Tài liệu Xây dựng quy trình xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật thường phun trên rau bằng phương pháp uplc ms ms

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ----------------- HUỲNH THỊ HỒNG NGỌC XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT THƯỜNG PHUN TRÊN RAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP UPLC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018 . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH KHOA DƯỢC HUỲNH THỊ HỒNG NGỌC XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT THƯỜNG PHUN TRÊN RAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP UPLC-MS/MS Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN THỊ NGỌC VÂN PGS.TS. VÕ THỊ BẠCH HUỆ Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018 . LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Huỳnh Thị Hồng Ngọc . Luận văn Thạc sĩ Dược học – Khóa: 2016 – 2018 Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất – Mã số: 8720210 XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT THƯỜNG PHUN TRÊN RAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP UPLC-MS/MS Huỳnh Thị Hồng Ngọc Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thị Ngọc Vân, PGS.TS. Võ Thị Bạch Huệ Từ khóa: abamectin, alpha-cypermrthrin, acetamiprid, chlorpyriphos- ethyl, chlorpyriphosmethyl, chlorantrainiliprol, fenobucarb, fipronil, thiamethoxam, trichlorfon, thuốc BVTV, LC-MS/MS, rau. Mở đầu: Rau ăn lá là nhóm nông sản được xếp vào nhóm nguy cơ bị nhiễm thuốc bảo vệ thực vật nhiều nhất. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc BVTV không hợp lý đã gây nên hiện tượng dư lượng thuốc BVTV trong rau vượt mức quy định gây ảnh hưởng sức khỏe người tiêu dùng. Hiện nay, nồng độ 0,01 mg/kg được xem là mức dư lượng tối đa cho phép (MRL) chung của những thuốc chưa có quy định. Đây là mức giới hạn khá thấp đòi hỏi phương pháp phân tích đủ nhạy. Trong nước, các nghiên cứu về dư lượng thuốc BVTV trong rau quả bằng LC-MS/MS chủ yếu phân tích trên một nhóm, chưa có công bố về định lượng đồng thời 10 thuốc BVTV trên, đặc biệt trong mẫu rau. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Quy trình định lượng đồng thời abamectin, alpha-cypermrthrin, acetamiprid, chlorpyriphos ethyl, chlorpyriphos- methyl, chlorantrainiliprol, fenobucarb, fipronil, thiamethoxam, trichlorfon trên mẫu rau ăn lá được thực hiện trên hệ thống ACQUITY UPLC H-CLASS SYSTEM (Waters) ghép đầu dò khối phổ Xevo TQ- Smicro (Waters) với bộ phận ion hóa phun điện tử. Phương pháp xử lý mẫu bằng phương pháp QuEChERS đã tối ưu. Quy trình định lượng được thẩm định theo hướng dẫn của AOAC và EC-657/2002. Kết quả: abamectin, alpha-cypermrthrin, acetamiprid, chlorpyriphos ethyl, chlorpyriphosmethyl, chlorantrainiliprol, fenobucarb, fipronil, thiamethoxam, trichlorfon và nội chuẩn TPP và CPR d10 được ion hóa kiểu ESI với kỹ thuật ghi phổ MRM cho ra các mảnh mẹ và mảnh con dùng cho định lượng. Điều kiện sắc ký bao gồm cột Acquity UPLC® BEH C18 (1,7µm, 2,1x 50 mm), pha động gồm: 5mm amonium acetat/ methanol và 5mm amonium acetat/ 0,1% acid formic / nước theo chương trình gradient, tốc độ dòng 0,25 ml/phút. Miền giá trị của các thuốc BVTV nằm trong khoảng 5-200 ng/ml, r2 > 0,99. Giới hạn phát hiện từ 0,03 đến 1 ng/ml, giới hạn định lượng từ 0,1 đến 5 ng/ml, tất cả đều thấp hơn giá trị MRL (0,01mg/kg hoặc 10 ng/ml). Độ thu hồi trong khoảng 74,47- 116,93% và RSD nhỏ hơn 16%. Các chỉ tiêu về tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác đều cho kết quả nằm trong giới hạn cho phép. Kết luận: Đề tài đã xây dựng và thẩm định thành công quy trình xác định dư lượng 10 thuốc BVTV thường phun trên rau bằng phương pháp LC–MS/MS với độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác cao. Do đó phương pháp có thể ứng dụng để xác định các mẫu rau nhiễm dư lượng thuốc BVTV trên thị trường. . Master’s Thesis – Academic course: 2016 - 2018 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210 DETERMINATION OF POPULAR PESTICIDE RESIDUES IN VEGETABLES BY LC-MS/MS Huynh Thi Hong Ngoc Supervisor: Assoc. Prof. Nguyen Thi Ngoc Van, Assoc. Prof. Vo Thi Bach Hue Keywords: : abamectin, alpha-cypermrthrin, acetamiprid, chlorpyriphos ethyl, chlorpyriphos- methyl, chlorantrainiliprol, fenobucarb, fipronil, thiamethoxam, trichlorfon, pesticides, LC-MS/MS, vegetables Introduction: Leafy vegetables contained the highest amounts of pesticide residues. However, the use of pesticides unreasonable cause pesticide residues in vegetables above the maximum residue limits (MRLs) can negatively affect human health.. A general default MRL of 0.01 mg/kg applies where a pesticide is not specifically mentioned. At this level, analytical methods must be sensitive enough to quantitate low levels. In Viet Nam, there are some studies analyzing pesticides residues by LC-MS/MS methods but mainly on one or two group. There is no published quantitative information on these 10 pesticides, especially in vegetables. Materials and methods: A method for quantification of abamectin, alpha-cypermrthrin, acetamiprid, chlorpyriphos ethyl, chlorpyriphos- methyl, chlorantrainiliprol, fenobucarb, fipronil, thiamethoxam, trichlorfon in leafy vegetables was been developed using Acquity UPLC H–Class system and Xevo TQ- Smicro mass spectrometer equipped with an electrospray ionization source. The modified QuEChERS procedure was used for sample preparation. The assay was validated in compliance with AOAC and EC guideline. Results: The detection of target compounds was done in multiple-reaction-monitoring (MRM) mode using a tandem mass spectrometry equipped with positive and negative ionswitching ESI source. LC conditions: column Acquity UPLC® BEH C18 (1.7µm, 2.1x 50 mm), mobile phase gradient mode including 5mm amonium acetat/ methanol và 5mm amonium acetat/ 0,1% acid formic/ water, flow rate of 0,25 ml/min. This method was validated base on AOAC and EC guideline, which met the requirements of widely linearity range of 5-200 ng/ml and high correlation coefficient (r2 > 0.99), very good accuracy (recovery rate 74,47- 116,93%) and intra-day precision (RSD < 16%), typical LOD, LOQ values of 0.03-1 ng/ml and 0.1- 5 ng/ml for 10 pesticides. Conclusion: A highly sensitive, specific, reproducible and rapid LC-MS/MS method for simultaneous determination of 10 pesticides in leafy vegetables was successfully developed and validated. This method can be useful for monitoring level of these pesticides in vegetables. . MỤC LỤC MỤC LỤC ....................................................................................................................i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT..................................................................................iv DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU .............................................................................vi DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ viii ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................................1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................3 1.1. TỔNG QUAN VỀ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT ............................................3 1.1.1. Một số khái niệm ...............................................................................................3 1.1.2. Phân loại thuốc bảo vệ thực vật ........................................................................3 1.1.3. Sơ lược về thuốc bảo vệ thực vật nhóm phospho hữu cơ .................................5 1.1.4. Sơ lược về thuốc bảo vệ thực vật nhóm carbamat ............................................9 1.1.5. Sơ lược về thuốc bảo vệ thực vật nhóm pyrethroid ........................................10 1.1.6. Sơ lược về thuốc bảo vệ thực vật nhóm neonicotinoid ...................................12 1.1.7. Sơ lược về thuốc bảo vệ thực vật nhóm macrocyclic lacton ..........................14 1.1.8. Một số thuốc thuốc BVTV trong nghiên cứu thuộc các nhóm khác...............16 1.2. TÌNH HÌNH SỬ DỤNG THUỐC BVTV..........................................................18 1.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU QUECHERS ..................................................20 1.3.1. Giới thiệu phương pháp QuEChERS ..............................................................20 1.3.2. Quy trình chung của phương pháp QuEChERS .............................................20 1.3.3. Ứng dụng của phương pháp QuEChERS ........................................................21 1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG .....................................................23 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................25 . i 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ...........................................................................25 2.1.1. Chuẩn đối chiếu sử dụng trong nghiên cứu ....................................................25 2.1.2. Mẫu thử nghiệm ..............................................................................................26 2.2. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU .........................................................26 2.3. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU .......................................................................26 2.3.1. Hóa chất, thuốc thử .........................................................................................26 2.3.2. Thiết bị, dụng cụ. ............................................................................................27 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................27 2.4.1. Khảo sát tình hình sử dụng thuốc BVTV thường phun trên rau tại một số huyện ở tỉnh Vĩnh Long .......................................................................................................27 2.4.2. Xây dựng phương pháp phân tích các thuốc BVTV thường phun trên rau ....28 2.4.3. Thẩm định quy trình phân tích ........................................................................32 2.5. ÁP DỤNG QUY TRÌNH ĐÃ THẨM ĐỊNH ĐỂ PHÂN TÍCH CÁC MẪU RAU ĂN LÁ TRÊN THỊ TRƯỜNG ..................................................................................35 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...............................................................37 3.1. TÌNH HÌNH SỬ DỤNG THUỐC BVTV TRÊN RAU .....................................37 3.1.1. Kết quả chủng loại thuốc trừ sâu đã sử dụng ..................................................37 3.1.2. Kết quả sự phối trộn thuốc BVTV của nông dân ............................................38 3.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÁC THUỐC BVTV THƯỜNG PHUN TRÊN RAU ...................................................................................................39 3.2.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký lỏng khối phổ .....................................39 3.2.2. Khảo sát và lựa chọn quy trình xử lý mẫu ......................................................46 3.2.3. Thẩm định quy trình phân tích ........................................................................48 . i 3.3. ÁP DỤNG QUY TRÌNH ĐỂ PHÂN TÍCH MẪU RAU THU THẬP TẠI TỈNH VĨNH LONG .............................................................................................................59 CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN ........................................................................................61 4.1. THỰC TRẠNG SỬ DỤNG THUỐC BVTV TRÊN RAU MÀU .....................61 4.1.1. Về địa điểm khảo sát .......................................................................................61 4.1.2. Thuốc BVTV thường được nông dân sử dụng................................................61 4.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG THUỐC BVTV THƯỜNG PHUN TRÊN RAU ...............................................................................................................62 4.2.1. Phương pháp phân tích bằng LC- MS/MS ......................................................62 4.2.2. Phương pháp xử lý mẫu ..................................................................................65 4.3. Kết quả thẩm định quy trình phân tích ...............................................................68 4.3.1. Tính tương thích hệ thống ...............................................................................68 4.3.2. Tính đặc hiệu, chọn lọc ...................................................................................69 4.3.3. Tính tuyến tính ................................................................................................69 4.3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng .....................................................70 4.3.5. Độ đúng và độ thu hồi .....................................................................................70 4.4. Dư lượng của thuốc BVTV trong rau ăn lá ........................................................70 KẾT LUẬN ...............................................................................................................72 KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................73 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................74 . DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt Chữ nguyên Ý nghĩa 1 ACN Acetonitrile Dung môi acetonitril 2 AOAC Association of Official Hiệp hội các nhà hóa Analytical Chemists học phân tích chính thức Atmospheric pressure chemical Ion hóa hóa học ở áp suất ionization khí quyển 3 APCI 4 BVTV Bảo vệ thực vật 5 CCD Colony collapse disorder Rối loạn sụt giảm bầy đàn 6 ChE Cholinesterase 7 CPR- d10 Chlorpyrifos- d10 8 CV Coefficient of variation Hệ số biến thiên 9 d-SPE Dispersive - Solid phase Chiết phân tán pha rắn extraction 10 ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử 11 FAO Food and Agriculture Tổ chức nông lương thế Organization giới Gas Chromatography - Mass Sắc ký khí ghép đầu dò Spectrometry/Mass Spectrometry kết hợp 2 lần khối phổ 12 GC- MS/MS 13 GCB Graphitized carbon black Than hoạt tính 14 HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng Chromatography cao Identification Point Điểm xác nhận 15 IP . 16 IS Internal standard Chất chuẩn nội 17 LD50 Lethal dose 50 Liều chết 50 18 LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện 19 LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng 20 MRL Maximum residue limit Giới hạn dư lượng tối đa 21 PSA Primary secondary amine Amin thứ cấp 22 QuEChERS Quick, Easy, Cheap, Effective, Nhanh, dễ dàng, rẻ, hiệu Rugged, Safe quả, ổn định, an toàn 23 RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối 24 SD Standard deviation Độ lệch chuẩn 25 SKĐ Sắc ký đồ 26 TGCL Thời gian cách ly 27 TPP Triphenylphosphate 28 UPLC-MS/MS Ultra Performance Liquid Triphenyl phosphat Sắc ký lỏng siêu hiệu Chromatography - Mass năng ghép đầu dò kết Spectrometry/Mass hợp 2 lần khối phổ Spectrometry 29 WHO World Health Organization . Tổ chức Y tế thế giới i DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng 1.1. Bảng phân loại thuốc BVTV theo nhóm độc .............................................5 Bảng 1.2. Tình hình nhập khẩu hóa chất BVTV từ năm 2010- 2014 .......................18 Bảng 1.3. Số lượng thuốc BVTV được phép sử dụng và cấm sử dụng ở ................19 Bảng 1.4. Một số ứng dụng của phương pháp QuEChERS .....................................22 Bảng 1.5. Một số nghiên cứu xác định dư lượng thuốc BVTV bằng phương pháp sắc ký lỏng trong nước và nước ngoài ............................................................................23 Bảng 2.1. Thông tin về các chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu ...........................25 Bảng 2.2. Hóa chất, thuốc thử trong phân tích .........................................................26 Bảng 2.3. Thiết bị và dụng cụ sử dụng cho phân tích ..............................................27 Bảng 2.4. Điều kiện phân mãnh đề xuất cho các thuốc BVTV ................................28 Bảng 2.5. Giới hạn sai lệch cho phép tối đa của tỷ lệ ion .......................................33 Bảng 2.6. Pha dung dịch khảo sát tính tuyến tính ....................................................33 Bảng 2.7. Pha dung dịch để khảo sát độ đúng và độ chính xác................................34 Bảng 2.8. Mã hóa mẫu ..............................................................................................36 Bảng 3.1. Một số hoạt chất BVTV được sử dụng trong vùng khảo sát....................37 Bảng 3.2. Tần suất và tỷ lệ phần trăm phối trộn thuốc BVTV (n =120) ..................38 Bảng 3.3. Các điều kiện MS trong LC-MS/MS để phân tích thuốc BVTV ............39 Bảng 3.4. Các thông số hoạt động của nguồn ion hóa..............................................40 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát điều kiện pha động .......................................................42 Bảng 3.6. Chương trình gradient ..............................................................................46 Bảng 3.7. Kết quả tính tương thích hệ thống ............................................................49 Bảng 3.8. Tỷ lệ ion của các thuốc BVTV trong nghiên cứu ....................................51 Bảng 3.9. Khoảng tuyến tính, đường chuẩn của các chất.........................................52 Bảng 3.10. Giá trị LOD và LOQ ..............................................................................54 Bảng 3.11. Kết quả độ đúng và độ chính xác của phương pháp ..............................56 Bảng 3.12. Kết quả độ đúng và độ chính xác của phương pháp ..............................57 Bảng 3.13. Kết quả độ đúng và độ chính xác của phương pháp ..............................58 Bảng 3.14. Kết quả phân tích các thuốc BVTV trên 7 mẫu rau ăn lá ......................59 . i Bảng 4.1. Thời gian lưu, điều kiện MS/MS của một số thuốc BVTV rửa giải gần nhau ...................................................................................................................................64 Bảng 4.2. %RSD diện tích pic của 10 thuốc BVTV.................................................68 . ii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Công thức cấu tạo chung của nhóm phospho hữu cơ .................................6 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của chlorpyrifos- ethyl .................................................7 Hình 1.3. Công thức cấu tạo của chlorpyrifos- methyl ..............................................8 Hình 1.4. Công thức cấu tạo của trichlorfon ..............................................................8 Hình 1.5. Công thức cấu tạo của fenobucarb ...........................................................10 Hình 1.6. Công thức cấu tạo của alpha- cypermethrin .............................................11 Hình 1.7. Công thức cấu tạo của acetamiprid ..........................................................13 Hình 1.8. Công thức cấu tạo của thiamethoxam ......................................................13 Hình 1.9. Công thức cấu tạo của abamectin .............................................................15 Hình 1.10. Công thức cấu tạo của chlorantraniliprol ...............................................16 Hình 1.11. Công thức cấu tạo của fipronil ...............................................................17 Hình 1.12. Tóm tắt quy trình chiết của ba phiên bản phương pháp QuEChERS.....21 Hình 2.1. Quy trình xử lý mẫu dự kiến ....................................................................30 Hình 3.1 Phổ MS ion phân tử của alpha- cypermethrin ...........................................40 Hình 3.2. Phổ MS ion phân mảnh của alpha- cypermethrin ....................................41 Hình 3.3. Phổ MS ion phân tử của acetamiprid .......................................................41 Hình 3.4. Phổ MS ion phân mảnh của acetamiprid ..................................................41 Hình 3.5. Sắc ký đồ của 5 chất (abamectin, alpha- cypermethrin, acetamiprid, chlorpyrifos- ethyl, chlorpyrifos- methyl), chương trình gradient 6 .........................44 Hình 3.6. Sắc ký đồ của 5 chất phân tích và nội chuẩn (chlorantraniliprol, fenobucarb, fipronil, thiamethoxam, trichlorfon, TPP và CPR d10), chương trình gradient 6 ....45 Hình 3.7. So sánh hiệu suất chiết của 3 quy trình ....................................................46 Hình 3.8. So sánh hiệu suất chiết của C18 và GCB trong d- SPE ...........................47 Hình 3.9. Dịch chiết sau khi xử lý theo quy trình có có GCB (trái) và có C18 (phải) ...................................................................................................................................47 Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu trắng thêm chuẩn của chất chlorantraniliprol .......................................................................................................50 Hình 3.11. Đường chuẩn abamectin truy xuất từ phần mềm Masslynx 4.1 .............52 . Hình 3.12. Đường chuẩn alpha- cypermethrin truy xuất từ phần mềm Masslynx 4.1 ...................................................................................................................................53 Hình 3.13. S/N xác định LOD, LOQ của thiamethoxam tại 0,1 và 1 ng/ml ..........54 Hình 3.14. S/N xác định LOD, LOQ của thiamethoxam tại 0,3 và 1 ng/ml ...........55 Hình 3.15. Sắc ký đồ chlorantraniliprol trên mẫu A06 ............................................60 Hình 3.16. Sắc ký đồ chlorpyrifos- ethyl trên mẫu A02 ..........................................60 Hình 4.1. Sắc ký đồ của hai chất có thời gian lưu gần nhau (fenobucarb và chlorantraniliprol) .....................................................................................................64 Hình 4.2. Sắc ký đồ của hai chất có thời gian lưu gần nhau ....................................65 . 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là một quốc gia phát triển đi lên từ ngành nông nghiệp. Trong suốt chiều dài phát triển của dân tộc, nông nghiệp luôn là ngành có đóng góp tích cực trong phát triển kinh tế - xã hội của đất nước[17]. Khí hậu ở Việt Nam là khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm quanh năm là điều kiện thuận lợi cho cho sự phát triển của cây trồng. Tuy nhiên, đây cũng là môi trường tốt cho sự phát sinh và phát triển của sâu bệnh, cỏ dại gây hại cho cây trồng, đặc biệt là trên cây rau. Theo chương trình giám sát quốc gia về tồn dư thuốc bảo vệ thực vật trên rau quả từ 2008 đến năm 2012 cho thấy: nhóm rau ăn lá có nguy cơ nhiễm sâu bệnh cao hơn rau ăn quả, trong đó, những loại rau có nguy cơ cao gồm rau ngót, rau muống, cải xanh, đậu đỗ…. [61]. Với tâm lý muốn phòng ngừa dịch hại, diệt sâu nhanh, gia tăng năng suất cây trồng nên người nông dân thường tăng liều lượng, sử dụng thuốc cực độc, thuốc giả, thuốc ngoài danh mục, không đạt tiêu chuẩn chất lượng, không rõ nguồn gốc để bảo vệ cây trồng. Từ đó, dẫn đến tình trạng sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) tùy tiện, không đúng loại thuốc, không theo khuyến cáo của cơ quan chức năng và không áp dụng kỹ thuật theo phương pháp “4 đúng”. Qua khảo sát của Cục bảo vệ thực vật tại một số địa phương cho thấy trên 30% lượng thuốc pha chế không đúng liều lượng và gần 3% sử dụng thuốc BVTV không nằm trong danh mục cho phép [60]. Theo quy định, mỗi loại thuốc BVTV đều có giá trị giới hạn dư lượng tối đa (MRL), mức giới hạn này là an toàn cho người sử dụng, từ việc lạm dụng hoặc sử dụng không đúng cách các loại thuốc BVTV dẫn đến tồn dư BVTV trong sản phẩm tăng lên vượt quá MRL. Khi đó, các thuốc BVTV sẽ gây ra các tác dụng không mong muốn cho người sử dụng, gây ngộ độc và có thể dẫn đến tử vong. Theo Tổ chức Y tế thế giới và Chương trình Môi trường Liên hiệp quốc đánh giá mỗi năm có khoảng 3 triệu nông dân ở các nước đang phát triển bị nhiễm độc trầm trọng bởi thuốc BVTV, trong số đó có khoảng 20.000 người chết [23]. Do đó, việc xác định dư lượng thuốc BVTV trong rau là việc làm hết sức cần thiết để xác định mức độ an toàn của rau và để ngăn chặn ảnh hưởng trên người, động vật và môi trường sống. . 2 Ở Việt Nam và các nước (Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản…..) đều có quy định mức dư lượng tối đa cho phép (MRL) của thuốc BVTV trên nhiều đối tượng khác nhau. Tuy nhiên, nhiều thuốc hiện nay vẫn chưa có MRL trên các loại rau khác nhau[3],[67],[66], [68]. Do đó, nồng độ 0,01 mg/kg được xem là giá trị MRL chung của những thuốc chưa có MRL [33]. Đây là mức giới hạn khá thấp, đòi hỏi các phương pháp phân tích đủ độ nhạy cần thiết. Phân tích đa dư lượng thuốc BVTV thường gặp nhiều khó khăn do các thuốc này có tính chất khác nhau về độ phân cực, tính bay hơi, độ tan…dẫn đến quy trình xử lý mẫu thường khó đạt độ thu hồi khi thẩm định quy trình. Năm 2003 phương pháp QuEChERS (viết tắt của Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged và Safe) đã được Anastassiades và cộng sự lần đầu tiên giới thiệu và xây dựng để phân tích dư lượng các thuốc BVTV trong rau quả [22]và những năm gần đây phương pháp này đã được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu phân tích dư lượng thuốc BVTV. Có nhiều phương pháp hiện đại để phân tích được thành phần dư lượng thuốc trừ sâu có trong thực phẩm nói chung và rau củ nói riêng. Tuy nhiên phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép với đầu dò khối phổ (UPLC- MS/MS) với độ tin cậy, độ chính xác, độ nhạy, tính đặc hiệu rất cao và khả năng phân tích nhanh ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến. Nhằm góp phần nâng cao chất lượng nông sản, kết hợp khai thác sử dụng hiệu quả một số kỹ thuật hiện đại và các thiết bị phân tích tiên tiến, đề tài “ Xây dựng quy trình xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật thường phun trên rau bằng phương pháp UPLC-MS/MS ” được thực hiện với các mục tiêu như sau: 1. Xây dựng quy trình xử lý mẫu để phân tích thuốc bảo vệ thực vật thường phun trên rau. 2. Thẩm định quy trình xác định dư lượng các loại thuốc bảo vệ thực vật thường phun trên rau bằng phương pháp UPLC- MS/ MS. 3. Ứng dụng quy trình đã thẩm định để xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong rau trên thị trường. . 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT 1.1.1. Một số khái niệm Thuốc BVTV còn gọi là thuốc trừ dịch hại hoặc sản phẩm nông dược, bao gồm những chế phẩm dùng để phòng trừ, tiêu diệt các sinh vật gậy hại hoặc các sinh vật mang mầm bệnh cho thực vật. Ngoài ra, các loại thuốc kích thích sinh trưởng, giúp cây trồng đạt năng suất cao cũng là một dạng của thuốc BVTV [4], [17]. Độc tính dư lượng: theo quy định của Tổ chức Lương Nông Thế Giới (FAO) thì dư lượng thuốc BVTV là những chất đặc thù tồn lưu trong lương thực và thực phẩm, trong sản phẩm nông nghiệp và trong thức ăn vật nuôi do sử dụng thuốc BVTV gây nên. [4] Giới hạn tối đa dư lượng thuốc bảo vệ thực vật (Maximum Residue Level - viết tắt là MRL) là hàm lượng tối đa của một tồn dư thuốc bảo vệ thực vật trong thực phẩm (đơn vị tính: mg/kg thực phẩm) [3]. Từng loại thuốc đối với từng loại nông sản đều được quy định mức dư lượng tối đa cho phép mà không gây hại đến cơ thể con người và vật nuôi khi ăn nông sản đó. [4] Thời gian cách ly (Preharvest interval, PHI) khoảng thời gian ngắn nhất từ khi phun thuốc lên cây cho đến khi thuốc phân hủy đạt mức dư lượng tối đa cho phép, gọi là thời gian cách ly. Trong thực tế, thời gian cách ly được quy định là từ ngày phun thuốc lần cuối lên cây trồng cho đến ngày thu hoạch nông sản làm thức ăn cho người và vật nuôi, được tính bằng ngày. [4] 1.1.2. Phân loại thuốc bảo vệ thực vật Có nhiều cách phân loại thuốc BVTV tùy theo mục đích nghiên cứu và sử dụng 1.1.2.1. Phân loại theo đối tượng phòng trừ - Thuốc trừ sâu (insecticides) - Thuốc trừ nấm (fungicides) - Thuốc trừ cỏ (herbicides) . 4 - Thuốc trừ chuột (rodenticides) - Thuốc trừ ốc sên (molluscicides) - Thuốc trừ nhện (acaricides) - Thuốc trừ vi khuẩn (bactericides) - Thuốc diệt trứng sâu bọ, ve bét ( Ocvicides) - Thuốc phá vỡ quá trình sinh trưởng, các quá trình sống khácMcủa côn trùng (insect growth regulators) - Thuốc thúc đẩy quá trình phát triển, ra hoa, nẩy mầm, ra quả của thực vật (plant growth regulators).[1], [6] 1.1.2.2. Phân loại theo nhóm độc Hầu hết thuốc BVTV đều độc với con người và động vật máu nóng ở các mức độ khác nhau. Độ độc của thuốc BVTV có thể chia làm hai loại: độ độc cấp tính và độ độc mãn tính. ❖ Độ độc cấp tính của thuốc BVTV Thuốc xâm nhập vào cơ thể gây nhiễm độc tức thời gọi là nhiễm độc cấp tính. Độc tính của thuốc BVTV được thể hiện bằng LD50 (Lethal dose 50) là liều lượng cần thiết gây chết 50% cá thể thí nghiệm và tính bằng đơn vị mg hoạt chất/kg thể trọng. Loại thuốc có trị số LD50 càng thấp là thuốc có độ độc tính cấp càng cao. [4] ❖ Độ độc mạn tính của thuốc BVTV Nhiều loại thuốc có khả năng tích lũy trong cơ thể người và động vật máu nóng, gây đột biến tế bào, kích thích tế bào u ác tính phát triển, ảnh hưởng đến bào thai và gây dị dạng đối với các thế hệ sau. Biểu hiện nhiễm độc mãn tính lúc đầu có thể nhằm lẫn với các bênh lý thông thường khác như da xanh, nhức đầu, mệt mỏi, ăn ngủ bất thường, cần phải phát hiện và điều trị kịp thời. Căn cứ vào độ độc cấp tính của thuốc. Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) phân chia các loại thuốc thành 5 nhóm độc khác nhau là nhóm Ia ( rất độc), Ib (độc cao), II (độc trung bình), III (ít độc) và IV (rất ít độc). [58] . 5 Bảng 1.1. Bảng phân loại thuốc BVTV theo nhóm độc Nhóm Mức độ độc Ia LD50 trên chuột (mg/kg cân nặng) Đường uống Đường ngoài da Cực độc <5 <50 Ib Độc tính cao 5-50 50-200 II Độc trung bình 50-2000 200-2000 III Độc nhẹ IV Không có mối nguy độc cấp (Nguồn: WHO, 2009[58]) >2000 >5000 1.1.2.3. Phân loại thuốc BVTV theo thành phần hóa học Căn cứ vào bản chất hóa học các loại thuốc BVTV được phân chia thành các nhóm khác nhau. - Nhóm thuốc có nguồn gốc thảo mộc - Nhóm thuốc sinh học - Nhóm thuốc vô cơ - Nhóm thuốc clo hữu cơ - Nhóm thuốc phospho hữu cơ - Nhóm thuốc carbamat - Nhóm thuốc pyrethroid (Cúc tổng hợp) - Nhóm thuốc neonicotinoid - Nhóm thuốc BVTV khác 1.1.3. Sơ lược về thuốc bảo vệ thực vật nhóm phospho hữu cơ 1.1.3.1. Đặc điểm thuốc BVTV nhóm phospho hữu cơ .[4], [6], [12], [15], [16] Thuốc BVTV phospho hữu cơ là các hợp chất trong thành phần hóa học có chứa phosphor (P), là dẫn xuất của các ester trung tính hay amid của acid phosphoric. . 6 R1 X P R2 O hay S Hình 1.1. Công thức cấu tạo chung của nhóm phospho hữu cơ Trong đó: - R1, R2 : là các nhóm thế alkyl, aryl, amino hoặc các amino có nhóm thế; cả hai có thể được gắn trực tiếp vào nguyên tử P, hoặc liên kết qua -O- , -S-. - X - là các hợp chất hữu cơ như: chất béo, thơm, dị vòng đuợc liên kết với nguyên tử P qua một nhóm không bền (thường là -O- hoặc -S-). Tùy theo sự thay thế các O bởi S, N và gốc ester hay amid mà có thể chia thành một số nhóm nhỏ như: phosphat, phosphorothionat, phosphorothiolat, phosphorothionothiolat, phosphorodithiolat, phosphoroamidat, phosphoroamidothionat, phosphoroamidothiolat. Cơ chế tác động: các thuốc nhóm phospho hữu cơ kết hợp với men chlolinesterase (ChE) tạo thành phức có tác dụng bất hoạt men ChE, nên không thể phân giải acetylcholin. Khi ChE bị bất hoạt, làm ứ động acetylcholin, gây rối loạn dẫn truyền cholinergic, làm ức chế dẫn truyền các xung thần kinh tới các tế bào cơ, tuyến, não và hạch. Ngộ độc thuốc nhóm phospho hữu cơ có các triệu chứng như: nhức đầu, choáng váng, cảm giác nặng đầu, nhức thái dương, giảm trí nhớ, dễ mệt mỏi, ngủ không ngon giấc, ăn kém ngon. Ở một số trường hợp, có rối loạn tinh thần và trí tuệ, giật nhãn cầu, run tay và một số triệu chứng rối loạn thần kinh khác. Các thuốc trừ sâu nhóm phospho hữu cơ có phổ tác dụng rộng (ngoài tác dụng trừ sâu, nhiều thuốc trong nhóm còn có tác dụng đồng thời là thuốc trừ nhện và tuyến trùng). Thuốc có tác dụng nhanh và mạnh đến côn trùng bằng con đường tiếp xúc, vị độc. Nhiệt độ môi trường tăng cao, hiệu lực của thuốc cũng tăng lên. Các thuốc trong nhóm độc với động vật máu nóng (hầu hết thuộc nhóm độc II, một số thuộc nhóm độc Ib) rất độc với cá và mật ong, dễ gây hại các loại ký sinh thiên địch và các sinh vật hoang dã, khá an toàn với thực vật. Do có độ độc cao với sinh .