Tài liệu Xây dựng quy trình định lượng đồng thời metronidazol và spiramycin i trong huyết tương người bằng kỹ thuật lc ms ms

. BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METRONIDAZOL VÀ SPIRAMYCIN I TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Khoa Dược Chủ trì nhiệm vụ: Nguyễn Đức Tuấn Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 . . ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METRONIDAZOL VÀ SPIRAMYCIN I TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT LC-MS/MS (Đã chỉnh sửa theo kết luận của Hội đồng nghiệm thu ngày …………...) Cơ quan chủ quản (ký tên và đóng dấu) Chủ trì nhiệm vụ Nguyễn Đức Tuấn Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (ký tên và đóng dấu) . . MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...............................i DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................... iii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ .....................................................iv ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................... 3 1.1. Tổng quan về metronidazol....................................................................3 1.2. Tổng quan về spiramycin I.....................................................................5 1.3. Xử lý mẫu huyết tương ..........................................................................7 1.4. So sánh hướng dẫn thẩm định quy trình định lượng thuốc trong dịch sinh học của US-FDA và EMA ...........................................8 1.5. Một số công trình định lượng metronidazol và spiramycin I trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ........................... 10 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 14 2.1. Nguyên vật liệu – Đối tượng nghiên cứu .............................................. 14 2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 15 2.2.1. Chuẩn bị mẫu ..................................................................................... 15 2.2.2. Khảo sát điều kiện khối phổ ............................................................... 16 2.2.3. Khảo sát chuẩn nội ............................................................................. 16 2.2.4. Khảo sát điều kiện sắc ký ................................................................... 16 2.2.5. Khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương ........................................ 17 2.2.6. Thẩm định quy trình ........................................................................... 17 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - BÀN LUẬN ................................................... 23 3.1. Khảo sát điều kiện khối phổ .................................................................. 23 3.2. Khảo sát chuẩn nội ................................................................................ 24 3.3. Khảo sát điều kiện sắc ký ...................................................................... 25 3.4. Khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương ........................................... 33 3.5. Xác định khoảng nồng độ định lượng metronidazol và spiramycin I trong huyết tương người ...................... 35 3.6. Thẩm định quy trình .............................................................................. 35 3.7. Dự thảo quy trình .................................................................................. 43 3.8. Bàn luận................................................................................................. 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC . . Báo cáo tổng kết đề tài DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, Từ nguyên chữ viết tắt ACN Acetonitrile AUC Area under cover (Diện tích dưới đường cong) APCI Atmospheric pressure chemical ionization (Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển) AS Analytical Substance (Chất phân tích) CE Collision cell (Buồng va chạm) FAB Fast atom bombardment (Bắn phá nhanh nguyên tử) CI Chemical Ionization (Ion hóa hóa học) Cmax Nồng độ đỉnh CV Coefficient of variation (Hệ số phân tán) ECD Electron capture detection (Đầu dò cộng kết điện tử) ESI Electrospray Ionization (Ion hóa bằng cách phun điện) FDA Food and Drug Administration (Cơ quan Quản lý thuốc và Thực phẩm) FI Field Ionization (ion hóa trường) EMA European Medicines Agency (Cơ quan Quản lý thuốc Châu Âu) HQC High Quality Control (Mẫu kiểm tra nồng độ cao) HT Huyết tương IS Internal standard (Chuẩn nội) IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry (Hiệp hội Quốc tế về Hóa học thuần túy và ứng dụng) LC Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng) . i . Báo cáo tổng kết đề tài LC-MS/MS Liquid Chromatography - Mass Spectrometry/Mass Spectrometry (Sắc ký lỏng - Khối phổ/Khối phổ) LLE Liquid-liquid extraction (Chiết lỏng-lỏng) LLOQ Lower Limit of Quantification (Giới hạn định lượng dưới) LQC Low Quality Control (Mẫu kiểm tra nồng độ thấp) MIC Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) MQC Medium Quality Control (Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình) MS Mass Spectrometry (Khối phổ) MRM Multiple reacting monitoring (Kỹ thuật ghi phổ MRM) MeOH Methanol MF Matrix effect (Ảnh hưởng nền mẫu) MET Metronidazole ROX Roxithromycin PPT Protein precipitation (Tủa protein) CV Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) SIM Selected Ion Monitoring (Kỹ thuật ghi phổ SIM) SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn) SPE Solid phase extraction (Chiết pha rắn) SRM Selected Reaction Monitoring (Kỹ thuật ghi phổ SRM) SPY I Spiramycin I TB Trung bình TIN Tinidazole Tmax Thời gian đạt nồng độ đỉnh t1/2 Thời gian bán thải ULOQ Upper Limit of Quantification (Giới hạn định lượng trên) . ii . Báo cáo tổng kết đề tài DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Các thông số dược động học của thuốc đối chứng và thuốc thử Bảng 1.2. Các thông số dược động học của spiramycin Bảng 1.3. So sánh hướng dẫn US-FDA 2018 và EMA 2015 Bảng 1.4. Một số công trình định lượng metronidazol và spiramycin trong huyết tương người Bảng 2.1. Chất chuẩn đối chiếu và chuẩn nội được sử dụng trong nghiên cứu Bảng 2.2. Dung môi và hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu Bảng 2.3. Nồng độ lý thuyết các dung dịch chuẩn và dung dịch kiểm tra (QC) Bảng 3.1. Tóm tắt thông tin khảo sát nội chuẩn Bảng 3.2. So sánh tỷ lệ thu hồi với 2 dung môi tủa protein ở mức nồng độ MQC Bảng 3.3. Nồng độ lý thuyết của các thuốc trong huyết tương Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra tính phù hợp hệ thống (n = 6) Bảng 3.5. Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của MET và SPY I Bảng 3.6. Tương quan giữa nồng độ MET trong huyết tương và tỷ số diện tích pic MET/IS Bảng 3.7. Tương quan giữa nồng độ SPY I trong huyết tương và tỷ số diện tích pic SPY/IS Bảng 3.8. Hiệu suất chiết của MET, SPY I và ROX (n = 6) Bảng 3.9. Kết quả thẩm định độ đúng và độ chính xác của phương pháp Bảng 3.10. Độ ổn định của MET và SPY I (n = 6) Bảng 3.11. Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng của nền mẫu khi phân tích MET và SPY I Bảng 3.12. Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng của mẫu tồn dư MET, SPYI và ROX Bảng 3.13. Kết quả đánh giá độ pha loãng của MET, SPY I trong huyết tương . iii 4 6 8 10 14 14 15 25 35 35 36 37 38 38 39 39 40 41 41 42 . Báo cáo tổng kết đề tài DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của metronidazol Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của spiramycin Hình 3.1. Phổ khối của SPY I (A), MET (B), ROX (C) và TIN (D) Hình 3.2. Sắc ký đồ dung dịch MQC với hệ pha động acid formic 0,1% MeOH (43:57), cột Gemini NX-C18 (100 x 3 mm; 5 µm), nhiệt độ cột 40oC, thể tích tiêm mẫu 3 µl Hình 3.3. Sắc ký đồ dung dịch MQC với pha động 1 (A đến C) và pha động 2 (D). Hình 3.4. Sắc ký đồ dung dịch MQC với pha động 3 (A), 4 (B), 5 (C) và (D), 6 (E) và 7 (F) Hình 3.5. Sắc ký đồ dung dịch MQC với pha động có pH 2,5 (A), pH 5 (B), pH 7,5 (C) và pH 8,0 (D) Hình 3.6. Sắc ký đồ dung dịch MQC với các cột sắc ký khác nhau (nhiệt độ cột 40oC). (A) Cột Nucleosil C18 (150 x 4,6 mm; 3 µm). (B) Cột Nucleosil C8 (150 x 4,6 mm; 5 µm). (C) Cột Gemini NX-C18 (100 x 3,0 mm; 5 µm). (D) Cột Gemini C18 (100 x 4,6 mm; 3 µm). (E) Cột Zorbax C18 (250 x 4,6 mm; 3 µm). Hệ pha động ACN - amoni format 5 mM pH 7,4 (80:20). Thể tích tiêm mẫu 3 µl Hình 3.7. Sắc ký đồ dung dịch MQC với nhiệt độ cột khác nhau. (A) 30oC, (B) 35oC, (C) 40oC. Hệ pha động amoni format 5 mM pH 7,4 - ACN (20:80). Thể tích tiêm mẫu 3 µl Hình 3.8. Sắc ký đồ dung dịch MQC với tốc độ dòng khác nhau. (A) 0,3 ml/phút, (B) 0,4 ml/phút, (C) 0,5 ml/phút Hình 3.9. Sắc ký đồ dung dịch MET, SPY I và ROX ở nồng độ MQC Hình 3.10. Sắc ký đồ dung dịch MQC với các dung môi tủa protein khác nhau. (A) tủa bằng ACN, (B) tủa bằng MeOH Hình 3.11. Sắc ký đồ dung dịch MQC với các dung môi tủa protein khác nhau. (A) tủa bằng ACN trong dung dịch NaOH 0,01 N; (B) và (C) tủa bằng ACN trong dung dịch NaOH 0,1 N; (D) tủa bằng ACN trong dung dịch NaOH 1 N; (E) tủa bằng ACN trong dung dịch acid formic 1%; (F) tủa bằng MeOH trong dung dịch acid formic 1%. Hệ pha động amoni format 5 mM pH 7,4 ACN (20:80). Nhiệt độ cột 40oC. Thể tích tiêm mẫu 3 µl Hình 3.12. Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu huyết tương tự tạo chứa MET, ROX và SPY I Hình 3.14. Công thức cấu tạo của spiramycin I gồm có 3 phân tử đường . iv 3 5 24 25 26 27 28 30 31 32 33 33 34 36 36 49 . Báo cáo tổng kết đề tài ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay dạng thuốc phối hợp metronidazol và spiramycin với liều cố định được sử dụng phổ biến trong nha khoa để điều trị nhiễm khuẩn răng miệng cấp tính, mạn tính và dự phòng nhiễm khuẩn tại chỗ sau phẫu thuật nha khoa tại Việt Nam. Ngoài việc sử dụng các thuốc kháng viêm giảm đau trong điều trị nhiễm trùng răng miệng, kháng sinh cũng có vai trò quan trọng trong việc diệt vi khuẩn gây bệnh vùng răng miệng như nướu răng, lợi…Các vi khuẩn gây bệnh vùng răng miệng khá đa dạng, thường bao gồm cả hai loại kỵ khí và hiếu khí nên sự phối hợp kháng sinh để điều trị là cần thiết. Việc phối hợp metronidazol và spiramycin nhằm tăng tác dụng điều trị, mở rộng phổ kháng khuẩn, tạo nên tác dụng hiệp đồng ức chế một số chủng vi khuẩn nhạy cảm, giảm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 30 lần đối với metronidazol và giảm MIC 10 lần đối với spiramycin [1], cũng như giảm những tác dụng không mong muốn. Spiramycin là một kháng sinh thuộc nhóm macrolid được phân lập từ Streptomyces ambofaciensand, là một hỗn hợp tự nhiên gồm ba thành phần spiramycin I, II và III, trong đó hàm lượng spiramycin I trên 85%, spiramycin II và spiramycin III lần lượt không quá 5% và 10% [2],[3]. Spiramycin I có hoạt tính sinh học cao nhất trong số ba đồng phân trên [4]. Vì vậy, spiramycin I thường được chọn là chất đại diện để định lượng spiramycin [3],[5],[6]. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sắc ký lỏng để định lượng metronidazol trong dịch sinh học [3],[7],[8],[9],[10],[11],[12],[13],[14] và spiramycin I [3],[5],[6],[15]. Tuy nhiên, việc nghiên cứu định lượng đồng thời metronidazol và spiramycin I trong mẫu huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS chỉ có một công trình công bố cho đến thời điểm hiện tại [3]. Trong nước, vẫn chưa có công trình công bố về phương pháp định lượng đồng thời metronidazol và spiramycin I trong huyết tương người. . 1 . Báo cáo tổng kết đề tài Thị trường Việt Nam hiện nay đang lưu hành dạng bào chế phối hợp metronidazol và spiramycin với nhiều tên biệt dược khác nhau, được sản xuất trong nước với giá thành rẻ hơn so với các thuốc ngoại nhập cùng hàm lượng. Tuy nhiên, chế phẩm này chưa được đánh giá tương đương sinh học so với thuốc gốc. Để đảm bảo chất lượng thuốc sản xuất trong nước, các thuốc generic cần được chứng minh tính hiệu quả và an toàn trong điều trị qua thử nghiệm tương đương sinh học với thuốc gốc. Xuất phát từ những lý do trên, đề tài: “XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METRONIDAZOL VÀ SPIRAMYCIN I TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ (LC – MS/MS)” được thực hiện với các mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình định lượng đồng thời metronidazol và spiramycin I trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC – MS/MS. - Thẩm định quy trình định lượng đồng thời metronidazol và spiramycin I trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC – MS/MS theo hướng dẫn của USFDA và EMA. . 2 . Báo cáo tổng kết đề tài CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về metronidazol (MET) 1.1.1 Danh pháp, cấu trúc - Cấu trúc hóa học: Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của metronidazol - Danh pháp IUPAC: (Metronidazol là 2-(2-methyl-5-nitro-1H-imidazol-1yl)-ethanol [16]. - Công thức phân tử: C6H9N3O3 [16]. - Khối lượng phân tử: 171,2 g/mol [16]. 1.1.2. Tính chất lý hóa - Metronidazol là bột kết tinh màu trắng hoặc hơi vàng hoặc gần như trắng, dễ hút ẩm [16]. - Tính chất: khó tan trong nước, aceton, ethanol 96% và methylen clorid [16]. - pKa = 2,5 [12]. - Điểm chảy: 159 - 162oC [17]. 1.1.3. Cơ chế tác dụng và dược động học 1.1.3.1. Cơ chế tác dụng Metronidazol là một dẫn chất 5-nitro imidazol, có phổ hoạt tính rộng trên động vật nguyên sinh như amip, Giardia, Entamoeba histolytica, Trichomonas vaginalis và trên vi khuẩn kỵ khí. Trong ký sinh trùng, nhóm 5nitro của thuốc bị khử thành các chất trung gian độc với tế bào. Các chất này liên kết với cấu trúc xoắn của phân tử DNA làm vỡ các sợi này và cuối cùng làm tế bào chết. Nồng độ trung bình có hiệu quả của metronidazol là 8 µg/ml . 3 . Báo cáo tổng kết đề tài hoặc thấp hơn đối với hầu hết các động vật nguyên sinh và các vi khuẩn nhạy cảm. Nồng độ ức chế tối thiểu các chủng nhạy cảm khoảng 0,5 µg/ml [18]. Metronidazol có tác dụng diệt khuẩn trên Bacteroides, Fusobacterium và các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc khác, nhưng không có tác dụng trên vi khuẩn hiếu khí. Khi bị nhiễm cả vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí, phải phối hợp metronidazol với các thuốc kháng khuẩn khác [18]. 1.1.3.2. Dược động học Metronidazol thường hấp thu nhanh và hoàn toàn sau khi uống. Khoảng 80% liều được hấp thu từ đường tiêu hóa, đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương (Cmax) khoảng 11,5 – 13,0 µg/ml trong vòng 1-3 giờ sau khi uống liều đơn 500 mg. Khoảng 10 - 20% thuốc liên kết với protein huyết tương. Metronidazol thâm nhập tốt vào các mô và dịch cơ thể, vào nước bọt và sữa mẹ. Nồng độ điều trị cũng đạt được trong dịch não tủy. Metronidazol chuyển hóa ở gan thành các chất chuyển hóa dạng hydroxy và acid, và thải trừ qua nước tiểu một phần dưới dạng glucuronid [18]. Thời gian bán thải trung bình trong huyết tương khoảng 7 giờ, đối với chất chuyển hóa hydroxy là 9,5 - 19,2 giờ. Sự bài tiết chủ yếu qua thận, chủ yếu là các chất chuyển hóa hydroxy và khoảng 14% liều dùng thải trừ qua phân [18]. Các thông số dược động học của metronidazol, thuốc đối chứng Flagyl® 250 mg và thuốc thử Amin 250 mg [7] được trình bày trong bảng 1.1. Bảng 1.1. Các thông số dược động học của thuốc đối chứng và thuốc thử Thử (TB ± SD) Đối chứng (TB ± SD) Cmax (µg/ml) 9,99 ± 1,34 10,61 ± 1,43 Tmax (giờ) 2,17 ± 0,91 2,17 ± 0,86 t1/2(giờ) 9,15 ± 1,84 9,10 ± 0,64 Nồng độ đỉnh của metronidazol và spiramycin sau 2 giờ uống thuốc phối hợp metronidazol và spiramycin (viên nén Rodogyl® và viên nghiên cứu chứa spiramycin 769.000 UI và metronidazol 128 mg trên người tình nguyện) lần lượt là 13,5 µg/ml và 1,06 µg/ml [1]. . 4 . Báo cáo tổng kết đề tài Trên bệnh nhân viêm nha chu, sau 2 giờ uống viên nén Rodogyl® chứa spiramycin 739.000 UI và metronidazol 127,4 mg; nồng độ đỉnh của metronidazol và spiramycin lần lượt là 11,8 µg/ml và 1,8 µg/ml [1]. 1.2. Tổng quan về spiramycin I (SPY I) 1.2.1. Danh pháp, cấu trúc Cấu trúc hóa học: Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của spiramycin Thành phần R Công thức phân tử Phân tử lượng Spiramycin I H C43H74N2O14 843,1 Spiramycin II COCH3 C45H76N2O15 885,1 Spiramycin III CO-CH2-CH3 C46H78N2O15 899,1 Danh pháp IUPAC: Spiramycin là một kháng sinh nhóm macrolid được tạo ra khi nuôi cấy các chủng vi khuẩn Streptomyces ambofaciens hoặc thu được bằng các phương pháp khác. Thành phần chính là (4R,5S,6S,7R,9R,10R, 11E,13E,16R)-6-[[3,6-dideoxy-4-O-(2,6-dideoxy-3-C-methyl--L-ribohexopyranosyl)-3-(dimethylamino)--D-glucopyranosyl]oxy]-4-hydroxy-5methoxy-9,16-dimethyl-7-(2-oxoethyl)-10-[[2,3,4,6-tetradeoxy-4(dimethylamino)-D-erythro-hexopyranosyl]oxy]-oxacy-clohexadeca-11,13dien-2-on (spiramycin I). Ngoài ra còn có spiramycin II (4-O-acetyl spiramycin I) và spiramycin III (4-O-propanoyl spiramycin I) [16]. 1.2.2. Tính chất lý hóa Spiramycin có dạng bột màu trắng hoặc hơi ngà vàng, hút ẩm nhẹ, khó tan trong nước, dễ tan trong aceton, trong ethanol 96% và trong MeOH [16]. pKa = 7,9 [19]. . 5 . Báo cáo tổng kết đề tài 1.2.3. Cơ chế tác dụng và dược dộng học 1.2.3.1. Cơ chế tác dụng Spiramycin là kháng sinh nhóm macrolid. Thuốc có tác dụng kìm khuẩn trên vi khuẩn đang phân chia tế bào. Cơ chế tác dụng của thuốc là tác dụng trên các tiểu đơn vị 50S của ribosom vi khuẩn và ngăn cản vi khuẩn tổng hợp protein. Ở những nơi có mức kháng thuốc rất thấp, spiramycin có tác dụng kháng các chủng vi khuẩn Gram dương, các chủng Coccus như Staphylococcus, Pneumococcus, Meningococcus, phần lớn chủng Gonococcus, 75% chủng Streptococcus và Enterococcus. Các chủng Bordetella pertussis, Corynebacteria, Chlamydia, Actinomyces, một số chủng Mycoplasma và Toxoplasma cũng nhạy cảm với spiramycin. Spiramycin không có tác dụng với các vi khuẩn đường ruột Gram âm [18]. 1.2.3.2. Dược động học Spiramycin được hấp thu không hoàn toàn ở đường tiêu hóa. Thuốc uống được hấp thu khoảng 20 - 50% liều sử dụng. Nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt được trong vòng 2 - 4 giờ sau khi uống và có thể duy trì được 4 đến 6 giờ. Nồng độ đỉnh trong huyết tương sau khi uống liều 6 triệu đơn vị spiramycin đạt được tương ứng là 3,3 µg/ml sau 1,5 – 3 giờ. Thức ăn làm giảm khoảng 70% nồng độ tối đa của thuốc trong huyết thanh và làm cho thời gian đạt đỉnh chậm 2 giờ. Spiramycin phân bố rộng khắp cơ thể. Nửa đời thải trừ trung bình là 5 - 8 giờ. Thuốc thải trừ chủ yếu ở mật [18]. Các thông số dược động học của spiramycin được thống kê trên 10 người tình nguyện sau khi uống thuốc thử spiramycin 1,5 g (6 viên Rovanmycin 750000 IU của Rhone-Poulenc Rorer) [20] được trình bày trong bảng 1.2. Bảng 1.2. Các thông số dược động học của spiramycin Thông số Cmax (µg/ml) Tmax (giờ) t1/2(giờ) Thử (TB ± SD) 2,403 ± 1,004 2,726± 1,234 6,238 ± 2,811 . 6 . Báo cáo tổng kết đề tài 1.3. Xử lý mẫu huyết tương 1.3.1. Một số phương pháp xử lý mẫu huyết tương Xử lý mẫu là kỹ thuật làm sạch mẫu trước khi phân tích nhằm loại trừ các chất gây nhiễu hay loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu. Các phương pháp xử lý huyết tương bao gồm phương pháp tủa protein (PP), chiết lỏng - lỏng (LLE) và chiết pha rắn (SPE). Muốn lựa chọn phương pháp thích hợp để xử lý mẫu huyết tương cần biết tính chất lý hóa và tính phân cực của chất phân tích. Ngoài ra, tỷ lệ thu hồi của phương pháp phải phù hợp và có độ lặp lại [21]. 1.3.2. Phương pháp kết tủa protein (PPT) Đây là phương pháp chuẩn bị mẫu chung, đơn giản để làm sạch mẫu và cắt đứt liên kết của thuốc với protein. Tủa protein với các tác nhân khác nhau (dung môi hữu cơ, acid mạnh, muối). Tính tan của protein phụ thuộc vào tương tác với dung dịch nước, tương tác ion với muối, lực đẩy tĩnh điện giữa các phân tử mang điện. Tại điểm đẳng điện, protein không mang điện, protein ít tan trong nước; trên điểm đẳng điện, protein tích điện âm; dưới điểm đẳng điện, protein tích điện dương. PPT là phương pháp nhanh, đơn giản hơn so với phương pháp chiết lỏng - lỏng (LLE) và chiết pha rắn (SPE) [21],[22]. Tủa protein bằng các dung môi hữu cơ như ACN, MeOH, ethanol,... ACN là dung môi được lựa chọn đầu tiên để tủa protein do có khả năng tủa hoàn toàn protein với tỷ lệ dung môi thấp. MeOH được chọn làm dung môi tủa sau ACN. Tủa bằng các muối vô cơ như kẽm sulfat 10%, amoni sulfat bão hòa,…các dung dịch acid như acid tricloroacetic 10% (kl/tt), acid phosphoric 5%... Sau khi ly tâm, dịch ly tâm được lọc, tiêm trực tiếp vào hệ thống sắc ký hay bốc hơi và hòa tan lại trong pha động trước khi tiêm [21],[22]. 1.3.3. Phương pháp chiết lỏng - lỏng (LLE) Chiết lỏng – lỏng là phương pháp dựa trên sự phân bố của chất hòa tan trong hai dung môi không hỗn hòa vào nhau. Sự phân bố của các chất phụ thuộc vào độ tan của chúng trong các dung môi khác nhau. Phương pháp chiết lỏng . 7 . Báo cáo tổng kết đề tài – lỏng sử dụng trong phân tích dịch sinh học giúp tách các chất phân tích ra khỏi những chất gây nhiễu có trong nền mẫu sinh học. Chất phân tích được tách ra khỏi mẫu bằng các dung môi hữu cơ sẽ được bay hơi dung môi, cắn được hòa tan trong thể tích dung môi thích hợp (có thể là pha động). Phương pháp cho khả năng thu hồi tốt nhờ chiết liên tục nhiều lần [21]. 1.3.4. Phương pháp chiết pha rắn (SPE) Chiết pha rắn là phương pháp xử lý mẫu được sử dụng rộng rãi nhất trong việc phân tích các thuốc và các chất chuyển hóa trong dịch sinh học. SPE thường dùng những ống nhựa nhỏ sử dụng một lần, có chứa chất rắn được nhồi. Có nhiều dạng chất rắn như: chất liên kết pha đảo, pha thuận, trao đổi ion và chất hấp phụ. Sự hấp phụ dựa trên tương tác giữa chất phân tích và chất hấp phụ. Chất phân tích sẽ được rửa giải khỏi cột trong khi các tạp chất được giữ lại trên cột, hoặc chất phân tích được giữ lại trên cột còn tạp chất bị rửa ra khỏi cột. Cách thứ nhất được lựa chọn khi có một chất phân tích mong muốn có nồng độ cao trong mẫu, hoặc nhiều chất cần phân tích quan tâm có nồng độ thấp hoặc có nhiều chất với độ phân cực khác nhau cần được tách ra khỏi hỗn hợp. Cách thứ hai dùng để làm giàu mẫu trong phân tích vết, nồng độ mẫu thấp. Đối với những nền mẫu phức tạp có thể sử dụng cả hai phương pháp để tách nhiều chất khác nhau. Ưu điểm của phương pháp chiết pha rắn là lượng dung môi hữu cơ sử dụng ít hơn so với chiết lỏng - lỏng. Phương pháp có độ thu hồi và độ lặp tốt, có thể tự động hóa, tuy nhiên khá đắt tiền và tốn kém [21]. 1.4. So sánh hướng dẫn thẩm định quy trình định lượng thuốc trong dịch sinh học của US-FDA và EMA Bảng 1.3. So sánh hướng dẫn US-FDA 2018 và EMA 2015 Stt 1 2 3 Chỉ tiêu thẩm định Tính phù hợp hệ thống Tính đặc hiệu/Độ chọn lọc Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) . 8 US-FDA + + + EMA + + + . Báo cáo tổng kết đề tài Stt Chỉ tiêu thẩm định 4 Đường chuẩn – Khoảng tuyến tính 5 Mẫu kiểm tra (QC) 6 Độ đúng – Độ chính xác trong ngày và giữa các ngày ( LLOQ, LQC, MQC, HQC) 7 Hiệu suất chiết (LQC, MQC, HQC) 8 Độ ổn định (LQC và HQC) 9 Ảnh hưởng nền mẫu 10 Ảnh hưởng mẫu tồn dư (Sample Carryover) 11 Độ pha loãng Hướng dẫn US-FDA năm 2018 [23] US-FDA + EMA + + + + + + - + Bảo đảm phương pháp phân tích không ảnh hưởng của nền mẫu, đạt yêu cầu về tính đặc hiệu và độ nhạy. Đường chuẩn trong dịch sinh học được so sánh với đường chuẩn trong dung môi pha mẫu. + + Tỷ số diện tích pic của chất phân tích trong nền mẫu đã được xử lý với diện tích pic của chất phân tích trong dung môi pha mẫu + + + Xây dựng phương pháp phân tích trong dịch sinh học bao gồm tối ưu hóa các quy trình và điều kiện liên quan đến việc xử lý mẫu và phát hiện các chất phân tích. Các thông số tối ưu trong phân tích dịch sinh học: chất chuẩn, thuốc thử, đường chuẩn, mẫu kiểm tra (QC), tính chọn lọc và độ đặc hiệu, độ nhạy, độ đúng, độ chính xác, tỷ lệ thu hồi, độ ổn định của chất phân tích trong nền mẫu. Những điểm cần lưu ý trong hướng dẫn: - Chất chuẩn và thuốc thử phải được mô tả và lưu hồ sơ về định tính, độ tinh khiết và độ ổn định. Các chất chuẩn đối chiếu có chứng nhận phân tích (CoA) bao gồm nguồn gốc, số lô và hạn sử dụng. - Hiệu suất chiết không đòi hỏi 100% mà phải ổn định và có tính lặp lại. . 9 . Báo cáo tổng kết đề tài - Độ nhạy là điểm thấp nhất của đường chuẩn (LLOQ), đáp ứng của chất phân tích tại LLOQ có tín hiệu ít nhất gấp 5 lần đáp ứng tín hiệu của mẫu nền. - Nếu phương pháp có định lượng mẫu được pha loãng, phải xem xét tính toàn vẹn của các dung dịch pha loãng trong quá trình thẩm định bằng cách pha loãng mẫu kiểm tra (QC) có nồng độ cao hơn giới hạn định lượng trên (ULOQ) trong khoảng nồng độ định lượng. Các mẫu QC pha loãng phải đạt độ đúng và độ chính xác trong giới hạn cho phép. - Ảnh hưởng của nền mẫu không có hướng dẫn chỉ tiêu cụ thể, nhưng bảo đảm phương pháp phân tích không bị ảnh hưởng của nền mẫu, đạt yêu cầu về tính đặc hiệu và độ nhạy. - Lượng mẫu tồn dư (nếu có) phải được đánh giá. Hướng dẫn EMA năm 2015 [24] So sánh với quy định của US-FDA, quy định EMA 2015 có vài điểm khác biệt như sau: - Trong phương pháp sắc ký với đầu dò khối phổ phải thẩm định chỉ tiêu ảnh hưởng nền mẫu. - Không đề cập đến hiệu suất chiết của phương pháp. 1.5. Một số công trình định lượng metronidazol và spiramycin I trong huyết tương người bằng kỹ thuật sắc ký lỏng Bảng 1.4. Một số công trình định lượng metronidazol và spiramycin trong huyết tương người Hoạt chất MET và SPY I Kỹ thuật LCMS/MS Điều kiện sắc ký Cột sắc ký Pha động Phương pháp xử lý mẫu 500 µl HT + 50 µl chuẩn nội + 50 µl NaOH 0,1 N + 1 ml đệm pH 9 + 6 ml ethyl acetat - Lắc xoáy, sau đó ly tâm trong 5 phút với tốc độ 3500 vòng/phút ở 4 oC - Dịch ly tâm được bay hơi dung môi bằng dòng khí nitơ ở 40oC - Cắn được hòa tan vào 600 µl ACN + 3,4 ml dung dịch acid formic 0,1% và tiến hành sắc ký . 10 Kromsil C18 (150 × 4,6 mm; 5 µm) - A: acid formic 0,1% với ACNnước (15:85, tt/tt); - B: acid formic 0,1% với ACN-nước (50:50, tt/tt) - Rửa giải gradient Chuẩn nội (IS) Ordinazol TLTK [3] Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. Báo cáo tổng kết đề tài MET HPLC-UV 320 nm MET HPLC-UV MET LCMS/MS MET HPLC-UV (324 nm) MET và 5 kháng sinh khác LCMS/MS SPY I HPLC-UV (229 nm) MET và omepraz ol HPLC-UV (254 nm) MET, ceftriaxo n LC MS/MS SPY I, II, III HPLC-MS (TOF) Tủa protein với 500 μL MeOH, lắc Eclipse XDBxoáy 10 phút, ly tâm 3500 vòng/phút phenyl ở 4 oC (250 x 4,6 mm; 5 μm) Symmetryshies Tủa protein với 25 μL MeOH có chứa RP18 acid percloric 2% (150 x 4,5 mm; 5 μm) - 250 µl HT + 50 µl chuẩn nội, lắc xoáy 30 giây - Thêm 3 ml ethyl acetat, lắc xoáy 60 C18 giây - Ly tâm trong 10 phút với tốc độ (150 x 4,6 mm; 3500 vòng/phút, bay hơi dung môi 5 µm) bằng dòng khí N2 ở 40 oC - Hòa tan cắn trong 300 µl pha động và tiến hành sắc ký Bondapal phenyl Tủa protein với 50 µl ZnSO4 10% (300 x 4,6 mm; 5 µm) - 200 µl IS + 45 µl HT + 5 µl dimethyl sulfoxid, lắc xoáy 15 phút - Ly tâm trong 10 phút với tốc độ 15600 vòng/phút ở 4 oC Aquasil C18 - Lọc qua màng lọc 0,22 µm và tiến (50 x 2,1 mm; hành sắc ký (IS: dicloxacillin 1,0 5 µm) mg/ml, pha trong dimethyl sulfoxid, hút 0,3 ml pha loãng thành 100 ml trong ACN) Merck RP18 Chiết pha rắn, cột Sep Pak C18 (125 x 4 mm; 5 µm) Omni Pax 500 (chứa 2 pha Chiết pha rắn, cột SPE C2, 500 mg tĩnh: trao đổi anion và pha đảo) - 50 µl HT + 200 µl IS, lắc xoáy 3 phút - Ly tâm trong 10 phút với tốc độ 4000 vòng/phút ở 4 oC Polaris C18 - Hút 100 µl dịch lọc + 400 µl MeOH (150 x 3,0 mm; 20%, lắc xoáy 3 phút 5 µm) - Lọc qua màng lọc 0,22 µm và tiến hành sắc ký (IS: cefuroxim 1,25 µg/ml, pha trong ACN) - 500 µl HT + 100 µl chuẩn nội (ROX) + 100 µl NaOH 0,1 M; lắc xoáy 30 giây - Thêm 3 ml hỗn hợp cloroform-ethyl acetat (1:2), lắc xoáy 3 phút, ly tâm Chromatorex trong 3 phút với tốc độ 3000 ODS (150 x vòng/phút ở 4 oC 4,6 mm; 5 µm) - Dịch ly tâm được bay hơi dung môi bằng cách thủy ở 30oC - Cắn được hòa tan vào 200 µl ACN và tiến hành sắc ký . 11 Đệm phosphat pH 4,5 - ACN (95:5, tt/tt) Carbamazepin [7] Natri acetat 0,05 M pH 4 - ACN (85:15, tt/tt) Tinidazol [11] ACN – amoni acetat 10 mM (80:20, tt/tt) Zidovudin [12] ACN – KH2PO4 0,1 M pH 4,5 (5:95, tt/tt) Ranitidin [8] - A: acid formic 0,1% - B: acid formic 0,1% với MeOH - Rửa giải gradient Dicloxacillin [13] ACN NaH2PO4 0,15 M (23:77) Spiramycin II [5] MeOH – ACN NaHPO4 0,1 M (20:20:60) pH 7 Acid salicylic [14] A: amoni acetat 10 mM pH 2,5 với ACN - B: acid formic 0,1% với ACN - Rửa giải gradient Cefuroxim [10] (Amoni acetat 0,1% + acid acetic 0,15% ) ACN (60:40) Roxithromycin [15] Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. Báo cáo tổng kết đề tài Nhận xét - Các công trình nghiên cứu đã ứng dụng kỹ thuật HPLC-UV hoặc LC-MS/MS. Sử dụng kỹ thuật HPLC phù hợp với điều kiện có sẵn tại phòng kiểm nghiệm và tính chất của chất cần phân tích. Ưu điểm của phương pháp LC-MS/MS là giới hạn phát hiện thấp nên được áp dụng để định lượng các chất có hàm lượng thấp trong nền mẫu phức tạp. Hơn nữa, kỹ thuật LC-MS/MS có thể định tính nhanh chóng, dựa trên cơ sở dữ liệu phổ có sẵn, độ đặc hiệu cao do tính phân mảnh riêng, định lượng đồng thời các chất có thời gian lưu giống nhau, thời gian phân tích nhanh, giảm tiêu tốn dung môi. - Các nghiên cứu trên đã áp dụng nhiều phương pháp xử lý mẫu huyết tương như phương pháp kết tủa protein (PPT) dùng tác nhân gây tủa protein như ACN. Sử dụng dung môi phù hợp với tính tan của spiramycin và metronidazol nhưng gây tủa protein. Đây là cách đơn giản và hiệu quả để loại bỏ protein. Phương pháp tủa protein đơn giản, thao tác nhanh chóng, ít độc hại môi trường, ít hao tốn dung môi, ít tốn thời gian, nhưng mẫu sau xử lý bị pha loãng nhiều, ít tinh khiết hơn, không thích hợp với hoạt chất có nồng độ thấp trong huyết tương với dung môi hữu cơ ACN, MeOH hoặc MeOH trong acid percloric 2% hoặc sử dụng muối kẽm sulfat 10%; phương pháp chiết lỏng - lỏng (LLE) được sử dụng khá phổ biến để tách các hoạt chất với kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện. Để chiết metronidazol và spiramycin trong mẫu huyết tương, sử dụng các dung môi như ethyl acetat, cloroform… mẫu được kiềm hóa bằng NaOH 2 N, sau đó được chiết với dicloromethan hoặc kết hợp các dung môi này theo một tỷ lệ thích hợp, Mẫu sau khi chiết tương đối sạch, nồng độ mẫu được tăng lên làm tăng tín hiệu các chất, thích hợp với hoạt chất có nồng độ trong huyết tương thấp. Tuy nhiên tốn nhiều dung môi; phương pháp chiết pha rắn SPE để chiết hoạt chất trong huyết tương người với cột chiết pha rắn SPE C18 và C2. . 12 Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. Báo cáo tổng kết đề tài - Cột sắc ký được sử dụng là cột pha đảo C18 và phenyl với các kích thước khác nhau và cỡ hạt 5 µm, thích hợp cho phân tích metronidazol và spiramycin bằng phương pháp HPLC hoặc LC ghép nối đầu dò MS/MS. - Pha động bao gồm các dung môi phân cực phù hợp với sắc ký pha đảo như MeOH, ACN, nước có thể có thêm acid formic 0,1%, amoni acetat, đệm acetat, … giúp tăng khả năng tách và phù hợp với thiết bị HPLC hoặc LCMS/MS. -Tinidazol, roxitromycin, ordinazol …được dùng làm chuẩn nội vì có cấu trúc hóa học gần giống với chất khảo sát (metronidazol và spiramycin), cùng nhóm, bền vững. Trong cùng điều kiện sắc ký, chuẩn nội tách khỏi chất phân tích, thời gian lưu gần với chất phân tích, ổn định, không tương tác với chất phân tích khi phân tích bằng khối phổ chuẩn nội có độ tinh khiết cao và dễ kiếm. . 13