Tài liệu Xác định dư lượng cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin có trong nước thải nuôi trồng thủy sản bằng phương pháp lc ms ms

. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐINH THỊ THANH LOAN XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CLORAMPHENICOL, FLORFENICOL, THIAMPHENICOL, OFLOXACIN, CIPROFLOXACIN, ENROFLOXACIN CÓ TRONG NƢỚC THẢI NUÔI TRỒNG THỦY SẢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2018 . . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐINH THỊ THANH LOAN XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CLORAMPHENICOL, FLORFENICOL, THIAMPHENICOL, OFLOXACIN, CIPROFLOXACIN, ENROFLOXACIN CÓ TRONG NƢỚC THẢI NUÔI TRỒNG THỦY SẢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP LC-MS/MS Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất Mã số : 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC Hƣớng dẫn khoa học: TS. ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC TUẤN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2018 . . Luận văn Thạc sĩ Dƣợc học – Khóa: 2016 – 2018 Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất – Mã số: 8720210 XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CLORAMPHENICOL, FLORFENICOL, THIAMPHENICOL, OFLOXACIN, CIPROFLOXACIN, ENROFLOXACIN CÓ TRONG NƢỚC THẢI NUÔI TRỒNG THỦY SẢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP LC-MS/MS Đinh Thị Thanh Loan Thầy hƣớng dẫn: TS. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn Từ khóa: cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin, LC –MS/MS, nƣớc thải, phenicol, quinolon. Mở đầu: Kháng sinh đóng vai trò quan trọng trong chăm sóc sức khỏe nhân dân, phòng và trị bệnh trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh không hợp lý đã gây nên hiện tƣợng kháng thuốc, tồn dƣ thuốc trong nƣớc thải, vật nuôi. Bên cạnh đó, sự lây lan của các chủng vi khuẩn kháng thuốc ngày càng trở nên đáng báo động. Do có phổ kháng khuẩn rộng và khả năng phân bố tốt nên nhóm phenicol và nhóm quinolon đƣợc dùng rất phổ biến. Trong đó, đƣợc sử dụng nhiều là cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin. Hiện nay, đã có một số nghiên cứu phân tích riêng lẻ các kháng sinh trên bằng phƣơng pháp LC-MS/MS nhƣng chƣa có công bố về định lƣợng đồng thời 6 kháng sinh trên, đặc biệt là trên các mẫu nƣớc thải nuôi trồng thủy sản. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin có trong mẫu nƣớc thải nuôi trồng thủy sản. Phương pháp nghiên cứu: Xây dựng qui trình định lƣợng đồng thời cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nƣớc thải nuôi trồng thủy sản bằng kỹ thuật UPLC-MS/MS với bộ phận ion hóa phun điện tử. Các kháng sinh và nội chuẩn đƣợc tách trên cột sắc ký pha đảo, sử dụng hệ pha động gồm acetonitril, methanol, nƣớc chứa acid formic. Qui trình định lƣợng đƣợc thẩm định theo hƣớng dẫn của EC-657/2002. Kết quả: Cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin, nội chuẩn cloramphenicol-d5 và norfloxacin đƣợc ion hóa kiểu ESI với kỹ thuật ghi phổ MRM để thu đƣợc các mảnh mẹ và mảnh con dùng cho định lƣợng lần lƣợt nhƣ sau: m/z 321,14  152,01, m/z 356,14  335,94, m/z 354,14  184,98, m/z 362,22  261,03, m/z 332,29  231,08, m/z 360,35  245,17, m/z 326,14  156,95, m/z 320,16  233,01. Điều kiện sắc ký bao gồm cột Agilent ZORBAX Eclipse Plus (150 x 4,6 mm; 3,5 µm), pha động gồm acetonitril, methanol, nƣớc chứa acid formic theo chƣơng trình gradient, tốc độ dòng 1 ml/phút. Miền giá trị của các kháng sinh nằm trong khoảng 1200 ppb (r > 0,99). Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của 6 kháng sinh lần lƣợt nằm trong khoảng 0,1-1 ppb và 0,4-4 ppb. Các chỉ tiêu về tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác đều cho kết quả nằm trong giới hạn cho phép. Kết luận: Đề tài đã xây dựng và thẩm định thành công qui trình định lƣợng đồng thời cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacinn, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nƣớc thải nuôi trồng thủy sản bằng phƣơng pháp UPLC–MS/MS với độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác cao. Do đó, qui trình có thể đƣợc ứng dụng để xác định dƣ lƣợng 6 kháng ản. . . Master’s Thesis – Academic course: 2016 - 2018 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210 SIMULTANEOUS DETERMINATION OF CHLORAMPHENICOL, FLORFENICOL, THIAMPHENICOL, OFLOXACIN, CIPROFLOXACIN, ENROFLOXACIN IN AQUACULTURE WASTEWATER BY LC-MS/MS Dinh Thi Thanh Loan Supervisor: Dr. Do Chau Minh Vinh Tho, Assoc. Prof. Dr. Nguyen Duc Tuan Keywords: LC-MS/MS, wastewater, chloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin, quinolone, phenicol. Introduction: Antibiotics play an important role in people's health care, prevention and treatment in livestock and aquaculture. However, unreasonably antibiotics use cause drug resistance, drug residues in wastewater, and livestock. In addition, the spread of resistant strains of bacteria is becoming increasingly alarming. Due to its broad spectrum of antibacterial activity and its ability to distribute well, phenol and quinolone are commonly used. The most commonly used ones are chloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, and enrofloxacin. At present, there are some studies on analyzing separately these antibiotics by LC-MS/MS methods, but there is no published quantitative information on these 6 antibiotics, especially in aquaculture wastewater samples. Materials and methods Object of study: Chloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, and enrofloxacin in aquaculture wastewater samples. Methods: A method for quantification of chloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, and enrofloxacin in aquaculture wastewater was developed by UPLC-MS/MS equipped with an electrospray ionization source. Six antibiotics and 2 internal standards (IS) were seperated on a C18 reversed phase column, and finally eluted with acetonitrile, methanol, and water with formic acid. The assay was validated in compliance with EC-657/2002 guideline. Results: Electrospray ionization source operated in positive and negative mode, and multi reaction monitoring (MRM) mode were applied for analysis of chloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin, chloramphenicol-d5 IS, and norfloxacin, using the transition of m/z 332.29  231.08, m/z 362.22  261.03, m/z 360.35  245.17, m/z 320.16  233.01, m/z 321.14  152.01, m/z 326.14  156.95, m/z 354.14  184.98, m/z 356.14  335.94, respectively for quantification. LC conditions contain Agilent ZORBAX Eclipse Plus (150 x 4.6 mm; 3.5 µm) column, mobile phase of acetonitrile – methanol - water with formic acid in gradient mode, and flow rate of 1 mL/min. This method was validated and met the requirements of widely linearity range (1-200 ppb) with high correlation coefficient (r > 0.99), very good accuracy (recovery of 81.2-109.2%) and intra-day precision (RSD < 6.63%), and typical LOD and LOQ values in the range of 0.1-1 ppb and 0.4-4 ppb for six antibiotics, respectively. Conclusion: A highly sensitive, specific, reproducible and rapid UPLC-MS/MS method for simultaneous determination of chloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin in aquaculture wastewater was successfully developed and validated. This method can be useful for monitoring level of these antibiotics in aquaculture wastewater samples. . . LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này đƣợc đảm bảo tính trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kì công trình nghiên cứu khác. Ngƣời cam đoan Đinh Thị Thanh Loan . . i MỤC LỤC Trang TRANG PHỤ BÌA TÓM TẮT LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC ................................................................................................................... i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................ vi DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................viii DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ........................................................... ix MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 2 1.1. Tổng quan về cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin ........................................................................................ 2 1.1.1. Tổng quan về cloramphenicol .......................................................................... 2 1.1.1.1. Cấu trúc, tên hóa học ..................................................................................... 2 1.1.1.2. Tính chất ........................................................................................................ 2 1.1.1.3. Định tính ........................................................................................................ 2 1.1.1.4. Định lƣợng .................................................................................................... 3 1.1.1.5. Dƣợc lý và cơ chế tác dụng .......................................................................... 3 1.1.1.6. Tác dụng phụ và độc tính ............................................................................. 3 1.1.2. Tổng quan về florfenicol .................................................................................. 4 1.1.2.1. Cấu trúc, tên hóa học ..................................................................................... 4 1.1.2.2. Tính chất ....................................................................................................... 4 1.1.2.3. Định tính ........................................................................................................ 5 1.1.2.4. Định lƣợng .................................................................................................... 5 1.1.2.5. Dƣợc lý và cơ chế tác dụng ........................................................................... 6 1.1.2.6. Tác dụng phụ và độc tính ............................................................................. 6 . . ii 1.1.3. Tổng quan về thiamphenicol ............................................................................ 7 1.1.3.1. Cấu trúc, tên hóa học ..................................................................................... 7 1.1.3.2. Tính chất ....................................................................................................... 7 1.1.3.3. Định tính ........................................................................................................ 7 1.1.3.4. Định lƣợng .................................................................................................... 7 1.1.3.5. Dƣợc lý và cơ chế tác dụng ........................................................................... 8 1.1.3.6. Tác dụng phụ và độc tính ............................................................................. 8 1.1.4. Tổng quan về ofloxacin .................................................................................... 9 1.1.4.1. Cấu trúc, tên hóa học ..................................................................................... 9 1.1.4.2. Tính chất ....................................................................................................... 9 1.1.4.3. Định tính ........................................................................................................ 9 1.1.4.4. Định lƣợng .................................................................................................. 10 1.1.4.5. Dƣợc lý và cơ chế tác dụng ......................................................................... 10 1.1.4.6. Tác dụng phụ và độc tính ........................................................................... 10 1.1.5. Tổng quan về ciprofloxacin hydroclorid ........................................................ 11 1.1.5.1. Cấu trúc, tên hóa học ................................................................................... 11 1.1.5.2. Tính chất ..................................................................................................... 11 1.1.5.3. Định tính ...................................................................................................... 11 1.1.5.4. Định lƣợng .................................................................................................. 12 1.1.5.5. Dƣợc lý và cơ chế tác dụng ......................................................................... 13 1.1.5.6. Tác dụng phụ và độc tính ............................................................................ 13 1.1.6. Tổng quan về enrofloxacin............................................................................. 14 1.1.6.1. Cấu trúc, tên hóa học ................................................................................... 14 1.1.6.2. Tính chất ..................................................................................................... 14 1.1.6.3. Định tính ...................................................................................................... 14 1.1.6.4. Định lƣợng .................................................................................................. 14 1.1.6.5. Dƣợc lý và cơ chế tác dụng ......................................................................... 15 1.1.6.6. Tác dụng phụ và độc tính ........................................................................... 15 1.2. Ảnh hƣởng của dƣ lƣợng kháng sinh trong nƣớc thải ..................................... 16 . . iii 1.3. Một số nghiên cứu liên quan đến phƣơng pháp định lƣợng cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nƣớc thải bằng phƣơng pháp LC-MS/MS ................................................................................ 17 1.4. Tổng quan về phƣơng pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu nƣớc thải .................... 20 1.4.1. Phƣơng pháp lấy mẫu nƣớc thải..................................................................... 20 1.4.1.1. Địa điểm lấy mẫu ........................................................................................ 20 1.4.1.2. Thời gian lấy mẫu và phân tích mẫu ........................................................... 20 1.4.1.3. Số lƣợng lấy mẫu ....................................................................................... 20 1.4.1.4. Yêu cầu chất lƣợng bình chứa mẫu ............................................................. 21 1.4.1.5. Phƣơng pháp lấy mẫu .................................................................................. 21 1.4.1.6. Thiết bị lấy mẫu .......................................................................................... 22 1.4.1.7. Thể tích lấy mẫu .......................................................................................... 22 1.4.2. Phƣơng pháp bảo quản mẫu nƣớc thải ........................................................... 22 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 23 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu........................................................................................ 23 2.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu ......................................................................... 23 2.3. Phƣơng tiện nghiên cứu .................................................................................... 23 2.3.1. Hóa chất, thuốc thử ........................................................................................ 23 2.3.2. Chất chuẩn đối chiếu và nội chuẩn ................................................................ 23 2.3.3. Trang thiết bị .................................................................................................. 24 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................... 25 2.4.1. Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nƣớc thải nuôi trồng thủy sản bằng phƣơng pháp LC-MS/MS ................................................................. 25 2.4.1.1. Khảo sát sự lựa chọn nội chuẩn .................................................................. 25 2.4.1.2. Khảo sát điều kiện khối phổ ....................................................................... 25 2.4.1.3. Khảo sát điều kiện sắc ký ........................................................................... 26 2.4.1.4. Khảo sát quy trình xử lý mẫu ...................................................................... 27 2.4.1.5. Khảo sát sự ổn định mẫu ............................................................................ 29 . . iv 2.4.1.6. Khảo sát sự ảnh hƣởng nhiễu nền lên chất phân tích .................................. 29 2.4.2. Thẩm định quy trình định lƣợng đồng thời cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nƣớc thải nuôi trồng thủy sản bằng phƣơng pháp LC-MS/MS ................................................................. 29 2.4.2.1. Tính tƣơng thích hệ thống ........................................................................... 29 2.4.2.2. Tính đặc hiệu ............................................................................................... 29 2.4.2.3. Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn ............................................................ 30 2.4.2.4. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng ..................................................... 31 2.4.2.5. Độ đúng và độ chính xác ............................................................................. 31 2.4.3. Ứng dụng quy trình để xác định đồng thời dƣ lƣợng cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin có trong một số mẫu nƣớc thải nuôi trồng thủy sản bằng phƣơng pháp LC-MS/MS ........................ 32 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................. 33 3.1. Xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nƣớc thải nuôi trồng thủy sản bằng phƣơng pháp LC-MS/MS ................................................................. 33 3.1.1. Khảo sát sự lựa chọn nội chuẩn .................................................................... 33 3.1.2. Khảo sát điều kiện khối phổ .......................................................................... 34 3.1.3. Khảo sát điều kiện sắc ký ............................................................................... 39 3.1.4. Khảo sát quy trình xử lý mẫu ........................................................................ 46 3.1.5. Khảo sát sự ổn định mẫu ................................................................................ 47 3.1.6. Khảo sát sự ảnh hƣởng nhiễu nền lên chất phân tích ..................................... 48 3.2. Thẩm định quy trình định lƣợng đồng thời cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nƣớc thải nuôi trồng thủy sản bằng phƣơng pháp LC-MS/MS ................................................................. 49 3.2.1. Tính phù hợp hệ thống ................................................................................... 49 3.2.2. Tính đặc hiệu .................................................................................................. 50 3.2.3. Đƣờng chuẩn và khoảng tuyến tính ............................................................... 53 3.2.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng .................................................... 54 . . v 3.2.5. Độ đúng và độ chính xác ................................................................................ 56 3.3. Ứng dụng quy trình để xác định đồng thời dƣ lƣợng cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong một số mẫu nƣớc thải nuôi trồng thủy sản bằng phƣơng pháp LC-MS/MS ............................... 57 Chƣơng 4. BÀN LUẬN .......................................................................................... 60 4.1. Xây dựng quy trình định lƣợng ......................................................................... 60 4.1.1. Khảo sát nội chuẩn ......................................................................................... 60 4.1.2. Khảo sát điều kiện khối phổ tối ƣu ................................................................ 60 4.1.3. Khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp............................................................... 64 4.1.4. Khảo sát quy trình xử lý mẫu thích hợp ......................................................... 67 4.1.5. Khảo sát sự ổn định mẫu phân tích ................................................................ 68 4.1.6. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiễu nền lên chất phân tích ................................... 68 4.2. Thẩm định quy trình định lƣợng ....................................................................... 68 4.2.1. Tính tƣơng thích hệ thống .............................................................................. 68 4.2.2. Tính đặc hiệu ................................................................................................. 69 4.2.3. Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn ............................................................... 70 4.2.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng .................................................... 70 4.2.5. Độ đúng và độ chính xác ................................................................................ 71 4.3. Ứng dụng quy trình định lƣợng đã thẩm định................................................... 71 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 72 5.1. Kết luận ............................................................................................................. 72 5.2. Kiến nghị ........................................................................................................... 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC . . vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Từ nguyên AF Acid formic AS Analyte Standard Chất chuẩn phân tích AOAC Association of Official Analytical Hiệp hội các nhà hóa học Chemists phân tích Atmospheric Pressure Chemical Ion hóa hóa học ở áp suất Ionization khí quyển CID Collision-Induced Dissociation Va chạm gây ra sự phân ly CIP Ciprofloxacin CLOR Cloramphenicol CV Coefficient of Variation CLOR-d5 Cloramphenicol-d5 EMA European Medicines Agency ERF Enrofloxacin ESI Electronspray Ionization APCI Ý nghĩa Hệ số phân tán Cơ quan quản lý dƣợc phầm Châu Âu Ion hóa bằng cách phun điện tử The United States Food and Drug Cục Quản lý thuốc và Thực Administration phẩm Hoa Kỳ FLD Flourescence Detector Đầu dò huỳnh quang FLOR Florfenicol FDA HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao IS Internal Standard Nội chuẩn ISBN International Standard Mã số tiêu chuẩn quốc tế . . Chữ viết tắt vii Từ nguyên Ý nghĩa Book Number cho sách Liquid Chromatography – Mass Sắc ký lỏng ghép hai lần Spectrometry/ Mass Spectrometry khối phổ LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lƣợng MeOH Methanol MRM Multiple Reaction Monitoring NOR Norfloxacin OFL Ofloxacin Ppm Parts per million Phần triệu Ppb Parts per billion Phần tỷ Rs Resolution factor Hệ số phân giải RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối S Area Diện tích S/N Signal / Noise Tín hiệu / Nhiễu SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SPME Solid Phase Microextraction Vi chiết pha rắn SPE Solid Phase Extraction Chiết pha rắn SRM Single Reaction Monitoring TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam THI Thiamphenicol UPLC Ultra Performance Liquid LC-MS/MS Tiêu chuẩn Việt Nam Sắc ký lỏng siêu hiệu năng Chromatography USA The United States of America Hoa Kỳ WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới . . viii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Một số công trình nghiên cứu định lƣợng cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nƣớc thải bằng phƣơng pháp LC-MS/MS ..................................................................................................... 17 Bảng 1.2. Giá trị K tƣơng ứng với mỗi mức tin cậy ................................................ 21 Bảng 2.1. Hóa chất, thuốc thử đƣợc dùng trong nghiên cứu ................................... 23 Bảng 2.2. Chất chuẩn đối chiếu và nội chuẩn đƣợc dùng trong nghiên cứu ........... 24 Bảng 2.3. Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ................................................. 24 Bảng 2.4. Giới hạn sai lệch cho phép tối đa của tỉ lệ ion ........................................ 30 Bảng 3.1. Thông tin khảo sát nội chuẩn ................................................................... 33 Bảng 3.2. Điều kiện khối phổ tối ƣu các kháng sinh phân tích ............................... 34 Bảng 3.3. Chƣơng trình gradient pha động thích hợp phân tích đồng thời CLOR, FLOR, THI, CIP, OFL, ERF. ................................................................................... 45 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu ..................................................... 47 Bảng 3.5. Khảo sát độ ổn định mẫu ........................................................................ 48 Bảng 3.6. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của nền mẫu lên chất phân tích ................. 48 Bảng 3.7. Kết quả tính tƣơng thích hệ thống ........................................................... 49 Bảng 3.8. Tỉ lệ ion định tính và định lƣợng các kháng sinh phân tích ................... 52 Bảng 3.9. Độ lệch chuẩn thời gian lƣu cho các chất phân tích. ............................... 52 Bảng 3.10. Khoảng tuyến tính, phƣơng trình hồi quy và hệ số tƣơng quan ........... 53 Bảng 3.11. LOD, LOQ của các chất cần phân tích. ................................................. 55 Bảng 3.12. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và liên ngày của các chất. .............. 56 Bảng 3.13. Kết quả phân tích trên 60 mẫu nƣớc thải vùng nuôi trồng thủy sản tại 4 tỉnh. ................................................................................................................... 57 Bảng 4.1. So sánh kết quả khảo sát pha tĩnh tìm điều kiện sắc ký tối ƣu ................ 65 . . ix DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1. Công thức cấu tạo của cloramphenicol ..................................................... 2 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của florfenicol ............................................................. 4 Hình 1.3. Công thức cấu tạo của thiamphenicol ....................................................... 7 Hình 1.4. Công thức cấu tạo của ofloxacin ............................................................... 9 Hình 1.5. Phổ IR của ofloxacin chuẩn .................................................................... 10 Hình 1.6. Công thức cấu tạo của ciprofloxacin hydroclorid .................................. 11 Hình 1.7. Phổ IR của ciprofloxacin ......................................................................... 12 Hình 1.8. Công thức cấu tạo của enrofloxacin ........................................................ 14 Hình 2.1. Hệ thống LC-MS/MS Xevo-TQD của Waters ......................................... 25 Hình 2.2. Quy trình xử lý mẫu 1 .............................................................................. 27 Hình 2.3. Quy trình xử lý mẫu 2 .............................................................................. 28 Hình 2.4. Quy trình xử lý mẫu 3 .............................................................................. 28 Hình 3.1. Kết quả năng lƣợng phân mảnh tối ƣu tín hiệu cho nội chuẩn CLOR-d5 (a) và NOR (b) ........................................................................................................ 33 Hình 3.2. Kết quả Auto-tune và Manual-tune của chất chuẩn ofloxacin. ................ 35 Hình 3.3. Kết quả Auto-tune và Manual-tune của chất chuẩn cloramphenicol ...... 36 Hình 3.4. Cơ chế phân mảnh và các mảnh con của các chất phân tích ................... 39 Hình 3.5. Sắc ký đồ khảo sát cột sắc ký thích hợp................................................... 42 Hình 3.6. Sắc ký đồ khảo sát pH pha động. ............................................................. 44 Hình 3.7. SKĐ phân tích đồng thời CLOR, FLOR, THI, CIP, OFL, ERF ở điều kiện khối phổ tối ƣu và sắc ký thích hợp. ........................................................................ 46 Hình 3.8. Hiệu suất thu hồi các chất phân tích qua các quy trình xử lý mẫu. ......... 47 Hình 3.9. Sắc ký đồ overlay 6 lần tiêm liên tiếp của cloramphenicol. .................... 50 Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn lần 2 của chất cloramphenicol. ............................................................. 50 Hình 3.11. Phổ đồ MS fullscan ES+ của mẫu trắng thêm chuẩn.............................. 51 . . x Hình 3.12. Phổ đồ Daughter Scan của ciprofloxacin. .............................................. 51 Hình 3.13. Đƣờng tuyến tính của CIP (a) và CLOR (b) đƣợc truy xuất từ phần mềm Masslynx 4.1 ............................................................................................................ 54 Hình 3.14. S/N xác định LOD, LOQ của các kháng sinh phân tích. ...................... 55 Hình 4.1. Phân mảnh con trong đặc trƣng cho phân tích định lƣợng CLOR, THIAM, FLOR, CIP, OFL, ERF và nội chuẩn NOR bằng kỹ thuật LC-MS/MS so với Thƣ viện Phổ chuẩn châu Âu (European Massbank) ..................................................... 64 Hình 4.2. Sắc ký đồ minh họa hệ acetonitril - nƣớc acid formic pH 2,99 ............... 66 . . 1 MỞ ĐẦU Kháng sinh đã và đang đóng vai trò quan trọng trong chăm sóc sức khỏe nhân dân, phòng và trị bệnh trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh không hợp lý đã gây nên hiện tƣợng kháng thuốc, tồn dƣ thuốc trong nƣớc thải, vật nuôi, ảnh hƣởng xấu đến hiệu quả điều trị bệnh, sức khỏe cộng đồng và môi trƣờng [9],[36]. Sự lây lan của các chủng vi khuẩn kháng thuốc ngày càng trở nên đáng báo động. Trên thế giới đã phát hiện rất nhiều chủng vi khuẩn kháng thuốc, siêu kháng thuốc [23],[25],[27],[44],[53]. Chính vì vậy, để tăng cƣờng kiểm soát dƣ lƣợng kháng sinh, các nƣớc phát triển đã có những qui định rất chặt chẽ và kiểm soát nghiêm ngặt [32],[52]. Do có phổ kháng khuẩn rộng và khả năng phân bố tốt nên kháng sinh nhóm phenicol và nhóm quinolon đƣợc dùng phổ biến. Trong hai nhóm này, các kháng sinh đƣợc sử dụng nhiều nhất là cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin [9]. Các kháng sinh nhóm phenicol rất độc, có thể gây hội chứng xám, suy tủy và dẫn đến tử vong. Các kháng sinh nhóm quinolon có thể gây hủy hoại mô sụn, lú lẫn, co giật, ảo giác [2]. Hiện nay, đã có một số công bố quy trình phân tích riêng lẻ cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nƣớc thải bằng phƣơng pháp LC-MS/MS [6],[10],[18],[20],[30],[37],[41],[42],[46] nhƣng chƣa có công bố về định lƣợng đồng thời tất cả các kháng sinh trên trong nƣớc thải. Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Xác định dư lượng cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin có trong nước thải nuôi trồng thủy sản bằng phương pháp LC-MS/MS” đƣợc thực hiện với các mục tiêu sau: - Xây dựng và thẩm định quy trình định lƣợng cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong mẫu thử giả lập bằng phƣơng pháp LC-MS/MS. - Ứng dụng quy trình đã đƣợc thẩm định để xác định đồng thời dƣ lƣợng cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nƣớc thải nuôi trồng thủy sản bằng phƣơng pháp LC-MS/MS. . . 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin 1.1.1. Tổng quan về cloramphenicol 1.1.1.1. Cấu trúc, tên hóa học Tên khoa học: 2,2-dicloro-N-[(1R,2R)-2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)-2-(4- nitrophenyl) ethyl] acetamid [1]. Công thức phân tử: C11H12Cl2N2O5 [1],[25]. Công thức cấu tạo: Hình 1.1. Công thức cấu tạo của cloramphenicol [1]. Phân tử lƣợng: 323,132 g/mol [1],[25]. 1.1.1.2. Tính chất Bột kết tinh màu trắng, trắng xám hoặc trắng vàng hay tinh thể hình kim hoặc phiến dài, khó tan trong nƣớc, dễ tan trong ethanol 96% và trong propylen glycol [1]. Dung dịch trong ethanol thì hữu tuyền, trong ethyl acetat thì tả tuyền [1]. 1.1.1.3. Định tính Có thể chọn một trong hai nhóm phép thử định tính sau: Nhóm 1: A, B Nhóm 2: B, C, D, E A. Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của cloramphenicol chuẩn [1]. B. Điểm chảy từ 149 oC đến 153 oC [1]. C. Trong phần thử tạp chất liên quan, vết chính trên sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng của 1 µl dung dịch thử phải tƣơng đƣơng với vết chính của dung dịch đối chiếu (1) về vị trí và kích thƣớc [1]. D. Hòa tan khoảng 10 mg chế phẩm trong 1 ml ethanol 50%, thêm 3 ml dung dịch . . 3 calci clorid 1% và 50 mg bột kẽm, đun cách thủy 10 phút. Lọc dung dịch nóng và để nguội. Thêm 0,1 ml benzoyl clorid và lắc 1 phút. Thêm 0,5 ml dung dịch sắt (III) clorid 10,5% và 2 ml cloroform, lắc. Lớp nƣớc có màu đỏ tím nhạt đến đỏ tía [1]. E. Lấy 50 mg chế phẩm vào chén sứ, thêm 0,5 g natri carbonat khan, đốt trên ngọn lửa trong 10 phút, để nguội. Hòa tan cắn bằng 5 ml dung dịch acid nitric 2 M và lọc. Lấy 1 ml dịch lọc, thêm 1 ml nƣớc, thêm 0,4 ml dung dịch bạc nitrat 2%, lắc và để yên, sẽ tạo tủa trắng lổn nhổn. Lọc lấy tủa, rửa tủa 3 lần, mỗi lần với 1 ml nƣớc, phân tán tủa trong 2 ml nƣớc và thêm 1,5 ml dung dịch amoniac 10 M, tủa tan dễ dàng [1]. 1.1.1.4. Định lượng Hòa loãng một thể tích chế phẩm có chứa 20 mg cloramphenicol với nƣớc thành 200 ml. Lấy 10 ml dung dịch này cho vào bình định mức 100 ml, thêm nƣớc vừa đủ đến vạch. Lắc kỹ và đo độ hấp thu của dung dịch thu đƣợc ở bƣớc sóng cực đại 278 nm, cốc đo dày 1 cm, dùng nƣớc làm mẫu trắng. Tính hàm lƣợng của cloramphenicol, C11H12Cl2N2O5, theo A (1%, 1 cm). Lấy 297 là giá trị A (1%, 1 cm) ở cực đại 278 nm [1]. 1.1.1.5. Dược lý và cơ chế tác dụng Cloramphenicol thƣờng có tác dụng kìm khuẩn, nhƣng có thể diệt khuẩn ở nồng độ cao hoặc đối với những vi khuẩn nhạy cảm cao. Cloramphenicol ức chế tổng hợp protein ở những vi khuẩn nhạy cảm bằng cách gắn vào tiểu đơn vị 50S của ribosom. Cloramphenicol có thể gây ức chế tủy xƣơng và có thể không hồi phục đƣợc [2]. Tỷ lệ kháng thuốc đối với cloramphenicol ở Việt Nam trong năm 1998: Shigella flexneri (85%), Escherichia coli (83%), Enterobacter spp. (80%), Staphylococcus aureus (64%), Salmonella typhi (81%), Streptococcus pneumoniae (42%), Streptococcus pyogenes (36%), Haemophilus influenzae (28%). Thử nghiệm in vitro cho thấy sự kháng thuốc đối với cloramphenicol tăng dần từng bƣớc. Sự kháng thuốc này là do sử dụng quá mức và đƣợc lan truyền qua plasmid [2]. 1.1.1.6. Tác dụng phụ và độc tính Những tác dụng không mong muốn của cloramphenicol có thể rất nghiêm trọng, do . . 4 đó phải tránh việc điều trị kéo dài hoặc nhắc lại. Tác dụng không mong muốn nghiêm trọng nhất là thiếu máu không tái tạo, không phục hồi do suy tủy xƣơng, thƣờng gây tử vong và có tần xuất khoảng 1 trong 10000 ca điều trị [2]. Thƣờng gặp (ADR > 1/100): Ngoại ban, buồn nôn, nôn, tiêu chảy [2]. Ít gặp (1/1000 < ADR < 1/100): Giảm bạch cầu hạt, giảm tiểu cầu và thiếu máu với giảm hồng cầu lƣới, tất cả có thể phục hồi, mày đay, phản ứng quá mẫn [2]. Hiếm gặp (ADR < 1/1000): Nhức đầu, mất bạch cầu hạt, giảm toàn thể huyết cầu, thiếu máu không tái tạo, viêm dây thần kinh thị giác, viêm đa thần kinh ngoại biên, liệt cơ mắt, và lú lẫn, hội chứng xám [2]. Những tác dụng không mong muốn về máu với sự ức chế tủy xƣơng không phục hồi dẫn đến thiếu máu không tái tạo, có tỷ lệ tử vong cao, có thể xảy ra chậm tới nhiều tháng sau điều trị. Giảm bạch cầu hạt, giảm tiểu cầu và thiếu máu có giảm hồng cầu lƣới có thể phục hồi xảy ra ở ngƣời lớn với liều trên 25 g [2]. 1.1.2. Tổng quan về florfenicol 1.1.2.1. Cấu trúc, tên hóa học Tên khoa học: 2,2-dicloro-N-[(1R,2S)-3-floro-1-hydroxy-1-(4-methanesulfonylphenyl)propan-2yl] acetamid [47],[48]. Công thức phân tử: C12H14Cl2FNO4S [47],[48]. Công thức cấu tạo: Hình 1.2. Công thức cấu tạo của florfenicol [47]. Phân tử lƣợng: 358,21 g/mol [47]. 1.1.2.2. Tính chất Chất rắn, dạng bột, màu trắng, không mùi, vị đắng, khó tan trong nƣớc, tan nhiều trong lipid và dung môi hữu cơ [48]. . . 5 1.1.2.3. Định tính Florfenicol đƣợc định tính bằng phƣơng pháp HPLC theo TCVN 8374 : 2010 [15]. 1.1.2.4. Định lượng Florfenicol đƣợc định lƣợng bằng phƣơng pháp HPLC theo TCVN 8374 : 2010 [15] Điều kiện sắc ký: - Cột sắc ký: C8 (150 x 4,6 mm; 5 m). - Thể tích tiêm mẫu: 10 µl. - Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Bƣớc sóng phát hiện: 220 nm. - Thời gian: 10 phút - Pha động: acetonitril - đệm amoni acetat pH 4,8 (25:75, tt/tt) Dung dịch chuẩn gốc, nồng độ 1 mg/ml: Cân chính xác 50 mg ± 0,1 mg florfenicol chuẩn, cho vào bình định mức 50 ml, hòa tan bằng acetonitril, lắc đều đến khi tan hoàn toàn và định mức đến vạch. Dung dịch chuẩn trung gian, nồng độ 100 µg/ml: Hút 1 ml dung dịch chuẩn gốc, cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch bằng acetonitril. Dung dịch chuẩn, nồng độ 0; 0,1; 0,5; 1; 2,5 và 5 µg/ml: Hút lần lƣợt 0 µl, 10 µl, 50 µl, 100 µl, 250 µl, 500 µl dung dịch chuẩn trung gian vào các bình định mức 10 ml, định mức đến vạch bằng hỗn hợp pha động. Dung dịch thử: Cân 3,0 g ± 0,1 g mẫu vào ống ly tâm dung tích 15 ml. Cho 2 ml nƣớc cất vào, đậy nắp, lắc đều. Thêm tiếp 6 ml ethyl acetat, lắc khoảng 5 phút bằng máy lắc, sau đó ly tâm 7 phút ở tốc độ 4000 vòng/phút. Hút 4 ml lớp trên cho vào ống ly tâm dung tích 15 ml và làm khô dung dịch bằng hệ thống thổi khí nitơ ở nhiệt độ 50 oC. Hoà tan phần cắn bằng 1 ml n-hexan, sau đó cho tiếp 1 ml hỗn hợp pha động, lắc khoảng 2 phút trên máy lắc, ly tâm 5 phút ở tốc độ 4000 vòng/phút. Hút bỏ lớp n-hexan ở trên, lấy lớp dƣới lọc qua màng lọc 0,22 µm. Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Hàm lƣợng florfenicol trong mẫu thử (C) đƣợc tính bằng miligam trên kilogam sản phẩm (mg/kg) theo công thức: .