Tài liệu Thiết lập một số chất đối chiếu alcaloid từ thân hành trinh nữ hoàng cung crinum latifolium l., amaryllidaceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ----------------- Nguyễn Thị Tuyết Nhung THIẾT LẬP MỘT SỐ CHẤT ĐỐI CHIẾU ALCALOID TỪ THÂN HÀNH TRINH NỮ HOÀNG CUNG Crinum latifolium L., Amaryllidaceae Luận văn Thạc sĩ Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ----------------- Nguyễn Thị Tuyết Nhung THIẾT LẬP MỘT SỐ CHẤT ĐỐI CHIẾU ALCALOID TỪ THÂN HÀNH TRINH NỮ HOÀNG CUNG Crinum latifolium L., Amaryllidaceae Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc và Độc chất Mã số: 8720210 Luận văn Thạc sĩ Dược học NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Phan Văn Hồ Nam PGS.TS. Võ Thị Bạch Huệ Thành phố Hồ Chí Minh - 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nguyễn Thị Tuyết Nhung ii Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2016-2018 Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc và Độc chất – Mã số: 8720210 THIẾT LẬP MỘT SỐ CHẤT ĐỐI CHIẾU ALCALOID TỪ THÂN HÀNH TRINH NỮ HOÀNG CUNG Crinum latifolium L., Amaryllidaceae Nguyễn Thị Tuyết Nhung Người hướng dẫn khoa học: TS. Phan Văn Hồ Nam và PGS.TS. Võ Thị Bạch Huệ Từ khóa: Crinum latifolium L., thân hành, chất đối chiếu, hippadin, lycorin. Mở đầu: Trinh nữ hoàng cung (TNHC) được sử dụng trong dân gian để điều trị u xơ, ung thư tử cung và u xơ, ung thư tuyến tiền liệt. Lá và thân hành là hai bộ phận dùng chính. Thành phần chủ yếu mang lại tác dụng sinh học cho TNHC là alcaloid. Có rất nhiều chế phẩm từ TNHC được lưu hành trên thị trường, dẫn đến vấn đề về quản lý và đảm bảo chất lượng nguyên liệu cũng như chế phẩm chứa TNHC, và một trong những khâu quan trọng liên quan đến việc đánh giá, kiểm tra chất lượng đó chính là chất đối chiếu. Vì vậy đề tài được thực hiện với mục tiêu thiết lập các chất đối chiếu alcaloid từ thân hành TNHC. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: các hợp chất tự nhiên từ thân hành TNHC. Phương pháp nghiên cứu: chiết cao alcaloid toàn phần từ thân hành TNHC bằng phương pháp ngấm kiệt, tách và phân lập các hợp chất tự nhiên từ thân hành TNHC bằng sắc kí cột. Hợp chất đã phân lập được xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ nghiệm. Xác định độ tinh khiết bằng phương pháp HPLC và thiết lập chất đối chiếu (CĐC). Sử dụng CĐC đã thiết lập để định lượng alcaloid trong thân hành TNHC bằng phương pháp HPLC. Kết quả: từ 10 kg thân hành TNHC đã phân lập được 470,2 mg hippadin; 270,6 mg daucosterol; 570,4 mg lycorin và 80,1 mg hợp chất CL 4 (C18H21NO5). Thiết lập được một chất đối chiếu hippadin (99,75%). Xây dựng một quy trình định lượng hippadin trong thân hành TNHC bằng phương pháp HPLC. Kết luận: đề tài đã xây dựng được quy trình chiết cao alcaloid toàn phần từ thân hành TNHC, phân lập được 4 hợp chất tinh khiết được định danh lần lượt là hippadin, daucosterol, lycorin và CL 4 là một alcaloid có công thức phân tử C18H21NO5. Hippadin phân lập được có khối lượng lớn và độ tinh khiết cao được sử dụng làm chất đối chiếu để định lượng hippadin trong dược liệu TNHC. iii Master’s Thesis – Academic course: 2016 – 2018 Speciality: Drug Quality Control and Toxicology – Code: 8720210 ESTABLISH REFERENCE STANDARDS FROM THE BULBS OF Crinum latifolium L., Amaryllidaceae. Nguyen Thi Tuyet Nhung Supervisors: Dr. Phan Van Ho Nam and Assoc. Prof. Dr. Vo Thi Bach Hue Keywords: Crinum latifolium, the bulbs, reference standards, hippadine, lycorine. Introduction: Crinum latifolium is used in Vietnamese folk medicine as an anticancer remedy, rubefacient, tonic and for treatment of allergic disorders and tumor diseases. These activities are attributed to the presence of Amaryllidaceae alkaloids. Nowaday, a large number of functional foods, drugs from Crinum latifolium are circulating in the Vietnamese market such as Crila, CrilaOPC, Tadimax … Therefore, the management and quality control of these products is essential, the study was carried out with the aim of establishing reference standards from the bulbs of Crinum latifolium L. for quality control of herbs and Crinum latifolium containing preparations. Materials and methods: Object of study: the natural subtances from the bulbs of Crinum latifolium L. Methods: bulb powder of Crinum latifolium was percolated with ethanol 70%, percolate obtained was evaporated at 65 ℃ to give a liquid extract. The extract was fractionated by distribution with solvents and the fractions were then chromatographed on silica gel 60 (0.40 – 0.063 mm). The pure compound was isolated, purified and elucidated by NMR, MS, IR and UV-Vis spectrum. The isolated compound was determined its purity by high performance liquid chromatography (HPLC) and established reference standards. Using established reference standards to quantify alcaloid in Crinum latifolium by HPLC. Results: From 10 kg of bulb powder of Crinum latifolium, the study isolated 470,2 mg of hippadine; 270,6 mg of daucosterol; 570,4 mg of lycorine and 80,1 mg of CL 4 (C18H21NO5); established a reference standard – hippadine (99,75%) and developed a process to quantify hippadin in Crinum latifolium by HPLC. Conclusions: The study developed a process to extract total alcaloid from the bulbs of Crinum latifolium, and isolated 4 pure compounds identified as hippadine, daucosterol, lycorine and CL 4 (C18H21NO5). Hippadine is established as a reference standard and used to determinate hippadine in Crinum latifolium by HPLC. iv MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................................. iv BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................................. vi DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. vii DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. ix DANH MỤC SƠ ĐỒ ..................................................................................................x MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................3 1.1. TỔNG QUAN VỀ TRINH NỮ HOÀNG CUNG ............................................3 1.2. TỔNG QUAN VỀ CHIẾT XUẤT - PHÂN LẬP ALCALOID .....................16 1.3. TỔNG QUAN VỀ CHẤT ĐỐI CHIẾU .........................................................18 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................21 2.1. ĐỐI TƯỢNG – NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU .........................................21 2.2. DUNG MÔI, HÓA CHẤT - THIẾT BỊ ..........................................................22 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................24 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .....................................................................35 3.1. CHIẾT CAO ALCALOID TỪ THÂN HÀNH TNHC ...................................35 3.2. KẾT QUẢ TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ PHÂN LẬP HỢP CHẤT ALCALOID BẰNG SẮC KÝ CỘT ...............................................................................................43 3.3. KIỂM TRA - XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT TINH KHIẾT....49 3.4. THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU ...................................................................71 3.5. ĐỊNH LƯỢNG HIPPADIN TRONG THÂN HÀNH TNHC BẰNG HPLC.78 Chương 4. BÀN LUẬN ............................................................................................89 v 4.1. CHIẾT XUẤT ALCALOID TRONG THÂN HÀNH TNHC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NGẤM KIỆT .................................................................................................89 4.2. PHÂN LẬP HỢP CHẤT TINH KHIẾT TỪ CÁC CAO PHÂN ĐOẠN .......92 4.3. THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU ...................................................................94 4.4. QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ALCALOID ...................................................94 Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................95 5.1. KẾT LUẬN .....................................................................................................95 5.2. ĐỀ NGHỊ ........................................................................................................97 TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................98 DANH MỤC PHỤ LỤC ......................................................................................PL -1 Phụ lục 1. DỮ LIỆU PHỔ IR, MS, NMR CỦA CL-1.........................................PL -2 Phụ lục 2. DỮ LIỆU PHỔ IR, MS, NMR CỦA CL-2.........................................PL -7 Phụ lục 3. DỮ LIỆU PHỔ IR, MS, NMR CỦA CL-3.......................................PL -17 Phụ lục 4. DỮ LIỆU PHỔ IR, MS, NMR CỦA CL-4.......................................PL -26 Phụ lục 5. THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU HIPPADIN - KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ĐỒNG NHẤT LIÊN PHÒNG THÍ NGHIỆM............................................PL -38 vi BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt 13 1 C-NMR H-NMR Ý nghĩa Chữ nguyên C-Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân 13C H-Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân 1H 13 1 CĐC Chất đối chiếu Chất đối chiếu d Doublet Đỉnh đôi DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxide GC - MS Gas Chrotography Mass Spectrometry Sắc ký khí ghép nối khối phổ HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation Phổ HSQC IR Infrared Hồng ngoại j Coupling constant Hằng số ghép m Multiplet Nhiều đỉnh, đỉnh bội MS Mass Spectrometry Phổ khối NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân ppm Part per million Phần triệu PTN Phòng thí nghiệm Phòng thí nghiệm s Singlet Đỉnh đơn SKLM Sắc kí lớp mỏng Sắc kí lớp mỏng TNHC Trinh nữ hoàng cung Trinh nữ hoàng cung TT Thuốc thử Thuốc thử UV Ultraviolet Tử ngoại UV - Vis Ultraviolet – Visible Tử ngoại khả kiến VLC Vacuum Liquid Chromatography Sắc ký cột chân không VS Vanilin – sulfuric Thuốc thử Vanilin - sulfuric vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học alcaloid khung crinin .......................................................9 Hình 1.2 Cấu trúc hóa học alcaloid khung lycorin ...................................................11 Hình 1.3 Cấu trúc khung lycorenin ...........................................................................11 Hình 1.4 Cấu trúc hóa học alcaloid khung belladin. .................................................11 Hình 1.5 Cấu trúc hóa học khung cheryllin ..............................................................12 Hình 1.6 Cấu trúc hóa học khung augustamin ..........................................................12 Hình 1.7 Cấu trúc hóa học một số hợp chất flavonoid trong cây TNHC..................13 Hình 2.1 Một số bộ phận của cây Trinh nữ hoàng cung ...........................................21 Hình 3.1 SKLM so sánh thân hành phơi và sấy........................................................36 Hình 3.2 SKLM so sánh các dung môi chiết ............................................................38 Hình 3.3 SKLM so sánh các tác nhân kiềm hóa .......................................................39 Hình 3.4 SKLM khảo sát ảnh hưởng pH đến quy trình chiết ...................................40 Hình 3.5 SKLM các phân đoạn cao HA ...................................................................44 Hình 3.6 SKLM các phân đoạn cao CF ....................................................................46 Hình 3.7 SKLM các hợp chất CL1, CL2, CL3, CL 4 ...............................................47 Hình 3.8 SKLM hợp chất CL 1 – hệ dung môi 1 ......................................................49 Hình 3.9 SKLM hợp chất CL 1 – hệ dung môi 2 ......................................................50 Hình 3.10 SKLM hợp chất CL 1 – hệ dung môi 3 ....................................................50 Hình 3.11 SKĐ xác định độ tinh khiết HPLC của hợp chất CL 1 ............................52 Hình 3.12 Cấu trúc hóa học của hippadin .................................................................55 Hình 3.13. Khảo sát độ tinh khiết hợp chất CL 2 trên sắc ký lớp mỏng ...................56 Hình 3.14. Cấu trúc hóa học của β-sitosterol-3-O-D-glucopyranosid ......................60 Hình 3.15 SKLM hợp chất CL 3 – hệ dung môi 1 ....................................................61 Hình 3.16 SKLM hợp chất CL 3 – hệ dung môi 2 ....................................................62 Hình 3.17 SKLM hợp chất CL 3 – hệ dung môi 3 ....................................................62 Hình 3.18. Cấu trúc hóa học của lycorin...................................................................65 Hình 3.19 SKLM hợp chất CL 4 – hệ dung môi 1....................................................66 viii Hình 3.20 SKLM hợp chất CL 4 – hệ dung môi 2 ....................................................67 Hình 3.21 SKLM hợp chất CL 4 – hệ dung môi 3 ....................................................67 Hình 3.22 SKĐ xác định độ tinh khiết HPLC của hợp chất CL 4 ............................68 Hình 3.23 SKĐ đánh giá tính đặc hiệu của quy trình kiểm tinh khiết hippadin .......73 Hình 3.24 Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ trong quy trình xác định độ tinh khiết hippadin ........................................................................74 Hình 3.25 SKĐ khảo sát tính đặc hiệu của quy trình định lượng hippadin ..............83 Hình 3.26 Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ trong quy trình định lượng hippadin ..........................................................................................84 Hình 4.1 SKLM lycorin bị phân hủy ........................................................................93 ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số alcaloid đã được phân lập từ TNHC Crinum latifolium L. .............6 Bảng 2.1 Bảng các dung môi, hóa chất sử dụng trong đề tài ....................................22 Bảng 2.2 Các trang thiết bị sử dụng ..........................................................................23 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của phương pháp xử lí dược liệu đến hiệu suất chiết ...........................................................................................................................35 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng dung môi đến hiệu suất chiết .......................37 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tác nhân kiềm hóa đến hiệu suất chiết...39 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng pH đến quy trình chiết cao alcaloid .............40 Bảng 3.5 Tổng hợp kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết ......41 Bảng 3.6 Kết quả tách các phân đoạn cao HA bằng sắc ký cột cổ điển. ..................43 Bảng 3.7 Kết quả tách phân đoạn cao CF bằng sắc ký cột chân không....................45 Bảng 3.8 So sánh dữ liệu phổ 13C-NMR, 1H-NMR của CL 1 với hippadin (dung môi đo CDCl3) ..................................................................................................................54 Bảng 3.9 So sánh phổ 13C-NMR của CL 2 với β-sitosterol -3-O-D-glucopyranosid (dung môi đo DMSO) ...............................................................................................58 Bảng 3.10 So sánh dữ liệu phổ 13C-NMR, 1H-NMR của CL 3 với lycorin (dung môi đo DMSO). ................................................................................................................64 Bảng 3.11 Bảng dữ liệu phổ 13C-NMR và 1H-NMR của hợp chất CL 4 ..................70 Bảng 3.12 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của quy trình xác định độ tinh khiết hippadin bằng HPLC. .......................................................................................72 Bảng 3.13 Sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ trong quy trình xác định độ tinh khiết hippadin.....................................................................................................74 Bảng 3.14 Kết quả khảo sát độ chính xác của quy trình xác định độ tinh khiết hippadin ...................................................................................................................................75 Bảng 3.15 Kết quả đánh giá độ đồng nhất lọ của hippadin sau đóng gói .................76 Bảng 3.16 Kết quả đánh giá độ đồng nhất liên phòng thí nghiệm của hippadin ......77 Bảng 3.17 Kết quả phân tích robust A của CĐC hippadin .......................................78 x Bảng 3.18 Chuẩn bị các dung dịch khảo sát tính tuyến tính .....................................79 Bảng 3.19 Chuẩn bị các dung dịch khảo sát độ đúng ...............................................80 Bảng 3.20 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình định lượng hippadin .81 Bảng 3.21 Sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ trong quy trình định lượng hippadin .....................................................................................................................84 Bảng 3.22 Kết quả khảo sát độ lặp lại trong quy trình định lượng hippadin ............86 Bảng 3.23. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của quy trình định lượng hippadin .....................................................................................................................87 Bảng 3.24 Kết quả khảo sát độ đúng của quy trình định lượng hippadin. ................88 Bảng 5.1 Tổng hợp kết quả đề tài .............................................................................96 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1 Vị trí của TNHC theo hệ thống phân loại thực vật Takhtajan 2009 ...........3 Sơ đồ 2.1 Các giai đoạn chiết tách alcaloid để thiết lập chất đối chiếu ....................24 Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết cao alcaloid từ thân hành TNHC .....................................42 1 MỞ ĐẦU Trinh nữ hoàng cung (TNHC) từ lâu đã được coi là vị thuốc quý, được dân gian biết đến nhiều từ những năm 1989-1990 với công dụng chữa u xơ, ung thư tử cung, u xơ và ung thư tiền liệt tuyến. Ngoài ra, loại cây này còn chữa được các bệnh như bướu cổ, viêm họng, viêm loét dạ dày tá tràng, phong thấp, mụn nhọt. [1, 2] Thành phần hóa học và tác dụng sinh học TNHC là hai lĩnh vực được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Kết quả của các công trình nghiên cứu cho thấy thành phần quyết định cho các tác dụng sinh học của TNHC chính là nhóm hợp chất alcaloid. Các alcaloid thuộc cây TNHC có tính kháng khối u, kháng viêm và kích thích miễn dịch. [1] Y học hiện đại cũng đã công nhận những tác dụng của TNHC, bằng chứng là sự xuất hiện các chế phẩm từ TNHC được Bộ Y tế cấp phép lưu hành trên thị trường, như Crila (Công ty trách nhiệm hữu hạn Thiên Dược), OPCrilati (Công ty cổ phần Dược liệu OPC), Tadimax (Công ty Cổ phần Dược phẩm Danapha)… Khi đã xuất hiện các chế phẩm trên thị trường, vấn đề về quản lý và đảm bảo chất lượng nguyên liệu cũng như chế phẩm có TNHC cần được quan tâm, và một trong những khâu quan trọng liên quan đến việc đánh giá, kiểm tra chất lượng đó chính là chất đối chiếu. Hiện nay, chất đối chiếu có nguồn gốc từ dược liệu rất hạn chế, chưa có cơ quan nào phân phối trên thị trường, vì vậy việc xây dựng và thiết lập chất đối chiếu từ các dược liệu là cần thiết. Đối với TNHC, đã có rất nhiều đề tài nghiên cứu về thành phần hóa học, phân lập và định danh alcaloid trong các bộ phận lá, thân hành, hoa và rễ của TNHC[3, 4, 5], tuy nhiên nghiên cứu về thiết lập chất đối chiếu alcaloid của TNHC thì lại rất ít. Vì vậy, đề tài “Thiết lập một số chất đối chiếu alcaloid từ thân hành Trinh nữ hoàng cung Crinum latifolium L. Amaryllidaceae” được tiến hành với mong muốn mở rộng nguồn nguyên liệu thiết lập chất đối chiếu của cây TNHC, phục vụ cho công tác 2 kiểm tra chất lượng nguyên liệu và các chế phẩm có chứa TNHC đang lưu hành trên thị trường. Đề tài được tiến hành với các mục tiêu nghiên cứu như sau: 1. Khảo sát các điều kiện chiết cao alcaloid từ thân hành cây TNHC bằng phương pháp ngấm kiệt. 2. Tách phân đoạn và phân lập các hợp chất tự nhiên bằng sắc ký cột. 3. Xác định cấu trúc của các hợp chất tự nhiên bằng phương pháp phổ nghiệm. 4. Thiết lập chất đối chiếu. 5. Xây dựng quy trình định lượng alcaloid trong thân hành TNHC. 3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ TRINH NỮ HOÀNG CUNG 1.1.1. Đặc điểm về thực vật Phân loại thực vật: theo hệ thống phân loại của A.L. Takhtajan năm 2009 [6], vị trí phân loại của TNHC được thể hiện ở sơ đồ 1.1. Giới thực vật (Plantae) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Hành (Liliopsida ) Phân lớp Hành (Liliidae) Bộ Thủy tiên (Amaryllidales) Họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) Chi Crinum Loài Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) Sơ đồ 1.1 Vị trí của TNHC theo hệ thống phân loại thực vật Takhtajan 2009 Tên Việt Nam: Trinh nữ hoàng cung, tỏi Thái Lan, tỏi lơi lá rộng, Thập bát học sĩ, Tây nam văn châu lan… [1] Tên khoa học: Crinum latifolium L., họ Thủy tiên Amaryllidaceae. [1] 4 Đặc điểm thực vật họ Amaryllidaceae và chi Crinum [1] Họ Amaryllidaceae có Thân: cỏ, sống nhiều năm nhờ thân hành hay thân rễ. Lá: mọc từ gốc, mỏng hay mọng nước, gân lá song song. Ở chi Crinum, các bẹ lá hợp thành thân giả cao 10- 15 cm. Cụm hoa: chùm, tán, ít hay nhiều hoa và có một mo bao lại. Trục cụm hoa dài mọc từ mặt đất. Hoa: đều, lưỡng tính, 5 vòng, mẫu 3. Bao hoa: 6 phiến cùng màu dạng cánh hoa, dính thành ống dài, ít khi rời. Bộ nhị: 6 nhị đính trên 2 vòng. Chỉ nhị rời hay dính nhau. Bao phấn thẳng hay lắc lư. Bộ nhụy: 3 lá noãn tạo thành bầu dưới 3 ô, mỗi ô chứa nhiều noãn, đính noãn trung trụ; 1 vòi nhụy, đầu nhụy chia 3 thùy. Quả: thông thường là nang nứt lưng. Hạt có nội nhũ. Đặc điểm thực vật cây Trinh nữ hoàng cung [1] TNHC là cây thân thảo lớn. Thân hành to, gần hình cầu hoặc hình trứng thuôn, đường kính 8-10 cm, phủ bởi những vảy hình bản to, dày, màu trắng, từ thân hành mọc rất nhiều củ con, có thể tách ra để trồng riêng dễ dàng. Lá mọc thẳng từ thân hành, hình dải dài đến 50 cm, có khi hơn, rộng 7-10 cm, mép nguyên, gốc phẳng có bẹ, đầu nhọn hoặc tù, gân song song. Mặt trên lá lõm thành rãnh, mặt dưới có một sống lá nổi rất rõ, đầu bẹ lá nơi sát đất có màu đỏ tía. Cụm hoa mọc thành tán trên một cán dẹt, dài 30-40 cm; lá bắc rộng hình thìa dài 7 cm, màu xanh, đầu nhọn. Hoa đều lưỡng tính, màu trắng pha hồng, dài 10-15 cm; bao hoa gồm 6 phiến bằng nhau, hàn liền 1/3 thành ống hẹp, khi nở đầu phiến quăn lại; bộ nhị gồm 6 nhị đính trên 2 vòng, chỉ nhị rời hoặc dính; bầu hạ noãn 3 ô. Hạt có nội nhũ. Quả có dạng gần hình cầu, nang nứt lưng (ít gặp). Mùa hoa quả là khoảng tháng 8,9. Phân bố - sinh thái [1] Họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) là một họ lớn với khoảng 90 chi và 1310 loài [7]. Trong đó, chi Crinum là một đại diện quan trọng với phân bố địa lý rộng khắp, từ vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới đến vùng ôn đới ấm áp. Chi Crinum có hơn 130 loài. Ở Việt Nam, chi Crinum có 6 loài được trồng làm cảnh và làm thuốc: Crinum amabile Donn., Crinum asiaticum L., Crinum latifolium L., Crinum defixum Ker Gawl., Crinum moorei Hook F., Crinum giganteum Andr. 5 TNHC Crinum latifolium L. có nguồn gốc từ Ấn Độ, hiện được trồng rộng rãi ở các quốc gia Đông Nam Á như Thái Lan, Malaysia, Philipin, Campuchia, Lào, Việt Nam và cả phía nam Trung Quốc. Ở Việt Nam, TNHC được trồng từ miền Bắc đến miền Nam, tập trung chủ yếu ở các tỉnh từ Quảng Nam, Đà Nẵng trở vào. Bộ phận dùng [1] Lá và thân hành, dùng tươi hoặc phơi khô. 1.1.2. Thành phần hóa học Các nghiên cứu về thành phần hóa học của TNHC đã được tiến hành rất sớm, từ năm 1982 bởi nhóm tác giả Ghosal S. và cộng sự (Ấn Độ), bên cạnh đó là các tác giả Kobayashi S. (Nhật, 1984) và Peter W. Jeffs (Mỹ, 1984). Tại Việt Nam, phải kể đến các công trình nghiên cứu của các tác giả Võ Thị Bạch Huệ (1997), Nguyễn Thị Ngọc Trâm (2002), Nguyễn Hữu Lạc Thủy (2014) và gần đây nhất là nhóm tác giả Trần Thị Hồng Hạnh (2018). Phương pháp chính được sử dụng để phân lập các hợp chất từ TNHC trong các nghiên cứu trên là sắc ký cột, kết hợp với HPLC điều chế hay GC-MS. Các nghiên cứu được tiến hành trên hầu hết các bộ phận của cây (hoa, lá, thân hành và rễ), kết quả cho thấy lá và thân hành là hai bộ phận chứa nhiều alcaloid nhất. 1.1.2.1. Alcaloid Cho đến nay, đã có hown 40 alcaloid được phân lập và định danh từ cây TNHC, phần lớn thuộc khung lycorin và crinin, chủ yếu từ lá và thân hành. 6 Bảng 1.1 Một số alcaloid đã được phân lập từ TNHC Crinum latifolium L. STT NĂM NƯỚC BỘ PHẬN 1 1983 Ấn Độ PHÂN ĐOẠN Thân hành Petroleum Thân hành Ethanol ALCALOID TLTK 1983 Cán hoa Pratorimin (23), pratosin (25) [3, 8, 9, 10, Hippadin (26), pratorinin 11, 12, (24). 13] Ambellin (2), lycorin (28). 1985 Thân hành Latisolin (37), latisodin (36) 11-O-Acetylambellin (1), 11-O-Acetyl-l,2-β epoxyambellin (9). 1987 Lá 1987 Thân hành 1989 Cán hoa Crinafolin (3), crinafolidin Phosphatydyllycorin 2-epilyocorin, 2- epipancrassidin 2 1984 Nhật Thân hành Cloroform Lá tươi Cloroform 3 1984 Mỹ Thân hành 4 1997 Việt Nam Lá Việt Nam Lá 5 2002 Cloroform Hamayn (20), crinamin (19), powellin, crinin (4), lycorin (28). [14] Undulatin (11), cheryllin (38), lycorin (28). Lycorin (28), hippeastrin (33). [15] Crinamidin (15) [16] 6-hydroxycrinamidin (16) Cloroform 6-hydroxycrinamidin (16), 6hydroxypowellin (8), undulatin (11). Ambellin (2), 1,2βepoxyambellin (10), powellin (5). 9-0ctadecenamid Dihydro-oxo-demethoxy haemanthamin. Augustamin, oxoassoanin Crinan-3α-ol, buphanidrin [5] 7 6-hydroxy-buphanidrin (6) Crinamidin (15) 6-hydroxyundulatin (12) Epoxy-3,7 dimethoxycrinan11-on. 6 2014 VN Lá Cloroform 6-ethoxyundulatin (13) [4] 6-ethoxybuphanidrin (7) Flazin 6-hydroxy-buphanidrin (6) Undulatin (11) Hippadin, augustamin 6-hydroxypowellin (8) Crinamidin (15) 6-hydroxycrinamidin (16) Lycorin (28), hippadin (26). Thân, rễ 7 2018 VN Lá Dichlorometan 6-methoxyundulatin* (14) Etylacetat 6-methoxycrinamidin* (17) [17] Undulatin N-oxid* (18) 6-hydroxyundulatin (12) 6-hydroxybuphanidrin (6) Undulatin (11), crinamidin (15) Ambellin (2), filifolin Augustamin, perlolyrin Alcaloid khung crinin: Là nhóm alcaloid có số lượng lớn nhất, tập trung nhiều ở lá. Một số alcaloid đã được phân lập: ambelin, crinafolin, crinafolidin, crinamidin, 11O-acetylambellin, 11-O-Acetyl-1,2-β-epoxyambellin, 6α-hydroxy-undulatin, 6αhydroxy-buphanidrin [4]. Cấu trúc cơ bản của khung này: 8 R1 R2 R3 R4 (1) 11-O-acetylambellin OMe H OMe OAc (2) Ambellin OMe H OMe OH (3) Crinafolin OMe OH OMe OH (4) Crinin OMe H H H (5) Powellin OH H OMe H (6) 6-hydroxy buphanidrin OMe OH OMe H (7) 6-ethoxy buphanidrin OMe OEt OMe H (8) 6-hydroxy powellin OH OH OMe H (9) (10) (11) (12) R1 R2 R3 R4 11-O-Acetyl-1,2-β-epoxyambellin OMe H OMe OAc 1,2-β-epoxyambellin OMe H OMe OH Undulatin OMe H OMe H 6-hydroxy undulatin OMe OH OMe H