Tài liệu Xây dựng quy trình định lượng đồng thời calophyllolid và curcumin i trong dầu mù u – nghệ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

. BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CALOPHYLLOLID VÀ CURCUMIN I TRONG DẦU MÙ U – NGHỆ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Mã số: Chủ nhiệm đề tài: TS.DS NUYỄN HỮU LẠC THỦY Tp. Hồ Chí Minh, 04/2019 . . BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CALOPHYLLOLID VÀ CURCUMIN I TRONG DẦU MÙ U – NGHỆ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Mã số: Chủ nhiệm đề tài NGUYỄN HỮU LẠC THỦY Tp. Hồ Chí Minh, 04/2019 . . DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI 1. TS. DS NGUYỄN HỮU LẠC THỦY 2. PGS.TS VÕ THỊ BẠCH HUỆ 3. ThS.DS NGUYỄN HOÀNG THẢO MY . . MỤC LỤC MỤC LỤC ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT................................................................................ iv DANH MỤC HÌNH ẢNH ...................................................................................... v DANH MỤC BẢNG ............................................................................................. vi CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................. 1 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 2.1. TỔNG QUAN VỀ MÙ U ............................................................................. 3 2.2. TỔNG QUAN VỀ NGHỆ VÀNG ................................................................ 9 2.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ DẦU MÙ U – NGHỆ ............................. 11 Sơ lược về Dầu Mù u – Nghệ.................................................................... 11 Các nghiên cứu về tiêu chuẩn kiểm nghiệm Dầu Mù u – Nghệ ................. 12 Phương pháp định lượng hoạt chất trong Dầu Mù u – Nghệ...................... 12 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................ 14 3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .................................................................... 14 3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 15 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời calophyllolid và curcumin I trong chế phẩm dầu Mù u – Nghệ ..................................................................................... 15 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 17 4.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CURCUMIN I VÀ CALOPHYLLOLID TRONG CHẾ PHẨM DẦU MÙ U – NGHỆ.................... 17 Khảo sát điều kiện chiết calophyllolid và curcumin I từ Dầu Mù u – Nghệ17 Khảo sát các điều kiện sắc ký ................................................................... 18 Thẩm định quy trình phân tích .................................................................. 24 Các chỉ tiêu kiểm nghiệm của Dầu Mù u – NghệError! Bookmark not defined. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ .......................................................... 31 5.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CALOPHYLLOLID, CURCUMIN TRONG DẦU MÙ U - NGHỆ .................................................... 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 34 . . DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT . ACN Acetonitril C Nồng độ CĐC Chất đối chiếu DCM Dicloromethan dd Dung dịch DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV MeOH Methanol EtOH Ethanol H Chiều cao pic HL Hàm lượng HPLC High Performance Liquid Chromatography M Khối lượng MHA Mueller – Hinton Agar N Số đĩa lý thuyết PA Purity angel PDA Photodiode array PT Purity threshold ppm Parts per million - Phần triệu RS Độ phân giải S Diện tích pic SKC Sắc ký cột SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng TLC Thin layer chromatography tR Thời gian lưu TSA Tryptic Soy Agar UV Ultraviolet - Tử ngoại . Danh mục hình ảnh DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1. Công thức khai triển của Calophyllolid ........................................................ 8 Hình 2.2. Phản ứng mở vòng lacton của Calophyllolid ................................................ 8 Hình 4.1. Kết quả khảo sát dung môi hòa tan mẫu dầu Mù u – Nghệ bằng HPLC ..... 17 Hình 4.2. SKĐ mẫu chuẩn trước và sau khi xử lý qua SPE ....................................... 18 Hình 4.3. Kết quả khảo sát pha động trên mẫu dầu Mù u – Nghệ .............................. 19 Hình 4.4. Các SKĐ khảo sát các chương trình dung môi với kỹ thuật gradient .......... 20 Hình 4.5. Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu trong quy trình định lượng đồng thời curcumin và calophyllolid trong Dầu Mù u – Nghệ bằng HPLC ................................ 25 Hình 4.6. Đường biểu diễn tương quan nồng độ và diện tích pic curcumin I ............. 26 Hình 4.7. Đường biểu diễn tương quan nồng độ và diện tích pic calophyllolid .......... 27 . .i Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1: Tỷ lệ phục hồi của mẫu chuẩn trước và sau khi qua SPE ........................... 18 Bảng 4.2: Kết quả khảo sát thành phần pha động mẫu Dầu Mù u – Nghệ .................. 19 Bảng 4.3: Các hệ gradient khảo sát trên mẫu dầu Mù u – Nghệ ................................. 20 Bảng 4.4: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của mẫu đối chiếu curcumin ........ 22 Bảng 4.5: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của mẫu thử chứa curcumin......... 22 Bảng 4.6: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của mẫu đối chiếu calophyllolid .. 23 Bảng 4.7: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của mẫu thử chứa calophyllolid ... 23 Bảng 4.8: Kết quả thẩm định tính tuyến tính mẫu đối chiếu curcumin I..................... 26 Bảng 4.9: Kết quả thẩm định tính tuyến tính mẫu đối chiếu calophyllolid ................. 26 Bảng 4.10: Biện luận kết quả trắc nghiệm phương trình hồi quy tuyến tính ............... 27 Bảng 4.11: Kết quả khảo sát độ lặp lại quy trình định lượng đồng thời curcumin, calophyllolid trong Dầu Mù u – Nghệ bằng phương pháp HPLC (n = 6).................... 28 Bảng 4.12: Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian quy trình định lượng đồng thời curcumin, calophyllolid trong Dầu Mù u – Nghệ bằng phương pháp HPLC............... 28 Bảng 4.13: Kết quả khảo sát độ đúng của pic curcumin I .......................................... 29 Bảng 4.14: Kết quả khảo sát độ đúng của pic calophyllolid ....................................... 29 Bảng 4.15: Kết quả thẩm định quy trình định lượng đồng thời calophyllolid và curcumin I bằng phương pháp HPLC ........................................................................................ 30 Bảng 4.16: TCCS của dầu Mù u - Nghệ ...................... Error! Bookmark not defined. . . CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ - Dầu Mù u, nguyên liệu được ép từ quả của cây Mù u (Calophyllum inophyllum Linn., Balsamaria inophyllum Lour.), thuộc họ Bứa (Guttiferae, Cluciasceae). Từ năm 1918, các nhà khoa học Pháp đã bắt đầu nghiên cứu tác dụng tại chỗ đối với da và khả năng làm lành da của dược liệu. Khoa học hiện đại cũng đã có nhiều công trình chứng minh các tác dụng dược lý của dầu này như tính kháng viêm, kháng khuẩn [34], [39], trị sẹo [34],[68] chữa bỏng [24] và mau lành vết thương [52], [60]. Y học không ngừng phát triển, các sản phẩm điều trị vết thương ngoài da càng được cải tiến, nguyên liệu dầu Mù u vẫn là vị thuốc thu hút sự quan tâm của các nhà Dược học trong và ngoài nước đối với các sản phẩm này [6], [7], [22], [46]. - Từ những nghiên cứu cơ bản về thành phần đến các nghiên cứu ứng dụng qua các dòng sản phẩm tiêu dùng từ dầu Mù u như: chế phẩm dầu dùng ngoài, tinh dầu, xà bông, kem dưỡng hay băng gạc; dầu Mù u ngày càng được phân tích sâu hơn về thành phần tác dụng lẫn đa dạng hóa chế phẩm để khai thác tác dụng điều trị dược liệu này. - Tại Việt Nam hiện nay, các sản phẩm dùng trên da nói chung cũng như trong điều trị nói riêng đi từ dầu Mù u đã xuất hiện nhiều trên thị trường, tuy nhiên sản phẩm từ dầu Mù u được quản lý chất lượng bằng tiêu chuẩn kiểm nghiệm còn rất hạn chế. Đặc biệt là các tiêu chuẩn có chỉ tiêu định lượng sử dụng chất đối chiếu calophyllolid – một chất maker đã được chiết xuất và định danh trong thành phần dầu Mù u [48], [51], [60]. - Mặt khác, các sản phẩm có sự kết hợp của dầu Mù u và Nghệ vàng nhằm hỗ trợ tác dụng để tăng tác dụng mau liền sẹo, tiêu viêm, nuôi dưỡng và tái tạo da được xem là một bước đột phá trong việc phối hợp tác dụng tương hỗ của hai loại dược liệu cũng như đa dạng hóa các sản phẩm từ dầu Mù u. Chế phẩm Dầu Mù u kết hợp với Nghệ (hay gọi tắt là Dầu Mù u – Nghệ) là hướng nghiên cứu kế thừa từ những dữ liệu khoa học đã được chứng minh về tác dụng tương hỗ của Dầu Mù u và Nghệ vàng, cũng như ứng dụng các công nghệ bào chế hiện đại tạo ra sản phẩm mới. Chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng quy trình định lượng calophylloid và curcumin I trong dầu Mù u – Nghệ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” nhằm góp phần trong công tác tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu này. . . Tổng quan tài liệu CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TỔNG QUAN VỀ MÙ U Sơ lược về cây Mù u Tên khoa học: Calophyllum inophyllum Linn. (Balsamaria inophyllum Lour.), thuộc chi Calophyllum là một trong những chi lớn nhất của họ Bứa (Guttiferae, Cluciasceae). Tên gọi khác: Hồ đồng, Kungtung, Khchyong (Campuchia),YaraboTetihabocu (Nhật Bản), Alexandrian Laurel (Pháp), Dilo (Fiji), Kamanu (Hawail)... [1], [3], [10]. Mù u phân bố rộng rãi từ Thái Lan, Malaysia đến Lào, Campuchia, Indonesia và một số đảo ở Nam Thái Bình Dương cũng như một số tỉnh ở miền Nam của Trung Quốc, đặc biệt là rất nhiều ở Ấn Độ. Mù u là cây thân mộc, có thể cao đến 20 – 25 m, đường kính trung bình 30 – 35 cm. Lá mọc đối, phía lá hơi cuống lại, đầu lá hơi tù, phiến lá dài 10 – 17 cm, gân rất nhỏ, chạy song song và nổi rõ ở hai mặt lá. Hoa khá to, thơm, có màu trắng , mọc thành xim hay kẽ lá ở đầu cành và chính là đặc điểm nổi bật phân biệt Mù u với các loại cây thân mộc khác [5]. Tại Việt Nam, dược liệu dân gian này được phân bố chủ yếu ở các vùng núi thấp của miền Bắc, miền Trung và đặc biệt là khu vực Tây Nam Bộ. Khu vực miền Tây Nam Bộ với một số tỉnh điển hình như: Tiền Giang, Long An, … thường gặp cây Mù u dọc theo các bờ kênh rạch cao hoặc vùng cát ven bờ biển [5], [16]. Tổng quan về Dầu Mù u Theo chuyên luận Mù u của DĐVN V; dầu Mù u (Oleum calophylii inophylii) được định nghĩa là dầu ép từ hạt của cây Mù u đã được tinh chế loại bỏ phần “nhựa” với thể chất dầu lỏng, sánh, màu vàng tới vàng sậm, mùi thơm hắc đặc trưng [28]. Các nghiên cứu trong nước về việc ly trích Dầu Mù u từ hạt với các phương pháp khác nhau sẽ cho hàm lượng hoạt chất và thành phần hóa học có sự khác biệt. Năm 2016, Nguyễn Hữu Hiếu và các cộng sự tại khoa Kỹ thuật Hóa học – trường Đại học Bách Khoa TP.HCM đã tối ưu hóa quá trình bằng kỹ thuật lưu chất siêu tới hạn (SCF – CO2) và phân tích thành phần trên hệ thống GC – MS so sánh với phương pháp ép cơ học và chiết với ether dầu hỏa [9]. Trước đó, xét trên quy mô công nghiệp, luận án của Đinh Văn Trạch (2013) đã đi sâu vào phương pháp ép lạnh cơ học với hệ thống cô thu . . Tổng quan tài liệu hồi dung môi nhằm nâng cao hiệu suất chiết và xác định một số thành phần bằng kỹ thuật GC – MS và HPLC [29]. Nghiên cứu được công bố vào tháng 8/2017 của Malaysia đã dùng kỹ thuật chiết siêu âm (Ultrasonic – assisted extraction, gọi tắt là UAE) và dùng mô hình Patricelli để đánh giá động học của quá trình chiết xuất và tối ưu hóa quy trình [54]. 2.1.2.1 Thành phần hóa học Từ năm 1985, các nghiên cứu về Mù u tại Khoa Dược – Đại học Y Dược TP.HCM của PGS.TS. Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ cho thấy hạt Mù u chứa 41- 51 % dầu thô, trong đó hàm lượng dầu béo và chất nhựa trong dầu thô lần lượt là 71,5 % và 28,5 %. Các nghiên cứu tiếp nối tại Khoa Dược năm 2009 cũng xác định rõ hơn các thành phần bằng kỹ thuật GC-FID [18], [23]. Hoạt chất chính trong hạt Mù u thuộc nhóm 4-phenyl courmarin; hàm lượng courmarin được xác định trong dầu Mù u thô là 0,77 %; trong Dầu Mù u tinh chế là 0,5 %; trong nhựa dư phẩm là 0,15% và trong bã của phương pháp ép lạnh để chiết xuất dầu là 1,75 – 2,13 %. Các dẫn xuất courmarin quan trọng được biết đến bao gồm: calophyllolid (C25H22O5), inophyllolid (C25H22O5), acid calophyllolid (C25H24O6), acid inophyllolid (C17H22O3)… [17], [18], [20]. Theo dữ liệu về chuyên mục Mù u trong “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam (2007)” cũng như chuyên đề về dầu Mù u (Tamanu oil) của nhóm tác giả A.C.Dweck về thành phần hóa học trong các loại dầu Mù u thuộc khu vực Châu Á và châu Phi cho thấy Tocopherol và Tocotrienol được xem là những chất chống oxi hóa tự nhiên tạo nên sự ổn định của dầu. Trong Calophyllum inophyllum L. thì thành phần chính là DTocotrienol (236,0 mg/kg), sau đó là C-Tocotrienol với hàm lượng khá cao (64130mg/kg) [5], [32]. 2.1.2.2 Tác dụng dược lý Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm Các thực nghiệm của nhóm nghiên cứu tại Đại học Paris Descartes (Pháp) cuối năm 2015 cho thấy nhóm hoạt chất phenyl courmarin cho hoạt tính kháng khuẩn điển hình nhất, kể cả trên vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis. Hoạt tính kháng khuẩn của dầu Mù u thể hiện mạnh trên vi khuẩn gram dương và khá yếu trên vi khuẩn gram . . Tổng quan tài liệu âm. Dầu Mù u có hoạt tính kháng khuẩn rõ trên chủng Staphylococcus aureus và Bacteroides fragilis do tác dụng ức chế trực tiếp sự phân bào. Các phân đoạn của quy trình cho thấy tác động của dầu Mù u tương tự như ofloxacin và được khuyến nghị sử dụng trong điều trị các bệnh ngoài da gây bởi nhóm vi khuẩn gram dương [52]. Các nghiên cứu tại Khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM những năm 2000 cũng cho thấy hiệu quả diệt khuẩn tốt trên dòng vi khuẩn gram dương và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cả dầu Mù u thô và tinh chế. Kết quả cho thấy dầu Mù u thô cho hiệu quả ức chế gấp đôi so với dầu đã qua tinh chế hay trong thành phẩm [2]. Trong nhóm courmarin, calophyllolid có tác dụng ức chế toàn bộ sự tăng trưởng của Mycobacterium tubeculosis H37RV khi pha loãng ở nồng độ 1/20000 không có huyết thanh, và nồng độ 1/7500 với sự hiện diện của 5% huyết thanh. Acid calophyllic có hoạt tính kém hơn với việc kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn ở nồng độ 1/7500 khi không có huyết thanh và 1/1000 khi có 5 % huyết thanh [16], [38]. Các xanthon phân lập được từ Mù u cho thấy hoạt tính kháng khuẩn trên nhiều chủng vi sinh vật khác nhau trong đó có Staphylococcus aureus theo thứ tự giảm dần là 6-deoxyjacareubin, jacareubin và calophyllin B. 1,5-dihydoxyxanthon có tác dụng kháng Bacillus subtilis, Mycobacterium smegmatis, ức chế sự phát triển của Cladosporium cucumerum với MIC là 0,25 (µg/ml) và 200 (µg/ml) với Staphylococcus aureus. Hoạt chất này cũng thể hiện tác dụng kháng nấm trên Aspergillus fumigatus. Tác dụng mạnh trên các vi nấm được biết đến là 1,3,5 – trihydroxy – 2- methoxyxanthon với tác dụng ức chế cả Aspergillus fumigatus và Candida albicans [45], [50]. Hoạt tính kháng viêm Các nghiên cứu mới tại Bangladesh vào năm 2017 cho thấy dịch chiết ethanol từ lá Mù u chứa các flavonoid tương tự như trong thành phần Dầu Mù u cho tác động kháng viêm, giảm đau rõ do cơ chế tác động trên cyclooxygenase làm giảm việc tiết prostaglandins gây đau. Tác dụng giảm đau và kháng viêm được so sánh với chất đối chiếu Diclofenac [34]. Năm 2014, Muhamad Bin Zakaria và các cộng sự tại trường đại học quốc gia Malaysia đã tiến hành nghiên cứu hoạt tính kháng viêm của dầu Mù u thô cho việc chiết xuất dầu Mù u thô ở nồng độ 50µg/ml sẻ ức chế 77% cyclooxygenase và 88% lipooxygenase cho thấy tác dụng kháng viêm tiềm năng của dầu [39]. . . Tổng quan tài liệu Trước đây, các thử nghiệm trên thỏ cho thấy Dầu Mù u có tác dụng làm mau lành vết thương. Gây vết thương bằng cách cắt bỏ miếng da ở đầu thỏ, hàng ngày bôi Dầu Mù u lên vết thương, theo dõi đo đường kính vết thương và thực hiện các xét nghiệm vi khuẩn và giải phẫu bệnh lý [33]. Hoạt tính kháng virus Quả và dịch chiết từ lá Calophyllum inophyllum đã phân lập được hai courmarin có hoạt tính chống lại sự phiên mã ngược của virus HIV là (+) – Inophyllum B và (+) – Inophyllum P [60]. Thử nghiệm in vitro của các xanthon phân lập được từ rễ cũng cho hoạt tính kháng virus với hoạt chất có giá trị nổi bật là caloxanthon với việc chữa trị nhiễm coronavirus [37], [44]. Nhóm nghiên cứu phối hợp của Singapore và Trung Quốc đầu năm 2017 cho thấy lá của Mù u là bộ phận chính chứa hoạt chất amentoflavon là một nhân tố tiềm năng trong kháng virus lẫn hoạt tính chống oxi hóa, kháng viêm, kháng khối u và tác động trên hệ thần kinh trung ương lẫn tim mạch. Amentoflavone thể hiện khả năng chống lại bệnh sốt xuất huyết bằng cách ức chế RNA polymerase. Amentoflavone đã được chứng minh là chất chủ động ức chế coronavirus hô hấp cấp tính nghiêm trọng (SARS-CoA) với IC50 là 8,3 μM. Hiệu quả được kết luận tương ứng với sự ức chế protease giống chymotrypsin. Hơn nữa, trong trường hợp suy giảm miễn dịch ở người, virus (HIV) và virus đồng hợp hô hấp (RSV), Amentoflavone có kết quả tốt với IC50 lần lượt là 119 μM và 5,5 μg / mL [68]. Hoạt tính bảo vệ chống tia UV Dầu Mù u có đặc tính hấp thụ tia UV đáng kể hay các tác nhân quang học. Shanmugapriya và các cộng sự (2016) đã làm rõ hoạt tính này cũng như các giá trị của Mù u về phương diện kháng khuẩn, kháng ung thư, chống lão hóa hay trị đái tháo đường. Dữ liệu của nghiên cứu cho thấy nồng độ dầu ở mức 1/10000 (v/v) có tác dụng trên tế bào nhằm chống lại việc gây tổn thương DNA của tia cực tím. Nồng độ dầu ở mức 1% không có tác dụng gây hại trên tế bào biểu mô người nên thường được sử dụng ngoài da như tác nhân chống nắng [60]. Các hợp chất tự nhiên trong dầu điển hình cho hoạt tính này là các flavonoid và polyphenol với khả năng hấp thụ bức xạ cao nhất là khu vực UV–C đến UV–B và cuối cùng là UV–A [64]. . . Tổng quan tài liệu 2.1.2.3 Công dụng trị liệu - Các thử nghiệm lâm sàng cho thấy Dầu Mù u ép từ hạt già có tác dụng tốt để trị ghẻ và thuốc mỡ bào chế từ Dầu Mù u có tác dụng trị bỏng, mụn nhọt, lở loét. Tác dụng này đã được áp dụng điều trị 350 ca lộ tuyến và lộ tuyến viêm tử cung và đạt kết quả lành tính 92 % [10]. - Dân gian dùng dầu mù u xoa bóp chữa tê thấp, bôi trị mụn trứng cá, trĩ. Dầu Mù u bôi ngoài da làm tan các chỗ sưng tấy, mụn nhọt hay vết loét nhiễm trùng, chữa đau họng, làm lành sẹo, nhất là để trị bỏng [14], [32]. - Ngoài ra dầu Mù u còn giúp dưỡng da, chống nắng, giữ ẩm cho da, đặc biệt còn có tác dụng trị vết thâm, thẹo, vẩy nến cực kỳ hiệu quả [14]. 2.1.2.4 Các sản phẩm từ Dầu Mù u Trong nước Một số chế phẩm với nguyên liệu từ dầu Mù u được biết đến như: “Dầu Mù u” của công ty cổ phần dược Minh Hải, thuốc mỡ “Trăn Mù u” của công ty cổ phần dược phẩm Quang Minh, chế phẩm “Dầu Mù u Inopilo” của công ty trách nhiệm hữu hạn thương mại và sản xuất dược phẩm Bình Minh, chế phẩm “Dầu Mù u SP” của công ty dược phẩm Phương Nam … với mức TCCS gần tương đương tiêu chuẩn DĐVN V. Dạng chế phẩm khác với tác dụng trị viêm loét hay nấm da được biết đến phổ biến như dạng kem (Balsino) hay thuốc mỡ (Mecalin) [19]. Hướng nghiên cứu của PGS.TS.Võ Thị Bạch Huệ đã mở rộng trên một số dạng bào chế ứng dụng khác từ dầu Mù u như xà bông, gạc tẩm, gel, dạng dầu phối hợp dược liệu… cũng đã được nghiên cứu thực nghiệm và tiêu chuẩn hóa [8], [13], [25]. Ngoài nước Một số chế phẩm từ Dầu Mù u được lưu hành ở Pháp như Inocalo huile (dạng ống, thuốc mỡ hoặc thuốc trứng) có tác dụng mau làm lành sẹo, tái sinh mô, viêm da hay bỏng; ngoài ra Inocalo có iod phối hợp hỗ trợ trong việc phòng phong thấp. Dạng phối hợp giữa Calophyllum inophyllum với morphin bazơ trong viên nén 1mg, thuốc đạn 3mg hay thuốc ống 5 ml nhằm chữa các rối loạn về thần kinh hay triệu chứng ho lâu ngày. Ngoài ra, các dòng sản phẩm dưỡng da như lotion, kem, sữa rửa mặt hay xà bông… từ dầu Mù u của Hoa Kỳ cũng đem lại hiệu quả sử dụng rõ rệt. . Tổng quan tài liệu . Tổng quan về Calophyllolid trong Dầu Mù u Calophyllolid là những tinh thể hình trụ, không màu, dễ tan trong aceton, n – hexan, benzen, ether ethylic hay alcol… Nhiệt độ nóng chảy: 158 – 159 oC, không có tính quang hoạt. Các nghiên cứu trong và ngoài nước dựa trên phổ UV, phổ NMR, phổ tia X đã xác định được công thức khai triển của calophyllolid [30], [51]. Tính chất hóa học Calophyllolid thuộc nhóm courmarin nên những phản ứng đặc trưng cho nhóm chức được biết đến bao gồm: phản ứng mở vòng lacton, phản ứng diazo hóa, phản ứng phát huỳn quang, phản ứng FeCl3 hay phản ứng vi thăng hoa. Với phản ứng mở vòng lacton, calophyllolid trong môi trường kiềm cho acid calophyllolid và khi đun nóng sẽ lacton hoá trở lại cho dạng ester vòng. Hình 2.1. Công thức khai triển của Calophyllolid Hình 2.2. Phản ứng mở vòng lacton của Calophyllolid Chiết xuất calophyllolid Calophyllolid thuộc nhóm coumarin là những chất phân cực yếu nên đa số tan trong ether dầu và ether ethylic. Nhiều trường hợp có thể thu được tinh thể coumarin ngay trong dung dịch ether hoặc dung môi ether dầu. Do sự có mặt của nhóm lacton, một số coumarin tan được trong kiềm nóng, dịch kiềm khi acid hoá sẽ thu lại courmarin. Các glycosid coumarin có thể chiết bằng dung dịch cồn loãng (EtOH, Methanol 6080%). Dược liệu có nhiều chất béo nên sơ bộ loại chất béo bằng ether dầu. Dịch chiết cồn đã loại chất béo có thể kết tinh coumarin ngay sau khi bốc hơi dung môi [30]. Năm 2002, Trần Thanh Thạo và nhóm nghiên cứu đã áp dụng phương pháp của Spath và Socias dựa vào sự đóng mở vòng lacton để chiết xuất calophyllolid. Nghiên cứu sử dụng NaHCO3 làm tác nhân mở vòng rồi acid hóa lại bằng HCl 10% và chiết với benzen để thu cắn courmarin. Sau đó, sử dụng sắc ký cột để phân lập hoạt . . Tổng quan tài liệu chất.[30]. Đối với các dẫn chất coumarin có nhiều nhóm OH hoặc các coumarin glycosid thì khó tan trong dung môi hữu cơ, hơn nữa các phenol coumarin dễ bị oxy hoá bởi không khí trong môi trường kiềm, các acyl coumarin cũng dễ bị cắt nhóm acyl trong môi trường kiềm nên phương pháp Spath bị hạn chế. Trong trường hợp này nên chiết bằng dung môi kém phân cực rồi tăng dần độ phân cực. Bốc hơi từng dung môi, kiểm tra sự có mặt của coumarin rồi tách biệt từng dẫn chất coumarin bằng sắc kí cột. Năm 2003, Chen và các cộng sự đã chiết từ dầu với EtOH rồi phân bố trong EtOAc và dùng sắc ký cột lẫn sắc ký lớp mỏng điều chế để phân lập [67]. Năm 2009, Leu và cộng sự đã phân lập calophyllolid từ nhựa trung tính và nhựa acid thu được khi tinh chế dầu thô ép từ hạt của Calophyllum inophyllum ở vùng Polynesia (Pháp) [63]. 2.2. TỔNG QUAN VỀ NGHỆ VÀNG Sơ lược về Nghệ vàng Nghệ vàng (hay gọi là nghệ) với phần sử dụng thông dụng là rễ con (Uất kim) hay thân rễ (Khương hoàng) với tên khoa học là Curcuma longa thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) [3], [5]. Nghệ là loài thân cỏ cao từ 0,6 – 1 m, thân rễ phát triển thành củ hình trụ hơi dẹt, khi cắt ngang có màu vàng sẫm. Lá nghệ có hình trái xoan, thon nhọn ở hai đầu và hai mặt nhẵn. Cụm hoa mọc lên từ phần nách lá, lá bắc hữu thụ hình máng rộng, đầu tròn màu xanh lục nhạt còn lá bắc bất thụ hẹp hơn, màu tím nhạt. Quả nang ba ngăn, hạt có áo hạt [3]. Nghệ không chỉ được trồng như một gia vị hàng ngày mà còn là một vị thuốc quý dân gian. Tổng quan về củ Nghệ vàng 2.2.2.1 Thành phần hóa học Theo Ishita Chattopadhyay (2004), tinh dầu (5,8%) thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn theo hơi nước gồm có: α-phellandren (1,00%), sabinene (0,6%), cineol (1,00%), borneol (0,5%), zingiberene (25%) và sesquiterpines (53%) [62]. Curcuminoid là các hợp chất tạo nên màu vàng cho củ Nghệ. Cùng với tinh dầu, các hợp chất curcuminoid tạo nên vị cay và mùi đặc trưng cho củ Nghệ. . 0. Tổng quan tài liệu 2.2.2.2 Dược tính của Nghệ Năm 1910, curcumin đã được trích ly và xác định cấu trúc hoá học bởi Lampe nhưng mãi đến năm 1790 người ta mới bắt đầu nghiên cứu chuyên sâu về dược tính của curcumin. Củ Nghệ được biết đến với nhiều công dụng như giúp chống lão hóa da, ngăn ngừa sự hình thành các nếp nhăn, vết nám. Nghệ còn hỗ trợ chống viêm, loét do ức chế các chất trung gian gây viêm như cyclooxygenase (COX - 2), lipooxy-genase (LOX)… hay chống xơ vữa động mạch do cholesterol và giúp tăng độ bền mao mạch ngoại vi [12], [59]. Các tác dụng điển hình bao gồm: Tác dụng chống oxy hóa Do cơ chế khử các gốc tự do, giúp phòng các bệnh tim mạch, chống lão hoá tương tụ như vitamin E, C, betacaroten. Cucurmin có khả năng chống oxy hóa mạnh (mạnh gấp 300 lần vitamin E), giúp cơ thể tiêu diệt các gốc tự do, giảm nám, mờ vết tàn nhang, giảm các trường hợp dị ứng ở da, bảo vệ hồng cầu, hàn gắn vết thương trong và ngoài cơ thể, và loại bỏ độc tố có trong thực phẩm nếu dùng mỗi ngày [40]. Tác dụng chống viêm dạ dày Do làm tăng bài tiết chất nhớt mucin, giúp bảo vệ niêm mạc dạ dày [56], [66]. Tác dụng kháng viêm Do ức chế enzym lypooxygenase và cyclooxygenase, giúp ngăn cản tiến trình phóng thích các chất gây viêm (prostaglandin, thromboxan…) tương đương với cortisone, phenybutaron… Curcumin được xem như một trong những chất kháng viêm tối ưu và không phản ứng phụ trong chữa trị các chứng viêm khớp [58], [59]. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm Hoạt chất từ củ nghệ có tác dụng tốt trên vi khuẩn gram dương như Staphylococcus aureus hay vi khuẩn gram âm như Samonella typhi. Hoạt tính kháng nấm cũng được chứng minh trên các chủng tiêu biểu như Trychophyton gypcum, Candida albicans, nhất là Aspergillus parasiticus thường phóng tích Aflatoxin - tác nhân gây nhiễm độc gan thường xảy ra khi dung thực phẩm đóng hộp [42], [53]. Tác dụng phòng chống HIV Năm 1994, Hội thảo về HIV/AIDS tại San Francisco (Mỹ) đã báo cáo về kết quả điều trị của curcumin trên 18 bệnh nhân bị nhiễm HIV. Cho các bệnh nhân được cho . 1. Tổng quan tài liệu uống curcumin với liều lượng 2000mg mỗi ngày trong vòng 127 ngày. Trước và sau khi điều trị người ta đo lượng thực bào T bao gồm CD-4 (T-suppressor) và ghi nhận được kết quả: CD-4 tăng từ 5 lên 615 tế bào /ml máu và CD-8 tăng từ 283 lên 1467 tế bào/ml máu. Các nhà nghiên cứu cho rằng curcumin có khả năng tăng cường hệ thống miến dịch do tác động ức chế trên enzim HIV- type 1 entegrase cũng như khả năng ức chế sự phóng thích các cytokine - tác nhân tham gia qua trình gây nhiễm HIV [53], [57]. Tổng quan về hoạt chất curcumin trong Nghệ Curcumin là thành phần quan trọng của củ nghệ không chỉ trong việc tạo màu sắc mà còn bởi các hoạt tính sinh học như: kháng viêm, kháng khuẩn, chống oxi hóa, mau lành vết thương và chống co thắt. Ở Mỹ, curcumin được sử dụng như một chất tạo màu trong phô mai, mù tạt, ngũ cốc hay kem và các loại yaourt bởi các đặc tính tốt của dược liệu này [36], [43], [58]. Năm 1815, cấu trúc hóa học của curcumin (C21H20O6) lần đầu tiên được Volger và Pelletier phân lập sơ bộ và chiếm 2-5 % trong nghệ. Sau đó, năm 1910, cấu trúc hóa học của curcumin được Milobedzka và cộng sựxác định là một polyphenol kỵ nước và là một hỗn hợp gồm 3 thành phần [36]. Các hoạt tính chống oxi hóa, kháng viêm, tác động tốt trên hệ tim mạch được xem là những dược tính tốt của curcumin. Bên cạnh đó, hoạt tính kháng virus HIV, tác động tốt trên bệnh Alzheimer hay trên sự ức chế tế bào ung thư cũng đã được nghiên cứu theo nhiều cơ chế và lý giải khác nhau; đặc biệt là trong nghiên cứu tổng hợp của Jan McBarron (2012) [12], [36], [59]. Curcumin I (hay còn gọi là curcumin) có thể tồn tại ít nhất ở 2 dạng là keto và enol. Các phản ứng hóa học đặc trưng bao gồm: phản ứng cộng hydro, phản ứng tạo Cấu trúc dạng enol ổn định hơn về mặt năng lượng ở pha rắn và dạng dung dịch. 2.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ DẦU MÙ U – NGHỆ Sơ lược về Dầu Mù u – Nghệ Dầu Mù u – Nghệ là sự phối hợp của dầu Mù u với dầu Nghệ hoặc dùng bột Nghệ để chiết với dầu Mù u nhằm tạo thành phẩm mang hoạt tính điều trị tốt hơn nhờ vào sự tương hỗ của hai dược liệu này. Hiện nay, các chế phẩm dầu Mù u – Nghệ lưu hành vẫn còn hạn chế, sản phẩm của công ty Hoàng Kim gia: Dầu Mù u và Nghệ Organicare, chai . 2. Tổng quan tài liệu 10ml được kiểm các yêu cầu về tính chất, giới hạn kim loại nặng (Arsen, chì được kiểm bằng phương pháp so màu; thủy ngân với phương pháp AAS). Các nghiên cứu về tiêu chuẩn kiểm nghiệm Dầu Mù u – Nghệ 2.3.2.1 Trong nước Các nghiên cứu trong nước về tiêu chuẩn hóa trên dầu được nhiều nhóm nghiên cứu trên các chuyên ngành khác nhau thực hiện. Nhóm tác giả thường tinh chế hoặc xây dựng quy trình điều chế và đưa ra tiêu chuẩn sơ bộ cho thành phẩm.[26]. Các chỉ tiêu chung của dạng dầu được quan tâm là: chỉ số acid, chỉ số xà phòng hóa. Chỉ số peroxyd, chỉ số iod, độ nhớt, tỷ trọng và định tính, định lượng hàm lượng hoạt chất theo các phương pháp thử của DĐVN V [28]. Một số nghiên cứu chú trọng vào việc thử tác dụng lâm sàng trên da và lấy hiệu quả điều trị hoặc mức độ kích ứng làm tiêu chuẩn hóa [27]. 2.3.2.2 Nước ngoài Các chỉ tiêu được quan tâm trong tiêu chuẩn hóa dạng dầu bao gồm các chỉ tiêu lý hóa như các nghiên cứu tại Việt Nam và bổ sung một số tiêu chí phù hợp với khu vực như độ ẩm, tỷ trọng ở các mức nhiệt độ khác nhau. Những nghiên cứu mới đầu năm 2017 đã hướng đến điều chế dạng nhiên liệu sinh học là dạng ester của dầu Mù u, vì thế các thông số ban đầu để xác định đúng nguyên liệu và không bị pha lẫn là hết sức cần thiết [65]. Ngoài ra, các nghiên cứu trên dầu Nghệ cũng chú trọng vào việc xác định thành phần dựa vào kỹ thuật sắc ký [55]. Phương pháp định lượng hoạt chất trong Dầu Mù u – Nghệ 2.3.3.1 Phương pháp định lượng calophyllolid và curcumin bằng HPLC Các nghiên cứu hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu nào định lượng đồng thời 2 hoạt chất này trong thành phẩm. Các nghiên cứu định lượng calophyllolid trong Mù u hay curcumin trong Nghệ đã được thực hiện với các dạng bào chế khác nhau từ 2 dược liệu quý này. Phương pháp HPLC được sử dụng phổ biến nhất cho phần định lượng các nghiên cứu trên. Calophyllolid thuộc nhóm courmarin nên hướng nghiên cứu thường hướng đến chiết xuất và định lượng nhóm chức này. Tùy vào loại mẫu khác nhau mà cách xử lí mẫu có sự khác biệt. . 3. Tổng quan tài liệu Frederic và cộng sự đã dùng cột silica (Uptisphere), lỗ sốp 120 Ao, hạt 5 µm, kích thước 250 mm x 4,6 mm để tách các coumarin khác nhau có trong lá Mù u Calophyllum inophyllum bằng hệ thống HPLC tiêm mẫu tự động với đầu dò UV- DAD [47]. Những nghiên cứu về sau đã xác định hàm lượng calophyllolid trong các mẫu dầu Mù u khác nhau theo hai hướng: tạo cắn courmarin hoặc bơm mẫu trực tiếp [6], [21], [29]. Các nghiên cứu định lượng curcumin trong Nghệ chủ yếu là từ bột nghệ và ở đa dạnh hóa các vùng lãnh thổ khác nhau. Một số nghiên cứu khác trên nghệ không chỉ bằng việc định lượng curcumin trong củ nghệ và còn xác định hàm lượng này trong một số chế phẩm từ nghệ, trong đó có dầu mù u – Nghệ. Việc phân tích bằng kỹ thuật HPLC trong mẫu dầu thì phức tạp và xác định hàm lượng curcumin I là chủ yếu [4], [12]. Kỹ thuật HPLC thường được dùng phối hợp với một số kỹ thuật khác như GC, NMR, IR… trong việc thiết lập chất chuẩn đối chiếu calophyllolid và curcumin [4], [7]. 2.3.3.2 Định lượng hoạt chất trong chế phẩm bằng các phương pháp khác Kỹ thuật GC-MS là kỹ thuật thứ hai sau HPLC được lựa chọn trong các nghiên cứu định lượng hoạt chất curcumin và calophyllolid. Bên cạnh đó, phổ UV, IR, NMR giúp xác định cấu trúc chất phân lập được. Ngoài ra, kỹ thuật DSC góp phần xác định độ tinh khiết của chất. Một số nghiên cứu đã tiến hành so sánh hai kỹ thuật trên để đưa ra mức chất lượng chung cho chỉ tiêu về hàm lượng [7], [29]. . 4. Phương pháp nghiên cứu CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Nguyên liệu: Dầu Mù u – Nghệ (Lô NCLo1116) do nhóm nghiên cứu điều chế. Hóa chất – Dung môi Dung môi - hóa chất sử dụng cho thử nghiệm các chỉ số của dầu Mù u, SKLM: benzene, diethyl ether, chloroform, aceton, ethyl acetat, ethanol, methanol, natri carbonat, acid acetic, hydrocloric, kali hydroxyd, natri hydroxyd phân tích do Trung quốc sản xuất. Dung môi - hóa chất sử dụng cho thử nghiệm phương pháp HPLC và SPE: methanol, acetonitril đạt tiêu chuẩn HPLC; acid phosphoric, acid acetic và acid formic đạt tiêu chuẩn phân tích do Merck sản xuất. Chất đối chiếu: Curcumin I chuẩn (94,90% - nguyên trạng), số lô QT 209050317 Calophyllolid (92,93% - nguyên trạng), số lô Cal03/0-1/17 do Viện Kiểm nghiệm thuốc TpHCM cung cấp. Trang thiết bị Các trang thiết bị chính  Hệ thống HPLC Alliance 2695-2996, đầu dò PDA  Máy đo pH Metrohm 744  Cột sắc ký Waters ODS1 (250 x 4,6 mm; 5 μm)  Cột sắc ký Inerstil (250 x 4,6 mm; 5 μm)  Cột chiết mẫu pha rắn SPE C18-E (Agilent)  Cột chiết mẫu pha rắn SPE Strata C18-E (Phenomenex)  Bếp cách thủy Memmert WNB29 Và các trang thiết bị – dụng cụ thông thường dùng trong phòng thí nghiệm. .