Tài liệu Xây dựng quy trình định lượng đồng thời paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat trong viên sủi bọt bằng phương pháp hplc với đầu dò pda

. BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PARACETAMOL, DEXTROMETHORPHAN HYDROBROMID, LORATADIN, PHENYLEPHRIN BITARTRAT TRONG VIÊN SỦI BỌT BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VỚI ĐẦU DÒ PDA Mã số: Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Phan Thanh Dũng Tp. Hồ Chí Minh, 09/2018 . . BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PARACETAMOL, DEXTROMETHORPHAN HYDROBROMID, LORATADIN, PHENYLEPHRIN BITARTRAT TRONG VIÊN SỦI BỌT BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VỚI ĐẦU DÒ PDA Mã số: Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Tp. Hồ Chí Minh, 09/2018 . . DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA PGS.TS Võ Thị Bạch Huệ Ds.  Nguyễn Thị Như Ngọc . . MỤC LỤC CHƯƠNG I. MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC ............ 1 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI.................................................................................................... 1 TÓM TẮT NỘI DUNG ĐỀ TÀI ................................................................................ 1 CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 3 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU – HÓA CHẤT – TRANG THIẾT BỊ ................ 3 2.2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 4 2.2.1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA .............................................. 4 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................... 14 3.1. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PARACETAMOL, DEXTROMETHORPHAN HYDROBROMID, LORATADIN, PHENYLEPHRIN BITARTRAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI ĐẦU DÒ PDA ........................................................................... 14 3.1.1. Xử lý mẫu .............................................................................................. 14 3.1.2. Điều kiện sắc ký .................................................................................... 14 3.1.3. Thẩm định quy trình định lượng đồng thời paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA ............................................ 24 CHƯƠNG IV. BÀN LUẬN .................................................................................. 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................... 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO . . DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Chữ nguyên Nghĩa tiếng Việt ACN Acetonitril Acetonitril ASEAN Association of Southeast Asian Nations Hiệp hội các quốc gia Đông Nam Á BP The British Pharmacopoeia DĐVN DEX Dược điển Anh Dược điển Việt Nam Dextromethorphan hydrobromid Dextromethorphan hydrobromid EP The European Pharmacopoeia Dược điển châu Âu HPLC High-performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao LOR Loratadin Loratadin MeOH Methanol Methanol PAR Paracetamol Paracetamol PDA Photodiod Array Detector Đầu dò dãy diod quang PHE Phenylephrin bitartrat Phenylephrin bitartrat RP Reversed-phase Pha đảo RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối S SD Diện tích pic Standard Deviation TCNSX Độ lệch chuẩn Tiêu chuẩn nhà sản xuất TEA Triethylamin Triethylamin TFA Trifloroacetic acid Acid trifloroacetic THF Tetrahydrofuran Tetrahydrofuran TNHH Trách nhiệm hữu hạn USP United States Pharmacopeia Dược điển Mỹ UV-Vis Ultra Violet - Visible Tử ngoại – khả kiến . . i DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Hình 3.1. Biểu đồ hàm lượng các hoạt chất ở các thời gian siêu âm mẫu … .......... 15 Hình 3.2. Lựa chọn bước sóng phát hiện ................................................................. 16 Hình 3.3. Sắc ký đồ dung dịch thử ở các chương trình gradient khảo sát ............... 17 Hình 3.4. Sắc ký đồ dung dịch thử ở các chương trình gradient khảo sát (tiếp) ...... 18 Hình 3.5. Sắc ký đồ với pha động ACN - TEA 0,01% điều chỉnh pH 3,0/pH 2,/ pH 2,1 bằng TFA ........................................................................................................... 19 Hình 3.6. Sắc ký đồ với pha động ACN – dung dịch TFA pH 2,1 ......................... 20 Hình 3.7. Sắc ký đồ với pha động ACN – dung dịch acid phosphoric pH 2,1 ....... 20 Hình 3.8. Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn cột sắc ký ................................................... 22 Hình 3.9. Sắc ký đồ thẩm định tính đặc hiệu .......................................................... 24 Hình 3.10. Sắc ký đồ thẩm định tính đặc hiệu (tiếp) ............................................... 25 Hình 3.11. Phổ UV-Vis các pic tại thời gian lưu trong mẫu chuẩn và mẫu thử. ..... 26 Hình 3.12. Sắc ký đồ các mẫu thử ở điều kiện khắc nghiệt .................................... 26 Hình 3.13. Sắc ký đồ các mẫu thử ở điều kiện khắc nghiệt (tiếp)............................ 27 Hình 3.14. Sắc ký đồ các mẫu thử ở điều kiện khắc nghiệt (tiếp)............................ 28 Hình 3.15. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ ........... 32 . . DANH MỤC BẢNG BIỂU – SƠ ĐỒ Trang Bảng 2.1. Thành phần và công thức của viên sủi bọt nghiên cứu ............................. 3 Bảng 2.2. Thông tin các chất chuẩn ........................................................................... 4 Bảng 2.3. Danh mục các trang thiết bị sử dụng ......................................................... 4 Bảng 2.4. Các chương trình gradient khảo sát định lượng 4 hoạt chất ...................... 6 Bảng 2.5. Cách pha dãy chuẩn khảo sát tính tuyến tính quy trình định lượng ........ 11 Bảng 2.6. Cách chuẩn bị các mẫu tự tạo thẩm định độ đúng 4 hoạt chất ................. 12 Bảng 2.7. Chương trình gradient (-1%) của độ thô ................................................. 13 Bảng 2.8. Chương trình gradient (+1%) của độ thô ................................................ 13 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát lựa chọn dung môi pha mẫu ........................................ 14 Bảng 3.2. Hàm lượng các hoạt chất ở các thời gian siêu âm mẫu ............................ 14 Bảng 3.3. So sánh độ phân giải khi thay đổi pH dung dịch B ................................. 21 Bảng 3.4. So sánh hệ số bất đối As với dung dịch B là TFA pH 2,1 và TEA 0,01% chỉnh pH 2,1 bằng TFA ............................................................................................ 21 Bảng 3.5. So sánh cột Inersustain C8 và Inersustain C18 ....................................... 23 Bảng 3.6. Chương trình gradient tối ưu được lựa chọn ............................................ 23 Bảng 3.7. Kết quả tính thích hợp hệ thống quy trình định lượng ............................ 29 Bảng 3.8. Kết quả thẩm định độ lặp lại ................................................................... 30 Bảng 3.9. Kết quả thẩm định độ chính xác trung gian ............................................ 30 Bảng 3.10. Kết quả khảo sát diện tích pic các hoạt chất theo nồng độ ................... 31 Bảng 3.11. Kết quả thống kê hồi quy tuyến tính các hoạt chất ............................... 31 Bảng 3.12. Kết quả thẩm định độ đúng paracetamol ............................................... 32 Bảng 3.13. Kết quả thẩm định độ đúng phenylephrin bitartrat ............................... 33 Bảng 3.14. Kết quả thẩm định độ đúng dextromethorphan HBr ............................. 33 Bảng 3.15. Kết quả thẩm định độ đúng loratadin .................................................... 34 Bảng 3.16. Khoảng xác định của các hoạt chất ....................................................... 34 Bảng 3.17. Kết quả thẩm định độ thô - tốc độ dòng 0,9 ml/phút ............................ 35 Bảng 3.18. Kết quả thẩm định độ thô - tốc độ dòng 1,1 ml/phút ............................ 35 . . Bảng 3.19. Kết quả thẩm định độ thô - nhiệt độ cột 23 oC ...................................... 36 Bảng 3.20. Kết quả thẩm định độ thô - nhiệt độ cột 27 oC ...................................... 36 Bảng 3.21. Kết quả thẩm định độ thô - pH 2,0 ........................................................ 37 Bảng 3.22. Kết quả thẩm định độ thô - pH 2,2 ........................................................ 37 Bảng 3.23. Kết quả thẩm định độ thô - chương trình gradient (-1%) ...................... 38 Bảng 3.24. Kết quả thẩm định độ thô - chương trình gradient (+1%) ..................... 38 Bảng 3.25. Kết quả thẩm định độ thô - cột Inertsil C8 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm) ... 39 Bảng 3.26. Kết quả thẩm định độ thô - vị trí đặt lọ chứa mẫu trong hệ thống tiêm mẫu tự động .............................................................................................................. 39 Bảng 3.27. Kết quả thẩm định độ thô - độ ổn định của dung dịch phân tích .......... 40 . . CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC - Paracetamol (acetaminophen hay N - acetyl - p - aminophenol) là chất chuyển hóa có hoạt tính của phenacetin, là thuốc giảm đau - hạ sốt hữu hiệu. Tác động lên vùng dưới đồi gây hạ nhiệt, tỏa nhiệt tăng do giãn mạch và tăng lưu lượng máu ngoại biên. Khả năng ức chế enzym cyclo oxygenase yếu nên không có tác dụng kháng viêm. Dextromethorphan là thuốc giảm ho do tác dụng lên trung tâm ho ở hành não dùng để điều trị triệu chứng do do họng hoặc phế quản bị kích thích khi cảm lạnh thông thường hoặc hít phải chất kích thích. Phenylephrin là thuốc chủ vận chọn lọc 1 receptor, gây co mạch tăng huyết áp, có tác dụng kéo dài hơn Epinephrin do ít bị enzym COMT thủy phân làm giảm nghẹt mũi và chảy mũi do có tác dụng chống sung huyết mũi, giảm sưng của các mạch máu trong mũi. Loratadin làm giảm nhẹ triệu chứng của viêm mũi dị ứng và mày đay, chống ngứa, không có tác dụng an thần [3]. Sự kết hợp đồng thời paracetamol, dextromethorphan, loratadin, phenylephrin trong một chế phẩm không những làm nâng cao hiệu quả, giảm chi phí mà còn mang lại sự thuận tiện cho bệnh nhân trong quá trình điều trị và cho bác sỹ khi kê đơn. - Hiện nay, công ty TNHH HASAN - DERMAPHARM hiện đang nghiên cứu sản xuất viên sủi bọt chứa đồng thời paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat và chưa xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm này. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin và phenylephrin bitartrat trong viên sủi bọt bằng phương pháp HPLC”. Để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho chế phẩm này. . . MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Xây dựng quy trình định lượng đồng thời paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin và phenylephrin bitartrat trong viên sủi bọt bằng phương pháp HPLC. Tiến hành thăm dò các điều kiện phân tích như: - Lựa chọn pha động - pH pha động - Tỉ lệ pha động, thăm dò chương trình gradient hóa dung môi - Tốc độ dòng - Bước sóng phát hiện Đưa ra qui trình định lượng đồng thời paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin và phenylephrin bitartrat. TÓM TẮT NỘI DUNG ĐỀ TÀI - Xây dựng quy trình định lượng đồng thời paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin và phenylephrin bitartrat trong viên sủi bọt bằng phương pháp HPLC. Thăm dò qui trình tốt nhất để định lượng 4 hoạt chất trên. - Thẩm định qui trình phân tích để ứng dụng vào việc định lượng đồng thời paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin và phenylephrin bitartrat trong viên sủi bọt bằng phương pháp HPLC.       Tính đặc hiệu Tính tuyến tính Độ chính xác Độ đúng Khoảng xác định của phương pháp Độ thô . . CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU – HÓA CHẤT – TRANG THIẾT BỊ 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Sản phẩm nghiên cứu: Viên sủi bọt PARAHASAN MULTI SYMPTOMS Bảng 2.1. Thành phần và công thức của viên sủi bọt nghiên cứu Hàm lượng (mg/viên) STT Tên nguyên phụ liệu Tiêu chuẩn Dược chất 1 2 3 4 Paracetamol Dextromethorphan hydrobromid Phenylephrin bitartrat Loratadin Tá dược 5 Manitol 6 Acid citric khan 7 Natri hydrocarbonat khan 8 Natri carbonat khan 9 Povidon K30 10 Betacyclodextrin 11 Sucralose 12 Natri benzoat 13 PEG 6000 14 Natri docusat 15 Simethicon 16 Bột hương chanh 17 Ethanol tuyệt đối (*) Tổng cộng (*) Mất đi trong quá trình pha chế 500,0 15,0 11,7 5,0 EP 8 USP 38 USP 38 EP 8 330,0 950,0 810,0 270,0 30,0 140,0 12,0 80,0 20,0 1,2 5,1 20,0 280,0 3200,0 DĐVN IV BP 2016 DĐVN IV BP 2016 BP 2016 USP 38 USP 38 DĐVN IV BP 2016 USP 38 USP 38 TCNSX BP 2016 2.1.2. Dung môi, hóa chất, chất chuẩn - ACN, MeOH loại dùng cho HPLC (Baker). - TEA, TFA, acid formic, acid phosphoric, natri butansulfonat, acid nitric, amoniac, sắt (II) sulfat, hydrogen peroxyd, natri hydroxyd, acid hydrocloric, kali dihydrophosphat, dinatri hydrophosphat đạt tiêu chuẩn phân tích. . . Bảng 2.2. Thông tin các chất chuẩn Chất chuẩn Số kiểm soát Hàm lượng (%) Nguồn gốc Phenylephrin bitartrat F003M0 100,00 USP Paracetamol QT009 170916 99,68 Dextromethorphan HBr QT015 090616 95,80 Loratadin QT070 100916 99,90 Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh 4-aminophenol QT216 040916 99,80 2.1.3. Trang thiết bị Bảng 2.3. Danh mục các trang thiết bị sử dụng STT Tên thiết bị Nguồn gốc 1 Máy HPLC Hitachi Chromaster PAD-5430 (Phần mềm xử lý số liệu EZChrom Elite) Nhật 2 Cân phân tích Shimadzu AUW 120D (Max = 120 g; Min = 10 mg, e = 1 mg, d = 0,1 mg) Nhật 3 Bể siêu âm Elmasonic S 180 H Đức 4 Máy đo pH Eutech 510 5 Cân kỹ thuật Shimadzu BL 220 Nhật 6 Bếp cách thủy Memmert WNB14 Đức 7 Tủ sấy Memmert UNB400 Đức 8 Đèn tử ngoại Spectronics CM-10 USA 9 Bộ lọc hút chân không 10 Các dụng cụ thủy tinh đạt yêu cầu chính xác dùng trong phân tích Singapore 2.2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA 2.2.1.1. Điều kiện phân tích ban đầu  Xử lý mẫu Dung môi pha mẫu: Nước - acetonitril (85:15) Mẫu chuẩn: Cân chính xác 12,5 mg loratadin; 29,3 mg phenylephrin bitartrat; 37,5 mg dextromethorphan hydrobromid các chất chuẩn cho vào bình định mức 50 ml . . (bình 1) và định mức cho tới vạch bằng dung môi pha mẫu. Cân chính xác 25 mg paracetamol chuẩn cho vào bình định mức 50 ml (bình 2). Hút chính xác 1 ml dung dịch từ bình 1 cho vào bình 2 và định mức bằng dung môi pha mẫu cho tới vạch để thu được nồng độ các chuẩn paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat về nồng độ tương ứng 0,500 mg/ml; 0,015 mg/ml; 0,005 mg/ml; 0,012 mg/ml. Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí. Mẫu thử: Cân 20 viên, xác định khối lượng trung bình viên, nghiền thành bột mịn. Cân một lượng bột viên tương ứng với khối lượng trung bình viên cho vào bình định mức 100 ml, thêm từ từ một lượng khoảng 60 ml dung môi pha mẫu (tránh mẫu sủi mạnh trào ra khỏi bình định mức), chờ cho đến khi mẫu sủi hết, siêu âm trong khoảng 15 phút, để nguội, định mức cho đến vạch bằng dung môi pha mẫu. Lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu để có nồng độ paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat cuối cùng tương ứng khoảng 0,500 mg/ml; 0,015 mg/ml; 0,005 mg/ml; 0,012 mg/ml. Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí. Tiến hành sắc ký lần lượt mẫu thử và chuẩn theo điều kiện sắc ký khảo sát.  Điều kiện sắc ký Dựa vào cấu trúc hóa học của paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat đều là những chất phân cực có nối đôi liên hợp và có các nhóm mang màu nên có thể sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo với pha tĩnh kém phân cực, pha động phân cực và sử dụng đầu dò PDA để định lượng các hoạt chất này với điều kiện sắc ký ban đầu như sau: + Cột sắc ký: Inertsustain C8 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm) + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Thể tích tiêm: 20 μl + Nhiệt độ cột: 25 oC + Bước sóng phát hiện: lựa chọn bước sóng phát hiện được cả bốn chất và cho tín hiệu tốt nhất. + Pha động: o Dung môi A: Acetonitril . . o Dung dịch B: Dung dịch TEA 0,01% điều chỉnh pH 3,0 bằng TFA 2.2.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký + Bước sóng phát hiện Lựa chọn bước sóng phát hiện đồng thời cả bốn chất và cho tín hiệu tốt nhất. + Chương trình gradient Bảng 2.4. Các chương trình gradient khảo sát định lượng 4 hoạt chất Chương trình gradient Thời gian (phút) 0 2,0 6,0 6,1 11,0 11,1 13,0 13,1 15,0 0 7,0 7,1 12 12,1 20 0 3 7,0 7,1 13,0 13,1 15 0 12 15 20 1 2 3 4 Dung môi A (%) 15 70 55 60 60 0 0 15 15 5 55 40 60 5 5 10 10 55 60 60 10 10 5 55 5 5 + Thay đổi pH và thành phần dung dịch B Dung dịch TEA 0,01% điều chỉnh pH 2,5 bằng TFA Dung dịch TEA 0,01% điều chỉnh pH 2,1 bằng TFA Dung dịch TFA pH 2,1 Dung dịch acid phosphoric pH 2,1 + Cột sắc ký . Dung dịch B (%) 85 85 45 40 40 100 100 85 85 95 45 60 40 95 95 90 90 45 40 40 90 90 95 45 95 95 Tốc độ dòng (ml/phút) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 . Cột Inertsustain C8 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm) Cột Inertsustain C18 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm) Yêu cầu: Lựa chọn điều kiện sắc ký có các pic đạt các thông số sắc ký theo quy định. Đối với định lượng hỗn hợp đa thành phần, đặc biệt ưu tiên độ phân giải (RS 1,5), hệ số đối xứng (0,8 AS 1,5), độ tinh khiết pic. 2.2.1.3. Khảo sát quá trình xử lý mẫu Sử dụng điều kiện sắc ký xây dựng được để khảo sát quá trình xử lý mẫu: + Dung môi pha mẫu: khảo sát 4 dung môi pha mẫu sau: Nước Nước - ACN (90:10) Nước - ACN (85:15) Nước - ACN (80:20) Yêu cầu: Lựa chọn dung môi pha mẫu có thời gian siêu âm làm mẫu tan hết bằng cảm quan nhanh nhất. + Thời gian siêu âm mẫu: khảo sát các khoảng thời gian siêu âm mẫu sau: 10 phút, 15 phút, 20 phút Yêu cầu: Lựa chọn thời gian siêu âm mẫu có hàm lượng các hoạt chất khác nhau có ý nghĩa thống kê so với các khoảng thời gian khác. 2.2.1.4. Thẩm định quy trình định lượng Sau khi đã lựa chọn được điều kiện phân tích tối ưu, tiến hành thẩm định quy trình đã xây dựng được theo hướng dẫn của ASEAN 2008 [3], [9]: a. Tính đặc hiệu Chuẩn bị dung môi pha mẫu, mẫu giả dược (placebo), mẫu chuẩn riêng lẽ, mẫu chuẩn hỗn hợp, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn, các mẫu thử ở điều kiện khắc nghiệt: - Mẫu được oxy hoá bởi H2O2 3% trong 24 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung dịch H2O2 3%, chờ sủi bọt hết, siêu âm 20 phút, để nguội và định mức bằng dung dịch H2O2 3%,, lắc đều. Dung dịch thu được được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Lắc đều, lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vào bình . . định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu. Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí. - Mẫu thủy phân trong NaOH 0,5 N trong 48 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung dịch NaOH 0,5 N, chờ sủi bọt hết, siêu âm 20 phút, để nguội và định mức bằng dung dịch NaOH 0,5 N, lắc đều. Dung dịch thu được được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Lắc đều, lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu. Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí. - Mẫu thủy phân trong HCl 0,5 N trong 48 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung dịch HCl 0,5 N, chờ sủi bọt hết, siêu âm 20 phút, để nguội và định mức bằng dung dịch HCl 0,5 N, lắc đều. Dung dịch thu được được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Lắc đều, lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu. Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí. - Mẫu chiếu ánh sáng trực tiếp trong 48 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc, trải thành một lớp mỏng trong đĩa petri và để dưới ánh sáng mặt trời trong 48 giờ. Sau đó cho bột thuốc vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung môi pha mẫu, siêu âm 20 phút, để nguội và định mức bằng dung môi pha mẫu, lắc đều, lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu. Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí. - Mẫu chiếu tia UV trong vòng 24 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc, trải thành một lớp mỏng trong đĩa petri và để dưới đèn UV 254 nm trong 24 giờ. Sau đó cho bột thuốc vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung môi pha mẫu, siêu âm 20 phút, để nguội và định mức bằng dung môi pha mẫu, lắc đều, lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu. Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí. . . - Mẫu đặt ở nhiệt độ 60 oC trong 48 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc, trải thành một lớp mỏng trong đĩa petri và cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 60 oC 2 oC trong 48 giờ. Sau đó cho bột thuốc vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung môi pha mẫu, siêu âm 20 phút, để nguội và định mức bằng dung môi pha mẫu, lắc đều, lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu. Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí. - Mẫu đun cách thủy 60 oC trong 48 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung môi pha mẫu, chờ mẫu sủi bọt hết, siêu âm 25 phút, để nguội và định mức bằng dung môi pha mẫu, lắc đều. Dung dịch sau khi pha được đun cách thủy ở nhiệt độ 60 oC trong 48 giờ. Để nguội, lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu. Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí. Tiến hành sắc ký các loại mẫu theo quy trình phân tích. Ghi lại các sắc ký đồ. Xác định thời gian lưu, độ tinh khiết của pic, phổ UV của pic hoạt chất cần phân tích trong sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn. Yêu cầu - Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu placebo phải không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn. - Sắc ký đồ mẫu thử phải cho thời gian lưu tương tự với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn. Trên sắc ký đồ mẫu thử các pic hoạt chất cần phân tích tách hoàn toàn khỏi các pic khác. - Khi thêm một lượng chất chuẩn vào mẫu thử, chiều cao và diện tích pic phải tăng lên so với trước khi thêm chuẩn. - Trên sắc ký đồ mẫu thử ở các điều kiện khắc nghiệt, các pic tạp xuất hiện phải tách ra khỏi các pic của hoạt chất cần phân tích. - Pic của hoạt chất cần phân tích trong sắc ký đồ của các mẫu phải tinh khiết (độ tinh khiết pic xấp xỉ 100%). Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic chính trong mẫu thử giống phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic trong mẫu chuẩn. . 0. b. Tính thích hợp hệ thống Sử dụng dung dịch chuẩn có nồng độ 100% so với nồng độ định lượng trong dãy mẫu chuẩn khảo sát tính tuyến tính tiến hành sắc ký 6 lần, ghi lại các sắc ký đồ và xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic trung bình và các thông số khác của pic (độ phân giải RS, hệ số đối xứng AS, số đĩa lý thuyết N…) Yêu cầu: - Giá trị RSD của thời gian lưu và diện tích pic phải 2,0%. - Các pic phải đạt các thông số sắc ký khác (0,8 AS 1,5; RS 1,5, N 2000) c. Độ chính xác  Độ lặp lại Tiến hành chuẩn bị 6 mẫu thử ở nồng độ 100% so với nồng độ định lượng tương tự mục 2.2.1.1. Xác định hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu theo công thức: X (%/nhãn) = % Trong đó: Sc, St: Diện tích pic các pic trong mẫu chuẩn, mẫu thử. Dc, Dt: Độ pha loãng của mẫu chuẩn, mẫu thử. mc, mt: lượng cân của mẫu chuẩn, mẫu thử (mg) C%: hàm lượng % của chất chuẩn MW: khối lượng trung bình viên (mg) T: hàm lượng trên nhãn của hoạt chất trong một viên Độ lặp lại của phương pháp được xác định bằng giá trị RSD (%) kết quả định lượng hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu. Yêu cầu: - Giá trị RSD (%) kết quả định lượng hàm lượng hoạt chất có trong 6 mẫu 2,0%, nếu lơn hơn 2% cần phải có sự giải thích phù hợp.  Độ chính xác trung gian - Tiến hành tương tự như độ lặp lại nhưng do 02 kiểm nghiệm viên khác nhau thực hiện trên các ngày khác nhau. . 1. - Xác định giá trị trung bình và giá trị RSD (%) hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu do mỗi kiểm nghiệm viên phân tích và giữa hai kiểm nghiệm viên. - Xác định mức độ sai khác kết quả định lượng giữa 2 kiểm nghiệm viên. Yêu cầu: - Các kết quả thu được phải khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê (sử dụng F – test để đánh giá). RSD ≤ 2% và Ftn ≤ F0,05. d. Tính tuyến tính Dung dịch chuẩn gốc A: paracetamol 10 mg/ml Dung dịch chuẩn gốc B: hỗn hợp gồm dextromethorphan hydrobromid 1,5 mg/ml, phenylephrin bitartrat 1,17 mg/ml, loratadin 0,5 mg/ml. Từ các dung dịch gốc này pha loãng thành các dung dịch từ 40% đến 140% so với nồng độ định lượng theo bảng để thu được dãy giai mẫu chuẩn. Bảng 2.5. Cách pha dãy chuẩn khảo sát tính tuyến tính quy trình định lượng Dung dịch 40% 60% 80% 100% 120% 140% Dung dịch chuẩn gốc A (ml) 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 Dung dịch chuẩn gốc B (ml) 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Thêm dung môi pha mẫu (ml) Vừa đủ 50 ml Tiến hành sắc ký các mẫu, ghi lại các sắc ký đồ và xác định diện tích pic của các mẫu. Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, tính hệ số tương quan. Sử dụng trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy. Sử dụng trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy. Yêu cầu: Hệ số tương quan R ≥ 0,999 e. Độ đúng . 2. Bảng 2.6. Cách chuẩn bị các mẫu tự tạo thẩm định độ đúng 4 hoạt chất Mẫu tự tạo Khối lượng placebo (mg) Lượng cân chuẩn paracetamol (99,68%) (mg) 2668,5 2668,9 2668,3 2668,8 2668,5 2668,6 2668,1 2668,5 2668,5 351,0 351,0 351,0 501,4 501,4 501,4 651,6 650,6 651,6 70% 100% 130% Thể tích dung dịch chuẩn gốc B thêm vào (ml) 7,0 7,0 7,0 10,0 10,0 10,0 13,0 13,0 13,0 Khối lượng chuẩn thêm vào (mg) PAR PHE DEX LOR 349,9 349,9 349,9 499,7 499,7 499,7 649,5 648,5 649,5 8,1 8,1 8,1 11,6 11,6 11,6 15,1 15,1 15,1 10,5 10,5 10,5 15,0 15,0 15,0 19,5 19,5 19,5 3,5 3,5 3,5 5,0 5,0 5,0 6,5 6,5 6,5 Chuẩn bị 3 loại mẫu tự tạo trên trong bình định mức 100 ml, thêm chính xác một lượng chất chuẩn thích hợp vào các mẫu giả dược. Lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với 3 mức nồng độ 70%, 100% và 130% so với mức nồng độ định lượng trong quy trình và nằm trong khoảng tuyến tính của phương pháp. Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất 3 mẫu độc lập phân tích theo quy trình đã xây dựng. Mẫu chuẩn: sử dụng kết quả mẫu chuẩn của tính thích hợp hệ thống. Phân tích mẫu theo quy trình phân tích. Xác định độ đúng của phương pháp theo công thức: Tỷ lệ thu hồi (%) ượ ượ ạ ạ ấ ấ ồ ê à 100 Yêu cầu: - Độ đúng của phương pháp phải nằm trong khoảng 98,0% đến 102,0% và giá trị RSD 2,0%. f. Khoảng xác định Được đánh giá dựa trên sự tương quan của tính tuyến tính, giá trị độ chính xác và độ đúng của phương pháp. g. Độ thô - Độ ổn định của phương pháp phân tích Khi thay đổi các thông số liệt kê ở phần này, yêu cầu RSD của diện tích pic  2%. .