Tài liệu Xây dựng quy trình định lượng (s) amlodipin bằng phương pháp hplc pha đảo sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH ----------------- TRẦN MỸ THIÊN THANH XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG (S)-AMLODIPIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC PHA ĐẢO SỬ DỤNG PHA ĐỘNG CÓ CHỨA TÁC NHÂN ĐỐI QUANG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018 . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH ----------------- TRẦN MỸ THIÊN THANH XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG (S)-AMLODIPIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC PHA ĐẢO SỬ DỤNG PHA ĐỘNG CÓ CHỨA TÁC NHÂN ĐỐI QUANG Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ THỊ THU CÚC TS. PHAN VĂN HỒ NAM Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018 . LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan dây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Người cam đoan Trần Mỹ Thiên Thanh . Luận văn Thạc sĩ – Khóa 2016 – 2018 Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất – Mã số: 8720210 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG (S)-AMLODIPIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC PHA ĐẢO SỬ DỤNG PHA ĐỘNG CÓ CHỨA TÁC NHÂN ĐỐI QUANG Trần Mỹ Thiên Thanh Hướng dẫn khoa học: TS. Lê Thị Thu Cúc, TS. Phan Văn Hồ Nam Từ khóa: HPLC, amlodipin, phân tách đồng phên, đồng phân quang học Mở đầu Amlodipin là thế hệ thứ ba của thuốc ức chế kênh cacli thuộc nhóm dihydropyridin có khả năng chặn kênh cacli được sử dụng trong điều trị bệnh cao huyết áp và chứng đau thắt ngực. Amlodipin có hai đồng phân đối quang là (S)-amlodipin và (R)-amlodipin. Tuy nhiên, chỉ có dạng (S) là có hoạt tính sinh học, còn dạng (R) có nhiều tác dụng phụ. Phần lớn các chế phẩm trên thị trường ở dạng racemic amlodipin. Tuy nhiên, để cải thiện tính an toàn và hiệu quả, amlodipin được sản xuất dưới dạng đồng phân (S)-amlodipin và được đưa ra thị trường vài năm trước. Trong nghiên cứu này, chúng tôi giới thiệu kết quả phân tích đồng phân quang học (S)-amlodipin bằng phương pháp HPLC pha đảo sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: hoạt chất amlodipin và (S)-amlodipin Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát một số điều kiện quan trọng ảnh hưởng trong quá trình tách (thành phần và tỉ lệ pha động) nhằm chọn được điều kiện phân tích đáp ứng các thông số: hai pic đồng phân phải tách nhau hoàn toàn với độ phân giải Rs >1,5; hệ số bất đối As nằm trong khoảng 0,8-1,5. Sau khi tìm được điều kiện thích hợp, tiến hành thẩm định quy trình phân tích bao gồm: khảo sát tính phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện, độ chính xác và độ đúng. Quy trình phân tích sau khi được thẩm định đã được áp dụng để định lượng hoạt chất (S)-amlodipin và xác định tạp (R)-amlodipin trong một số chế phẩm chứa (S)-amlodipin trên thị trường. Kết quả Để xác định được điều kiện sắc ký thích hợp để phân tích đồng phân quang học của amlodipine như sau: sử dụng cột C18 của Germini NX. Pha động là hỗn hợp methanol – dung dịch đệm NaH2PO4 5 mM có chứa 17,5 mM SBE-β-CD và 0,3 mM PEG, pH 2,5 (25: 75, tt/tt). Tốc độ dòng 1 ml/ phút, nhiệt độ 30 oC, thể tích tiêm mẫu 10 µl, bước sóng phát hiện 237 nm. Độ phân giải của các đồng phân lớn hơn 1,5. Giới hạn định lượng là 250 - 750 µg.mL-1. Độ lệch chuẩn tương đối dưới 2% (n = 6), độ phục hồi là 98 -102%, phương pháp này phù hợp trong kiểm tra chất lượng. Kết luận Đã xây dựng được quy trình phân tách đồng phân quang học amlodipin bằng phương HPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang. Quy trình này có tính chọn lọc, giới hạn phát hiện thấp, cho kết quả chính xác và độ lặp cao. Quy trình này đã được áp dụng để định lượng (S)-amlodipin, xác định tạp đồng phân (S)-amlodipin trong một số chế phẩm chứa (S)-amlodipin. . Master’s Thesis – Academic course: 2016 – 2018 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210 CHIRAL SEPARATION OF (S)-AMLODIPINE ENANTIONMER BY RP-HPLC USING CHIRAL MOBILE PHASE ADDITIVE Tran My Thien Thanh Supervisor: Assoc. Dr. Le Thi Thu Cuc; Dr. Phan Van Ho Nam Keywords: HPLC, amlodipine, chiral separation, enantiomers. Introduction Amlodipine, a third generation dihydropyridine calcium antagonist that is in a group of drugs called calcium channel blockers. It is used to lower blood pressure - to treat high blood pressure (hypertension) - or to prevent chest pain (angina). Amlodipine has two enantiomers called (S)-amlodipine and (R)-amlodipine. Only (S)-amlodipine is biologically active, while the R) -amlodipine has many side effects. Most of the products on the market are racemic amlodipine. However, to improve safety and effectiveness, amlodipine is produced in the form of isomer (S)-amlodipine and was marketed several years ago. In this study, we present the results of optical (S)-amlodipine analysis by reverse-phase HPLC using a mobile phase containing the chiral separation agent. Material and methods This subject of this study was amlodipine and (S)-amlodipine. The aim of the study was to investigate some important conditions affecting the separation process in order to select analytical conditions that suitable in some chromatographic the parameters. Two isomers must be completely separated. With the resolution of the enantiomers were more than 1.5; the asymmetry factor is between 0.8 and 1.5. After finding out the appropriate chromatographic conditions for separatation of amlodipine enantiomers, the method was validated is system suitability, selectivity, linearity and range, limit of detection, precision and accuracy. Then, the validated method was applied for quantification of (S)amlodipin and determination of (S)-amlodipin’s enantionmeric impurity in some available (S)-amlodipin finhised products. Results The appropriate chromatographic conditions for a HPLC method was developped for the chiral separation of amlodipine. The two enantiomers were separated on a Germini NX C18 column. The mobile phase was methanol - phosphate buffer (5 mmol.mL-1 NaH2PO4, pH 2.5; containing 17.5 mM sulfobutylether-β-cyclodextrin (SBE-β-CD) and 0.3 mM polyethylene glycol-20000 (PEG) (25: 75, v/v) and UV detection at 237 nm. The resolution of the enantiomers were more than 1,5. The effective range of quantification for both enantiomers was 250 – 750 µg.mL-1. Relative standard deviation was below 2% (n=6), the recovery range was 98 -102%. The method is suitable in quality control. Conclusion The HPLC approach for quality control of (S)-amlodipine and its enantiomeric impurity was successfully developed using Germini NX C18 column. The validated method was applied for quantification of (S)-amlodipine and determination of (S)-amlodipine’s enantiomeric impurity in some available S)-amlodipine drugs . MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ……………… iv DANH MỤC CÁC BẢNG………………………………………………. vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ……………………… ix MỞ ĐẦU…………………………………………………………………. 1 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………. 3 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ AMLODIPIN…………………………………….. 3 1.1.1. Tính chất vật lý................................................................................... 3 1.1.2. Tính chất hóa học………………………………………………… 4 1.1.3. Tác dụng dược lý................................................................................ 4 1.1.4. Chỉ định.............................................................................................. 4 1.1.5. Tương tác thuốc.................................................................................. 4 1.1.6. Định tính và định lượng…………………………………………….. 5 1.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG……………………. 6 1.2.1. Khái niệm về đồng phân đối quang………………………………… 6 1.2.2. Các phương pháp phân tích đồng phân đối quang…………………. 7 1.2.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích đồng phân đối quang………… 9 1.2.4. Điện di mao quản phân tích đồng phân đối quang…………………. 10 1.2.5. Một số phương pháp phân tích đồng phân đối quang khác………… 10 1.3. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)……………………… 11 1.3.1. Khái niệm về phương pháp HPLC…………………………………. 11 1.3.2. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo ……………………………………… 11 1.3.3. Pha động trong sắc ký pha đảo……………………………… …….. 12 1.4. PHA ĐỘNG ĐỐI QUANG (CHIRAL MOBILE PHASE) …….......... 14 1.4.1. Khái niệm………………………………………………………… 14 1.4.2. Các tác nhân quang hoạt …………………………………………… 15 1.5. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG (S)-AML………………. 16 1.5.1. Một số đề tài nghiên cứu trong nước……………………………….. 17 . i 1.5.2. Một số đề tài nghiên cứu ngoài nước………………………………. 16 CHƯƠNG 2- ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU….. 19 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU……………………………………….. 19 2.1.1. Đối tượng………………………………………………………… 19 2.1.2. Hóa chất…………………………………………………………….. 18 2.1.3. Trang thiết bị, dụng cụ……………………………………………… 19 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………………………………. 21 2.2.1. Xây dựng quy trình định lượng (S)-amlodipin ……………………… 21 2.2.2. Thẩm định quy trình phân tích …………………………………… 23 2.3. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG MỘT VÀI CHẾ PHẨM (S)-AML TRÊN THỊ TRƯỜNG………………………………… 25 2.3.1. Định lượng (S)- amlodipin………………………………………… 25 2.3.2. Xác định tạp đồng phân (R)-amlodipin ................................................... 26 CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.............................................. 27 3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÁCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC (S)-AMLODIPN BẰNG HPLC SỬ DỤNG PHA ĐỘNG CÓ CHỨA TÁC NHÂN ĐỐI QUANG............................................................. 27 3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký................................................................... 27 3.1.2. Thẩm định quy trình phân tích (S)-amlodipin bằng HPLC sử dụng 40 pha động có chứa tác nhân đối quang .......................................................... 3.1.3. Dự thảo quy trình phân tích đồng phần quang học (S)-amlodipin bằng phương pháp HPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang... 50 3.1.4. Úng dụng quy trình để định lượng một vài chế phẩm (S)-amlodipin 52 trên trên thị trường………………………………………………………… 3.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÁCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC AMLODIPN BẰNG HPLC SỬ DỤNG CỘT CELLULOSE- 4....... 53 3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký................................................................... 53 3.1.2. Thẩm định quy trình phân tích (S)-amlodipin bằng HPLC sử dụng cột cellulose-4.............................................................................................. 57 . i 3.2.3. Dự thảo quy trình phân tích đồng phân quang học (S) amlodipin bằng phương pháp HPLC sử dụng cột cellulose-4.……………………… 68 3.2.4. Úng dụng quy trình để định lượng một vài chế phẩm (S)-amlodipin 70 trên trên thị trường………………………………………………………… CHƯƠNG 4 – BÀN LUẬN………………………………………… 72 CHƯƠNG 5 –KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ.......................................... 76 5.1. Kết luận................................................................................................ 76 5.2. Kiên nghị.............................................................................................. 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................ 77 PHỤ LỤC................................................................................................... 82 . DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên tiếng Anh Tên Tiếng Việt (R )-AML (R)-amlodipin (R)-amlodipin (S)-AML (S)-amlodipin (S)-amlodipin ACN Acetonitril AML Amlodippin BDS Base deactivated Silanol CE Capillary electrophoresis CM-β-CD Carboxymethyl- beta-cyclodextrin CSPs Chiral stationary phases Từ viết tắt Amlodippin Điện di mao quản Pha tĩnh bất đối Đối chiếu ĐC DE Dextrose DHP Dihydropyridin EMEA European Medicines Evaluation Agency FDA Food and Drug Administration HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng Dihydropyridin cao HP-β-CD Hydroxyl propyl - beta- cyclodextrin HS-α-CD Highly sulfated-alpha-cyclodextin IR Infrared Hồng ngoại LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng MeOH Methanol MIP- Molecularly Imprinted Polymer- column colum MS Mass spectrometry . Khối phổ NSAID Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs PEG Polyethylene glycol RP-HPLC Revesed phase -high performance liquid Sắc kí lỏng hiệu năng chromatography cao pha đảo SBE-β-CD Sulfobutylether- beta- cyclodextrin Sắc ký đồ SKĐ TEA Triethylamin TLTK Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử UV Ultra violet α-CD Alpha-cyclodextrin β-CD Beta-cyclodextrin . Tử ngoại i DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Danh mục các chất đối chiếu…………………………………… 19 Bảng 2.2. Danh mục hóa chất thuốc thử…………………………………… 19 Bảng 2.3. Danh mục trang thiết bị, dụng cụ……………………………….. 20 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát các cột sắc ký khác nhau………………………. 27 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát các tác nhân đối quang khác nhau…………….. 29 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát các nồng độ tác nhân đối quang khác nhau…… 29 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát các nồng độ pH dung dịch khác nhau ………… 32 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát các nồng độ PEG khác nhau………………...... 34 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát các nồng độ NaH2PO4 khác nhau....................... 34 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát các tỷ lệ pha động khác nhau………………… 38 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống trên mẫu chuẩn Amlodipin (n=6)……………………………………………………………. 40 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống trên mẫu chuẩn (S)amlodipin (n=6)……………………………………………………………. 41 Bảng 3.10. Kết quả khảo sát tính tuyến tính của mẫu chuẩn amlodipin…… 44 Bảng 3.11. Kết quả khảo sát tính tuyến tính của mẫu chuẩn (S)- amlodipine 45 Bảng 3.12. Phương trình hồi quy, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện đồng phân amlodipin trong mẫu chuẩn amlodipin và mẫu chuẩn (S)-amlodipin… 46 Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ lập lại của viên nén amlodipine (đồng phân (S)-amlodipin)………………………………………………………………. 47 Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ lập lại của viên nén amlodipin (đồng phân 47 (R)-amlodipin)………………………………………………………………. Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ lặp lại của viên nén (S)-amlodipin………… 48 Bảng 3.16. Kết quả khảo sát độ đúng của viên nén amlodipin (n=9) (đồng phân (S)-amlodipin)…………………………………………………………. 48 . i Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độ đúng của viên nén amlodipin (đồng phân 49 (R-amlodipin)………………………………………………………………. Bảng 3.18. Kết quả khảo sát độ đúng của viên nén (S)-amlodipin…………... 49 Bảng 3.19. Kết quả khảo sát LOD (µg/ml) và LOQ (µg/ml) của viên nén (S) amlodipin………………………………………………………………….. 50 Bảng 3.20. Kết quả định lượng (S)-amlodipin trong các chế phẩm……… 52 Bảng 3.21. Kết quả khảo sát tạp đồng phân (R)-amlodipin trong các chế phẩm ………………………………………………………………………... 52 Bảng 3.22. Kết quả khảo sát các cột sắc ký cellulose khác nhau…………… 54 Bảng 3.23. Kết quả khảo sát các tỷ lệ pha động khác nhau……………….. 55 Bảng 3.24. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống trên mẫu chuẩn amlodipin (n=6)…………………………………………………………….. 57 Bảng 3.25. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống trên mẫu chuẩn (S)amlodipin (n=6)…………………………………………………………….. 58 Bảng 3.26. Kết quả khảo sát tính tuyến tính của mẫu chuẩn amlodipine….. 61 Bảng 3.27. Kết quả khảo sát tính tuyến tính của mẫu chuẩn (S)- amlodipin 61 Bảng 3.28. Phương trình hồi quy, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện đồng 64 phân amlodipin trong mẫu chuẩn amlodipin và mẫu chuẩn (S)-amlodipin…. Bảng 3.29. Kết quả khảo sát độ lập lại của viên nén amlodipine (đồng phân (R)-amlodipin)………………………………………………………………. 64 Bảng 3.30. Kết quả khảo sát độ lập lại của viên nén amlodipin (đồng phân 65 (S)-amlodipin)……………………………………………………………… Bảng 3.31. Kết quả khảo sát độ lặp lại của viên nén (S)-amlodipin……….. 65 Bảng 3.32. Kết quả khảo sát độ đúng của viên nén amlodipin (n=9) (đồng phân (R-amlodipin)…………………………………………………………. 66 Bảng 3.33. Kết quả khảo sát độ đúng của viên nén amlodipin (đồng phân (S)-amlodipin)………………………………………………………………. . 66 ii Bảng 3.34. Kết quả khảo sát độ đúng của viên nén (S)-amlodipin ………… 67 Bảng 3.35. Kết quả khảo sát LOD (µg/ml) và LOQ (µg/ml) của viên nén (S) 67 amlodipin………………………………………………………………….. Bảng 3.36. Kết quả định lượng (S)-amlodipin trong các chế phẩm…………. 70 Bảng 3.37. Kết quả khảo sát tạp đồng phân (R)-amlodipin trong các chế 70 phẩm………………………………………………………………………… Bảng 4.1. So sánh các thông số sắc ký khi sử dụng cột sắc ký có chức tác nhân đối quang SBE-β-CD và cột cellulose-4 để phân tích (S)-AML…….. . 73 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Công thức cấu tạo của amlodipin………………………………… 3 Hình 1.2. Độ nhớt của hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ ở 25oC………... 13 Hình 3.1. SKĐ của dung dịch chuẩn amlodipin tại các cột sắc ký khảo sát . 27 Hình 3.2 Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của cột sắc ký PHLC lên độ phân giải và thời gian phân tách đồng phân amlodipine……………………… 28 Hình 3.3. SKĐ khảo sát trên các tác nhân đối quang khác nhau ………….. 29 Hình 3.4. SKĐ khảo sát sự tách đồng phân (thay đổi nồng độ tác nhân đối quang)…………………………...................................................................... 31 Hình 3.5. Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của các nồng độ tác nhân đối quang Sulfobutyl ether- β-cyclodextrin (SBE-β-CD) khác nhau lên độ phân giải và thời gian phân tách đồng phân amlodipin……………………………… 31 Hình 3.6. SKĐ khảo sát sự tách đồng phân (thay đổi pH của pha động) …… 33 Hình 3.7. Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của các nồng độ pH dung dich khác 34 nhau lên độ phân giải và thời gian phân tách đồng phân amlodipine……… Hình 3.8. SKĐ khảo sát sự tách đồng phân (khác PEG)……………………. 35 Hình 3.9. Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của các nồng độ PEG khác nhau lên độ phân giải và thời gian phân tách đồng phân amlodipine……………….. 35 Hình 3.10. SKĐ khảo sát sự tách đồng phân (khác nồng độ đệm NaH2PO4) 37 Hình 3.11. Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của các nồng độ NaH2PO khác nhau 37 lên độ phân giải và thời gian phân tách đồng phân amlodipin ……………. Hình 3.12. SKĐ khảo sát sự tách đồng phân (khác tỷ lệ pha động)………. 39 Hình 3.13. Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của các tỷ lệ pha động khác nhau 39 lên độ phân giải và thời gian phân tách đồng phân amlodipin …………….. Hình 3.14. Sắc ký đồ mẫu chuẩn amlodipin ……………………………… 41 Hình 3.15. Sắc ký đồ mẫu chuẩn (S)-amlodipin ………………………..... 41 Hình 3.16. Sắc ký đồ của chuẩn amlodipin +chuẩn (S)-amlodipin………. 42 Hình 3.17. Sắc ký đồ mẫu thử amlodipin..................................................... 42 Hình 3.18. Sắc ký đồ của mẫu trắng ………………………………………. 42 . Hình 3.19. Sắc ký đồ của mẫu trắng thêm chuẩn………………………… 42 Hình 3.20. Sắc ký đồ mẫu thử (S)-amlodipin……………………………… 42 Hình 3.21. Độ tinh khiết của pic (S)-amlodipin trong mẫu thử…………… 42 Hình 3.22. Phổ UV tại thời gian lưu của pic (S)-amlodipin trong mẫu chuẩn……………………………………………………………………….. 43 Hình 3.23. Phổ UV tại thời gian lưu của pic (R)-amlodipin trong mẫu chuẩn 43 Hình 3.24. Phổ UV tại thời gian lưu của pic (S)-amlodipin trong mẫu thử.. 43 Hình 3.25. Phổ UV tại thời gian lưu của pic (R)-amlodipin trong mẫu thử… 43 Hình 3.26. Mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích đỉnh (S)-amlodipin……. 44 Hình 3.27. Mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích đỉnh (R)-amlodipin…… 44 Hình 3.28. Mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích đỉnh (S)-amlodipin 45 Hình 3.29. Sắc ký đồ mẫu chuẩn amlodipin nồng độ 0,3 µg/ml…………… 46 Hình 3.30. Sắc ký đồ mẫu chuẩn amlodipin nồng độ 0,2 µg/ml……………. 46 Hình 3.31. Sắc ký đồ mẫu chuẩn amlodipin nồng độ 0,1 µg/ml……………. 46 Hình 3.32. Sắc ký đồ của mẫu Viên nén Safeesem 2,5 ((S)-amlodipin 2,5mg) 53 Hình 3.33. Sắc ký đồ của mẫu Viên nén Safeesem 5 ((S)-amlodipin 5mg)...... 53 Hình 3.34. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn (S)-amlodipin……………………………… 53 Hình 3.35 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn (R)-amlodipin……………………………… 53 Hình 3.36. SKĐ kết quả khảo sát các cột cellulose khác nhau..................... 54 Hình 3.37. SKĐ khảo sát trên các tỷ lệ pha động………………………….. 56 Hình 3.38. Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của các tỷ lệ pha động khác nhau lên độ phân giải và thời gian phân tách đồng phân amlodipine……………. 56 Hình 3.39. Sắc ký đồ mẫu chuẩn amlodipine…………………………….. 58 Hình 3.40. Sắc ký đồ mẫu chuẩn (S)-amlodipin……………………………. 58 Hình 3.41. Sắc ký đồ của chuẩn amlodipin +chuẩn (S)-amlodipin………… 59 Hình 3.42. Sắc ký đồ mẫu thử amlodipin…………………………………… 59 Hình 3.43. Sắc ký đồ của mẫu trắng …………………………...................... 59 Hình 3.44. Sắc ký đồ của mẫu trắng thêm chuẩn………………………… 59 Hình 3.45. Sắc ký đồ mẫu thử (S)-amlodipin……………………………… 59 . i Hình 3.46. Độ tinh khiết của pic (S)-amlodipin trong mẫu thử…………… 60 Hình 3.47. Phổ UV tại thời gian lưu của pic (S)-amlodipin trong mẫu 60 chuẩn………………………………………………………………………… Hình 3.48. Phổ UV tại thời gian lưu của pic (R)-amlodipin trong mẫu chuẩn……………………………………………………………………….. 60 Hình 3.49. Phổ UV tại thời gian lưu của pic (S)-amlodipin trong mẫu thử… 60 Hình 3.50. Phổ UV tại thời gian lưu của pic (R)-amlodipin trong mẫu thử…. 60 Hình 3.51. Mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích đỉnh (R)-amlodipin…… 61 Hình 3.52. Mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích đỉnh (S)-amlodipin……. 62 Hình 3.53. Mối quan hệ giữa nồng độ và diện tích đỉnh (S)-amlodipin……. 60 Hình 3.54. Sắc ký đồ mẫu chuẩn amlodipine nồng độ 0,3 µg/ml…………. 63 Hình 3.55. Sắc ký đồ mẫu chuẩn amlodipine nồng độ 0,2 µg/ml…………. 63 Hình 3.56. Sắc ký đồ mẫu chuẩn amlodipine nồng độ 0,1 µg/ml…………. 63 Hình 3.57. Sắc ký đồ của mẫu Viên nén Safeesem 2,5 ((S)-Amlodipin 2,5mg) 70 Hình 3.58. Sắc ký đồ của mẫu Viên nén Safeesem 2,5 ((S)-Amlodipin 5 70 mg)................................................................................................................... Hình 3.59. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn (S)-amlodipin……………………….. 70 Hình 3.60. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn (R)-amlodipin……………………… 70 . MỞ ĐẦU Các đồng phân quang học có thể khác nhau về tính chất dược động học, dược lý học hay độc tính. Không hiếm các trường hợp chỉ một đối quang có hoạt tính trong khi đối quang kia lại gây độc cho cơ thể. Trong hướng dẫn của FDA (Mỹ) hay EMEA (Châu Âu) đều nhấn mạnh việc tách riêng các đối quang và đánh giá sự đóng góp của mỗi đối quang với tác dụng của thuốc [18]. Hiện nay, các chế phẩm thuốc đang lưu hành ở dạng đồng phân riêng lẻ ngày càng phổ biến dẫn đến yêu cầu phát triển các phương pháp phân tích đồng phân quang học nhằm phục vụ cho kiểm nghiệm tạp đồng phân của nguyên liệu và các chế phẩm thuốc trên thị trường. Amlodipin (AML) là thế hệ thứ ba của thuốc ức chế kênh calci thuộc nhóm dihydropyridin (DHP) có khả năng chặn kênh calci được sử dụng trong điều trị bệnh cao huyết áp và chứng đau thắt ngực. AML được sử dụng trong điều trị chứng đau thắt ngực ổn định mạn tính và trong điều trị tăng huyết áp từ nhẹ đến trung bình [36]. Giống như hầu hết các chất ức chế kênh calci khác của nhóm dihydropyridin, AML thường được sử dụng trong điều trị dưới dạng racemic. Tuy nhiên, đồng phân (R) và (S) không có cùng hoạt tính sinh học. Chỉ có (S)-AML có thuộc tính giãn mạch [10], tác dụng của nó tương đương với dạng racemic nhưng ít tác dụng phụ hơn [35] trong khi đó phù, đau đầu, chóng mặt, rát mặt và các phản ứng phụ khác đến từ (R)-AML [17]. (S)-AML lại có tác dụng ức chế kênh calci mạnh, do tác động trên chuột mạnh hơn hơn so với (R)-AML khoảng 1000 lần. Ngoài thời gian hoạt động dài hơn, (S)AML làm giảm nguy cơ tái nhịp nhanh, và độ thanh thải của bệnh nhân phụ thuộc vào sự biến đổi nhiều hơn so với (R)-AML [33]. Do sự khác biệt đáng kể về dược động học giữa hai dạng đồng phân quang học này và để cải thiện tính an toàn và hiệu quả, AML được sản xuất dưới dạng đồng phân (S) và được đưa ra thị trường vài năm trước. Vì vậy, đồng phân (R) coi như là tạp chất nên hạn chế sử dụng và cần được thực hiện bởi các phương pháp phân tích nhanh và hiệu quả. Có nhiều nghiên cứu phân tích các đồng phân quang học đã được báo cáo như sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ [41], điện di mao quản [4], [16],... Phương pháp CE rẻ tiền do tiết kiệm dung môi hóa chất nhưng độ ổn định và độ lặp lại của CE không . bằng HPLC. Vì vậy đề tài sử dụng HPLC để phân tách, đây là phương pháp vẫn được áp dụng trong hầu hết các quy trình. Các đồng phân quang học của AML đã được tách trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao khi sử dụng pha tĩnh cột chiral (chiral stationary phases- CSPs) [27, 30] hoặc pha động chứa chiral (chiral mobile phase additives- CMPAs) [12, 37, 40]. Do các cột bất đối thường đắt tiền và không thông dụng. Nên trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu và ứng dụng phương pháp để định lượng (S)-AML trên HPLC với pha động có chứa tác nhân đối quang. Đề tài giúp giảm chi phí và góp phần xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho viên nén chứa (S)-amlodipin để có thể áp dụng trong kiểm tra chất lượng và tiêu chuẩn hóa. Đề tài “Xây dựng quy trình định lượng (S)-amlodipin bằng phương pháp HPLC pha đảo sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang” được thực hiện với các mục tiêu sau: - Khảo sát các pha động có chứa tác nhân đối quang có thể tách (S)-amlodipin bằng phương pháp HPLC. - Thẩm định phương pháp định lượng (S)-amlodipin bằng HPLC sử dụng pha động có chứa tác nhân đối quang. - Ứng dụng quy trình để định lượng một vài chế phẩm (S)-amlodipin trên thị trường . CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ AMLODIPIN Công thức cấu tạo: (S)-AML (R)-AML Hình 1.1. Công thức cấu tạo của amlodipin CÔNG THỨC PHÂN TỬ : C20H25CLN2O5 Danh pháp: 3-ethyl 5-methyl (4RS)-2-[(2-aminoethoxy)methyl]-4-(2-clorophenyl)6-methyl-1,4-dihydropyridin-3,5-dicarboxylat. Khối lượng phân tử : 408,879 g/mol Tên thường: Amlodipin besylat (Amlodipin tồn tại dưới dạng muối amlodipin besilat, trong chế phẩm có chứa từ 95,0 đến 102,0 % : C20H25ClN2O5.C6H5SO3H Khối lượng phân tử: 567,06 g/mol pKa = 8,6 1.1.1. Tính chất vật lý [1]: Bột kết tinh màu trắng. Dễ tan trong methanol, hơi tan trong ethanol, khó tan trong nước và 2-propanol. . 1.1.2. Tính chất hóa học [8] Nhân thơm : Hấp thụ UV. Nhóm chức este : Các phản ứng thủy phân. Nhóm NH2 : Tính khử và tính base. Nhân dihydropyridin : Tính base và tính khử, bị oxy hóa bởi Ce2+ tạo thành pyridin, ứng dụng trong định lượng. 1.1.3. Tác dụng dược lý AML có tác dụng chống tăng huyết áp, làm tăng lưu lượng máu ở thận và cải thiện chức năng thận. Có thể dùng AML để điều trị tăng huyết áp ở người bệnh đái tháo đường. AML tác dụng chậm nên ít có nguy cơ hạ huyết áp cấp hoặc nhịp nhanh phản xạ. AML có tác dụng chống đau thắt ngực, thời gian chống đau kéo dài 24 giờ. Người bệnh có thể dùng phối hợp với thuốc chẹn beta và nitrat trong điều trị đau thắt ngực. Amlodipin là dẫn chất của dihydropyridin có tác dụng chẹn calci qua màng tế bào. Trong phân tử amlodipin có một nguyên tử carbon bất đối nên amlodipin tồn tại dưới dạng hỗn hợp racemic của 2 đồng phân đối quang. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh trong hai đồng phân của amlodipin thì đồng phân tả truyền (levamlodipin S(-)amlodipin) đóng vai trò chính để tạo ra tác dụng điều trị tăng huyết áp và đau thắt ngực. (S)-amlodipin có hoạt lực mạnh hơn (R)-amlodipin 1000 lần [29]. 1.1.4. Chỉ định [11] - Tăng huyết áp (có thể dùng cho bệnh nhân đái tháo đường) - Dự phòng ở người bệnh đau thắt ngực ổn định 1.1.5. Tương tác thuốc [1] - Thuốc gây mê: làm giảm huyết áp mạnh - Lithi: Khi dùng cùng với amlodipin, có thể gây độc thần kinh, buồn nôn, ỉa chảy - NSAID đặc biệt là indomethacin do ức chế prostaglandin hoặc giữ natri và dịch nên làm giảm tác dụng chống tăng huyết áp của amlodipin - Amlodipin liên kết cao với protein huyết tương do đó cần thận trọng với những thuốc liên kết với protein huyết tương (thay đổi nồng độ thuốc) .