Tài liệu Xây dựng quy trình định lượng 10 hydroxy 2 decenoic trong sữa ong chúa bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

. BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG 10-HYDROXY-2-DECENOIC TRONG SỮA ONG CHÚA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Mã số: Chủ nhiệm đề tài: TS.DS NUYỄN HỮU LẠC THỦY Tp. Hồ Chí Minh, 04/2019 . . BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG 10-HYDROXY-2-DECENOIC TRONG SỮA ONG CHÚA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Mã số: Chủ nhiệm đề tài NGUYỄN HỮU LẠC THỦY Tp. Hồ Chí Minh, 04/2019 . . DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI 1. TS. DS NGUYỄN HỮU LẠC THỦY 2. ThS TRƯƠNG VĂN ĐẠT 3. DS NGUYỄN MINH NGHUYỆT . .i MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................. ii DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. 3 DANH MỤC HÌNH ............................................................................................... 4 ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................. 5 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 6 2.1. TỔNG QUAN VỀ SỮA ONG CHÚA.................................................................... 6 2.2. TỔNG QUAN VỀ ACID (E)-10-HYDROXY-2-DECENOIC .............................. 13 MỤC TIÊU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 16 3.1. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................ 16 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................................................... 20 4.1. ĐỊNH TÍNH ACID (E)-10-HYDROXY-2-DECENOIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG ................................................................................................ 20 4.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ACID (E)-10-HYDROXY-2DECENOIC TRONG SỮA ONG CHÚA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ..................................................................................................... 21 4.3. ỨNG DỤNG ........................................................................................................ 31 4.4. BÀN LUẬN ......................................................................................................... 31 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................... 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 33 . .ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh 10-HDA (E)-10-hydroxy-2-decenoic acid As Asymmetry Hệ số bất đối C Concentration Nồng độ dung dịch HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao k’ Capacity factor Hệ số dung lượng N Theoretical plate Số đĩa lý thuyết PDA Photodiode array Đầu dò dãy diod quang Rs Resolution Độ phân giải RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối S Area Diện tích pic SOC Royal jelly Sữa ong chúa TB Average Giá trị trung bình tR Retention time Thời gian lưu UV-Vis Ultraviolet - Visible Phổ tử ngoại - khả kiến . Tiếng Việt . 3 Mục tiêu – Phương pháp nghiên cứu DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Hàm lượng vitamin trong sữa ong chúa ........................................................... 7 Bảng 2.2. Một số acid béo trong sữa ong chúa................................................................. 8 Bảng 2.3. Các acid amin tự do trong sữa ong chúa [1] ...................................................... 9 Bảng 2.4. So sánh thành phần sữa ong chúa tươi và dạng đông khô................................. 9 Bảng 2.5. Sản lượng sữa ong chúa trên thế giới năm 1984 và 2012 (ĐV: Tấn) [24] ......... 11 Bảng 2.6.Tình hình tiêu thụ sữa ong chúa từ Đà Lạt năm 2002 - 2003 (ĐV: Tấn) [25] .... 12 Bảng 4.7. Kết quả Rf của 10-HDA với 3 hệ dung môi ................................................... 20 Bảng 4.8. Khảo sát thời gian siêu âm mẫu thử ............................................................... 21 Bảng 4.9. Tỷ lệ pha động gồm methanol – dung dịch acid phosphoric pH 3 .................. 21 Bảng 4.10. Tỷ lệ pha động gồm acetonitril – dung dịch acid phosphoric pH 3 ............... 21 Bảng 4.11. Pha động gồm dung môi hữu cơ – dung dịch acid phosphoric pH 4 ............. 24 Bảng 4.12. So sánh các thông số sắc ký với cột C8 và C18 ............................................. 25 Bảng 4.13. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống ....................................................... 26 Bảng 4.14. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính dung dịch đối chiếu 10-HDA ............... 29 Bảng 4.15. Kết quả khảo sát độ lặp lại........................................................................... 29 Bảng 4.16. Kết quả khảo sát độ đúng ............................................................................ 30 Bảng 4.17. Kết quả thẩm định quy trình định lượng ...................................................... 30 Bảng 4.18. Kết quả khảo sát các mẫu sữa ong chúa ....................................................... 31 . . 4 Mục tiêu – Phương pháp nghiên cứu DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Sự phát triển của ong chúa từ ấu trùng ong nhờ sữa ong chúa ............................ 6 Hình 2.2. Một số sản phẩm chứa sữa ong chúa [nguồn internet] ...................................... 12 Hình 2.3. Cấu trúc hóa học của 10-HDA ......................................................................... 13 Hình 4.8. Sắc ký lớp mỏng của mẫu thử phát hiện bằng đèn UV 254 nm ........................ 20 Hình 4.10. Sắc ký đồ pha động methanol – dung dịch acid phosphoric pH 3 (45 : 55) ..... 22 Hình 4.11. Sắc ký đồ pha động methanol – dung dịch acid phosphoric pH 3 (50 : 50) ..... 22 Hình 4.12. Sắc ký đồ pha động methanol – dung dịch acid phosphoric pH 3 (55 : 45) ..... 22 Hình 4.13. Sắc ký đồ pha động methanol – dung dịch acid phosphoric pH 3 (60 : 40) ..... 22 Hình 4.14. Sắc ký đồ pha động acetonitril – dung dịch acid phosphoric pH 3 (55 : 45).... 23 Hình 4.15. Sắc ký đồ pha động acetonitril – dung dịch acid phosphoric pH 3 (50 : 50).... 23 Hình 4.16. Sắc ký đồ pha động acetonitril – dung dịch acid phosphoric pH 3 (40 : 60).... 23 Hình 4.17. Sắc ký đồ pha động acetonitril – dung dịch acid phosphoric pH 3 (30 : 70).... 23 Hình 4.18. Sắc ký đồ pha động acetonitril – acid phosphoric pH 4 (30 : 70) .................... 24 Hình 4.19. Sắc ký đồ pha động methanol – acid phosphoric pH 4 (55 : 45) ..................... 24 Hình 4.20. Sắc ký đồ mẫu thử với cột C8......................................................................... 25 Hình 4.21. Sắc ký đồ mẫu thử với cột C18 ....................................................................... 25 Hình 4.22. Độ tinh khiết pic 10-HDA mẫu thử với cột sắc ký C8..................................... 25 Hình 4.23. Độ tinh khiết pic 10-HDA mẫu thử với cột sắc ký C18 ................................... 25 Hình 4.24. Phổ UV - Vis của 10-HDA trong mẫu chuẩn và mẫu thử ............................... 27 Hình 4.25. Độ tinh khiết pic 10-HDA trong mẫu thử ....................................................... 27 Hình 4.26. Sắc ký đồ mẫu trắng ...................................................................................... 28 Hình 4.27. Sắc ký đồ mẫu đối chiếu 10-HDA ................................................................. 28 Hình 4.28. Sắc ký đồ mẫu thử ......................................................................................... 28 Hình 4.29. Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn ...................................................................... 28 Hình 4.30. Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ........................ 29 . . 5 Mục tiêu – Phương pháp nghiên cứu ĐẶT VẤN ĐỀ Sữa ong chúa (SOC) được sử dụng lâu đời trong nhiều lĩnh vực từ công nghiệp thực phẩm tới công nghiệp mỹ phẩm, dược phẩm và ngày càng được mở rộng sản xuất để đáp ứng nhu cầu tăng cao trong những năm gần đây. Sữa ong chúa đã được chứng minh các tác động dược lý qua thử nghiệm in vitro, in vivo và qua các nghiên cứu lâm sàng, bao gồm các tác động giãn mạch và hạ huyết áp, chống vô sinh, chống ung thư, hạ cholesterol, chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng viêm. Ngoài ra, tác động điều hòa miễn dịch, tác dụng tương tự estrogen làm giảm các triệu chứng khó chịu ở phụ nữ thời kỳ tiền mãn kinh và mãn kinh, ức chế sự phá hủy khớp, tác động giống insulin cũng đã được chứng minh [1]. Sữa ong chúa chứa lượng protein dồi dào, các acid amin tự do, chất béo, vitamin, carbohydrat và đặc biệt là acid (E)-10-hydroxy-2-decenoic (10-HDA) có nhiều tác dụng sinh học như điều hòa miễn dịch, tăng tổng hợp collagen [2], làm trắng da [3], đồng thời có tác dụng chống ung thư, kháng khuẩn…10-HDA có thể được sử dụng như 1 marker để đánh giá chất lượng sữa ong chúa vì đây là chất chỉ có ở SOC và không có trong các sản phẩm từ ong khác [4]. Với giá trị dinh dưỡng cao và các tác dụng sinh học đã được chứng minh, nhu cầu sử dụng SOC là rất lớn, nếu khai thác được tiềm năng này bên cạnh mật ong sẽ đem lại nguồn lợi nhuận đáng kể cho người nuôi ong. Tuy nhiên, để đảm bảo đầu ra của sản phẩm, việc ban hành tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng chặt chẽ để tạo niềm tin nơi người tiêu dùng là vô cùng cần thiết khi mà chất lượng của sản phẩm trên thị trường “vàng thau lẫn lộn” với mức giá dao động từ 90.000 – 300.000 đồng/100 g đi kèm với thông tin về hàm lượng 10-HDA – chất có giá trị sinh học chính của SOC thay đổi đáng kể theo thời gian gây không ít hoang mang cho người tiêu dùng. Các công trình nghiên cứu sữa ong chúa trên thế giới đã định lượng 10-HDA bằng các phương pháp như sắc ký khí [5], điện di mao quản [6] và HPLC [7], [8], [9]. Ở Việt nam, các sản phẩm từ SOC được kiểm soát chất lượng theo yêu cầu sản phẩm là thực phẩm chức năng gồm các chỉ tiêu lý hóa, chỉ tiêu vi sinh và kim loại nặng, hàm lượng 10-HDA được định lượng bằng phương pháp chuẩn độ thể tích (TCVN 5272 – 90), cho đến nay chưa có tiêu chuẩn kiểm nghiệm nào áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để đánh giá chất lượng của SOC. Do đó, với mong muốn góp phần vào công tác kiểm soát chất lượng cho SOC Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng acid (E)-10-hydroxy-2-decenoic bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”. . . 6 Mục tiêu – Phương pháp nghiên cứu TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TỔNG QUAN VỀ SỮA ONG CHÚA 2.1.1. Giới thiệu sữa ong chúa Sữa ong chúa là sản phẩm được tiết ra từ hàm của ong thợ làm thức ăn để nuôi dưỡng những con ong đang phát triển và ong chúa. Ở nhiệt độ thường sữa ong chúa là chất đặc biệt như bơ, màu hơi ngà vàng. Sữa ong chúa có màu vàng nhạt, dạng kem, có tính acid và mùi đặc trưng [4]. Hình 2.1. Sự phát triển của ong chúa từ ấu trùng ong nhờ sữa ong chúa 2.1.2. Thành phần hóa học của sữa ong chúa Thành phần của SOC gồm nước (50 – 65 %), protein (11 – 18 %), lipid (4 – 8 %), carbohydrat (10 – 15 %), muối khoáng (khoảng 1,5 %), polyphenol, vitamin VÀ và một số hợp chất khác. Acid béo Không giống như các acid béo có nguồn gốc từ động vật và thực vật chủ yếu là các acid béo triglycerid có 14 – 20 nguyên tử carbon, acid béo trong sữa ong chúa có mạch carbon ngắn khoảng 8 – 12 carbon thường là acid béo hydroxy, dicarboxylic, monohydroxy acid và dẫn chất. Lượng acid béo trong sữa ong chúa thay đổi tùy thuộc vào nguồn gốc của mật và đặc tính của đàn ong [1]. Acid béo chính trong sữa ong chúa gồm acid (E)-10-hydroxy-2-decenoic (10-HDA) và 10-hydroxy decanoic chiếm khoảng 60 – 80 % tổng lượng acid hữu cơ. Trong đó thành phần có giá trị dinh dưỡng cao là 10-HDA chỉ có trong sữa ong chúa mà không tìm thấy trong các sản phẩm khác từ ong Protein [1] Protein chiếm đến 50 % trọng lượng khô. Các protein chính trong sữa ong chúa gồm 9 protein với trọng lượng phân tử từ 49 đến 87 kDa. Các protein tồn tại trong sữa ong chúa tạo thành nguồn nitơ và acid amin thiết yếu cho ấu trùng ong. . . 7 Mục tiêu – Phương pháp nghiên cứu Carbohydrat [1] Các loại đường chứa trong sữa ong chúa chủ yếu là fructose và glucose tương đối giống với mật ong, fructose là đường phổ biến. Các loại đường khác cũng được tìm thấy với lượng nhỏ hơn rất nhiều như maltose, trehalose, ribose, erlose, … Sterol 24-methylen cholesterol là sterol quan trọng nhất trong sữa ong chúa. Các sterol trong sữa ong chúa: 24-methylen cholesterol (49 – 58 %), β-sitosterol (19 – 24 %), isofucosterol (9 – 16 %), campesterol (6 – 7 %) [11]. Testosteron cũng tồn tại trong sữa ong chúa với lượng rất nhỏ, khoảng 11 – 12 ng/g [12]. Khoáng chất Khoáng chất trong sữa ong chúa chiếm khoảng 1 % trong tổng lượng tro và khoảng 2 – 3 % trong dạng đông khô. Các kim loại chính đã được phát hiện là K, Ca, Na, Zn, Fe, Cu và Mn, trong đó K có nồng độ cao nhất [1]. Vitamin Sữa ong chúa giàu vitamin, chủ yếu là các vitamin tan trong nước. Vitamin C được tìm thấy trong sữa ong chúa, nhưng không có vitamin A, D, K [1]. Thành phần khác Ngoài các thành phần chủ yếu trên, sữa ong chúa còn chứa biopterin, neopterin; các acid hữu cơ (acid lactic, glycolic, glyceric, malic); alcol béo (2,3-butanediol, mesoglycerol); aldehyd béo (3-methyl butanal, 2-methyl butanal); lacton (δdecalacton, δ-octalacton); hydrocarbon (n-pentacosan, n-heptacosan); ceton béo (2pentanon, 2-heptanon); vòng thơm (pyrocatechol, hydroquinon, 2-methoxy-p-cresol, methyl salicylat,…). Bảng 2.1. Hàm lượng vitamin trong sữa ong chúa Vitamin Hàm lượng (μg/g) Thiamin (B1) 1,44 – 6,70 Riboflavin (B2) 5,0 – 25,0 Pyridoxin (B6) 1,0 – 48,0 Niacin (B3) 48,0 – 88,0 Acid pantothenic (B5) Biotin (B7) 159,0 – 265,0 1,1 – 19,8 Acid folic (B9) 0,130 – 0,530 Inositol (B8) 80,0 – 350,0 . . Mục tiêu – Phương pháp nghiên cứu 8 Bảng 2.2. Một số acid béo trong sữa ong chúa Phân loại Tên hóa học Acid béo Acid (E)-10-hydroxy-2decenoic Chính Acid 10-hydroxy decanoic Cấu trúc OH HO O OH HO O OH O Acid (E)-2-decenedioic O OH Acid Dicarboxylic OH O Acid sebacic O OH O HO Acid 9-hydroxy nonanoic OH O Acid 3-hydroxy decanoic Acid monohydroxy OH O Acid 11-(S)-hydroxy dodecanoic và dẫn xuất OH OH OH O Acid 10-acetoxy decanoic H3C O O OH OH Acid 10-(R),11-(R)dihydroxy dodecanoic Acid Dihydroxy . O OH Acid 11-(R),12dihydroxy dodecanoic HO Acid 3,12-dihydroxy dodecanoic HO OH O OH OH O OH OH . 9 Mục tiêu – Phương pháp nghiên cứu Bảng 2.3. Các acid amin tự do trong sữa ong chúa [1] Acid amin mg/kg Acid amin mg/kg Alanin 0,08 Lysin 3,72 Arginin 0,59 Phenylalanin 0,06 Acid aspartic 0,26 Prolin 8,00 Acid glutamic 1,00 Serin 0,13 Glycin 0,10 Threonin 0,04 Histidin 0,23 Tyrosin 0,04 Isoleucin 0,05 Valin 0,06 Leucin 0,05 Bảng 2.4. So sánh thành phần sữa ong chúa tươi và dạng đông khô Hàm lượng Tươi Đông khô Nước (%) 60 – 70 <5 Lipid (%) 3–8 8 – 19 10-HDA (%) > 1,4 > 3,5 Protein (%) 9 – 18 27 – 41 Fructose + glucose + sucrose (%) 7 – 18 - Độ tro (%) 0,8 - 3,0 2–5 pH 3,4 - 4,5 3,4 - 4,5 2.1.3. Tác dụng dược lý Tính kháng khuẩn: các hợp chất phân lập từ sữa ong chúa như acid 3-hydroxy dodecandioic, 9-hydroxy-2-nonanon, sebacic đều có hoạt tính kháng khuẩn trên gram âm và gram dương, hai chủng gây bệnh ở miệng (Streptococcus mutans và S. viridans) và ba loài nấm gây bệnh trên người (Candida albicans, C. tropicalis và C. glabrata). Royalisin, một protein trong sữa ong chúa đã được chứng minh có hoạt tính kháng khuẩn chống lại một số vi khuẩn gram dương như Bacillus subtilis và Sarcina lutea. Nghiên cứu in vitro và in vivo cho thấy sữa ong chúa còn có tác động kháng nấm da [1]. Khả năng chống oxy hoá: hợp chất polyphenol là thành phần chính cho hoạt động chống oxy hóa trong sữa ong chúa. Hàm lượng các hợp chất polyphenol khác nhau tùy thuộc vào thời gian thu hoạch và tuổi ấu trùng ban đầu, từ đó ảnh hưởng mạnh đến khả năng chống oxy hoá trong sữa ong chúa [13]. Tác dụng miễn dịch: protein của sữa ong chúa có tác động điều hòa miễn dịch, ức chế sự sản sinh kháng nguyên đặc hiệu IgE và phóng thích histamin từ tế bào mast . . 10 Mục tiêu – Phương pháp nghiên cứu kết hợp với sự phục hồi chức năng đại thực bào và cải thiện đáp ứng tế bào TH1/TH2 ở chuột [1]. Ngoài protein, các acid béo trong sữa ong chúa cũng ức chế biểu hiện của Interleukin2 receptor, qua đó làm giảm sản xuất IL-2. Hai acid béo đầu tiên được nghiên cứu về tác động này là 10-HDA và acid 3,10-dihydroxy decanoic [14]. Tác dụng tương tự estrogen: bốn hợp chất tinh khiết được phân lập từ sữa ong chúa như 10-HDA, 10-hydroxy decanoic, (E)-2-decenoic, 24-methylen cholesterol đều ức chế gắn kết 17-β-estradiol lên estrogen receptor, mặc dù yếu hơn diethylstilbestrol hoặc phytoestrogen. Đánh giá hiệu quả của sữa ong chúa trong một công thức thảo dược trên phụ nữ có triệu chứng mãn kinh cho thấy sữa ong chúa có lợi cho phụ nữ trong thời kỳ tiền mãn kinh [1]. Tác động trên cơ quan sinh sản: sữa ong chúa chứa testosteron tự nhiên và thực nghiệm chứng minh rằng nó cải thiện chức năng sinh sản của chuột đực [12]. Tác dụng chống loãng xương: sữa ong chúa có hiệu quả gần giống như 17-βestradiol trong việc ngăn ngừa sự mất xương ở chuột bị cắt bỏ buồng trứng, làm tăng hàm lượng canxi ở xương đùi chuột nhắt thông thường. Việc ngăn ngừa loãng xương này là do tăng sự hấp thu canxi từ ruột, nhưng không phải do tác động trực tiếp của hormon tuyến cận giáp [15]. Chức năng thần kinh: sữa ong chúa làm gia tăng đáng kể số lượng tế bào của thùy hải mã và cải thiện suy giảm nhận thức, phát triển các tế bào gốc thần kinh [16]. Tác dụng chống trầm cảm: sữa ong chúa có hiệu quả trong việc cải thiện các triệu chứng căng thẳng của chứng trầm cảm và lo âu [17]. Tác dụng hạ huyết áp: peptide từ sữa ong chúa đã được nghiên cứu (Ile-Tyr (IY), Val-Tyr (VY), và Ile-Val-Tyr (IVY) cho thấy ức chế hoạt tính của ACE (Angiotensin converting enzyme) và có tác dụng hạ huyết áp khi uống sữa ong chúa trong 28 ngày đối với những con chuột tăng huyết áp tự phát [1]. Tác động đối với sự tổng hợp lipoprotein huyết thanh trên in vivo và ở người: sữa ong chúa có tác dụng dự phòng và điều trị chứng tăng lipid máu, làm tăng chỉ số HDL và cải thiện tình trạng huyết khối. Nghiên cứu trên người tình nguyện cho thấy chế độ ăn có sữa ong chúa làm giảm triglycerid cholesterol và LDL [18]. Các tác động giống insulin: sữa ong chúa chứa nhiều peptid giống insulin, tương tự như insulin bò về sinh học và cấu trúc. Tác động lên sự chuyển hóa glucose của người khỏe mạnh đã được nghiên cứu cho thấy nồng độ glucose trong huyết thanh sau 2 giờ và diện tích vùng dưới đường cong của glucose thấp hơn đáng kể sau khi dùng sữa ong chúa [19]. Tác dụng làm lành vết thương và cải thiện da: sữa ong chúa rút ngắn thời gian lành vết thương đồng thời làm giảm sự tổng hợp melanin do giảm sự biến đổi của . . 11 Mục tiêu – Phương pháp nghiên cứu mRNA tyrosinase. Kết quả này chứng minh tiềm năng của sữa ong chúa trong việc làm trắng da hoặc trị liệu mới [2]. Tác động gây độc tế bào: 10-HDA cũng như các acid dicarboxylic có thể ức chế sự phát triển của ung thư bạch cầu và các khối u cổ trướng (tế bào Ehrlich). Hoạt tính này cũng có liên quan đến acid monocarboxylic thẳng có 9 và 10 carbon, đặc biệt là acid decanoic dạng ethyl este. Các hợp chất này không có hoạt tính trên in vivo [1]. 2.1.4. Công dụng Sữa ong chúa có hiệu quả trong việc làm giảm triệu chứng tiền kinh nguyệt như dễ cáu, căng thẳng, mệt mỏi, phù nề [20]. Đồng thời sữa ong chúa giúp cải thiện các triệu chứng tiền mãn kinh, mãn kinh ngăn ngừa quá trình lão hóa [21]. [1] ; Sữa ong chúa giúp cải thiện tinh thần, đồng thời có tác dụng bảo vệ thần kinh trong bệnh Alzheimer. Ở bệnh nhân đái tháo đường có loét bàn chân, sữa ong chúa làm tăng hoạt động chữa lành vết thương [22]. Sữa ong chúa còn dùng để chữa tàn nhang, mụn trứng cá ở phụ nữ; viêm da có mủ, mụn nhọt và chàm ở trẻ sơ sinh; giảm rõ rệt triệu chứng của những người bị bệnh Parkinson, bệnh nhân bị nhiễm phóng xạ, hồi phục dần khả năng sinh dục ở những người bị bệnh liệt dương [23]. 2.1.5. Sản lượng và tình hình tiêu thụ sữa ong chúa Sản lượng sữa ong chúa trên toàn thế giới vào năm 2012 xấp xỉ 4000 tấn với tổng trị giá 135 đôla Mỹ, trong đó dẫn đầu là Trung Quốc. Bảng 2.5. Sản lượng sữa ong chúa trên thế giới năm 1984 và 2012 (ĐV: Tấn) [24] Quốc gia Trung Quốc Đài Loan Việt Nam Nhật Bản Hàn Quốc Các nước khác (Đông Âu, Pháp, Ý và Mexico) Thế giới 1984 450 80 20 46 20 24 700 2012 3500 140 100 75 50 80 3885 Đối với thị trường trong nước, người tiêu dùng đã biết đến và sử dụng sữa ong chúa khá nhiều. Hàng năm nhu cầu trong nước vào khoảng 6 – 10 tấn sữa ong chúa, trong đó các sản phẩm từ Đà Lạt chiếm tỉ lệ cao 33 %. . . 12 Mục tiêu – Phương pháp nghiên cứu Bảng 2.6.Tình hình tiêu thụ sữa ong chúa từ Đà Lạt năm 2002 - 2003 (ĐV: Tấn) [25] Sữa ong chúa Xuất khẩu Tiêu dùng trong nước Tổng lượng tiêu thụ 2002 2,17 0,03 2,20 2003 7,7 1,8 9,5 2.1.6. Một số sản phẩm chứa sữa ong chúa trên thị trường Hiện nay, sản phẩm có sữa ong chúa trên thị trường rất đa dạng, có thể ở dạng viên ngậm cho trẻ em, dạng viên nang hay dạng kem trong thực phẩm chức năng dùng để ăn, uống hoặc thoa da để tăng cường sức khỏe và làm đẹp. Hình 2.2. Một số sản phẩm chứa sữa ong chúa [nguồn internet] 2.1.7. Một số công trình nghiên cứu các hợp chất trong sữa ong chúa Chiết xuất và định lượng các hợp chất trong sữa ong chúa Sử dụng kỹ thuật vi chiết pha rắn với các phân đoạn diethyl ether và methanol để phân lập 185 hợp chất hữu cơ từ 17 mẫu sữa ong chúa. Trong đó có khoảng 169 hợp chất được xác định bằng GC-MS, phân đoạn ether thu được 85 hợp chất khác nhau, chủ yếu acid béo: (E)-10-hydroxy-2-decenoic; 3,10-dihydroxy decenoic; 10-hydroxy decenoic; 8-hydroxy octanoic; 2-decen-1,10-dioic; (Z)-9-hydroxy-2-decenoic. Trong phân đoạn methanol chiết được 82 hợp chất, chủ yếu là carbohydrat và dẫn chất, trong đó đa số là fructose, glucose, sucrose. Phân lập một số acid béo trong sữa ong chúa Năm 2005, Naoki Noda và các đồng nghiệp, sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao điều chế, đã tách được 10-HDA và một số dẫn xuất hydroxy, este béo của 10-HDA từ dịch chiết chlorofom/methanol của sữa ong chúa. Các chất phân lập được: 10-HDA, 8-hydroxy octanoic, 10-hydroxy decanoic, (E)-9-carboxy-2-nonenoic dạng enantiomer, 3,10-dihydroxy decanoic, 9-hydroxy decanoic, ester và diester của 10HDA, 10-HDA phosphat [27]. . . 13 Mục tiêu – Phương pháp nghiên cứu Theo dõi hàm lượng các acid amin tự do thay đổi theo điều kiện bảo quản Ngoài thành phần acid béo, protein hay acid amin trong sữa ong chúa cũng có giá trị dinh dưỡng cao. Hàm lượng acid amin tự do trong sữa ong chúa thay đổi theo đặc tính của nguồn ong, thời điểm thu hoạch; điều kiện bảo quản. Không thể chỉ dựa vào hàm lượng acid amin để đánh giá chất lượng mẫu. Các mẫu sữa ong chúa sau khi thu hoạch đều được bảo quản đông lạnh ngay. Sau đó tiến hành theo dõi ở nhiệt độ phòng và 4 oC trong 3, 6, 10 tháng. Kết quả cho thấy hàm lượng các acid amin tự do không thay đổi ở 4 oC so với bảo quản đông lạnh -18 oC. Tuy nhiên, ở nhiệt độ phòng thì prolin và lysin tăng trong 3 tháng đầu, nhưng sau đó giảm; trong khi serin bị phân hủy ngay lập tức; aspartat và glutamat không bị ảnh hưởng, các acid amin còn lại giảm theo thời gian. 2.2. TỔNG QUAN VỀ ACID (E)-10-HYDROXY-2-DECENOIC 10-HDA là một trong hai acid béo chính của sữa ong chúa và chỉ có trong sữa ong chúa. Sự có mặt của 10-HDA có thể được sử dụng làm điểm đánh dấu để phân biệt sữa ong chúa với các sản phẩm khác của ong. Tính chất lý hóa [7]: - Công thức phân tử: C10H18O3 - Khối lượng phân tử: 186,25 g/mol - Danh pháp IUPAC: acid (E)-10-hydroxy-2-decenoic - 10-HDA là acid béo không bão hòa, còn có tên queen bee acid hay royal jelly acid. - Tính chất: 10-HDA có tính acid yếu, dạng tinh thể màu trắng, ít tan trong nước, tan trong cloroform, ethanol, methanol. - Điểm chảy: 64 - 68 oC. OH HO O Hình 2.3. Cấu trúc hóa học của 10-HDA Hoạt tính sinh học Nhiều nghiên cứu đã chứng minh 10-HDA trong sữa ong chúa có nhiều tác động có lợi như kháng khuẩn, đặc biệt các vi khuẩn gây bệnh của khoang miệng; kháng viêm do giảm sản xuất interleukin-2 (IL-2) và giảm biểu hiện thụ thể IL-2; tác động tương tự estrogen, ức chế gắn kết 17-β-estradiol với estrogen receptor; cải thiện các triệu chứng căng thẳng của chứng trầm cảm và lo âu; ức chế sự phá hủy khớp trong viêm khớp dạng thấp thông qua việc ức chế hoạt động của chất gây phá hủy khớp; ức chế sự phát triển của ung thư bạch cầu và các khối u [1]. . . 14 Mục tiêu – Phương pháp nghiên cứu 10-HDA có hiệu quả trong dự phòng và điều trị rối loạn chuyển hóa lipid – tăng lipid máu, cải thiện tình trạng huyết khối. Ngoài ra, 10-HDA còn giúp thúc đẩy sản xuất collagen của các tế bào nguyên sợi bằng cách sản xuất yếu tố tăng cường chuyển hóa beta 1 (TGF-beta 1) Một số công trình nghiên cứu về 10-HDA Định tính bằng sắc ký lớp mỏng Bản mỏng: Silicagel F254 Dung môi khai triển: propanol – amoniac (7 : 3) Dung dịch thử: hòa tan 0,2 g sữa ong chúa trong 5 ml nước, 1 ml acid hydrochloric loãng và 10 ml diethyl ether, lắc đều trong 15 phút, sau đó ly tâm. Lấy lớp diethyl ether, làm bay hơi dưới áp suất. Sau đó, lấy phần cắn hòa tan trong 5 ml methanol. Dịch hòa tan này được dùng làm dung dịch thử. Dung dịch chuẩn: hòa tan 2 mg 10-HDA (mẫu chuẩn) trong 1 ml methanol. Cách tiến hành: chấm riêng biệt lên bản mỏng 20 μl mỗi dung dịch thử và dung dịch chuẩn. Sau khi khai triển khoảng 7 cm, lấy bản mỏng ra, để khô ở nhiệt độ phòng. Kiểm tra dưới ánh sáng cực tím với bước sóng 254 nm. Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết cùng Rf với vết trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. - Định lượng bằng phương pháp thể tích: TCVN 5272 – 90 đã định lượng bằng phương pháp chiết diethyl ether nhiều lần nhằm loại bỏ các acid và các chất tan trong diethyl ether. Xác định lượng 10-HDA bằng cách dùng acid sulfuric chuẩn lượng natri hydroxid thừa [9]. - Định lượng bằng phương pháp sắc ký khí: năm 1995, các tác giả đã định lượng 10HDA bằng phương pháp sắc ký khí. Các acid béo được chuyển sang dạng hơi trước khi phân tích. Việc tạo nhũ trong quá trình chiết các acid béo làm hao hụt lượng 10HDA. Phương pháp này có tỷ lệ phục hồi khá thấp khoảng 40 – 75 % [4]. - Định lượng bằng phương pháp điện di mao quản: dùng cột mao quản silica với hệ đệm phosphat pH = 7,3; điện thế nguồn 20 kV, đổi chiều dòng điện thẩm bằng cetyl trimethyl amoni bromid (CTAB), detector UV 214 nm. - Định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao: Định lượng 10-HDA trong sữa ong chúa tươi và các sản phẩm từ sữa ong chúa ở Hoa Kỳ với cột sắc ký C18 (150 x 4,6 mm), nhiệt độ cột 25 oC, chuẩn nội methyl 4-hydroxy benzoat, pha động: methanol – nước – acid phosphoric (55 : 45 : 2,7), rửa giải đẳng dòng, tốc độ dòng 1 ml/phút, phát hiện ở bước sóng 215 nm. . . 15 Mục tiêu – Phương pháp nghiên cứu Thời gian lưu 10-HDA là 6,4 phút; MHB: 3,6 phút, tỷ lệ phục hồi: 97,4 – 100,4 %, khoảng tuyến tính: 0,05 - 80 μg/ml (R2 = 0,9999) [7]. 10-HDA đã được định lượng trong 7 mẫu sữa ong chúa tươi ở Brazil bằng phương pháp HPLC. Mẫu được bảo quản đông lạnh ở -18 oC và tránh ánh sáng. Điều kiện sắc ký gồm cột C18 (150 x 4,0 mm), pha động: methanol – dung dịch acid hosphoric (pH = 2,5) (45 : 55), rửa giải đẳng dòng, chuẩn nội α-naphtol, tốc độ dòng 0,5 ml/phút, bước sóng phát hiện 225 nm. Hàm lượng 10-HDA trong các mẫu nằm quanh 2 giá trị: 1,8 % và 3 % [8]. Năm 2013, Marghitas L. và cộng sự đã định lượng 10-HDA trong các mẫu sữa ong chúa ở Transylvania bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA: Điều kiện sắc ký: cột C18 (250 x 4,6 mm), nhiệt độ ổn định cột 40 oC, pha động methanol – dung dịch acid phosphoric pH = 2,5 (60 : 40), rửa giải đẳng dòng, tốc độ dòng: 0,8 ml/phút, thể tích tiêm 20 μl, bước sóng phát hiện 210 nm [9]. Mẫu thử: hòa tan 0,2 g sữa ong chúa trong 20 ml methanol, siêu âm trong 30 phút và thêm vừa đủ 50 ml methanol rồi đem ly tâm. Sau đó, lấy chính xác 2 ml chất lỏng phía trên và thêm chính xác 2 ml dung dịch chuẩn nội bộ propyl para hydroxy benzoat trong methanol (1/5000). Thêm 25 ml nước và methanol vừa đủ 50 ml được mẫu thử. Mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 10 mg 10-HDA hoà tan trong 100 ml methanol. Lấy chính xác 3 ml dung dịch này và thêm chính xác 2 ml chất chuẩn nội. Sau đó, thêm 25 ml nước và methanol vừa đủ 50 ml được mẫu đối chiếu. . . 16 Mục tiêu – Phương pháp nghiên cứu MỤC TIÊU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.1. Nguyên vật liệu - Đối tượng nghiên cứu: acid (E)-10-hydroxy-2-decenoic (10-HDA) trong sữa ong chúa Việt Nam. - Chất chuẩn: Acid (E)-10-hydroxy-2-decenoic (97 %) do công ty Tokyo Chemical Industry (TCI) phân phối, bảo quản lạnh 8 - 10 oC. - Nguyên liệu thử nghiệm: bán thành phẩm sữa ong chúa đông khô do nhóm nghiên cứu điều chế, số lô: SOCNC-0118, dùng để xây dựng quy trình định lượng. Đồng thời, tiến hành khảo sát hàm lượng 10-HDA trong một số mẫu sữa ong chúa thu thập trên thị trường: Mẫu SOC 1: thu thập tại cơ sở sản xuất Út Cẩm, Tiền Giang vào tháng 4/2018. Mẫu SOC 2 và SOC 3: công ty Đại Mộc Garden cung cấp (lô 1 và lô 2). Mẫu SOC 4: trại nuôi ong Buôn Mê Thuột cung cấp vào tháng 3/2018. Mẫu SOC 5: trại nuôi ong Bình Dương vào tháng 3/2018. Mẫu SOC đông khô: nguyên liệu từ lô 2. -Dung môi – hóa chất – thuốc thử: Methanol, cloroform, ethyl acetat đạt tiêu chuẩn phân tích do Chemsol sản xuất. Methanol, acetonitril dùng cho HPLC do Merck sản xuất. Acid phosphoric 85 %, thuốc thử vanilin – acid sulfuric. Bản mỏng silicagel F254 (Merck). - Trang thiết bị: Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Alliance e2695 Waters (Mỹ) đầu dò PDA. Cột sắc ký Eurospher II C8 (250 x 4,6 mm; 5 μm). Cân phân tích Sartorius PB 221S, độ nhạy 0,1 mg (Đức). Cân phân tích Sartorius CP 225D, độ nhạy 0,01 mg (Đức). Bể siêu âm Elma. Đèn UV bước sóng 254 nm. Máy đo pH 744 Metrohm. Các trang thiết bị - dụng cụ khác thông dụng trong phòng thí nghiệm. . . 17 Mục tiêu – Phương pháp nghiên cứu 3.1.2. Phương pháp nghiên cứu 3.1.2.1. Định tính acid (E)-10-hydroxy-2-decenoic trong sữa ong chúa bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng Thử nghiệm định tính xác định 10-HDA trong sữa ong chúa bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng được khảo sát trên một số hệ dung môi với mục đích xác định sự hiện diện của 10-HDA trong nguyên liệu và có sự tách hoàn toàn vết 10-HDA với các vết lân cận trong mẫu thử. Thực hiện trên bản mỏng Silicagel F254 (Merck). Dung môi khai triển: Hệ dung môi (1): cloroform – ethyl acetat (1 : 2) Hệ dung môi (2): cloroform – methanol (5 : 1) Hệ dung môi (3): ethyl acetat – methanol (3 : 1) Mẫu đối chiếu: dung dịch đối chiếu 10-HDA 40 μg/ml. Mẫu thử: cân 0,2 g sữa ong chúa, hòa tan trong 50 ml methanol, siêu âm, lọc lấy dịch lọc làm mẫu thử cho phương pháp sắc ký lớp mỏng. Cách tiến hành: chấm riêng biệt lên bản mỏng 20 μl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Triển khai sắc ký cho đến khi dung môi đi được khoảng 8 cm, để khô ở nhiệt độ phòng. Phát hiện: quan sát sắc ký đồ dưới đèn UV 254 nm và sau khi phun thuốc thử vanilin – acid sulfuric, sấy ở 105 oC. Đánh giá: dịch chiết từ mẫu thử phải có vết cùng giá trị Rf và màu sắc tương ứng với vết 10-HDA trong dung dịch đối chiếu. 3.1.2.2. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng acid (E)-10-hydroxy-2decenoic bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Khảo sát thời gian chiết Khảo sát thời gian chiết siêu âm mẫu thử với dung môi chiết là methanol để đạt hiệu quả chiết 10-HDA tối ưu. Mẫu thử: cân chính xác khoảng 180 mg sữa ong chúa vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 10 ml methanol, siêu âm với các khoảng thời gian khác nhau, thêm methanol vừa đủ đến định mức, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm. Khảo sát điều kiện sắc ký Mẫu thử: cân chính xác 180 mg sữa ong chúa vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 10 ml methanol, siêu âm với thời gian đã khảo sát, thêm methanol vừa đủ đến định mức, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm, dịch lọc được tiêm vào hệ thống sắc ký. Mẫu đối chiếu: chuẩn 10-HDA được pha trong methanol, nồng độ 40 μg/ml. .