Tài liệu Xây dựng quy trình định lượng sofosbuvir trong chế phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG SOFOSBUVIR TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Khoa Dược Chủ trì nhiệm vụ: Nguyễn Đức Tuấn Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 . ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG SOFOSBUVIR TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (Đã chỉnh sửa theo kết luận của Hội đồng nghiệm thu ngày …………...) Cơ quan chủ quản (ký tên và đóng dấu) Chủ trì nhiệm vụ Nguyễn Đức Tuấn Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (ký tên và đóng dấu) . MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...............................i DANH MỤC CÁC BẢNG.......................................................................... ii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ .................................................... iii ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................... 3 1.1. Tổng quan về viêm gan C ......................................................................3 1.2. Tổng quan về sofosbuvir ........................................................................4 1.3. Một số công trình định lượng sofosbuvir bằng phương pháp HPLC ....6 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 8 2.1. Nguyên vật liệu – Đối tượng nghiên cứu ............................................... 8 2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 10 2.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký ................................................................... 10 2.2.2. Chuẩn bị mẫu ..................................................................................... 10 2.2.3. Thẩm định quy trình ........................................................................... 12 2.2.4. Áp dụng quy trình định lượng sofosbuvir trong một số chế phẩm .... 13 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - BÀN LUẬN ................................................... 14 3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký ...................................................................... 14 3.2. Thẩm định quy trình .............................................................................. 16 3.3. Dự thảo quy trình định lượng sofosbuvir bằng HPLC.......................... 21 3.4. Định lượng sofosbuvir trong một số chế phẩm..................................... 23 3.5. Bàn luận................................................................................................. 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC . Báo cáo tổng kết đề tài DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, Từ nguyên chữ viết tắt As Asymmetry Factor (Hệ số bất đối) CE Capillary Electrophoresis (Điện di mao quản) DAA Direct Antiviral Agent (Tác nhân kháng virus trực tiếp) HCV Hepatitis C Virus HINT Histidine triad nucleotide-binding protein (Protein gắn kết histidin nucleotid tam bội) HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) ICH International Council on Hamonization (Hội đồng hòa hợp quốc tế) IDSA Infectious Diseases Society of America (Hiệp hội bệnh nhiễm Hoa Kỳ) PDA Photo Diode Array (Dãy diod quang) PEG Polyethylen glycone PEG-interferon Interferon polyethylen glycolate (Interferon PEG hóa) Rs Resolution (Độ phân giải) RSD Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) S Peak area (Diện tích pic) SFV Sofosbuvir tR Retention time (Thời gian lưu) UV-Vis Ultraviolet – Visible (Tử ngoại - Khả kiến) WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới) . i Báo cáo tổng kết đề tài DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Phân loại một số thuốc nhóm DAA 04 Bảng 1.2. Phác đồ phối hợp các thuốc nhóm DAA theo khuyến cáo của 04 IDSA Bảng 1.3. Một số công trình định lượng sofosbuvir bằng phương pháp 07 HPLC Bảng 2.1. Một vài chế phẩm chứa sofosbuvir được sử dụng trong nghiên 08 cứu Bảng 2.2. Danh mục chất đối chiếu được sử dụng trong nghiên cứu 08 Bảng 2.3. Danh mục dung môi, hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu 09 Bảng 2.4. Danh mục trang thiết bị dùng trong nghiên cứu 09 Bảng 2.5. Thành phần và tỷ lệ tá dược của chế phẩm nghiên cứu 09 Bảng 2.6. Chuẩn bị các dung dịch đối chiếu đối với phương pháp HPLC 12 Bảng 3.1. Thông số sắc ký của sofosbuvir 14 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của phương pháp HPLC 16 trên mẫu đối chiếu và mẫu thử (n=6) Bảng 3.3. Kết quả khảo sát sự tương quan giữa nồng độ sofosbuvir và diện 18 tích pic (n=12) Bảng 3.4. Kết quả xử lý thống kê sự phụ thuộc giữa nồng độ sofosbuvir và 18 diện tích pic Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp HPLC 19 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp HPLC 19 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp HPLC 20 Bảng 3.8. Kết quả định lượng sofosbuvir trong một số chế phẩm bằng 23 phương pháp HPLC . ii Báo cáo tổng kết đề tài DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1. Công thức cấu tạo của sofosbuvir 04 Hình 3.1. Sắc ký đồ mẫu đối chiếu với pha động 1; mẫu đối chiếu, mẫu thử 15 và mẫu giả dược với pha động 2 Hình 3.2. Sắc ký đồ mẫu đối chiếu, mẫu thử, mẫu giả dược, mẫu trắng và các mẫu phân hủy . iii 17 Báo cáo tổng kết đề tài ĐẶT VẤN ĐỀ Theo số liệu của Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization, WHO), năm 2016, Việt Nam có hơn 1,1 triệu người bị viêm gan C [1]. Viêm gan C là nguyên nhân gây xơ gan (27%) hay ung thư gan (25%). Bệnh nhân viêm gan C nếu không điều trị có nguy cơ ung thư gan cao gấp 15 - 20 lần, nguy cơ xơ gan tăng 1 - 4% mỗi năm [2],[3]. Trước đây, việc điều trị viêm gan C bằng liệu pháp interferon rất tốn kém và kéo dài. Sự ra đời của các thuốc nhóm kháng virus trực tiếp (Direct Antiviral Agent, DAA) đã mở ra kỹ nguyên mới trong điều trị viêm gan C với đáp ứng cao, ít tác dụng phụ và thời gian điều trị ngắn. Sofosbuvir thuộc nhóm kháng virus trực tiếp thế hệ hai, được Hiệp hội bệnh nhiễm Hoa Kỳ (Infectious Diseases Society of America, IDSA) và WHO đề nghị như là phác đồ ưu tiên để điều trị viêm gan C, dưới dạng phối hợp một thuốc nhóm DAA khác như simeprevir hay ledipasvir. Phác đồ có sofosbuvir tăng đáp ứng điều trị trên 95% so với liệu pháp interferon (50%), giảm tác dụng phụ và rút ngắn thời gian trị liệu xuống còn 12 tuần [4],[5]. Năm 2013, chi phí cho phác đồ 12 tuần có sofosbuvir là hơn 10.000 USD tại Mỹ [5]. Hiện nay, nhờ cam kết của công ty thuốc phát minh (Gilead), thành phẩm sofosbuvir dạng nhượng quyền tự nguyện tại Việt Nam do công ty Hetero Labs Limited của Ấn Độ cung cấp được bán lẻ cho người tiêu dùng với giá 3,5 đến 4,0 triệu đồng/ 28 viên. Đây là mức giá cao so với thu nhập trung bình của người dân Việt Nam. Hiện nay, một số cơ sở sản xuất thuốc tại Việt Nam đang tiến hành nghiên cứu phát triển thành phẩm sofosbuvir [6]. Vì vậy, việc kiểm soát chất lượng thuốc này cần được ưu tiên. Tuy nhiên, USP 40, BP 2017 và Dược điển Việt Nam V chưa có chuyên luận nguyên liệu sofosbuvir và thành phẩm tương ứng. Trên thế giới, chỉ có một vài công trình công bố quy trình định lượng sofosbuvir riêng lẽ hoặc phối hợp với một thuốc trong điều trị viêm gan C . 1 Báo cáo tổng kết đề tài bằng kỹ thuật quang phổ tử ngoại, sắc ký lỏng và điện di mao quản [7],[8],[9],[10],[11],[12],[13],[14],[15]. Trong nước chưa có tác giả nào công bố quy trình định lượng sofosbuvir. Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Xây dựng quy trình định lượng sofosbuvir trong chế phẩm bằng phương pháp HPLC” được thực hiện với mong muốn đưa ra phương pháp định lượng sofosbuvir trong chế phẩm, tạo điều kiện cho các cơ sở sản xuất thuốc trong nước phát triển nhanh sản phẩm này, góp phần vào công tác điều trị bệnh viêm gan C. Mục tiêu của đề tài là: - Khảo sát điều kiện sắc ký để định lượng sofosbuvir bằng phương pháp HPLC. - Thẩm định quy trình định lượng theo Hướng dẫn của ICH (International Council on Hamonization) [16], Hướng dẫn của Asean [17] và Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc, phụ lục 8 [18]. - Áp dụng quy trình để định lượng sofosbuvir trong một số chế phẩm. . 2 Báo cáo tổng kết đề tài CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về viêm gan C 1.1.1. Dịch tễ học Viêm gan C là bệnh gan gây ra bởi virus viêm gan C (Hepatitis C Virus, HCV), lây nhiễm chủ yếu qua đường máu do dùng chung kim tiêm, vệ sinh y tế kém hay do tiêm truyền máu chưa qua kiểm tra. Thời gian ủ bệnh từ 2 tuần đến 6 tháng. Một nghiên cứu cho thấy có 60 - 80% người nhiễm virus sẽ bị nhiễm HCV mạn tính và 80% trong số đó không biểu hiện triệu chứng [19]. Trên thế giới có khoảng 71 triệu người nhiễm HCV mạn tính với 1,75 triệu trường hợp nhiễm mới. Ở Việt Nam, tỷ lệ nhiễm HCV mạn tính là khoảng 1,1 triệu người. Tỷ lệ chuyển biến từ viêm gan C sang xơ gan là 27% và ung thư gan là 25%. Hàng năm, khoảng 399.000 người chết do các bệnh lý liên quan đến viêm gan C mà chủ yếu là xơ gan và ung thư gan [20]. Ở Việt Nam, trong 6 typ HCV, tỷ lệ nhiễm typ 1 và 6 là cao nhất (lần lượt là 30% và 54%) [21]. 1.1.2. Một số phác đồ điều trị viêm gan C Từ khi HCV được phát hiện vào năm 1989, liệu pháp trị liệu đầu tiên là sử dụng interferon-alpha, một cytokin ngoại mô phỏng phản ứng miễn dịch của tế bào gan với virus. Khi polyethylenglycol-interferon (PEG-interferon) kết hợp ribavirin sẽ làm tăng t1/2 và hiệu quả trị liệu. Tuy nhiên, liệu pháp này có nhiều tác dụng phụ và tỷ lệ đáp ứng thấp (40 - 65%) [20]. Năm 2013, việc điều trị viêm gan C được cải thiện rõ rệt nhờ sự phát hiện nhóm thuốc đường uống ức chế trực tiếp sự nhân bản của virus (Direct Antiviral Agent, DAA). Nhóm DAA được chia thành 3 nhóm nhỏ theo vị trí tác động: ức chế protease NS3/4A, protease NS5A và RNA polymerase NS5B. Phác đồ kết hợp 2 DAA có đáp ứng trị liệu tốt, thời gian điều trị ngắn, dùng được đường uống và ít tác dụng phụ hơn phác đồ sử dụng interferon [20]. . 3 Báo cáo tổng kết đề tài Bảng 1.1. Phân loại một số thuốc nhóm DAA [20] Ức chế protease NS3/4A Ức chế Polymerase (NS5B) Cấu trúc tương Cấu trúc không tự nucleotid nucleotid Ức chế NS5A Asunaprevir Daclatasvir Paritaprevir Ledipasvir Sofosbuvir Dasabuvir Simeprevir Ombitasvir Hiệp hội bệnh nhiễm Hoa Kỳ (Infectious Diseases Society of America, IDSA) đã đề nghị phác đồ điều trị viêm gan C cho bệnh nhân nhiễm HCV typ 1 và 6 trong trường hợp có hoặc không có xơ gan như sau [4]: Bảng 1.2. Phác đồ phối hợp các thuốc nhóm DAA theo khuyến cáo của IDSA Thuốc phối hợp Elbasvir (50 mg) và grazoprevir (100 mg) Glecaprevir (300 mg) và pibrentasvir (120 mg) Sofosbuvir (400 mg) và ledipasvir (90 mg) Sofosbuvir (400 mg) và velpatasvir (100 mg) Thời gian trị liệu Liều dùng 12 tuần 1 lần/ngày 12 tuần trong trường hợp có xơ gan và 8 tuần khi không xơ gan 1 lần/ngày 12 tuần 1 lần/ngày 12 tuần 1 lần/ngày 1.2. Tổng quan về sofosbuvir 1.2.1. Cấu trúc, danh pháp Công thức cấu tạo Hình 1.1. Công thức cấu tạo của sofosbuvir Công thức phân tử: C22H29FN3O9P. Trọng lượng phân tử: 529,45 g/mol. . 4 Báo cáo tổng kết đề tài Danh pháp: (S)-Isopropyl 2-((S)-(((2R,3R,4R,5R)-5-(2,4-dioxo 3,4- dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-4-fluoro-3-hydroxy-4-methyltetrahydrofuran2yl)methoxy)-(phenoxy)phosphorylamino) propanoate. Tên quốc tế: Sofosbuvir. 1.2.2. Tính chất vật lý, hóa học Bột màu trắng đến trắng ngà, ít tan trong nước, thực tế tan tốt trong ethanol, methanol và aceton [9],[13],[22],[23]. Độ tan trong nước: ≥ 2 mg/ml ở pH 2 - 7,7 và nhiệt độ 37oC [22],[23]. LogP = 1,62 [23]. pKa = 9,3 [23]. 1.2.3. Tác dụng dược lý Sofosbuvir ức chế RNA polymerase phụ thuộc RNA NS5B của HCV, từ đó ức chế sự nhân bản của virus. Sofosbuvir là một tiền dược có cấu trúc nucleotid. Khi được hấp thu, sofosbuvir được chuyển hóa thành chất có cấu trúc tương tự uridin triphosphat (GS-461203) có hoạt tính. GS-461203 gắn kết với RNA của HCV nhờ polymerase NS5B và làm kết thúc chuỗi. GS-461203 không tác động lên DNA và RNA polymerase của người [20],[24]. 1.2.4. Dược động học Hấp thu: Sofosbuvir đạt nồng độ tối đa trong máu 0,5 - 2 giờ sau khi dùng đường uống. Sự hấp thu của sofosbuvir không bị ảnh hưởng bởi thức ăn [22]. Phân bố: Sofosbuvir gắn kết khoảng 61 - 65% với protein huyết tương [22]. Chuyển hóa: Sofosbuvir được chuyển hóa ở gan tạo thành thành chất có cấu trúc tương tự uridin triphosphat (GS-461203) có hoạt tính. Quá trình chuyển hóa bao gồm sự thủy phân nhóm carboxyl nhờ enzym carboxyl esterase hay enzym cathepsin A và sự phân cắt nhóm phospho-amid nhờ protein gắn kết histidin nucleotid tam bội (Histidine triad nucleotide-binding protein, HINT) sau đó là sự phosphoryl hóa bằng con đường sinh tổng hợp pyrimidin . 5 Báo cáo tổng kết đề tài nucleosid. Sự dephosphoryl hóa sẽ tạo thành chất chuyển hóa GS-331007 không có hoạt tính kháng virus in vitro [22]. Thải trừ: Sofosbuvir được thải trừ chủ yếu qua thận (80%) dưới dạng GS331007 (78%) và nguyên vẹn (3,5%) [22]. 1.2.5. Chỉ định Sofosbuvir được chỉ định trong điều trị viêm gan C typ 1, 2, 3, 4 và 6 dưới dạng kết hợp với một thuốc nhóm DAA khác hay kết hợp interferon, ribavirin [4],[22]. 1.2.6. Chống chỉ định Sofosbuvir khi được phối hợp với ribavirin hay với PEG-interferon và ribavirin sẽ không được sử dụng cho phụ nữ có thai [22]. Sử dụng sofosbuvir với amiodaron có thể gây chậm nhịp, đặc biệt là ở bệnh nhân đang sử dụng thuốc chẹn thụ thể beta [22]. 1.2.7. Tác dụng phụ Thường gặp (> 20%): mệt mỏi, đau đầu, mất ngủ [22]. Hiếm gặp (< 1%): giảm huyết cầu (đặc biệt khi dùng phối hợp với PEGinterferon), nguy cơ trầm cảm ở bệnh nhân có tiền sử bệnh tâm thần, nguy cơ giảm hemoglobin thai kỳ [22]. 1.3. Một số công trình định lượng sofosbuvir bằng phương pháp HPLC Cho đến nay, sofosbuvir có thể được định lượng bằng các phương pháp sau: - Quang phổ UV-Vis: đa số các công trình đều sử dụng methanol làm dung môi chiết và độ hấp thụ của sofosbuvir được đo ở bước sóng hấp thụ cực đại 260 ± 1 nm [7],[8],[9],[10],[12],[13] - Điện di mao quản (CE): kỹ thuật điện di mao quản vùng được áp dụng với dung dịch điện ly nền có giá trị pH = 8 nên sofosbuvir chưa bị ion hóa hoàn toàn. Tuy nhiên, điện thế được cài đặt đến 30 kV nên rút ngắn thời gian phân tích. Metformin được lựa chọn làm nội chuẩn và tách hoàn toàn pic sofosbuvir [7] . 6 Báo cáo tổng kết đề tài - Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Bảng 1.3 tóm tắt một số công trình định lượng sofosbuvir bằng phương pháp HPLC Bảng 1.3. Một số công trình định lượng sofosbuvir bằng phương pháp HPLC Pha động Quy trình Quy trình 1 Acid formic 0,1% [7] acetonitril (60:40, tt/tt) Quy trình 2 Đệm phosphat pH 2,5 [25] methanol (20:80, tt/tt) Quy trình 3 Đệm phosphat pH 4 [11] methanol (50:50, tt/tt) Quy trình 4 Acid triflouroacetic 0,1% [14] methanol (70:30, tt/tt) Quy trình 5 Acid orthophosphoric 0,1% [15] - acetonitril (60:40, tt/tt) Cột sắc ký C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm) C8 (250 x 4,6 mm; 5 μm) C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) C18 (150 mm x 4,6 mm; 5 µm) C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm) Bước sóng Tốc độ Thể tích phát hiện dòng tiêm mẫu (nm) (ml/phút) (µL) 260 1 20 260 1,2 20 262 0,8 10 260 1 20 240 1 10 Nhận xét: Các công trình trên đều sử dụng cột sắc ký pha đảo với pha động là môi trường acid để ion hóa hoàn toàn sofosbuvir, rút ngắn thời gian sắc ký mà vẫn đảm bảo hệ số đối xứng của pic sofosbuvir. . 7 Báo cáo tổng kết đề tài CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu – Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Sofosbuvir trong chế phẩm chứa sofosbuvir. Bảng 2.1. Một vài chế phẩm chứa sofosbuvir được sử dụng trong nghiên cứu Tên chế Dạng phẩm bào chế Thành phần, hàm lượng Nhà sản xuất Số lô Hạn dùng Hetero Labs 3117699 06/2019 Limited Natco Pharma Hepcinat Viên nén Sofosbuvir 400 mg 1900656 06/2019 Limited Mylan Myhep Viên nén Sofosbuvir 400 mg Pharmaceutical 8065265 02/2019 Private Limited Trong đó, chế phẩm Sofovir được sử dụng cho nghiên cứu xây dựng phương Sofovir Viên nén Sofosbuvir 400 mg pháp phân tích và chế phẩm Hepcinat, Myhep được sử dụng trong việc ứng dụng quy trình phân tích để xác định hàm lượng sofosbuvir. Thành phần công thức chế phẩm Sofovir bao gồm: sofosbuvir, colloidal silicon dioxyd, natri croscarmellose, magnesium stearat, mannitol và cellulose vi tinh thể, polyethylen glycol, polyvinyl alcohol, talc, titanium dioxyd và yellow iron oxyd. 2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất, dung môi 2.1.2.1. Chất đối chiếu Bảng 2.2. Danh mục chất đối chiếu được sử dụng trong nghiên cứu Hoạt chất Sofosbuvir Metformin hydroclorid Hàm lượng tính trên Số lô chế phẩm nguyên trạng (%) OP-SFS/RS142 99,40 QT168 060616 99,41 . 8 Nơi cung cấp Optimus Pharma Viện Kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh Báo cáo tổng kết đề tài 2.1.2.2. Dung môi, hóa chất Bảng 2.3. Danh mục dung môi, hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu STT Dung môi hóa chất Mục đích sử dụng Xuất xứ Độ tinh khiết (%) 1 Acid boric Điện di mao quản Merck 99,5 2 Acid formic Sắc ký lỏng Xilong 88,0 3 Cloroform Chiết xuất Xilong 95,0 4 Dikali hydrophosphat Điện di mao quản Merck 99,0 5 Dinatri tetraborat Điện di mao quản Merck 99,5 6 Kali dihydrophosphat Điện di mao quản Merck 99,5 7 Methanol Dung môi hòa tan Xilong 99,5 8 Methanol Sắc ký lỏng Merck 99,9 9 Natri hydroxyd Điện di mao quản Merck 99,0 2.1.2.3. Trang thiết bị Bảng 2.4. Danh mục trang thiết bị dùng trong nghiên cứu STT Thiết bị Xuất xứ Mã hiệu 1 Bể siêu âm Hwashin EQ/01/VL/051 2 Cân phân tích 4 số Metler AE 240 EQ/01/VL/032 3 Cân phân tích 5 số Sartorius CP225D 4 Cân phân tích 6 số Metler Toledo PX26 EQ/01/VL/086 5 Cột sắc ký Phenomenex Gemini NX F-4453-E0 6 Hệ thống CE/DAD Agilent EQ/01/VL/120 7 Hệ thống HPLC – PDA Waters Alliance 2695XE 8 Hệ thống HPLC – PDA Waters Alliance e2696 9 Máy đo pH Metler Toledo S20 EQ/01/VL/063 10 Máy quang phổ UV-VIS Shimadzu MPC-2200 11 Máy siêu âm Elma T840 DH 12 Tủ sấy Memmert WM 500CO 2.1.2.4. Mẫu giả dược Bảng 2.5. Thành phần và tỷ lệ tá dược của chế phẩm nghiên cứu Thành phần Cellulose vi tinh thể (Avicel PH) Mannitol Natri croscarmellose Colloidal silison dioxide (Aerosil) Magnesium stearat Talc Titan dioxyd Tổng khối lượng (g) . 9 Khối lượng (g) 2,1 2,35 0,125 0,025 0,15 0,25 0,02 5 Báo cáo tổng kết đề tài 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký 2.2.1.1. Điều kiện sắc ký ban đầu Dựa vào cấu trúc hóa học sofosbuvir, đồng thời tham khảo một số công trình đã công bố (Bảng 1.3), kỹ thuật sắc ký pha đảo với đầu dò PDA đã được áp dụng với điều kiện sắc ký ban đầu như sau: - Cột sắc ký: Phenomenex® Gemini C18 (150 x 4,6 mm; 3 m) - Đầu dò PDA: Bước sóng phát hiện 262 nm - Pha động: Methanol – acid formic 0,1% (50:50, tt/tt) - Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút - Thể tích tiêm mẫu: 10 l 2.2.1.2. Khảo sát tỷ lệ pha động Khảo sát hệ pha động methanol – acid formic 0,1% ở các tỷ lệ 50:50 (tt/tt) và 60:40 (tt/tt). Qua các khảo sát thực nghiệm, chọn được điều kiện sắc ký thích hợp sao cho pic sofosbuvir đạt độ tinh khiết (theo phổ UV-Vis), tách hoàn toàn khỏi các pic tạp (nếu có) và có hệ số bất đối nằm trong khoảng 0,8 – 1,5. 2.2.2. Chuẩn bị mẫu Mẫu đối chiếu: Cân chính xác 5 mg chất đối chiếu sofosbuvir, cho vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 30 ml methanol, siêu âm 10 phút, thêm methanol vừa đủ thể tích, lắc đều, thu được dung dịch đối chiếu có nồng độ sofosbuvir khoảng 100 ppm. Mẫu thử: Cân 20 viên, xác định khối lượng trung bình của 1 viên, nghiền thành bột mịn, cân chính xác một lượng bột thuốc tương ứng 5 mg sofosbuvir, cho vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 30 ml methanol, siêu âm 10 phút, thêm methanol vừa đủ thể tích, lắc đều, lọc qua giấy lọc, thu được dung dịch thử có nồng độ sofosbuvir khoảng 100 ppm. . 10 Báo cáo tổng kết đề tài Mẫu giả dược: Cân chính xác khoảng một lượng giả dược tương ứng với 5 mg sofosbuvir và chuẩn bị tương tự mẫu thử. Mẫu trắng: pha động. Để chứng minh quy trình phân tích có tính đặc hiệu trong trường hợp xuất hiện tạp phân hủy, chế phẩm sofosbuvir đã được để trong một số điều kiện khắc nghiệt sau đây (mẫu phân hủy) Mẫu thử trong môi trường kiềm trong 24 giờ: Cân chính xác một lượng bột thuốc tương ứng 5 mg sofosbuvir, cho vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 30 ml natri hydroxyd 0,1 N và chuẩn bị tương tự mẫu thử. Dung dịch thu được được để ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Mẫu thử trong môi trường acid trong 24 giờ: Chuẩn bị tương tự mẫu thử thủy phân trong môi trường base nhưng thay bằng acid hydrocloric 0,1 N. Mẫu thử trong môi trường oxy hóa trong 72 giờ: Chuẩn bị tương tự mẫu thử thủy phân trong môi trường base nhưng thay bằng hydrogen peroxyd 30% và để ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ. Mẫu thử đặt ở nhiệt độ 80oC trong 48 giờ: Lấy một viên chế phẩm Sofosvir, cho vào đĩa petri, đặt vào tủ sấy ở nhiệt độ 80  2oC trong 48 giờ. Sau đó nghiền thành bột mịn và chuẩn bị tương tự mẫu thử. Mẫu thử chiếu ánh sáng trực tiếp trong 24 giờ: Lấy một viên chế phẩm Sofosvir, cho vào đĩa petri, đặt dưới ánh sáng mặt trời trong 24 giờ (từ 10 giờ đến 14 giờ trong 6 ngày liên tiếp). Sau đó nghiền thành bột mịn và chuẩn bị tương tự mẫu thử. Mẫu thử chiếu tia UV trong 6 giờ: Lấy một viên chế phẩm Sofosvir, cho vào đĩa petri, đặt dưới đèn tử ngoại 254 nm trong 6 giờ. Sau đó nghiền thành bột mịn và chuẩn bị tuơng tự mẫu thử. Tất cả các mẫu đều được lọc qua màng lọc milipore 0,45 µm trước khi tiến hành sắc ký. . 11 Báo cáo tổng kết đề tài 2.2.3. Thẩm định quy trình phân tích 2.2.3.1. Tính phù hợp của hệ thống Tiến hành sắc ký 6 lần mẫu đối chiếu và mẫu thử. Yêu cầu [18]: - Giá trị RSD của thời gian lưu và diện tích pic sofosbuvir phải ≤ 2,0%. - Hệ số bất đối của pic sofosbuvir phải trong khoảng 0,8 - 1,5. - Độ phân giải của pic sofosbuvir và các pic tạp (nếu có) phải lớn hơn 1,5. 2.2.3.2. Tính chọn lọc Tiến hành sắc ký mẫu đối chiếu, mẫu thử, mẫu giả dược, mẫu trắng và các mẫu phân hủy. Ghi lại sắc ký đồ. Xác định thời gian lưu của sofosbuvir, độ tinh khiết của pic sofosbuvir trong sắc ký đồ mẫu thử, phổ UV tại thời gian lưu của pic sofosbuvir trong sắc ký đồ mẫu thử và mẫu đối chiếu. Yêu cầu [18]: - Sắc ký đồ các mẫu trắng và mẫu giả dược không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất đối chiếu. - Sắc ký đồ mẫu thử cho pic có thời gian lưu tương tự với pic của chất đối chiếu trong sắc ký đồ mẫu đối chiếu. Trên sắc ký đồ mẫu thử và mẫu phân hủy nếu xuất hiện thêm các pic khác (pic tạp), thì pic sofosbuvir phải tách hoàn toàn các pic tạp. - Pic của sofosbuvir trong sắc ký đồ mẫu thử, mẫu phân hủy và mẫu đối chiếu phải tinh khiết (theo phổ UV). 2.2.3.3. Tính tuyến tính và miền giá trị Chuẩn bị dung dịch đối chiếu gốc sofosbuvir có nồng độ khoảng 1000 ppm trong methanol. Từ dung dịch này pha loãng thành các dung dịch đối chiếu như bảng 2.6. Bảng 2.6. Chuẩn bị các dung dịch đối chiếu đối với phương pháp HPLC Dung dịch đối chiếu Dung dịch đối chiếu gốc (ml) Nước Nồng độ (ppm) 1 2 2 3 40 60 . 12 3 4 5 4 5 6 vừa đủ 50 ml 80 100 120 6 7 140 Báo cáo tổng kết đề tài Tiến hành sắc ký mỗi dung dịch 2 lần. Ghi lại sắc ký đồ và diện tích pic. Xác định sự tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của các dung dịch. Thiết lập phương trình hồi quy nồng độ và diện tích pic, tính hệ số tương quan. Sử dụng trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy và trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy. Yêu cầu: Hệ số tương quan (r) ≥ 0,999 [18]. 2.2.3.4. Độ chính xác a. Độ lặp lại Chuẩn bị 6 dung dịch thử và 1 dung dịch đối chiếu như mục 2.2.2. Tiến hành sắc ký mỗi mẫu 2 lần, từ đó suy ra hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử. b. Độ chính xác trung gian Tiến hành như độ lặp lại trong một ngày khác, trên hệ thống HPLC khác. Yêu cầu: Giá trị RSD của hàm lượng sofosbuvir có trong mẫu thử trong cùng một ngày không quá 2,0% và giá trị RSD của hàm lượng sofosbuvir có trong 12 mẫu không quá 2,0% [18]. 2.2.3.5. Độ đúng Độ đúng được thực hiện bằng cách thêm chất đối chiếu sofosbuvir lần lượt vào mẫu giả dược ở ba mức nồng độ 80%, 100% và 120% của nồng độ định lượng. Mỗi mức nồng độ chuẩn bị 3 mẫu và tiến hành sắc ký mỗi mẫu 2 lần. Tính tỷ lệ phần trăm thu hồi dựa trên lượng chất đối chiếu thêm vào và lượng tìm được. Yêu cầu: Tỷ lệ phần trăm thu hồi từ 98 – 102% và giá trị RSD của tỷ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ không quá 2,0% [18]. 2.2.4. Áp dụng quy trình định lượng sofosbuvir trong một số chế phẩm Quy trình định lượng sofosbuvir sau khi được thẩm định đạt yêu cầu sẽ được áp dụng để định lượng sofosbuvir trong một số chế phẩm đang lưu hành trên thị trường Việt Nam. . 13 Báo cáo tổng kết đề tài CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký Tiến hành sắc ký mẫu giả dược, mẫu thử và mẫu đối chiếu có nồng độ sofosbuvir khoảng 30 ppm theo điều kiện sắc ký ban đầu ở mục 2.2.1.1 và thay đổi thành phần pha động theo các tỷ lệ khác nhau để khảo sát các thông số sắc ký của sofosbuvir. Bảng 3.1 trình bày các thông số sắc ký của sofosbuvir tương ứng với các tỷ lệ pha động khảo sát. Hình 3.1 minh họa sắc ký đồ mẫu đối chiếu, mẫu thử và mẫu giả dược ở các điều kiện khảo sát. Bảng 3.1. Thông số sắc ký của sofosbuvir 1 Tỷ lệ MeOH – acid formic 0,1% (tt/tt) 50 - 50 2 60 - 40 Pha động Mẫu tR (phút) Đối chiếu Thử Đối chiếu 19,026 6,594 6,432 Hệ số dung lượng 7,4 1,9 1,8 S (µAU x giây) AS Độ tinh khiết pic 417059 459078 478685 1,0 1,1 1,1 Đạt Đạt Đạt Nhận xét: Với pha động 1, pic sofosbuvir tinh khiết và có hệ số bất đối trong khoảng 0,8 – 1,5; tuy nhiên thời gian lưu dài (trên 15 phút). Với pha động 2, pic sofosbuvir tinh khiết và có hệ số bất đối trong khoảng 0,8 – 1,5; thời gian lưu ngắn và hệ số dung lượng nằm trong khoảng 1 đến 8. Với pha động 2, sắc ký đồ dung dịch mẫu giả dược không xuất hiện pic tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic sofosbuvir. Diện tích pic sofosbuvir của mẫu thử và mẫu đối chiếu còn nhỏ với đơn vị hấp thụ khoảng 0,035 AU. Như vậy, pha động 2 sẽ được lựa chọn và nồng độ định lượng sofosbuvir sẽ được điều chỉnh từ 30 ppm lên 100 ppm. Từ các kết quả khảo sát, điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng sofosbuvir là: cột Phenomenex® Gemini C18 (150 x 4,6 mm; 3 m), đầu dò PDA, bước sóng phát hiện 262 nm, pha động methanol – acid formic 0,1% (60:40, tt/tt), tốc độ dòng 0,7 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 l. . 14