nang. Hạt có áo hạt [3]. Có nhiều loài DDH. Một số loài quy định trong DĐVN V [1]:  DDH lá hình tim (Epimedium brevicornum Maxim.).  DDH lá mác (Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim.).  DDH lông mềm (Epimedium pubescens Maxim.).  DDH Triều Tiên (Epimedium koreanum Nakai).  Vu Sơn DDH (Epimedium wushanense T.S Ying). Phân bố, sinh thái Chi Epimedium L. có một số ít loài, phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới ấm và cận nhiệt đới Đông Á. Ở Trung Quốc, có 3 loài thường được khai thác sử dụng là E.brevicornum Maxim., E.koreanum Nakai và E.sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim. Ở Việt nam có 2 loài được thu hái, có thể là E.macranthum Mon. et Decne. và E.sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim. Chúng thường mọc ở vùng núi cao trên 1500 m như Sa Pa, Bát Xát, Bắc Hà (Lào Cai); Sin Hồ (Lai Châu); Đồng Văn, Quản Bạ, Yên Minh, Mèo Vạc (Hà Giang). DDH là loài cây ưa ẩm, chịu bóng, thường mọc lẫn với các loại cây cỏ, cây bụi thấp ở sườn núi, ven rừng, nhất là những nơi gần nguồn nước [3]. Bộ phận dùng Phần trên mặt đất của một số loài DDH được thu hái vào mùa hè, mùa thu lúc cây mọc xanh tốt. Loại bỏ tạp chất, phơi nắng hoặc phơi trong râm. DDH thường được chế biến như sau: đun nhẹ lửa mỡ dê (20 g) đã được tinh chế đến khi chảy lỏng, gạn bỏ tóp mỡ, cho DDH (100 g) đã thái nhỏ vào đảo cho đến thấm hết mỡ dê, sau đó sao khô [3]. 1.1.2. Tổng quan về thành phần hóa học Chi Epimedium rất giàu flavonoid và lignan. Flavonoid chiếm tỉ lệ lớn trong các hợp chất được phân lập trong suốt những năm 1980 và 1990. Nhóm hợp chất nổi bật và đặc trưng nhất là flavonoid, trong đó chủ yếu là những prenylflavonoid glycosid. . . 5 Prenylflavonoid Tên chất R1 R2 R3 Icariin Rha Glc CH3 Epimedin A Rha(2-1)Glc Glc CH3 Epimedin B Rha(2-1)Xyl Glc CH3 Epimedin C Rha(2-1)Rha Glc CH3 Diphyllosid A Rha(2-1)Glc Glc H Desmethylicaritin Rha Glc H Desmethylanhydroicaritin H H H Epimedosid C H Glc H Hexandrasid F Rha(3-1)Glc Glc CH3 Sagittatosid A Rha(2-1)Glc H CH3 Sagittatosid B Rha-Xyl H CH3 Hexandrasid E Glc Glc H Baohuosid I Rha H CH3 Baohuosid II Rha H H Baohuosid VII Rha(4-1)Glc H CH3 Hình 1.2 Một số prenylflavonoid trong DDH [20]. Cho đến nay, từ chi Epimedium, đã phân lập và xác định được 141 flavonoid, 31 lignan, 12 ionon, 9 phenol glycosid, 6 phenylethanoid glycosid, 5 sesquiterpen và một số hợp chất chuyển hóa thứ cấp [20]. . . 6 Trong các thành phần của DDH, epimedin A, B, C và icariin được xem như các thành phần hoạt tính sinh học chính, chiếm hơn 52% tổng số flavonoid trong cây [10], [11], [13], [14]. 1.1.3. Tổng quan về tác dụng dược lý DDH có công năng bổ thận dương, cường cân cốt, trừ phong thấp. Chủ trị: Liệt dương, hoạt tinh, yếu chân tay, phong thấp đau tê bại, co rút cơ [1]. DDH có truyền thống được sử dụng để tăng cường kích thích tình dục, tăng sức sống và cải thiện số lượng tinh trùng in vitro và in vivo, điều trị liệt dương, xuất tinh ngoài ý muốn, rối loạn chức năng tình dục và các chứng bất lực, viêm xương khớp, loãng xương, đau thần kinh và mệt mỏi thể chất, mất trí nhớ, tăng huyết áp, bệnh tim mạch vành, viêm phế quản, viêm gan mãn tính, bệnh bại liệt, giảm bạch cầu mãn tính và viêm cơ tim do virus. Dịch chiết DDH có tác dụng tương tự hormon sinh dục nam. Cũng giống như các loại thuốc Viagra và Cialis, DDH có thể làm tăng ham muốn tình dục và cải thiện chức năng cương dương thông qua một loạt các cơ chế, chẳng hạn như tăng năng lượng và tăng sản xuất testosteron và hormon tình dục [20]. Cho chuột uống nước sắc DDH với liều 2,0 mg/kg thể trọng trong 14 ngày, cải thiện rõ rệt chức năng tình dục, tăng trọng lượng của bộ phận sinh dục trực thuộc và tăng hàm lượng testosteron trong huyết tương [12]. Sử dụng flavonoid tổng chiết xuất từ Epimedium brevicornum, bằng đường uống, ở liều 150 mg / kg thể trọng trong 7 ngày làm tăng đáng kể trọng lượng của tuyến yên, mào tinh và túi tinh ở chuột, tăng hormon testosteron, estradiol và hormon tạo hoàng thể và thúc đẩy tiết testosteron trong các tế bào mô đệm của chuột. Những kết quả này chỉ ra rằng flavonoid tổng của Epimedium brevicornum thúc đẩy hệ thống sinh sản nam giới và các hoạt động nội tiết sinh sản [7]. Năm 2007, Marina và cộng sự dùng cao khô DDH được chuẩn hóa theo hàm lượng icariin, phân tán vào dầu mầm lúa mì, bổ sung thêm lecithin và sáp ong và cho chuột .