Tài liệu Xây dựng quy trình định lượng đồng thời vitamin a, d3, e, k1 trong chế phẩm đa thành phần bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH …………… HÀ THỊ HUÊ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI VITAMIN A, D3, E, K1 TRONG CHẾ PHẨM ĐA THÀNH PHẦN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HÀ THỊ HUÊ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI VITAMIN A, D3, E, K1 TRONG CHẾ PHẨM ĐA THÀNH PHẦN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc – Độc chất Mã số: 60 72 04 10 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Giáo viên hướng dẫn: TS. PHAN VĂN HỒ NAM Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2017 LỜI CẢM ƠN Mơ ước được học dưới mái trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh của em đã thành hiện thực, và đây cũng là lần đầu tiên em được tiếp xúc với việc nghiên cứu nên em cũng cảm thấy rất lo lắng và bỡ ngỡ. Nhưng em cảm thấy hạnh phúc và vững tin hơn khi được cảm thụ những kiến thức quý giá của tất cả các Thầy Cô trong mỗi buổi học, và đó chính là hành trang giúp em thực hiện luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn thầy TS. Phan Văn Hồ Nam đã quan tâm hướng dẫn, truyền đạt các kiến thức, kinh nghiệm giúp em thực hiện và hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn cô PGS. TS. Võ Thị Bạch Huệ đã hướng dẫn, giúp đỡ em những bước đi đầu tiên trong con đường nghiên cứu và tạo điều kiện cho em được làm việc để thực hiện và hoàn thành luận văn. Em xin cảm ơn thầy PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn, thầy PGS.TS. Trương Ngọc Tuyền và thầy PGS.TS. Nguyễn Ngọc Vinh đã dành thời gian đóng góp ý kiến và giải đáp những khó khăn, vướng mắc trong quá trình em thực hiện đề tài. Em xin cảm ơn Ban giám đốc công ty TNHH Liên doanh Hasan – Dermapharm và chị CN. Lê Thị Hồng Ngân, trưởng phòng QC Liên Doanh công ty đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em làm việc. Chị truyền đạt những kinh ngiệm, hướng dẫn em vận hành và sử dụng các trang thiết bị khi lần đầu em được tiếp xúc. Em rất biết ơn khi chị đã tạo điều kiện cho em được ở lại làm đêm và làm việc vào các ngày nghỉ để em có thể hoàn thành luận văn. Em xin cảm ơn tất cả các anh chị, các bạn cùng làm luận văn, những người luôn giúp đỡ, đóng góp ý kiến và động viên em trong suốt quá trình làm luận văn. Trân trọng. LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Hà Thị Huê Luận văn Thạc sĩ dược học – Khóa học 2015 – 2017 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI VITAMIN A, D3, E, K1 TRONG CHẾ PHẨM ĐA THÀNH PHẦN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Hà Thị Huê Thầy hướng dẫn: TS. Phan Văn Hồ Nam Đặt vấn đề Viên nén Hasantrum vital 50+ được sản xuất tại công ty Liên doanh Hasan – Dermapharm bổ sung 24 vitamin và khoáng chất thiết yếu cho cơ thể, giúp hỗ trợ nâng cao sức khỏe tổng thể cho phụ nữ trên 50 tuổi. Hiện nay việc định lượng các hoạt chất trong chế phẩm này phải sử dụng những quy trình riêng gây phức tạp và tốn kém. Do đó, mục tiêu của đề tài là xây dựng quy trình định lượng đồng thời vitamin A, D3, E, K1 trong chế phẩm đa thành phần bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA đáp ứng yêu cầu của một quy trình định lượng dùng trong kiểm nghiệm dược phẩm. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: viên nén Hasantrum vital 50+ Phương pháp nghiên cứu: Tiến hành xây dựng quy trình định lượng đồng thời vitamin A, D3, E, K1trong chế phẩm đa thành phần bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA. Kết quả và bàn luận: Điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng đồng thời vitamin A, D3, E, K1 bằng phương pháp HPLC là: Cột Inersustain C18 (4,6 x 250 mm x 5 µm), đầu dò PDA với bước sóng phát hiện 265 nm, pha động:methanol – dicloromethan - nước (96:2:2, tt/tt), tốc độ dòng 1,5 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 50 µl. Quy trình được đánh giá đạt tính phù hợp của hệ thống (RSD ≤ 2%), có tính đặc hiệu, độ chính xác cao (RSD ≤ 5% đối với vitamin A, D3, K1, vitamin E RSD ≤ 2% và độ đúng cao (tỷ lệ phục hồi năm trong khoảng 90 -110%). Khi ứng dụng quy trình trên để đinh lượng đồng thời vitamin A, D3, E, K1 trong ba lô chế phẩm Hasantrum vital 50+ thấy hàm lượng các vitamin đều đạt RSD ≤ 2% Kết luận Đã xây dựng được quy trình định lượng đồng thời vitamin A, D3, E, K1trong chế phẩm đa thành phần bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA. Quy trình đã được đánh giá có tính đặc hiệu, độ chính xác và độ đúng cao, đáp ứng đầy đủ yêu cầu của một quy trình định lượng trong kiểm nghiệm dược phẩm. Master’s thesis– Academic course: 2015 - 2017 SIMUTANEOUS DETERMINATION OF VITAMINS A, D3, E, K1 IN MULTI-COMPONENTS PHARMACEUTICAL BY HPLC Ha Thi Hue Supervisor: PhD. Phan Van Ho Nam Introduction Hasantrum vital 50+ tablets which are manufactured by Hassan – Dermapharm jointventure Company 24 vitamins and minerals are essential for the body, helping to promote overall health for women over 50 years. Currently the quantification of four compount is complex and costly because of application many analytical HPLC procedures. Therefore, the aim of this study was to develop a simple and rapid reverse phase HPLC method for identification and simultaneous quantitation of vitamins A, D3, E, K1 in multi-components pharmaceuticals, without using buffer in mobile phase. Materials and methods The subject of this study was Hasantrum vital 50+ Methods: Quantitative analysis of theses active ingredient was applied by HPLC with PDAdetector. Results and discussion The suitable chromatographic conditions for separation of four components were obtained using a C18 Inertsustain column (4,6 x 250 mm x 5 µm), mixture of methanol dicloromethan - water (96:2:2, v/v) as a mobile phase, flow rate of 1,5 ml/min and 50 µl of injection volume, The PDA detection was performed at 265 nm. Validation results showed that the method was suitable for the HPLC system, selective, linear, precise (A, D3, K1: RSD ≤ 5%, E:RSD ≤ 2%) and accurate (the recoveries in the range of 90.0 – 110.0%) All the calculations concerning the quantitative analysis showed that three batchecontaints of Hasantrum vital 50+ tablets found the vitamin content reached RSD ≤ 2% Conclusion A simple and rapid reverse-phase HPLC method was successfully developed for simultaneous determination of vitamins A, D3, E, K1. The proposed method is selective, accurate and precise, and can be applied for routine quality control of multi-components pharmaceutical containing these components. i MỤC LỤC MỤC LỤC ............................................................................................................... i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................... iii DANH MỤC HÌNH ẢNH ...................................................................................... v DANH MỤC BẢNG BIỂU – SƠ ĐỒ .................................................................... vii ĐẶT VẤN ĐỀ ......................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 3 1.1. VITAMIN A ................................................................................................. 3 1.2. VITAMIN D3 ................................................................................................ 6 1.3. VITAMIN E .................................................................................................. 8 1.4. VITAMIN K1 ................................................................................................ 10 1.5. CÁC NGHIÊN CỨU VITAMIN A, D3, E, K1 TRONG CÁC CHẾ PHẨM ĐA THÀNH PHẦN ĐÃ ĐƯỢC THỰC HIỆN................................................... 12 1.5.1. Một số nghiên cứu định lượng vitamin A, D3, E, K1 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao trên thế giới ............................................................. 12 1.5.2. Một số nghiên cứu định lượng vitamin A, D3, E, K1 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ở Việt Nam .............................................................. 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 22 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU .................................................................................. 22 2.2. TRANG THIẾT BỊ ....................................................................................... 23 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 23 2.3.1. Khảo sát điều kiện phân tích vitamin A, D3, E, K1 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ........................................................................................ 23 2.3.2. Thẩm định quy trình định lượng đồng thời vitamin A, D3, E, K1 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao............................................................ 27 2.3.3. Ứng dụng ................................................................................................. 31 ii CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU............................................................. 32 3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH VITAMIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ... 32 3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký ........................................................................ 32 3.1.2. Phương pháp xử lý mẫu ........................................................................... 40 3.2. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI VITAMIN A, D3, E, K1 TRONG CHẾ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ........................................................................................................ 46 3.3. DỰ THẢO QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI VITAMIN A, D3, E, K1 TRONG CHẾ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ........................................................................................................ 59 3.4. ỨNG DỤNG ................................................................................................. 61 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ..................................................................................... 66 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ nguyên AcN Acetonitril AS Asymmetric factor BHA Butylated hydroxyl anisole BHT Butylated hydroxyl toluene DAD Diod Array Detector Hệ số bất đối Đầu dò dãy diod Dung môi hòa tan mẫu DMHTM DMSO Nghĩa tiếng Việt Dimethyl sulfoxid ĐC Đối chiếu ĐKSK Điều kiện sắc ký EP European Pharmacopoeia Dược điển Châu Âu GC Gas Chromatography Sắc ký khí HL Hàm lượng HLNT Hàm lượng nguyên trạng HLTB Hàm lượng trung bình HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography Khối lượng cân mcân MS Mass Spectroscopy Khối phổ PDA Photodiod Array Dãy diod quang QC Quality Control Kiểm soát chất lượng Rs Resolution Độ phân giải SKĐ SPE Sắc ký đồ Solid Phase Extraction TB TBME Trung bình Tert Butyl Methyl Ether Tiêu chuẩn cơ sở TCCS TFA Chiết pha rắn Trifluoroacetic acid iv THF Tetrahydrofuran TLTK Tài liệu tham khảo TNHH Trách nhiệm hữu hạn UPLC Ultra Performance Liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu năng Chromatography UV XNDPTƯ Ultra Violet Phổ Tử ngoại Xí nghiệp dược phẩm trung ương v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Công thức cấu tạo vitamin A .................................................................. 3 Hình 1.2: Công thức cấu tạo vitamin D3 ................................................................. 6 Hình 1.3: Phổ hồng ngoại vitamin D3 ..................................................................... 7 Hình 1.4: Công thức cấu tạo vitamin E ................................................................... 8 Hình 1.5: Phổ hồng ngoại vitamin E ....................................................................... 9 Hình 1.6: Công thức cấu tạo vitamin K1 ................................................................. 10 Hình 3.1: SKĐ mẫu thử sử dụng pha động methanol – nước ................................ 32 Hình 3.2: SKĐ mẫu thử sử dụng pha động methanol – TFA 0,01%/nước ............. 32 Hình 3.3: SKĐ mẫu thử sử dụng pha động methanol – ethyl acetat – nước........... 33 Hình 3.4: SKĐ mẫu thử sử dụng pha động acetonitril – nước ................................ 33 Hình 3.5: SKĐ mẫu thử sử dụng pha động methanol – THF – nước ..................... 34 Hình 3.6: SKĐ mẫu thử sử dụng pha động methanol – dicloromathane – nước .... 34 Hình 3.7: SKĐ mẫu thử dùng cột Inertsustain C18, pha động methanol – dicloromathane – nước ............................................................................................. 35 Hình 3.8: Biểu đồ minh họa độ tinh khiết pic vitamin A, D3, E, K1 ....................... 35 Hình 3.9: SKĐ mẫu thử các pic hoạt chất có hiện tượng thay đổi thời gian lưu .... 37 Hình 3.10: SKĐ mẫu thử khi sử dụng hỗn hợp pha động methanol – dicloromathane – nước ............................................................................................ 37 Hình 3.11: SKĐ mẫu thử trong khảo sát tốc độ dòng ............................................. 38 Hình 3.12: SKĐ mẫu thử trong khảo sát thể tích tiêm ............................................ 39 Hình 3.13: Biểu đồ biểu diễn hàm lượng các vitamin theo tỉ lệ DMSO – nước ..... 40 Hình 3.14: Biểu đồ biểu diễn hàm lượng các vitamin theo thể tích DMHTM ....... 41 Hình 3.15: Biểu đồ biểu diễn hàm lượng các vitamin theo số lần chiết ................. 42 Hình 3.16: Biểu đồ biểu diễn hàm lượng các vitamin theo thời gian cách thủy ..... 43 Hình 3.17: Biểu đồ biểu diễn hàm lượng các vitamin theo thời gian chiết ............. 44 Hình 3.18: Biểu đồ biểu diễn hàm lượng các vitamin theo phương pháp chiết ...... 45 Hình 3.19: SKĐ mẫu pha động ............................................................................... 47 Hình 3.20: SKĐ mẫu trắng ...................................................................................... 47 vi Hình 3.21: SKĐ mẫu chuẩn .................................................................................... 47 Hình 3.22: SKĐ mẫu thử......................................................................................... 47 Hình 3.23: SKĐ mẫu chuẩn A ................................................................................ 48 Hình 3.24: SKĐ mẫu chuẩn D3 ............................................................................... 48 Hình 3.25: SKĐ mẫu chuẩn E ................................................................................. 48 Hình 3.26: SKĐ mẫu chuẩn K1 ............................................................................... 48 Hình 3.27: SKĐ mẫu thử thêm chuẩn A ................................................................. 49 Hình 3.28: SKĐ mẫu thử thêm chuẩn D3 ................................................................ 49 Hình 3.29: SKĐ mẫu thử thêm chuẩn E.................................................................. 49 Hình 3.30: SKĐ mẫu thử thêm chuẩn K1 ................................................................ 49 Hình 3.31: SKĐ mẫu thử thêm hỗn hợp chuẩn ....................................................... 50 Hình 3.32: Phổ UV của pic vitamin A, D3, E, K1 trong mẫu thử. mẫu thử thêm chuẩn và mẫu chuẩn ................................................................................................. 50 Hình 3.33: SKĐ mẫu thử tiêm ngay khi pha mẫu ................................................... 51 Hình 3.34: SKĐ mẫu thử sau khi để mẫu ở nhiệt độ phòng trong 6 giờ ................ 51 Hình 3.35: Biểu đồ pic tinh khiết các vitamin ở mẫu để nhiệt độ phòng/6h .......... 51 Hình 3.36: Đường tuyến tính của vitamin A theo quy trình ................................... 54 Hình 3.37: Đường tuyến tính của vitamin D3 theo quy trình .................................. 54 Hình 3.38: Đường tuyến tính của vitamin E theo quy trình .................................... 55 Hình 3.39: Đường tuyến tính của vitamin K1 theo quy trình .................................. 55 Hình 3.40: SKĐ mẫu thử Hasantrum vital 50+ lô 00316 ........................................ 62 Hình 3.41: SKĐ mẫu thử Hasantrum vital 50+ lô 00416 ........................................ 62 Hình 3.42: SKĐ mẫu thử Hasantrum vital 50+ lô 00516 ........................................ 62 Hình 3.43: SKĐ mẫu thử Hasantrum man 50+ lô 00117 ........................................ 63 Hình 3.44: SKĐ mẫu thử Hasantrum man 50+ lô 00217 ........................................ 63 Hình 3.45: SKĐ mẫu thử Hasantrum man 50+ lô 00317 ........................................ 64 Hình 3.46: SKĐ mẫu thử Hasantrum plus woman 50+ lô 00217 ............................ 64 Hình 3.47: SKĐ mẫu thử Ribomin advance lô 00416 ............................................ 65 vii DANH MỤC BẢNG BIỂU – SƠ ĐỒ Bảng 1.1: Một số nghiên cứu vitamin A, D3, E, K1 bằng phương pháp HPLC đã được thực hiện trên thế giới ..................................................................................... 15 Bảng 1.2: Một số nghiên cứu vitamin A, D3, E, K1 bằng phương pháp HPLC đã được thực hiện ở Việt Nam ...................................................................................... 19 Bảng 2.1: Thành phần viên Hasantrum vital 50+ .................................................... 22 Bảng 2.2: Danh mục các chất chuẩn ....................................................................... 23 Bảng 2.3: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết mẫu .......................... 26 Bảng 2.4: Thể tích dung dịch chuẩn gốc cần để pha giai mẫu chuẩn ..................... 29 Bảng 3.1: Sự thay đổi thời gian lưu các pic hoạt chất ............................................. 36 Bảng 3.2: Thời gian lưu các pic hoạt chất ở các tốc độ dòng khác nhau ................ 38 Bảng 3.3: Diện tích các pic hoạt chất ở các thể tích tiêm khác nhau ...................... 39 Bảng 3.4: Hàm lượng các vitamin khi khảo sát DMHTM ...................................... 40 Bảng 3.5: Hàm lượng cácvitamin khi khảo sát thể tích DMHTM .......................... 41 Bảng 3.6: Hàm lượng các vitamin khi khảo sát số lần chiết mẫu ........................... 42 Bảng 3.7: Hàm lượng các vitamin khi khảo sát thời gian cách thủy....................... 43 Bảng 3.8: Hàm lượng các vitamin khi khảo sát thời gian chiết .............................. 44 Bảng 3.9: Hàm lượng các vitamin khi khảo sát phương pháp chiết ....................... 45 Bảng 3.10: Tổng hợp các điều kiện xử lý mẫu thích hợp ....................................... 45 Bảng 3.11: Độ thu hồi các vitamin trong điều kiện thích hợp ................................ 46 Bảng 3.12: Thẩm định độ đặc hiệu thời gian lưu của vitamin A, D3, E, K1 trong mẫu chuẩn và thử ..................................................................................................... 46 Bảng 3.13:Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của 4 vitamin ............... 52 Bảng 3.14: Kết quả thống kê hồi quy tuyến tính của 4 vitamin theo quy trình ...... 53 Bảng 3.15: Thẩm định tính phù hợp hệ thống của quy trình đối với vitamin A ..... 56 Bảng 3.16: Thẩm định tính phù hợp hệ thống của quy trình đối với vitamin D3 .... 56 Bảng 3.17: Thẩm định tính phù hợp hệ thống của quy trình đối với vitamin E...... 56 Bảng 3.18: Thẩm định tính phù hợp hệ thống của quy trình đối với vitamin K1 .... 57 Bảng 3.19: Thẩm định độ lặp lại của quy trình đối với vitamin A, D3 ................... 57 viii Bảng 3.20: Thẩm định độ lặp lại của quy trình đối với vitamin E, K1 .................... 57 Bảng 3.21: Thẩm định độ chính xác trung gian đối với vitamin A, D3 .................. 58 Bảng 3.22: Thẩm định độ chính xác trung gian đối với vitamin E, K1 ................... 58 Bảng 3.23: Kết quả thẩm định độ đúng quy trình ................................................... 59 Bảng 3.24: Định lượng vitamin A, D3, E, K1 trong chế phẩm Hasantrum vital 50+ trên các lô ................................................................................................................. 61 Bảng 3.25: Định lượng vitamin A, D3, E trong chế phẩm Hasantrum man 50+ trên các lô ........................................................................................................................ 63 Bảng 3.26: Định lượng vitamin D3, E, trong chế phẩm Hasantrum plus woman 50+ .................................................................................................................................. 64 Bảng 3.27: Định lượng vitamin A, D3, E, trong chế phẩm Ribomin advance ........ 65 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Vitamin và muối khoáng là những yếu tố cần thiết cho sức khỏe mọi người, được cung cấp qua thức ăn vì cơ thể không tự tổng hợp được. So với thực phẩm thì nhu cầu hàng ngày về vitamin và muối khoáng nhỏ hơn ngàn lần nên còn được gọi là vi chất dinh dưỡng [2]. Vitamin phát huy vai trò sinh học ở dạng phối hợp tốt hơn dạng đơn độc vì các quá trình sinh hóa xảy ra trong cơ thể mà vitamin đóng vai trò xúc tác có liên quan mật thiết với nhau. Do đó phối hợp vitamin là cần thiết [2]. Có thể phối hợp vitamin bằng cách dùng nhiều loại vitamin riêng lẻ hoặc dùng dạng phối hợp sẵn. Hiện nay, trên thị trường thuốc và thực phẩm chức năng chứa vitamin đa thành phần trở nên rất phổ biến. Các nhà sản xuất thường sản xuất dạng polyvitamin phối hợp sẵn nhằm mục đích tiện dụng cho người dùng, giảm số lần dùng, tăng hiệu quả sử dụng…. Tuy nhiên, khi phối hợp nhiều thành phần khác nhau dẫn tới một số vấn đề khó khăn trong việc bào chế cũng như xây dựng quy trình kiểm nghiệm do các thành phần có hàm lượng khác nhau quá lớn, tính chất mỗi thành phần khác nhau, đặc biệt hàm lượng các hoạt chất trong chế phẩm thường nhỏ, gây khó khăn trong việc xử lý mẫu, chọn bước sóng phát hiện,…Trong các chuyên luận của DĐVN IV và dược điển các nước về vitamin và khoáng chất, việc định lượng các thành phần đều có quy trình riêng. Do đó, việc xây dựng quy trình định lượng đồng thời nhiều vitamin trong cùng một quy trình là cần thiết. Hiện nay, nhiều phương pháp được xây dựng định lượng vitamin: UV-Vis, HPLC, LC-MS, GC. Trong đó, phương pháp HPLC được sử dụng phổ biến vì nhiều lý do: độ nhạy cao, khả năng định lượng đồng thời nhiều chất tốt, thích hợp tách các hợp chất không bay hơi và chịu nhiệt. Trong lĩnh vực kiểm nghiệm dược phẩm, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao hiện là một công cụ đắc lực cho việc định lượng các thuốc và thực phẩm đa thành phần. Hiện nay viên bổ sung vitamin với nhiều thành phần vitamin, nguyên tố vi lượng xuất hiện rất nhiều trên thị trường nhưng vẫn chưa thể định lượng đồng thời tất cả các vitamin. 2 Viên nén bao phim Hasantrum vital 50+ được sản xuất tại công ty TNHH Liên doanh Hasan – Dermapharm bổ sung 24 vitamin và khoáng chất thiết yếu cho cơ thể, giúp hỗ trợ nâng cao sức khỏe tổng thể cho phụ nữ trên 50 tuổi. Trong TCCS của sản phẩm này, mỗi vitamin có quy trình định lượng riêng. Để góp phần nâng cấp tiêu chuẩn của chế phẩm, đề tài “ Xây dựng quy trình định lượng đồng thời vitamin A, D3, E, K1 trong chế phẩm đa thành phần bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” được thực hiện để đưa ra một quy trình định lượng chung, có tính chọn lọc, đơn giản, tiết kiệm thời gian và chi phí kiểm nghiệm, giúp kiếm soát tốt chất lượng chế phẩm đa thành phần chứa các vitamin tan trong dầu khi đưa ra thị trường. Mục tiêu của đề tài là: - Xây dựng quy trình định lượng đồng thời vitamin A, D3, E, K1 trong chế phẩm đa thành phần bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. - Thẩm định quy trình phân tích. - Áp dụng quy trình đã thẩm định để định lượng 03 lô thành phẩm và một số chế phẩm khác. 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. VITAMIN A 1.1.1. Công thức cấu tạo và danh pháp [1], [ 14], [23] Hình 1.1: Công thức cấu tạo vitamin A Công thức phân tử: C20H30O Trọng lượng phân tử: 286,5 Danh pháp Retinol: 3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-enyl)nona-2,4,6,8tetraen-1-ol. 1.1.2. Tính chất [1], [14] Tinh thể màu hơi vàng, thực tế không tan trong nước, dễ tan trong alcol, cloroform, ether, ether dầu hỏa, dầu béo. Nhiệt độ nóng chảy 62 - 64 oC. 1.1.3. Định tính 1.1.3.1. Phản ứng tạo màu với Antimony III [24] Dung dịch mẫu thử: tương đương 6 µg/ml retinol trong cloroform. Lấy 1 ml dung dịch thử thêm 10 ml antimony triclorid, thấy xuất hiện sản phẩm có màu xanh. 1.1.3.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng [1], [24] ˗ Bản mỏng: Silica gel GF254 (TT). ˗ Dung môi khai triển: Ether – cyclohexan (20 : 80). ˗ Dung dịch thử: Lấy 1 lượng chế phẩm tương ứng với khoảng 17.000 IU vitamin A. Thêm 20 mg bromelains (TT), 2 ml nước và khoảng 150 l 2-propanol (TT), lắc tròn nhẹ nhàng trong 2 - 5 phút trong cách thủy ở 60 - 65 oC. Làm nguội đến dưới 30 oC và thêm 5 ml 2-propanol (TT) có chứa 1 g/l butylhydroxy-toluen (TT). Lắc mạnh trong 1 phút, để yên trong vài phút và sử dụng dung dịch phía trên. 4 ˗ Dung dịch đối chiếu: Dung dịch 10 mg/ml các chất chuẩn ester của retinol trong 2-propanol (TT) có chứa 1 g/l buty hydroxytoluen (TT). ˗ Lượng mẫu chấm: 3 l. ˗ Chiều dài khai triển: khoảng 15 cm. ˗ Cách phát hiện: soi dưới đèn UV(bước sóng 254 nm). ˗ Yêu cầu: sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu có các vết riêng rẽ tương ứng với các ester. Thứ tự rửa giải từ dưới lên trên là: retinol acetat, retinol propionat và retinol palmitat. Thành phần của dung dịch thử được xác định bằng cách so sánh các vết chính của dung dịch thử với các vết của dung dịch đối chiếu. 1.1.4. Định lượng 1.1.4.1. Phương pháp đo quang [1], [24] Lấy chính xác một lượng chế phẩm không ít hơn 500 IU vitamin A, thêm 30 ml ethanol (TT), 3 ml dung dịch kali hydroxyd bão hòa, vài viên đá bọt, đun sôi 30 phút trên cách thủy có lắp ống sinh hàn hồi lưu, dưới dòng khí nitrogen không có oxygen. Làm nguội nhanh rồi dùng 30 ml nước cất chuyển hết hỗn hợp sang bình gạn, thêm 4 gam natri sulfat (TT) đã nghiền mịn. Chiết vitamin A với 150 ml ether (TT) và lắc 2 phút, nếu tạo nhũ tương thì chiết thêm 3 lần nữa, mỗi lần với 25 ml ether (TT). Gộp dịch chiết lại rồi rửa dịch chiết 4 lần, mỗi lần 50 ml nước cất. Làm bay hơi dịch chiết ether trên cách thủy dưới dòng khí nitrogen không có oxygen hoặc cất quay chân không ở nhiệt độ không quá 30 oC đến hết dung môi. Hòa tan cắn trong một lượng isopropanol (TT) vừa đủ để thu được dung dịch chứa 10 đến 15 IU vitamin A trong 1 ml. Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở các bước sóng 300 nm, 310 nm, 325 nm, và 334 nm trong cốc dày 1 cm với mẫu trắng là isopropanol (TT), sau đó xác định bước sóng có độ hấp thụ cực đại. Nếu cực đại hấp thụ nằm trong dải sóng từ 323 nm đến 327 nm và tỷ lệ A300/ A325 ≤ 0,73 thì kết quả được tính như sau: Tính độ hấp thụ hiệu chỉnh A325(K) = 6,815A325 – 2,555A310 – 4,260A334 A325(K) : độ hấp thu ở bước sóng 325 nm đã hệu chỉnh 5 Nếu A325(K)/A325 ≥ 0,970 thì kết quả hàm lượng vitamin A trong mẫu thử (IU/g) theo công thức sau: HL (IU/g) = A325 x 1830 x V 100 x m Trong đó: A325: độ hấp thụ quang tại bước sóng 325 nm; m: lượng chế phẩm đem thử (g) V: lượng thể tích dung dịch thu được sau khi hòa tan để đem đo (ml); Nếu A325(K)/ A325 < 0,970 thì kết quả vẫn tính theo công thức trên nhưng thay A325 bằng A325(K). 1.1.4.2.Phương pháp sắc ký lỏng [1] Pha động: Methanol – ethyl acetat – nước (90 : 7 : 3) Dung dịch thử: Lấy chính xác một lượng chế phẩm có chứa khoảng 4000 IU vitamin A cho vào bình định mức dung tích 100 ml, thêm ethanol, lắc kỹ rồi thêm ethanol đến định mức lắc đều, lọc. Dung dịch chuẩn: Pha chất chuẩn vitamin A (dạng giống với dung dịch thử : retinol, retinyl acetat, retinyl palmitat…) trong ethanol để thu được dung dịch chuẩn có nồng độ vitamin A chính xác khoảng 40 IU/ml. Điều kiện sắc ký: ˗ Cột: Cột thép không gỉ (25 cm x 4 mm x 5 µm ) được nhồi pha tĩnh C. ˗ Tốc độ dòng: 1,5 - 2,0 ml/phút ˗ Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 325 nm ˗ Thể tích tiêm: 20 µl Cách tiến hành: Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của 6 lần tiêm lặp lại mẫu chuẩn (RSD) không được lớn hơn 2,0 %. Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Cách tính kết quả: Hàm lượng vitamin A trong mẫu thử (IU/g) được tính theo công thức: 6 HL(IU/g) = ST x C x 100 SC x mT Trong đó: ST và SC: diện tích của vitamin A trên sắc ký đồ của thử và chuẩn; mT: lượng cân mẫu thử (g); C: nồng độ dung dịch chuẩn đem tiêm sắc ký (IU/ml). 1.2. VITAMIN D3 1.2.1. Công thức cấu tạo và danh pháp [1], [14]. Hình 1.2: Công thức cấu tạo vitamin D3 Công thức phân tử: C27H44O. Trọng lượng phân tử: 384,64 Danh pháp: (5Z,7E)-9,10 secocholesta-5,7,10(19)-trien-3-ol. Theo DĐVN IV Cholecalciferol phải chứa từ 97,0% - 103,0% C27H44O. 1.2.2. Tính chất [1],[14] Tinh thể trắng hoặc gần như trắng, dễ biến đổi khi tiếp xúc với không khí, nhiệt độ và ánh sáng. Dễ tan trong cloroform, ethanol 96% và ether, tan trong dầu béo; thực tế không tan trong nước. Dung dịch trong các dung môi bay hơi không vững bền, nên dùng ngay. 1.2.3. Định tính 1.2.3.1. Phổ hồng ngoại [1] Phổ hồng ngoại của mẫu thử phải phù hợp với phổ hồng ngoại của cholecalciferol chuẩn.