Tài liệu Tổng hợp và tiêu chuẩn hóa tạp chất liên quan 2 azaspiro[4.5]decan 3 on (tạp a) của gabapentin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ THANH LONG TỔNG HỢP VÀ TIÊU CHUẨN HÓA TẠP CHẤT LIÊN QUAN 2-AZASPIRO[4.5]DECAN-3-ON (TẠP A) CỦA GABAPENTIN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ THANH LONG TỔNG HỢP VÀ TIÊU CHUẨN HÓA TẠP CHẤT LIÊN QUAN 2-AZASPIRO[4.5]DECAN-3-ON (TẠP A) CỦA GABAPENTIN Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc – Độc chất Mã số : 60.72.04.10 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC TUẤN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Lê Thanh Long Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2015 – 2017 Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc và Độc chất – Mã số: 60.72.04.10 TỔNG HỢP VÀ TIÊU CHUẨN HÓA TẠP CHẤT LIÊN QUAN 2-AZASPIRO[4.5]DECAN-3-ON (TẠP A) CỦA GABAPENTIN Lê Thanh Long Thầy hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn Từ khóa: 2-azaspiro[4.5]decan-3-on, tạp A gabapentin, γ-lactam. Mở đầu: 2-azaspiro[4.5]decan-3-on (tạp A) là tạp phân hủy của gabapentin do sự đóng vòng γ-lactam. Độc tính của tạp A cao gấp 20 lần so với gabapentin nên gây ảnh hưởng không nhỏ đến hiệu quả điều trị lâm sàng và đặc tính an toàn của thành phẩm chứa gabapentin. Do đó, trong chuyên luận gabapentin của BP 2017, EP 9.0 và USP 40 đều quy định phải kiểm tra giới hạn hàm lượng tạp A cả trong nguyên liệu và thành phẩm. Trong khi đó, tạp A chuẩn USP đang được bán với giá rất đắt nên gây không ít khó khăn cho công tác kiểm nghiệm tạp chất này. Cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào trong nước công bố quy trình tổng hợp tạp A. Từ nhu cầu thực tế trên, nghiên cứu tổng hợp tạp A từ gabapentin đã được thực hiện nhằm hướng đến việc thiết lập chất đối chiếu tạp A. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: tạp A. Phương pháp nghiên cứu: Tạp A được tổng hợp bằng cách đun gabapentin trong nước với một số tác nhân xúc tác tạo môi trương kiềm như natri carbonat, natri hydrocarbonat, natri tetraborat decahydrat, natri hydroxyd; sau đó tạp A được chiết xuất bằng diclorometan. Sử dụng phần mềm Modde 5.0 để thiết kế mô hình thực nghiệm và tối ưu các thông số ảnh hưởng đến phản ứng tổng hợp như tỷ lệ chất tham gia phản ứng, nhiệt độ và thời gian phản ứng. Sản phẩm tổng hợp được xác định sơ bộ độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng, sau đó được xác cấu trúc bằng các kỹ thuật phổ nghiệm như IR, MS và NMR; được xác định độ tinh khiết bằng phương pháp HPLC quy về 100% diện tích pic và được thiết lập chất đối chiếu. Sau cùng, tạp A trong nguyên liệu và chế phẩm gabapentin được xác định bằng phương pháp HPLC, sử dụng chất đối chiếu tạp A đã được thiết lập. Kết quả: Tạp A đã được tổng hợp thành công từ gabapentin bằng phản ứng đóng vòng γ-lactam với xúc tác natri tetraborat. Điều kiện phản ứng đã được tối ưu hoá với mô hình Box – Behnken cho hiệu suất trên 90% (4,02 gam). Sản phẩm tổng hợp đạt độ tinh khiết trên 99% tính trên nguyên trạng, đủ điều kiện thiết lập chất đối chiếu. Quy trình HPLC định lượng đồng thời gabapentin và tạp A trong nguyên liệu và chế phẩm đã được xây dựng và thẩm định đạt yêu cầu của một quy trình kiểm nghiệm. Kết luận: Tạp A đã được tổng hợp và tiêu chuẩn hóa thành công để làm chất đối chiếu sử dụng trong kiểm nghiệm tạp chất liên quan của gabapentin. Quy trình HPLC định lượng đồng thời gabapentin và tạp A có thể được ứng dụng để kiểm tra hàm lượng gabapentin và tạp A trong nguyên liệu và chế phẩm chứa gabapentin. Master’s Thesis – Academic course: 2015 - 2017 Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 60.72.04.10 SYNTHESIS AND STANDARDIZATION OF 2-AZASPIRO[4.5]DECAN-3-ONE AS RELATED IMPURITIY OF GABAPENTIN Le Thanh Long Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Nguyen Duc Tuan Keywords: 2-azaspiro[4.5]decan-3-one, gabapentin impurity A, γ-lactam. Introduction: 2-azaspiro[4.5]decan-3-one (gabapentin impurity A) is a degraded compound of gabapentin due to γ-lactam cyclization. Impurity A is 20 times more toxic than gabapentin. The presence of this impurity may influence treatment efficacy and safety of gabapentin. The BP 2017, EP 9.0 and USP 40 require conducting the impurity test in gabapentin pharmaceutical substance as well as corresponding finished products. Additionally, the mentioned impurity reference standard is costly with limited accessibility. There have been no published local studies on chemical synthesis of gabapentin impurity A so far. Therefore, in this study, impurity A was synthesized from gabapentin in order to establish the reference standard. Materials and methods: Object of study: gabapentin impurity A. Methods: Gabapentin was heated in the distilled water with several alkaline catalysts such as sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, sodium tetraborate decahydrate, sodium hydroxide and then the target was extracted by dichloromethane. Modde 5.0 software was used to design experimental model and optimize the parameters of the reaction such as ratio of gabapentin and sodium tetraborate, temperature, and reaction time. The purity of the synthesized product was preliminarily determined by thin layer chromatography, and then the structure of synthesized compound was elucidated by IR, MS and NMR data; determined the purity by HPLC using peak area normalization method, and established as reference substance. Finally, the assay of impurity A in gabapentin raw materials and corresponding pharmaceuticals was determined by HPLC method, using the established impurity A reference standard. Results: Gabapentin impurity A was successfully synthesized by γ-lactam cyclization of gabapentin with the catalysis of sodium tetraborate. The synthetic process was optimized by Modde 5.0 software using Box – Behnken model that gave optimized yield over 90% (4.02 gram). The purity of the synthesized impurity A was more than 99% on basis and conformed to establish reference substance. Additionally, a HPLC method for simultaneous assay of gabapentin and impurity A in gabapentin raw materials and corresponding pharmaceuticals was successfully developed and validated. Conclusion: Impurity A was successfully synthesized and standardized as reference substance for related impurity test of gabapentin. The validated HPLC method can be applied for simultaneously quantitative determination of gabapentin and impurity A in gabapentin raw materials and corresponding phamaceuticals. ii MỤC LỤC Trang TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................i MỤC LỤC ...................................................................................................................ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................................iv DANH MỤC CÁC BẢNG.........................................................................................vi DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ......................................................... viii MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3 1.1. Tổng quan về gabapentin ..................................................................................... 3 1.2. Tổng quan về 2-azaspiro[4.5]decan-3-on (tạp A) ................................................ 8 1.3. Một số công trình nghiên cứu về tạp A .............................................................. 13 1.4. Xác định độ tinh khiết bằng phân tích nhiệt vi sai (DSC) ................................. 18 1.5. Chất đối chiếu .................................................................................................... 21 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 24 2.1. Nguyên vật liệu – Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................... 24 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................... 25 2.2.1. Tổng hợp tạp A từ gabapentin......................................................................... 25 2.2.2. Thử tinh khiết .................................................................................................. 26 2.2.3. Xác định cấu trúc sản phẩm tổng hợp ............................................................. 27 2.2.4. Tối ƣu hóa quy trình tổng hợp tạp A bằng mô hình Box – Behnken.............. 27 2.2.5. Xây dựng quy trình xác định độ tinh khiết tạp A bằng HPLC ....................... 27 2.2.6. Đánh giá tạp A ................................................................................................ 30 2.2.7. Thiết lập chất đối chiếu tạp A ......................................................................... 31 2.2.8. Xây dựng quy trình định lƣợng gabapentin và tạp A trong nguyên liệu và thành phẩm chứa gabapentin ..................................................................................... 34 iii CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................. 44 3.1. Tổng hợp tạp A từ gabapentin............................................................................ 44 3.2. Thử tinh khiết sản phẩm tổng hợp A.................................................................. 45 3.3. Xác định cấu trúc sản phẩm tổng hợp A ............................................................ 53 3.4. Hiệu suất tổng hợp tạp A.................................................................................... 57 3.5. Tối ƣu hóa quy trình tổng hợp tạp A bằng mô hình Box – Behnken................. 58 3.6. Xây dựng quy trình xác định độ tinh khiết tạp A bằng HPLC .......................... 61 3.7. Xác định độ tinh khiết, nhiệt độ nóng chảy tạp A bằng DSC và hàm ẩm bằng Karl Fischer ............................................................................................................... 67 3.8. Đánh giá tạp A ................................................................................................... 68 3.9. Thiết lập chất đối chiếu tạp A ............................................................................ 68 3.10. Xây dựng quy trình định lƣợng gabapentin và tạp A trong nguyên liệu và thành phẩm chứa gabapentin ..................................................................................... 70 CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN ........................................................................................ 86 4.1. Tổng hợp tạp A .................................................................................................. 86 4.2. Xác định độ tinh khiết tạp A bằng HPLC .......................................................... 86 4.3. Thiết lập chất đối chiếu tạp A ............................................................................ 87 4.4. Định lƣợng gabapentin và tạp A trong nguyên liệu và thành phẩm chứa gabapentin ................................................................................................................. 87 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 89 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT TỪ VIẾT TẮT TỪ NGUYÊN NGHĨA TIẾNG VIẾT ACN Acetonitrile AS Asymmetric factor Hệ số bất đối (Hệ số đối xứng) BP British Pharmacopoeia Dƣợc điển Anh CE Capillary electrophoresis Điện di mao quản DSC Differential Scanning Calorimetry Nhiệt vi sai European Pharmacopoeia Dƣợc điển châu Âu High performance Sắc ký lỏng liquid chromatography hiệu năng cao H Height Chiều cao pic IR Infrared Hồng ngoại LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lƣợng MeOH Methanol MS Mass spectrum Phổ khối N-methyl-N- N-methyl-N- EP HPLC MSTFA trimethylsilyltrifluoroacetamide trimethylsilyltrifluoroacetamid N Number of theoretical plate Số đĩa lý thuyết NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân RS Resolution Độ phân giải RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối S Peak area Diện tích pic Độ lệch chuẩn của độ đồng Sbb nhất giữa các lọ Độ lệch chuẩn lặp lại Sr SKLM Sắc ký lớp mỏng v tR Retention time Thời gian lƣu TFA Trifluoroacetic acid Acid trifluoroacetic Độ không đảm bảo đo từ độ Ubb đồng nhất giữa các lọ USP United States Pharmacopeia Dƣợc điển Mỹ UV Ultraviolet – Visible Tử ngoại – khả kiến XTB Giá trị trung bình vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Giới hạn cho phép của tạp A .................................................................... 13 Bảng 1.2. Yêu cầu về độ tinh khiết chất đối chiếu theo quy trình phân tích ............ 21 Bảng 2.1. Hóa chất và dung môi dùng trong nghiên cứu ......................................... 24 Bảng 2.2. Trang thiết bị dùng trong nghiên cứu ....................................................... 25 Bảng 3.1. Khối lƣợng sản phẩm tổng hợp A với tác nhân natri carbonat ................ 44 Bảng 3.2. Khối lƣợng sản phẩm tổng hợp A với tác nhân natri hydrocarbonat ....... 44 Bảng 3.3. Khối lƣợng sản phẩm tổng hợp A với tác nhân natri tetraborat decahydrat ................................................................................................................................... 45 Bảng 3.4. Khối lƣợng sản phẩm tổng hợp A với tác nhân natri hydroxyd ............... 45 Bảng 3.5. Phần trăm diện tích pic sản phẩm tổng hợp A với chƣơng trình HPLC-1 ................................................................................................................................... 47 Bảng 3.6. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm tổng hợp A ....................... 52 Bảng 3.7. So sánh các đỉnh đặc trƣng trong phổ IR của sản phẩm tổng hợp A với gabapentin ................................................................................................................. 53 Bảng 3.8. Dữ liệu phổ IR của sản phẩm tổng hợp A và tạp A ................................. 54 Bảng 3.9. Dữ liệu phổ NMR của sản phẩm tổng hợp A và tạp A ............................ 55 Bảng 3.10. Mã hóa các yếu tố khảo sát quy trình tổng hợp tạp A........................... 58 Bảng 3.11. Bố trí thí nghiệm Box-Behnken mức cơ bản kiểu bề mặt đáp ứng và hiệu suất trung bình toàn quy trình tƣơng ứng với từng thí nghiệm ......................... 59 Bảng 3.12. Hiệu suất phản ứng tổng hợp tạp A theo điều kiện dự đoán .................. 60 Bảng 3.13. Khảo sát pha động .................................................................................. 61 Bảng 3.14. Giá trị các thông số sắc ký tƣơng ứng với các nhiệt độ cột khảo sát ..... 62 Bảng 3.15. Kết quả khảo sát dung môi pha mẫu ...................................................... 62 Bảng 3.16. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên mẫu thử tạp A 1000 µg/ml ................................................................................................................................... 63 Bảng 3.17. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của tạp A ....................................... 65 Bảng 3.18. Các giá trị thống kê khoảng tuyến tính tạp A......................................... 65 vii Bảng 3.19. Kết quả khảo sát độ lặp lại của qui trình xác định độ tinh khiết tạp A ................................................................................................................................... 65 Bảng 3.20. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của qui trình xác định độ tinh khiết tạp A ................................................................................................................. 66 Bảng 3.21. Kết quả xác định độ tinh khiết và nhiệt độ nóng chảy tạp A bằng DSC ................................................................................................................................... 67 Bảng 3.22. Kết quả đánh giá tạp A ........................................................................... 68 Bảng 3.23. Kết quả xác định độ tinh khiết tạp A trong quá trình đóng lọ................ 68 Bảng 3.24. Giá trị các thông số của hệ thống sắc ký khi định lƣợng tạp A tại hai phòng thí nghiệm....................................................................................................... 69 Bảng 3.25. Kết quả định lƣợng tạp A tại hai phòng thí nghiệm ............................... 69 Bảng 3.26. Kết quả tính giá trị ấn định hàm lƣợng tạp A......................................... 70 Bảng 3.27. Kết quả khảo sát hệ pha động methanol – nƣớc .................................... 71 Bảng 3.28. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống của phƣơng pháp trên mẫu chuẩn (1) .................................................................................................................... 73 Bảng 3.29. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống của phƣơng pháp trên mẫu chuẩn (2) .................................................................................................................... 73 Bảng 3.30. Kết quả khảo sát tỷ số S/N của tạp A ..................................................... 78 Bảng 3.31. Kết quả khảo sát sự tƣơng quan giữa nồng độ và diện tích pic ............. 79 Bảng 3.32. Kết quả xử lý thống kê ........................................................................... 79 Bảng 3.33. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phƣơng pháp ........................................ 80 Bảng 3.34. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phƣơng pháp ................. 80 Bảng 3.35. Kết quả khảo sát độ đúng của quy trình định lƣợng trong mẫu giả dƣợc đƣợc thêm chuẩn gabapentin và tạp A đối chiếu ............................................................. 81 Bảng 3.36. Kết quả khảo sát độ đúng của quy trình định lƣợng trong mẫu nguyên liệu đƣợc thêm chuẩn gabapentin và tạp A đối chiếu ............................................... 82 Bảng 3.37. Kết quả định lƣợng gabapentin và tạp A trong một số nguyên liệu và chế phẩm chứa gabapentin trên thị trƣờng ................................................................ 83 viii DANH MỤC CÁC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Trang Sơ đồ 1.1. Cơ chế hình thành tạp A từ gabapentin ..................................................... 9 Hình 1.1. Phổ IR của gabapentin monohydrat chuẩn ................................................. 4 Hình 1.2. Sắc ký đồ định lƣợng tạp A ở điều kiện khắc nghiệt bằng HPLC ........... 16 Hình 1.3. Sắc ký đồ phân tích tạp A bằng UHPLC ................................................. 17 Hình 3.1. Sắc ký đồ sản phẩm tổng hợp A và tạp A chuẩn khi phun thuốc thử benzidin 0,4% - KI 2% (7:3) .................................................................................... 46 Hình 3.2. Sắc ký đồ dung dịch sản phẩm tổng hợp tạp A với chƣơng trình HPLC-1 ................................................................................................................................... 48 Hình 3.3. Sắc ký đồ dung dịch sản phẩm tổng hợp tạp A với chƣơng trình HPLC-2 ................................................................................................................................... 49 Hình 3.4. Sắc ký đồ GC dung dịch sản phẩm tổng hợp tạp A ................................. 51 Hình 3.5. Phổ khối của dung dịch sản phẩm tổng hợp tạp A ................................... 52 Hình 3.6. Phổ UV-Vis của sản phẩm tổng hợp A .................................................... 53 Hình 3.7. Phổ IR của sản phẩm tổng hợp A ............................................................. 53 Hình 3.8. Phổ MS của sản phẩm tổng hợp A ........................................................... 54 Hình 3.9. Phổ 13C-NMR của sản phẩm tổng hợp A ................................................. 56 Hình 3.10. Phổ 1H-NMR của sản phẩm tổng hợp A ................................................ 57 Hình 3.11. Bề mặt đáp ứng hiệu suất tổng hợp tạp A theo yếu tố khảo sát ............. 59 Hình 3.12. Hiệu suất tổng hợp tạp A dự đoán, ý nghĩa của phƣơng trình và hệ số ................................................................................................................................... 60 Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu pha động, dung môi pha mẫu, tạp A, gabapentin, hỗn hợp gabapentin và tạp A............................................................................................ 64 Hình 3.14. Kiểm tra độ tinh khiết của pic tạp A ...................................................... 64 Hình 3.15. Sắc ký đồ 3 chiều pic tạp A .................................................................... 64 Hình 3.16. Sắc ký đồ dung dịch tạp A khi khảo sát độ lặp lại ................................. 66 Hình 3.17. Biểu đồ phân tích nhiệt vi sai của tạp A ................................................. 67 ix Hình 3.18. Sắc ký đồ mẫu chuẩn H với pha động MeOH - H2O (35:65) ................ 71 Hình 3.19. Sắc ký đồ mẫu chuẩn H với pha động MeOH - H2O (40:60) ................ 71 Hình 3.20. Sắc ký đồ mẫu chuẩn H với pha động MeOH - H2O (45:55) ................ 71 Hình 3.21. Sắc ký đồ mẫu chuẩn H với pha động MeOH - H2O (50:50) ................ 72 Hình 3.22. Sắc ký đồ mẫu chuẩn H với pha động MeOH - H2O (55:45) ................ 72 Hình 3.23. Sắc ký đồ mẫu chuẩn H với pha động MeOH - H2O (60:40) ................ 72 Hình 3.24. Sắc ký đồ mẫu chuẩn H với pha động MeOH - H2O (65:35) ................ 72 Hình 3.25. Sắc ký đồ mẫu trắng ............................................................................... 74 Hình 3.26. Sắc ký đồ mẫu giả dƣợc ......................................................................... 74 Hình 3.27. Sắc ký đồ mẫu nguyên liệu..................................................................... 74 Hình 3.28. Sắc ký đồ mẫu thử thành phẩm .............................................................. 75 Hình 3.29. Sắc ký đồ mẫu giả dƣợc thêm gabapentin chuẩn và tạp A đối chiếu ..... 75 Hình 3.30. Sắc ký đồ mẫu chuẩn (2) ........................................................................ 75 Hình 3.31. Sắc ký đồ mẫu nguyên liệu đƣợc chiếu tia UV trong 24 giờ ................. 75 Hình 3.32. Sắc ký đồ mẫu nguyên liệu đƣợc làm ẩm trong 24 giờ .......................... 76 Hình 3.33. Sắc ký đồ nguyên liệu đƣợc đun nóng ở 100 oC trong 24 giờ ............... 76 Hình 3.34. Sắc ký đồ mẫu bột thuốc đƣợc chiếu tia UV trong 24 giờ ..................... 76 Hình 3.35. Sắc ký đồ mẫu bột thuốc đƣợc đun nóng ở 100 oC trong 24 giờ ........... 76 Hình 3.36. Sắc ký đồ mẫu bột thuốc đƣợc làm ẩm trong 24 giờ .............................. 77 Hình 3.37. Sắc ký đồ mẫu bột thuốc đƣợc oxy hóa bằng H2O2 trong 24 giờ .......... 77 Hình 3.38. Sắc ký đồ dung dịch đối chiếu tạp A đƣợc pha loãng tại LOD .............. 79 Hình 3.39. Sắc ký đồ dung dịch đối chiếu tạp A đƣợc pha loãng tại LOQ .............. 79 Hình 3.40. Sắc ký đồ các mẫu phân tích gabapentin và tạp A ................................. 85 1 MỞ ĐẦU Động kinh là một bệnh rối loạn trầm trọng chức năng của não, phổ biến ở nước ta và trên thế giới, chiếm 1% trong tổng số các bệnh tật. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới, ước tính có khoảng 50 triệu người mắc bệnh động kinh. Tỷ lệ mắc bệnh động kinh khác nhau ở các khu vực trên toàn cầu: châu Mỹ (12,59 trường hợp), châu Âu (8,23 trường hợp), Đông Nam Á (9,97 trường hợp)… tính trung bình trên 1000 dân [45],[48]. Hiện nay, đã và đang có nhiều loại thuốc điều trị động kinh được sử dụng với nhiều cơ chế tác dụng, dạng bào chế khác nhau nhằm mục đích kiểm soát các cơn co giật cho bệnh nhân như nhóm barbiturat (phenobarbital), dẫn xuất iminostilben (carbamazepin), dẫn xuất hydantoin (phenytoin), acid valproic, ethosuximid, gabapentin [4],[48]. Đa số các nhóm thuốc này được bệnh nhân sử dụng trong một thời gian dài, có khi suốt đời. Trong các thuốc trên, gabapentin được chỉ định ngày càng nhiều để điều trị động kinh do thuốc có rất ít tác dụng phụ so với các thuốc trị động kinh khác và còn được chỉ định để điều trị giảm đau thần kinh ngoại biên [2],[4]. Điều này làm cho việc sản xuất, kê đơn sử dụng, hàm lượng hoạt chất và tạp chất liên quan phải được kiểm soát một cách chặt chẽ vì chỉ cần một sự thay đổi nhỏ hàm lượng hoạt chất chính hoặc có tạp chất phát sinh có thể sẽ làm thay đổi hiệu quả lâm sàng và đặc tính an toàn của thuốc, hoặc gây ra các tác dụng khác nhau với hậu quả không lường trước được. Vấn đề khảo sát và kiểm soát các tạp chất liên quan trong nguyên liệu và đặc biệt là trong thành phẩm tương ứng gây một số khó khăn tại Việt Nam vì một số lý do như một số tạp chất chuẩn vẫn chưa có hoặc nếu có thường rất đắt tiền và phải mua từ nước ngoài. Trong khi đó, phần lớn các chuyên luận trong dược điển nước ngoài (USP, EP, BP) và một số chuyên luận trong dược điển Việt Nam IV bắt buộc phải kiểm soát tạp chất liên quan. Cục quản lý Dược Việt Nam cũng đã có yêu cầu phải kiểm tra tạp chất liên quan một cách chặt chẽ trong nguyên liệu và thành phẩm đăng ký cho sản xuất và lưu hành. 2 Hiện nay, dược điển Anh 2017 [10], dược điển Châu Âu 9.0 [16] và dược điển Mỹ 40 [43] đã có chuyên luận nguyên liệu, viên nén và viên nang thành phẩm chứa gabapentin. Cả ba dược điển này đều có quy định về tạp chất liên quan bắt buộc phải được kiểm soát đối với hoạt chất gabapentin, trong đó tạp A là tạp phân hủy cần phải được kiểm tra. Nguyên nhân phải kiểm soát tạp này là do tạp A có nguồn gốc từ quá trình tổng hợp và bảo quản gabapentin; Tạp này luôn luôn xuất hiện trong nguyên liệu và thành phẩm có chứa gabapentin; Độc tính của tạp A cao gấp 20 lần độc tính của gabapentin [51]. Trên thế giới, cho đến nay chỉ có một vài công trình nghiên cứu tổng hợp tạp A và các tạp chất liên quan của gabapentin [21],[22],[24],[33],[42],[46]. Trong khi đó, chưa có công trình nghiên cứu tổng hợp tạp A của gabapentin được công bố ở Việt Nam. Hiện nay, tạp chuẩn A đã được thương mại hóa, đang được bán với giá rất đắt và phải mua từ nước ngoài (730 USD/ 50 mg) [44]. Vì những lý do trên, đề tài “Tổng hợp và tiêu chuẩn hóa tạp chất liên quan 2-azaspiro[4.5]decan-3-on (tạp A) của gabapentin” được thực hiện với mong muốn tổng hợp và tiêu chuẩn hóa tạp A của gabapentin, sử dụng tạp này để kiểm nghiệm tạp A trong nguyên liệu và thành phẩm chứa gabapentin, góp phần kiểm soát và nâng cao chất lượng thuốc. Mục tiêu cụ thể của đề tài là: - Tổng hợp tạp A của gabapentin ở quy mô phòng thí nghiệm. - Thiết lập chất đối chiếu tạp tổng hợp. - Định lượng đồng thời gabapentin và tạp A trong nguyên liệu và thành phẩm chứa gabapentin. 3 Chương I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về gabapentin Tên hóa học: [1-(aminomethyl)cyclohexyl]acetic acid. Tên khác: gabapentin. Công thức phân tử: C9H17NO2. Phân tử lượng: 171,2 g/mol. Công thức cấu tạo: Gabapentin 1.1.1. Tính chất vật lý Bột trắng hoặc gần như trắng, tan trong nước (4491 mg/L ở 25 oC), hơi tan trong etanol 96%, thực tế không tan trong metylen clorid, dễ tan trong acid loãng và kiềm loãng [9],[10],[43]. 1.1.2. Tính chất hóa học Trong dung dịch và tùy thuộc vào pH, gabapentin có thể tồn tại ở 4 dạng: ion dương, ion âm, ion lưỡng cực và dạng trung tính. pKa của nhóm carboxylat và nhóm amin lần lượt là 3,7 và 10,7 [9],[50]. Gabapentin ổn định trong dung dịch ở pH khoảng 5,5-6. Dưới ảnh hưởng của nhiệt độ và pH, nhóm alkyl amin là tác nhân ái nhân tấn công nhóm carbonyl của nhóm carboxylat đóng vòng nội phân tử hình thành vòng lactam 5 cạnh [50]. 1.1.3. Định tính 1.1.3.1. Điểm chảy 162 °C đến 167 °C [9],[25]. 4 1.1.3.2. Phổ hồng ngoại Phổ hồng ngoại của mẫu thử phải phù hợp với phổ hồng ngoại của gabapentin chuẩn (gabapentin monohydrat). Phổ IR của gabapentin monohydrat phải có các đỉnh đặc trưng sau đây [41]: - δas(N-H): 1615 cm-1, δs(N-H): 1544 cm-1. - υ(C=O): 1662 cm-1 [dịch chuyển thấp hơn so với υ(C=O) của một acid carboxylic (1700-1730 cm-1)]. - υ(N-H): 2144 cm-1; υ(C-O): 1400 cm-1. - υ(O-H): 3389 cm-1 (dao động O-H của phân tử nước). Hình 1.1. Phổ IR của gabapentin monohydrat chuẩn 1.1.4. Định lượng Có nhiều công trình công bố định lượng gabapentin trong nguyên liệu, chế phẩm và dịch sinh học. Sau đây là một số công trình tiêu biểu. 1.1.4.1. Định lượng gabapentin bằng phương pháp quang phổ hấp thu tử ngoại - Năm 2009, Singh Gujral R. và cộng sự đã định lượng gabapentin trong chế phẩm ở bước sóng 210 nm với giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) lần lượt là 0,044 µg/ml và 0,133 µg/ml [40]. - Năm 2011, Patel Satish Ambalal và cộng sự đã định lượng gabapentin trong viên nén và viên nang bằng cách tạo phức giữa gabapentin với xanh bromocresol hoặc bromothymol, đo độ hấp thụ của phức ở bước sóng hấp thu cực đại tương ứng là 5 416 nm và 421 nm. LOD tương ứng là 2,90 μg/ml và 10,86 μg/ml. LOQ tương ứng là 8,77 μg/ml và 32,91 μg/ml [35] . - Năm 2014, Magda S. Saleh và cộng sự đã tạo một base Schiff giữa gabapentin và 2,5-dihydroxybenzaldehyd, đo độ hấp thu sản phẩm tạo thành ở bước sóng hấp thu cực đại 445 nm, từ đó xây dựng được quy trình định lượng gabapentin trong nguyên liệu và các dạng thành phẩm với LOD và LOQ lần lượt là 0,330 µg/ml và 0,996 µg/ml [29] . - Năm 2015, Mohammed và cộng sự đã định lượng gabapentin trong nguyên liệu và các dạng thành phẩm thông qua việc tạo dẫn xuất với 4-cloro-7-nitrobenzo-2-oxa1,3-diazol có đỉnh hấp thu cực đại ở 576 nm. Phương pháp có LOD và LOQ lần lượt là 1,725 µg/ml và 5,227 µg/ml [31] . - Năm 2016, Adam ME và cộng sự đã tạo phức gabapentin với acid ascorbic có hai đỉnh hấp thu cực đại ở 390 nm và 531 nm. LOD và LOQ ở hai đỉnh hấp thu cực đại lần lượt là 0,73 μg/ml và 1,69 μg/ml; 2,43 μg/ml và 5,65 μg/ml [8] . 1.1.4.2. Định lượng gabapentin bằng phương pháp sắc ký lỏng - Năm 2005, Abdulrahman A. Al-Majed đã định lượng gabapentin trong viên nén và viên nang bằng HPLC với đầu dò huỳnh quang. Phản ứng tiền cột giữa gabapentin và fluorescamin tạo dẫn xuất phát huỳnh quang ở bước sóng phát xạ 472 nm và bước sóng kích thích 390 nm với LOD là 0,1 μg/ml [7]. - Năm 2012, Desireddy và cộng sự đã xây dựng quy trình định lượng gabapentin đơn giản trong nguyên liệu và các dạng thành phẩm bằng sắc ký lỏng pha đảo với pha động metanol-acetonitril-trietylamin (50:25:25), bước sóng phát hiện 211 nm. Phương pháp có LOD và LOQ lần lượt là 0,75 μg/ml và 2,5 μg/ml [15]. - Năm 2012, Ramesha và cộng sự đã định lượng đồng thời gabapentin và các tạp chất liên quan của gabapentin: tạp A, B và tạp D bằng kỹ thuật UHPLC với đầu dò PDA. Phương pháp có LOD và LOQ của gabapentin lần lượt là 0,0046 mg/ml và 0,014 mg/ml [37]. 6 - Năm 2013, Das Binaya đã định lượng gabapentin trong mẫu huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS, xử lý mẫu huyết tương bằng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng. Phương pháp có giới hạn định lượng dưới (LLOQ) là 50 ng/ml [13]. - Năm 2017, dược điển USP 40 [43], EP 9.0 [16], BP 2017 [10] có chuyên luận gabapentin, trong đó gabapentin được định lượng bằng kỹ thuật HPLC với đầu dò PDA. Cả 3 dược điển đều sử dụng cột C18 và bước sóng phát hiện 210 nm khi định lượng gabapentin trong nguyên liệu. Riêng USP 40 còn có chuyên luận định lượng gabapentin trong viên nén và viên nang ở bước sóng 215 nm bằng cột C8. 1.1.4.3. Định lượng gabapentin bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ - Năm 2005, Cristiana Gambelunghe và cộng sự đã định lượng gabapentin trong huyết thanh bằng kỹ thuật GC-MS/MS. Gabapentin được chiết xuất từ mẫu huyết thanh bằng kỹ thuật chiết pha rắn trên cột C18 sau đó được tạo dẫn xuất với Nmetyl-N-trimetylsilyltrifluoroacetamid (MSTFA) và cuối cùng được phân tích bằng kỹ thuật GC-MS/MS dưới dạng trimetylsilyl-gabapentin. Phương pháp phân tích có LOD là 0,1 ng/ml [12]. 1.1.4.4. Định lượng gabapentin bằng phương pháp điện di mao quản - Năm 1995, Liliana Garcia và cộng sự đã định lượng gabapentin trong huyết thanh người bằng kỹ thuật điện di mao quản (CE) với đầu dò UV. Gabapentin được tạo dẫn xuất với fluorescamin cho hợp chất hấp thu ở bước sóng 200 nm. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 1 µg/ml [27]. - Năm 2012, Liwei Cao và cộng sự đã định lượng gabapentin trong huyết tương bằng kỹ thuật điện di mao quản với đầu dò huỳnh quang cảm ứng laser (laser induced fluorescence detection). Gabapentin được tạo dẫn xuất tiền cột với thuốc thử 5-(4,6-dichlorotriazinyl)amino fluoresencin. Phương pháp phân tích có LOD là 0,02 nmol/L [28]. - Năm 2015, Xia Lin và cộng sự đã định lượng gabapentin trong huyết tương và nước tiểu bằng kỹ thuật điện di mao quản với đầu dò huỳnh quang cảm ứng laser. Gabapentin được tạo dẫn xuất tiền cột với thuốc thử 4-cloro-7-nitrobenzofurazan. 7 Phương pháp phân tích có LOD trong mẫu huyết tương và nước tiểu lần lượt là 0,03 µg/ml và 0,02 µg/ml; LOQ là 0,1 µg/ml [49]. 1.1.5. Tính chất dược lý Gabapentin là thuốc chống động kinh và giảm đau do thần kinh, cơ chế tác động vẫn chưa rõ. Trên động vật thực nghiệm thuốc có tác dụng chống cơn duỗi cứng các chi sau khi làm sốc điện và cũng ức chế được cơn co giật do pentylenetetrazol. Hiệu quả thí nghiệm trên cũng tương tự đối với acid valproic nhưng khác với phenytoin và carbamazepin [2]. Cấu trúc hóa học của gabapentin tương tự chất ức chế dẫn truyền thần kinh acid gama-aminobutyric (GABA) nhưng gabapentin không tác động trực tiếp lên các thụ thể GABA, không làm thay đổi cấu trúc, giải phóng, chuyển hóa và hấp thu GABA. Các vị trí gắn gabapentin có ái lực cao khu trú khắp não. Các vị trí này tương ứng với sự hiện diện của các kênh calci phụ thuộc điện thế đặc trưng có đơn vị phụ alpha-2-delta. Kênh này nằm ở tiền synap và có thể điều hòa giải phóng các chất dẫn truyền thần kinh kích thích thúc đẩy gây co giật và đau [2],[32]. Thuốc chống động kinh: gabapentin là một trong những thuốc chống động kinh mới nhất, được phép sử dụng ở Vương quốc Anh và Mỹ từ năm 1993. Gabapentin được chỉ định điều trị các cơn động kinh cục bộ có hay không kèm theo các cơn toàn thể thứ phát ở người lớn và trẻ em trên 12 tuổi [32]. Đau thần kinh: gabapentin được chỉ định điều trị đau thần kinh ở người lớn từ 18 tuổi trở lên, đặc biệt là đau thần kinh ngoại biên do đái tháo đường và đau thần kinh do virus Varicella zoster [32]. 1.1.6. Dược động học Hấp thu: gabapentin hấp thu qua đường tiêu hóa theo cơ chế bão hòa (khi liều tăng sinh khả dụng lại giảm). Sau khi uống, gabapentin đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương sau 2-3 giờ, sinh khả dụng tuyệt đối với liều 300 mg gabapentin khoảng 59%. Sinh khả dụng của gabapentin không phụ thuộc vào liều dùng, thậm chí khi liều