Tài liệu Tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi mắc phải cộng đồng ở bệnh nhân nhập viện điều trị

. BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT Đề tài khoa học và công nghệ cấp trường TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY VIÊM PHỔI MẮC PHẢI CỘNG ĐỒNG Ở BỆNH NHÂN NHẬP VIỆN ĐIỀU TRỊ Mã số đề tài : Đồng chủ nhiệm đề tài - ThS. BS Lý Khánh Vân - PGS.TS Lê Tiến Dũng Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018 . . MỤC LỤC Thông tin kết quả nghiên cứu Đặt vấn đề và mục tiêu nghiên cứu Chương 1 : Tổng quan tài liệu 1.1. Một số khái niệm về viêm phổi 1.2. Các tác nhân vi khuẩn gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng 1.2.1. Các vi khuẩn thường gặp 1.2.2. Các vi khuẩn không điển hình 1.3. Các công trình nghiên cứu có liên quan 1.3.1. Các công trình nghiên cứu trong nước 1.3.2. Các công trình nghiên cứu nước ngoài Chương 2 : Đối tương và phương pháp nghiên cứu 2.1. Thiết kế nghiên cứu 2.2. Đối tượng nghiên cứu 2.3. Cỡ mẫu 2.4. Tiêu chuẩn chọn mẫu 2.5. Tiêu chuẩn loại trừ 2.6. Phương pháp chọn mẫu 2.7. Xử lý số liệu 2.8. Kiểm soát sai lệch 2.9. Vấn đề y đức Chương 3 : Kết quả 3.1. Tác nhân vi khuẩn gây bệnh chính và tác nhân vi khuẩn phối hợp phát hiện được bằng kỹ thuật multiplex real-time PCR 3.2. Tác nhân vi khuẩn ở bệnh nhân đơn thuần viêm phổi cộng đồng phát hiện kỹ thuật multiplex real-time PCR 3.3. Tác nhân vi khuẩn ở bệnh nhân COPD viêm phổi cộng đồng phát hiện được bằng kỹ thuật multiplex real-time PCR 3.4. Tác nhân vi khuẩn ở bệnh nhân viêm phổi mắc phải cộng đồng phát hiện được bằng kỹ thuật nuôi cấy truyền thống 3.5. Sự phù hợp tác nhân vi khuẩn giữa phương pháp nuôi cấy truyền thống và kỹ thuật multiplex real-time PCR Chương 4 : Bàn luận 4.1. Tỷ lệ tác nhân vi khuẩn gây bệnh 4.2. Tỷ lệ vi khuẩn phối hợp 4.3. Sự phù hợp vi khuẩn giữa phương pháp nuôi cấy truyền thống và kỹ thuật multiplex real time PCR Kết luận Tài liệu tham khảo Phụ lục 1 : Đánh giá độ tin cậy mẫu đàm theo thang điểm Barlett Phụ lục 2 : Quy trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn gây bệnh Phụ lục 3 : Quy trình kỹ thuật multiplex real time PCR . TRANG 1 3 6 6 7 7 10 12 12 15 17 17 17 17 18 18 18 19 19 19 20 21 23 25 26 29 29 31 31 33 . DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 : Số và tỷ lệ tác nhân vi khuẩn gây bệnh chính và phối hợp Bảng 2 : Số và tỷ lệ tác nhân vi khuẩn ở bệnh nhân đơn thuần viêm phổi mắc phải cộng đồng Bảng 3 : Số và tỷ lệ tác nhân vi khuẩn ở bệnh nhân COPD bị viêm phổi mắc phải cộng đồng Bảng 4 : Số và tỷ lệ tác nhân vi khuẩn phát hiện bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống Bảng 5 : Số và tỷ lệ tác nhân vi khuẩn phù hợp giữa phương pháp nuôi cấy truyền thống và kỹ thuật multiplex real-time PCR. . . THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG 1. Thông tin chung - Tên đề tài: Tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi mắc phải cộng đồng ở bệnh nhân nhập viện điều trị. - Mã số: - Đồng chủ nhiệm đề tài: Ths.BS. Lý Khánh Vân PGS.TS. Lê Tiến Dũng - Điện thoại: 0918.874.488 - Email: [email protected] - Đơn vị quản lý về chuyên môn: BM.Sinh lý – Sinh lý bệnh – Miễn dịch Khoa y, Đại học y dược TP.HCM. - Thời gian thực hiện: Tháng 05/2016 – 12/2017 2. Mục tiêu - Xác định tỷ lệ tác nhân vi khuẩn gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng ở người lớn nhập viện. - Xác định tỷ lệ phối hợp giữa các tác nhân vi khuẩn gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng. - Xác định tỷ lệ phù hợp tác nhân vi khuẩn giữa phương pháp nuôi cấy truyền thống với kỹ thuật multiplex real time PCR. 3. Nội dung Sử dụng kỹ thuật multiplex real time PCR là một kỹ thuật hiện đại, có độ tin cậy cao để phát hiện vi khuẩn gây bệnh song song với phương pháp nuôi cấy truyền thống. Mẫu bệnh phẩm đàm hoặc bệnh phẩm có chứa đàm được khảo sát đại thể và vi thể qua nhuộm Gram để đánh giá mức độ tin cậy dựa vào thang điểm Barlett. Chọn . . mẫu bệnh phẩm có mức độ rất tin cậy (> 3 điểm) để thực hiện nuôi cấy theo phương pháp truyền thống đồng thời tiến hành kỹ thuật multiplex real time PCR. Kết quả phát hiện vi khuẩn gây bệnh chính và vi khuẩn phối hợp dựa vào số lượng vi khuẩn đếm được nhờ kỹ thuật multiplex real time PCR. Các số liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm thống kê y học và phép kiểm chỉ bình phương. Kết quả được mô tả bằng số lượng và tỷ lệ %. 4. Kết quả đạt được (Khoa học, đào tạo, kinh tế, xã hội, ứng dụng) - Tỷ lệ dương tính ở kỹ thuật multiplex real time PCR là 67,5% và ở kỹ thuật nuôi cấy truyền thống là 44,3% (không kể nhóm S. viridans). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. - Vi khuẩn phát hiện bằng kỹ thuật multiplex real time PCR có tỷ lệ cao nhất là S.pneumoniae (34,3%), kế đến là K.pneumoniae (11,4%), A.baumannii (10,7%) trong khi bằng kỹ thuật nuôi cấy truyền thống thì vi khuẩn có tỷ lệ cao nhất là K.pneumoniae (12,2%), kế đến là P.aeruginosa (9,6%), A.baumannii (7,7%) và không có trường hợp nào phát hiện S.pneumoniae. - Chỉ có 23,7% vi khuẩn phát hiện bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống là phù hợp với vi khuẩn phat hiện bằng kỹ thuật multiplex real time PCR trong đó E.coli có tỷ lệ phù hợp cao nhất là 57,1%. Các vi khuẩn khác có tỷ lệ phù hợp dưới 50%. 5.Hiệu quả kinh tế - xã hội do đề tài mang lại Kết quả xác định đúng tác nhân vi khuẩn gây bệnh thường gặp trong viêm phổi mắc phải cộng đồng nhập viện điều trị có thể: - Giúp các bác sĩ lâm sàng định hướng sử dụng kháng sinh ban đầu một cách hợp lý nhầm nâng cao hiệu quả điều trị, nhất là trong trường hợp nhiễm vi khuẩn không điển hình hoặc đồng nhiễm (đa nhiễm). - Tác động bệnh viện trong việc trang bị và sử dụng kỹ thuật multiplex real time PCR để chẩn đoán tác nhân gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng nói riêng và các bệnh nhiễm khuẩn nói chung. . . ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm phổi mắc phải cộng đồng là tình trạng viêm phổi xảy ra ở ngoài bệnh viện hoặc trong 48 giờ đầu sau khi nhập viện [34]. Viêm phổi mắc phải cộng đồng là một bệnh phổ biến xảy ra ở mọi lứa tuổi và là bệnh lý rất thường gặp, chiếm tỷ lệ 12% trong các bệnh hô hấp nói chung ở Việt Nam [4]. Tác nhân gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng thường được phát hiện là các vi khuẩn, vi rút và vi nấm, trong đó tác nhân vi khuẩn là chủ yếu. Ở Việt Nam, theo thống kê của Bộ Y tế năm 2014, viêm phổi mà hầu hết là viêm phổi mắc phải cộng đồng là một bệnh lý có tỷ lệ tử vong hàng đầu với tỷ lệ 1,32 trên 100.000 dân, tương đương với tỷ lệ tử vong do chấn thương sọ não [4]. Một trong các nguyên nhân gây tử vong cao là do kết quả xét nghiệm vi khuẩn bằng kỹ thuật nuôi cấy truyền thống bị hạn chế trong việc phát hiện tác nhân gây bệnh. Như chúng ta đều biết, bệnh phẩm chủ yếu để phát hiện các tác nhân vi khuẩn gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng chính là các mẫu đàm hay các bệnh phẩm có chứa đàm lấy được từ bệnh nhân. Tuy nhiên xét nghiệm đàm bằng kỹ thuật nuôi cấy để phát hiện các vi khuẩn gây bệnh có rất nhiều thách thức cần phải vượt qua, vì đây là một loại bệnh phẩm thường bị tạp nhiễm do phải qua đường hầu họng. Do đó, việc nuôi cấy để phát hiện đúng vi khuẩn gây bệnh chứ không phải là vi khuẩn tạp nhiễm là một thử thách rất lớn. Hơn nữa do đa số bệnh nhân đã sử dụng kháng sinh trước đó nên các vi khuẩn gây bệnh dù vẫn còn sống trong các dịch lót biểu mô của phế nang nhưng trong mẫu đàm khảo sát thì các vi khuẩn này đã chết. Ngoài ra còn có nguyên nhân chủ quan của phòng xét nghiệm cũng làm cho khả năng phát hiện vi khuẩn gây bệnh qua nuôi cấy giảm đi. Đó là : (i) phòng xét nghiệm vi sinh không có được các môi trường nuôi cấy thích hợp để phân lập được các vi khuẩn gây bệnh chủ yếu thường gặp nhưng lại khó nuôi cấy; (ii) mẫu bệnh phẩm không được cấy ngay để tăng cơ hội nuôi cấy phát hiện được các vi khuẩn gây bệnh; (iii) thiếu kinh nghiệm trong việc chọn khuẩn lạc mọc trên mặt thạch để phân lập đúng vi khuẩn gây bệnh và (iv) cũng có thể không đánh giá được độ tin cậy của mẫu đàm để loại bỏ các mẫu bệnh phẩm không phải là . . đàm mà chỉ là nhầy nhớt vùng hầu họng. Ngoài ra kỹ thuật nuôi cấy truyền thống cũng không đếm được số lượng vi khuẩn để xác định vi khuẩn gây bệnh chính và phối hợp. Hiện nay, bằng kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến, nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã công bố phổ tác nhân vi khuẩn thật sự gây nhiễm khuẩn hô hấp dưới. Theo công bố của các công trình nghiên cứu trên thế giới, phổ tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi mắc phải cộng đồng đứng đầu là Streptococcus pneumoniae , kế đến là Haemophilus influenza, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa; các vi khuẩn đường ruột và các vi khuẩn không điển hình như Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae cũng được phát hiện mặc dù tỷ lệ có thấp hơn [28]. Trái lại ở nước ta, các công trình nghiên cứu tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi mắc phải cộng đồng nhập viện điều trị thì vi khuẩn đứng đầu (không kể nhóm Streptococcus viridans là vi khuẩn thường trú) là Pseudomonas spp, Klebsiella spp trong khi các vi khuẩn Streptococcus pneumoniae, H. influenza chiếm tỷ lệ rất thấp[5], [6], [7], [8]. Đó là do các công trình nghiên cứu ở nước ta sử dụng kỹ thuật nuôi cấy truyền thống để phân lập vi khuẩn gây bệnh trong khi ở các công trình nghiên cứu trên thế giới sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử PCR để phát hiện tác nhân vi khuẩn gây bệnh. Kỹ thuật multiplex real time PCR là một kỹ thuật hiện đại, có độ nhạy rất cao và độ đặc hiệu không khác gì kỹ thuật nuôi cấy phân lập vi khuẩn [12], [22], [24], [28], [33]. Khi không xác định được tác nhân vi khuẩn thật sự gây bệnh sẽ dẫn đến sử dụng kháng sinh không hợp lý, gây lãng phí và có thể đưa đến sự xuất hiện dòng vi khuẩn kháng thuốc [15]. Ở nước ta cho đến nay chưa có công trình nghiên cứu nào chính thức công bố đầy đủ tác nhân vi khuẩn thật sự gây viêm phổi mắc phải cộng đồng ở người lớn, chỉ có một số công trình riêng lẻ thực hiện tại một bệnh viện với thời gian nghiên cứu ngắn, mẫu nghiên cứu hạn chế. Chính vì vậy, để phát hiện tác nhân vi khuẩn thật sự gây viêm nhiễm hô hấp dưới ở người lớn viêm phổi mắc phải cộng đồng nhập viện điều trị, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “ Tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi mắc phải cộng đồng ở bệnh nhân nhập viện điều trị “ với phương pháp phát hiện tác nhân vi khuẩn . . thật sự gây bệnh bằng kỹ thuật multiplex real-time PCR song song với kỹ thuật nuôi cấy truyền thống. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU (1) Xác định tỷ lệ tác nhân vi khuẩn gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng ở người lớn nhập viện. (2) Xác định tỷ lệ phối hợp giữa các tác nhân vi khuẩn gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng. (3) Xác định tỷ lệ phù hợp tác nhân vi khuẩn giữa phương pháp nuôi cấy truyền thống với kỹ thuật multiplex real time PCR. . . CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Một số khái niệm về viêm phổi 1.1.1. Viêm phổi Viêm phổi hay viêm hô hấp dưới là tình trạng viêm nhiễm xảy ra ở toàn bộ cấu trúc gồm phế nang, ống và túi phế nang, tiểu phế quản tận cùng và tổ chức mô kẽ. Tác nhân gây viêm phổi có thể là vi khuẩn, vi rút, ký sinh trùng, nấm nhưng không phải là trực khuẩn lao [1]. Viêm phổi là bệnh lý rất thường gặp, theo thống kê, bệnh viêm phổi chiếm 12% các bệnh viêm hô hấp nói chung ở Việt Nam [4]. 1.1.2. Viêm phổi mắc phải cộng đồng Viêm phổi mắc phải cộng đồng là tình trạng viêm phổi mắc phải xảy ra ở cộng đồng dân cư ngoài bệnh viện, khác với viêm phổi bệnh viện là viêm phổi xảy ra do nhiễm các tác nhân vi khuẩn trong bệnh viện ( nhiễm khuẩn bệnh viện) Viêm phổi mắc phải cộng đồng cũng xảy ra khá phổ biến nhưng không dễ dàng báo cáo chính xác tác nhân vi khuẩn gây bệnh; phần lớn các thông tin về tần suất mắc bệnh đều dựa trên những thống kê ước đoán thô. Theo thống kê của Bộ y tế năm 2014, viêm phổi mắc phải cộng đồng là một bệnh lý có tỷ lệ tử vong hàng đầu với tỷ lệ 1,32% trên 100.000 dân, tương đương với tử vong do chấn thương sọ não [4]. Ở nước ta hàng năm có khoảng 4/5 triệu trường hợp viêm phổi mắc phải cộng đồng, phần lớn được theo dõi điều trị ngoại trú nhưng có khoảng 20% phải nhập viện điều trị với phân nửa số điều trị nội trú có biểu hiện nặng, đặc biệt tỷ lệ nhiễm khuẩn và tình trạng bệnh nặng ngày càng tăng cao ở người già và trẻ nhỏ [10], [18]. . . 1.2. Các tác nhân vi khuẩn gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng 1.2.1. Các vi khuẩn thường gặp 1.2.1.1. Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) [3], 25] E. coli là loại vi khuẩn thường trú ở người và vật, nhất là ở ruột già. Ngoài ra chúng ta còn có thể gặp vi khuẩn này ở ngoài thiên nhiên như trong đất, nước, không khí. Về khả năng gây bệnh, E. coli thường gây bệnh tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật, nhiễm khuẩn huyết, viêm phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thương, vết mổ. Dựa vào tính chất gây bệnh, trực khuẩn E. coli được phân thành các loại : - EPEC ( Entero-pathogenic E.coli ) - ETEC ( Entero-toxigenic E. coli) - EIEC ( Entero-invasive E. coli) - EAEC ( Entero-adherent E. coli) - EHEC ( Entero-hemorrhagic E. coli) 1.2.1.2. Klebsiella pneumoniae ( K. pneumoniae ) [3], 25] K. pneumoniae thuộc họ vi khuẩn đường ruột, do Edwin Klebs người Đức tìm ra. Về khả năng gây bệnh, K. pneumoniae có thể gây nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính, nhiễm khuẩn tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết. Đây cũng là vi khuẩn thường gây nhiễm khuẩn bệnh viện, nhất là ở bệnh nhân nằm viện lâu dài, đặc biệt là gây nhiễm khuẩn đường hô hấp ở bệnh nhân thở máy, ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch, bệnh nhân lớn tuổi và ở trẻ nhỏ. 1.2.1.3. Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa ) [3], 25] P. aeruginosa là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí tuyệt đối, thường sống trong thiên nhiên, trong đất, trong nước, nhất là nơi ẩm ướt, kể cả trong bệnh viện. Ở người, vi khuẩn sống ở vùng da ẩm, một số sống cộng sinh ở đường tiêu hóa của người ( P. aeruginosa được phân lập với tỷ lệ khoảng 1/10 trong phân người bình thường ). . . Tính chất đặc trưng của P. aeruginosa là sinh sắc tố và chất thơm, làm cho môi trường và khuẩn lạc có sắc tố màu xanh và thơm mùi nho. Có 2 loại sắc tố chính : sắc tố pyocyanin và sắc tố pyoverdin. Sắc tố pyocyanin có màu xanh lá cây, tan trong nước và chloroform. Do pyocyanin khuếch tán tốt trong môi trường nuôi cấy nên làm cho môi trường và khuẩn lạc có màu xanh, dễ nhận diện bằng mắt thường.Chính sắc tố pyocyanin cũng làm cho mủ có màu xanh ( tiếng Hy Lạp pseudo có nghĩa là giả, monas là đơn vị, aeruginosa là gỉ đồng có màu xanh ). Còn sắc tố pyoverdin là sắc tố huỳnh quang, sẽ phát ra màu xanh khi chiếu tia cực tím có bước sóng 400 µm nên còn được gọi là flourescein. Sắc tố pyoverdin không bền, dễ mất khi nuôi cấy P. aeruginosa ở môi trường không chuẩn, có nhiều chất sắt. Về khả năng gây bệnh, P. aeruginosa chỉ gây bệnh trong điều kiện có cơ hội thuận tiện như nhiễm khuẩn ngoài da, nhiễm khuẩn huyết, viêm phổi, viêm đường tiết niệu, viêm đường ruột gây tiêu chảy ở trẻ em… Hậu quả nhiễm trực khuẩn P. aeruginosa ngày càng trở nên trầm trọng do vi khuẩn kháng với kháng sinh ngày càng mạnh. 1.2.1.4. Acinetobacter baumannii (A. baumannii) [3], 25] Acinetobacter baumannii là những vi khuẩn không lên men đường. Trong những năm gần đây, vi khuẩn A. baumannii là một trong những vi khuẩn hàng đầu gây nhiễm khuẩn ở người tại nước ta. A. baumannii là vi khuẩn được tìm thấy trong đất, nước và môi trường thiên nhiên. A. baumannii dễ dàng được phân lập từ da, họng và nhiều dịch tiết ở người khỏe mạnh. A.baumannii đóng vai trò quan trọng trong nhiễm khuẩn cơ hội và nhiễm khuẩn bệnh viện. Về khả năng gây bệnh, mặc dù A. baumannii hiện diện khắp nơi, đặc biệt những nơi ẩm ướt như đất, nước, môi trường bệnh viện và có thể tìm thấy trên da, ở màng nhầy, chất tiết, ở ruột nhưng lại là tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện với bệnh cảnh lâm sàng nặng như viêm màng não, viêm nội tâm mạc, viêm phổi, nhiễm khuẩn huyết với khuynh hướng ngày một tăng. . . 1.2.1.5. Haemophilus influenzae ( H. influenzae ) [3], 25] H. influenzae do Richard Pfeiffer phân lập đầu tiên từ một bệnh nhân chết trong vụ dịch cảm cúm năm 1892 nên còn được gọi là trực khuẩn Pfeiffer . Từ đó trở đi trong khoảng thời gian dài, người ta nghĩ H. influenzae chính là căn nguyên gây ra bệnh cúm ( influenza ). Mãi đến năm 1933, khi phát hiện ra vi rút cúm là căn nguyên chính của bệnh cúm thì vai trò của H. influenzae mới được sáng tỏ : chúng chỉ là mầm bệnh của viêm họng cấp và nhiễm khuẩn thứ phát “ăn theo” bệnh cúm khi tế bào niêm mạc đường hô hấp bị tổn thương do vi rút cúm gây ra. Về khả năng gây bệnh, H. influenzae có thể gây bệnh họng, viêm thanh quản, viêm phế quản, viêm xoang, đặc biệt là viêm phổi, viêm màng não mủ do Hib gây ra, nhất là ở trẻ nhỏ suy dinh dưỡng và người suy giảm miễn dịch. 1.2.1.6. Moraxella catarrhalis ( M. catarrhalis ) [3], 25] M.catarrhalis lần đầu tiên được mô tả năm 1896, với tên gọi là Micrococcus catarrhalis, sau đổi thành Neisserria catarrhalis. Đến năm 1984 mới có tên chính thức là Moraxella catarrhalis, thuộc giống Moraxella, họ Moraxellaceae. Về khả năng gây bệnh, M. catarrhalis là nguyên nhân gây nhiễm khuẩn ở trẻ em, nhất là trẻ em suy dinh dưỡng với các bệnh như viêm xoang, viêm tai giữa, viêm phế quản, viêm phổi, viêm màng não. Ở người lớn, M. catarrhalis có thể gây bệnh viêm họng, viêm phế quản, viêm phổi, đặc biệt là ở bệnh nhân COPD và người già. M. catarrhalis cũng có thể gây viêm nội tâm mạc, viêm màng não và là tác nhân quan trọng trong nhiễm khuẩn bệnh viện. 1.2.1.7. Staphylococcus aureus ( S. aureus ) [3], 25] S. aureus là một trong những vi khuẩn gây bệnh được phát hiện sớm nhất. Robert Knock đã tìm ra S. aureus từ mủ mụn nhọt vào năm 1878. Về khả năng gây bệnh, S. aureus thường ký sinh ở mũi họng và ở da. Tuy nhiên S. aureus là vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và gây ra nhiều bệnh khác nhau, như nhiễm khuẩn da gây mụn nhọt, gây viêm phổi, viêm màng não, viêm thận, viêm cơ tim, nhiễm khuẩn huyết. Ngoài ra, S. aureus còn gây nhiễm độc thức ăn, hội chứng choáng nhiễm độc, hội chứng da phồng rộp ( Scalded skin syndrome ) . . 1.2.1.8. Streptococcus pneumoniae ( S. pneumoniae ) [3], 25] S. pneumoniae còn được gọi là Diplococcus pneumoniae được Louis Pasteur phân lập được từ mủ áp-xe năm 1880. Năm 1883, Talamon phá t hiện được S. pneumoniae trong đàm, trong máu và trong viêm ph ổi gan hóa ở bệnh nhân nên trong thời gian dài S. pneumoniae còn được gọi là Pneumococci. Còn thuật ngữ Diplococcus pneumoniae được sử dụng từ năm 1926 do đặc tính xếp đôi hình mũi giáo khi quan sát mẫu đàm nhuộm Gram dưới kính hiển vi. Về khả năng gây bệnh. S. pneumoniae không có nội, ngoại độc tố, chủ yếu gây bệnh là do nang. Nang của S. pneumoniae có tác dụng bão hòa hiện tượng opsonin hóa làm vô hiệu tác dụng của IgG và bổ thể, từ đó khả năng thực bào vi khuẩn của cơ thể bị giảm. S. pneumoniae gây bệnh thường gặp nhất là viêm hô hấp, đặc biệt là viêm phổi. Ngoài ra, S. pneumoniae có thể gây viêm họng, viêm tai giữa, viêm xoang, viêm màng não, viêm màng tim, viêm thận trong đó viêm màng não thường hay gặp ở trẻ em. 1.2.2. Các vi khuẩn không điển hình Các vi khuẩn không điển hình thường gặp trong viêm phổi là Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila. 1.2.2.1. Chlamydia pneumoniae (C. pneumoniae) [3], 25] Về khả năng gây bệnh, Chlamydia pneumoniae gây bệnh viêm phổi với bệnh cảnh lâm sàng từ nhẹ đến nặng nhưng không có dấu hiệu và triệu chứng đặc trưng giúp phân biệt với bệnh viêm phổi do các tác nhân khác. Tuy nhiên một số nghiên cứu cho thấy một bệnh cảnh viêm phổi không điển hình xảy ra ở người trẻ trong cộng đồng có đến 5-20% trường hợp là do Chlamydia pneumoniae gây ra. Ngoài khả năng gây bệnh viêm phổi, Chlamydia pneumoniae còn có thể gây viêm hầu họng, viêm tai giữa đơn thuần hay đi kèm với viêm phổi. . . Hiện nay, để chẩn đoán Chlamydia pneumoniae, các nhà y học thường sử dụng kỹ thuật real time PCR hoặc kỹ thuật giải trình tự. 1.2.2.2. Mycoplasma pneumoniae (M. pneumoniae) [3], 25] Mycoplasma pneumoniae thuộc giống Mycoplasma gồm ít nhất 15 loài được phân lập từ người trong đó có Mycoplasma pneumoniae. Mycoplasma được xếp vào nhóm Mollicutes là những vi khuẩn không có vách tế bào[25], được phân lập từ người, động vật và thực vật. Về bệnh cảnh lâm sàng, sau thời gian ủ bệnh 1-2 tuần, bệnh khởi phát âm ỉ với các triệu chứng sốt, nhức đầu, mệt mỏi, đau họng và ho từ ít đến nhiều, có đàm, đôi khi có lẫn máu kèm tức ngực. Ở giai đoạn đầu, việc thăm khám và hình ảnh trên X quang phổi không có gì đặc biệt so với bệnh viêm phổi do các vi khuẩn khác. Trong quá trình diễn tiến của bệnh, bệnh lý viêm phổi mô kẽ, hoại tử quanh các phế quản và viêm tiểu phế quản xảy ra kèm theo thiếu máu tán huyết và các hồng ban đa dạng xuất hiện trên cơ thể. Các biến chứng có thể gặp là viêm não màng não, viêm đa dây thần kinh, viêm cơ tim, viêm màng tim, viêm khớp và viêm tụy[30]. 1.2.2.3. Legionella pneumophila (L. pneumophila) [3], 25] Từ ngày 21 đến ngày 28 tháng 7 năm 1976, một hội nghị của tổ chức “Lê dương Mỹ” họp ở khách sạn Straiford, bang Philadelphia, Hoa Kỳ với hơn 4000 người tham dự. Trong thời gian hội nghị và ăn ở tại khách sạn, có hơn 200 người bị viêm phổi cấp tính nặng trong đó có 34 người bị tử vong. Năm tháng sau, Mc. Dale và cộng sự phân lập được từ tổ chức mô phổi của người chết một loại trực khuẩn Gram âm mới mà trước đây chưa ai biết. Tháng 11 năm 1978 tại Hội nghị quốc tế về bệnh “Lê dương” họp ở Atlanta, Hoa Kỳ, trực khuẩn gây bệnh này được đặt tên là Legionella pneumophila[25],[30]. Về khả năng gây bệnh, vi khuẩn Legionella pneumophila xâm nhập cơ thể qua đường hô hấp do hít phải bụi hay hơi nước bị nhiễm khuẩn. Việc lây nhiễm thường xảy ra ở những người bị suy giảm miễn dịch hoặc bị suy kiệt khi hít phải . . không khí, bụi bị nhiễm Legionella pneumophila hoặc hít các khí dung phát ra từ các máy điều hòa bị nhiễm khuẩn hoặc từ đầu các vòi sen. Biểu hiện lâm sàng nổi bật là viêm phổi nặng, cấp tính với triệu chứng sốt cao đột ngột, ớn lạnh, ho, mệt mỏi, tím tái. Bệnh nhân có thể có triệu chứng đau bụng, tiêu chảy, rối loạn tri giác, li bì, mê sảng kèm theo dấu hiệu tổn thương một số cơ quan khác. X quang phổi cho thấy hình ảnh loang lổ, đông đặc đa thùy. Xét nghiệm máu có thể thấy tăng bạch cầu, hạ natri hoặc bất thường chức năng gan hoặc có dấu hiệu suy thận. Hiện nay để chẩn đoán xác định vi khuẩn Legionella pneumophila, người ta dùng kỹ thuật real time PCR được thực hiện ở một số phòng xét nghiệm tại bệnh viện có trang bị các kỹ thuật sinh học phân tử. 1.3. Các công trình nghiên cứu có liên quan 1.3.1. Các công trình nghiên cứu viêm phổi mắc phải cộng đồng trong nước Theo tác giả Nguyễn Văn Thành có 50% viêm phổi mắc phải cộng đồng thì tác nhân vi khuẩn được phát hiện là Streptoccci spp (bao gồm nhóm S. viridans) chiếm tỷ lệ cao nhất (47,7%) kế đến là S. aureus (15,6%) và P. aeruginosa (10%) [20] . Nghiên cứu của tác giả Đặng Văn Ninh trên 146 bệnh nhân viêm phổi mắc phải cộng đồng tại bệnh viện Chợ Rẫy năm 2005, kết quả ghi nhận có 86 trường hợp xác định được vi khuẩn gây bệnh, chiếm tỷ lệ 58,9% (86/146), trong đó vi khuẩn Gram âm có tỷ lệ 58,1% (50/86), vi khuẩn Gram dương có tỷ lệ 41,9% (36/86). Trong số các vi khuẩn phát hiện được thì nhóm S. viridans chiếm tỷ lệ 23,3%, S. aureus và H. influenzae cùng tỷ lệ 8,1%, M. catarrhalis 5,8%, K. pneumoniae và Acinetobacter spp cùng tỷ lệ 4,7%, P. aeruginosa chỉ chiếm 2,3% [18] . Kết quả nghiên cứu của Đinh Ngọc Sỹ và cộng sự trên bệnh nhân viêm phổi mắc phải cộng đồng điều trị ở bệnh viện Bạch Mai Hà Nội năm 2000-2004 cho thấy vi khuẩn S. pneumoniae và H. influenzae chiếm tỷ lệ rất thấp với 6% và 2% [19]. Sau đó năm 2005, cũng tại bệnh viện Bạch Mai, tác giả Ngô Quý Châu và cộng sự nghiên cứu tác nhân gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng ghi nhận kết quả vi khuẩn chiếm . . ưu thế là K. pneumoniae với tỷ lệ 42,1%, kế đến là P. aeruginosa với tỷ lệ 13,2%, H. influenzae là 10,5% và S. pneumoniae là 10,5% [5]. Theo kết quả nghiên cứu của Trần Văn Ngọc, Phạm Hùng Vân và cộng sự, tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi mắc phải cộng đồng ở 146 bệnh nhân điều trị tại bệnh viện Chợ Rẫy năm 2005-2006 ghi nhận tỷ lệ phát hiện vi khuẩn gây bệnh là 58,9% (86/146) trong đó vi khuẩn Gram âm chiếm tỷ lệ 33% (28/86) với đa số là H. influenzae 25% (7/28), M. catarrhalis 17% (5/28), P. aeruginosa và K. pneumoniae chỉ chiếm cùng tỷ lệ 7% (2/28) [16] . Trước đó vào năm 2004, tác giả Trần Văn Ngọc và Phạm Hùng Vân trong nghiên cứu tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi mắc phải cộng đồng cùng ghi nhận vi khuẩn Gram âm ngà y càn g có vai trò quan tr ọng và tần suất gâ y bệnh ngà y càng tăng [17] . Tương tự theo kết quả nghiên cứu của Lê Tiến Dũng về tác nhân gây viêm phổi mắc phải cộng đồng trên bệnh nhân nhập viện điều trị tại bệnh viện Nguyễn Tri Phương năm 2005, 2006 và 2008 cho thấy vi khuẩn Gram âm chiếm đa số với tỷ lệ từ 69-94,6% trong đó thường gặp nhất là P. aeruginosa 27-36,5%, kế đến là Klebsiella spp (10-29%), H. influenzae 6,7% và vi khuẩn Gram dương thư ờng gặp nhất là S. pneumoniae chiếm t ỷ lệ 3,2-20,5% [7],[9] . Cũng nghiên cứu về tác nhân vi khuẩn trong bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng ở bệnh nhân điều trị tại bệnh viện Nguyễn Tri Phương năm 2007, tác giả Võ Đức Chiến ghi nhận vi khuẩn Gram âm chiếm tỷ lệ cao hơn vi khuẩn Gram dương (68,6% so với 31,4%) trong đó vi khuẩn Gram âm thường gặp nhất là P.aeruginosa 34,4%, Klebsiella spp 10%, Moraxiella catarrhalis, Acinetobacter baumannii và E. coli cùng có tỷ lệ 5%. Còn với vi khuẩn Gram dương thì S. pneumoniae chiếm tỷ lệ 10% và S.aureus có tỷ lệ 6,2% [6].Kết quả nghiên cứu của Trần Anh Đào năm 2011 tại bệnh viện Nhân dân Gia Định về đặc tính lâm sàng và cận lâm sàng ở 172 bệnh nhân bị viêm phổi mắc phải cộng đồng cho thấy tỷ lệ phát hiện vi khuẩn là 28,5% (49/172). Tuy nhiên, trong số 172 mẫu đàm thì chỉ có 101 mẫu đàm đạt chuẩn tin cậy, tỷ lệ đạt chuẩn là 58,7% (101/172). Nếu chỉ tính trên mẫu đàm đạt chuẩn thì tỷ lệ phát hiện vi khuẩn gây bệnh (tỷ lệ dương tính) là 48,1% (49/101) trong đó vi . . khuẩn Gram âm chiếm đa số 93,9% (46/49) với P. aeruginosa 30,6%, Acinetobacter spp 16,3%, Klebsiella spp 14,3% và H. influenzae 6,1%. Vi khuẩn Gram dương chỉ chiếm tỷ lệ 6,1% (3/49) trong đó S. pneumoniae có tỷ lệ 4,1% và S. aureus 2%. Ngoài ra tác giả cũng ghi nhận vi khuẩn P. aeruginosa thường gặp ở bệnh nhân viêm phổi mắc phải cộng đồng có kèm theo COPD, dãn phế quản hoặc lao phổi cũ cũng như ở nhóm bệnh nhân ≥ 60 tuổi so với nhóm bệnh nhân < 60 tuổi (38,9% so với 14,3% với p < 0,01% ) [10]. Kết quả nghiên cứu của Trần Hạnh trên bệnh nhân viêm phổi mắc phải cộng đồng tại bệnh viện Nguyễn Tri Phương năm 2009 cũng cho thấy vi khuẩn Gram âm chiếm đa số với tỷ lệ 78%, thường gặp nhất là P. aeuginosa 16%. H. influenzae 15%, Acinetobacter spp 10,5%, Klebsiella spp 10,5% và M. catarrhalis 10% [11] . Tương tự theo kết quả nghiên cứu của Huỳnh Thị Loan về tác nhân vi sinh gây viêm phổi mắc phải cộng đồng ở bệnh nhân điều trị tại bệnh viện Bệnh Nhiệt đới TP.HCM thì vi khuẩn Gram âm chiếm đa số với tỷ lệ 86,2% (25/29 trường hợp phát hiện vi khuẩn gây bệnh), trong đó K. pneumoniae chiếm tỷ lệ 31,1% (9 trường hợp), H. influenzae 13,8% ( 4 trường hợp ), P. aeruginosa 13,8% (4 trường hợp ) và E. coli 6,9% ( 2 trường hợp ). Vi khuẩn Gram dương chỉ chiếm 13,8% (4/29) trong đó S. pneumoniae và S. aureus cùng có tỷ lệ là 6,9%. Không có trường hợp nào phát hiện vi khuẩn không điển hình [14] . Còn kết quả nghiên cứu trên bệnh nhân COPD bị viêm phổi mắc phải cộng đồng nhập viện điều trị tại bệnh viện Lao và bệnh phổi Phạm Ngọc Thạch năm 2015 của tác giả Nguyễn Sử Minh Tuyết và cộng sự thì vi khuẩn gây bệnh chiếm đa số là H. influenzae với tỷ lệ 30,3%, kế đến là P. aeruginosa, Acinetobacter spp và Enterobacter spp cùng có tỷ lệ là 12,1% [21] . Tóm lại, kết quả công trình nghiên cứu của các tác giả trong nước về tác nhân vi sinh gây viêm phổi mắc phải cộng đồng nhập viện điều trị chỉ ghi nhận tác nhân vi khuẩn gây bệnh với tỷ lệ dương tính khoảng 45-55. Vi khuẩn Gram âm chiếm tỷ lệ cao hơn vi khuẩn Gram dương và có khuynh hướng ngày càng tăng, trong đó chiếm đa số là P .aeruginosa và A. baumannii ( đặc biệt là ở bệnh nhân COPD, . . dãn phế quản, bệnh trầm trọng và tuổi cao ≥ 60 tuổi). Vi khuẩn S. pneumoniae ( không kể nhóm S. viridans ) và H. influenzae chiếm tỷ lệ khá thấp. Hầu hết các nghiên cứu trong nước không phát hiện được vi khuẩn không điển hình và đồng nhiễm (đa tác nhân). 1.3.2. Các công trình nghiên cứu viêm phổi mắc phải cộng đồng ở nước ngoài Theo kết quả nghiên cứu Ruiz M. và cộng sự thì tỷ lệ tác nhân vi sinh trong viêm phổi mắc phải cộng đồng được phát hiện 46% trong đó có đến 23% nhiễm đa tác nhân. Trong số các tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi mắc phải cộng đồng phải nhập viện điều trị thì S .pneumoniae chiếm đa số với tỷ lệ 29%, H. influenzae 11%, L . pneumophila 8%, C. pneumoniae 7%. Vi khuẩn đường ruột chỉ chiếm 6%, P. aeruginosa 5%[35] . Kết quả nghiên cứu cho thấy có một số trường hợp có nhiễm khuẩn phối hợp ( đa nhiễm ). Ở bệnh nhân viêm phổi mắc phải cộng đồng trong tình trạng trầm trọng thì có nguy cơ nhiễm P. aeruginosa với tỷ lệ cao. Tác giả cũng ghi nhận các vi khuẩn không điển hình như M. pneumoniae, C. pneumoniae trước đây chưa được biết nhiều, nay ngày không ngừng gia tăng trong nhiễm khuẩn hô hấp dưới. Hơn nữa các vi khuẩn không điển hình như C. pneumoniae có thể gây nhiễm khuẩn phối hợp với các vi khuẩn khác và làm cho tình trạng nhiễm khuẩn do S. pneumoniae càng thêm trầm trọng [35]. Kết quả nghiên cứu của tác giả Arancibia F. và của tác giả Liam CK. đều ghi nhận, ngoài tác nhân chính gây viêm phổi mắc phải cộng đồng là S. pneumoniae, vi khuẩn Gram âm ngày càng có vai trò quan trọng và tần suất gây bệnh ngày càng tăng [26],[32] . Tương tự, kết quả nghiên cứu của tác giả Kobashi Y. ở Nhật Bản và kết quả công rrình nghiên cứu của tác giả Wattanathum A. và cộng sự ở Đông Nam Á trên bệnh nhân viêm phổi mắc phải cộng đồng nhập viện điều trị cùng ghi nhận tác nhân vi khuẩn Gram âm xảy ra ngày càng phổ biến, nhất là ở bệnh nhân từ 65 tuổi trở lên [36]. Các công trình nghiên cứu tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi mắc phải cộng đồng của tác giả Carlos M.L. [27] của Nair Girish B. [34], của Garcia Vidal C. [29] của Lauderdale Tsai-Ling và cộng sự [31] đều ghi nhận vi khuẩn S. pneumoniae chiếm đa số, kế đến là H. influenzae, M. pneumoniae, C. pneumoniae, sau cùng là các vi khuẩn Gram . . âm thuộc nhóm Enterobacteriaceae và P. aeruginosa. Tác giả Lauderdalee T. và cộng sự cũng ghi nhận, trong các tác nhân vi khuẩn gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng thì S. pneumoniae là tác nhân gây bệnh chính với tỷ lệ 23,8%, kế đến là M. pneumoniae 14,3%, C. pneumoniae 7,1%, K. pneumoniae 4,8% và H. influenzae 4,8% [31]. Hầu hết các tác giả nước ngoài kể trên đều cho rằng nhờ các kỹ thuật tiên tiến mà các tác nhân gây nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới ngày càng được phát hiện càng nhiều, tuy nhiên S. pneumoniae vẫn là vi khuẩn thường gặp nhất. Tóm lại, kết quả công trình nghiên cứu của các tác giả nước ngoài về tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi mắc phải cộng đồng nhập viện điều trị đều ghi nhận S. pneumoniae là tác nhân chính, chiếm tỷ lệ cao trong các tác nhân vi khuẩn thật sự gây bệnh, kế đến là H. influenzae và K. pneumoniae. Các vi khuẩn Gram âm có tỷ lệ thấp hơn nhưng có khuynh hướng ngày càng tăng, nhất là ở bệnh nhân ≥ 60 tuổi, đặc biệt là tác nhân P. aeruginosa thường xảy ra ở bệnh nhân viêm phổi mắc phải cộng đồng có kèm COPD, dãn phế quản, bệnh nặng trầm trọng. Đa tác nhân ( phối hợp vi khuẩn ) cũng được ghi nhận với tỷ lệ 23% các trường hợp. Kết quả của các công trình nước ngoài cũng cho thấy tỷ lệ phát hiện vi khuẩn ( tỷ lệ dương tính ) bằng kỹ thuật real time PCR cao hơn nhiều so với phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn, đồng thời phát hiện được các vi khuẩn không điển hình như M. pneumoniae, C. pneumoniae và L. pneumophila mà kỹ thuật nuôi cấy không phát hiện được. . . CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thiết kế nghiên cứu - Thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang - Thời gian nghiên cứu : tháng 6/2016 đến 6/2017 - Địa điểm nghiên cứu : Công ty Nam Khoa Biotek 2.2. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là các bệnh nhân bị viêm phổi mắc phải cộng đồng điều trị tại khoa Hô hấp các bệnh viện Cần Thơ, bệnh viện Chợ Rẫy, bệnh viện Lao và bệnh phổi Phạm Ngọc Thạch, bệnh viện Nhân dân Gia Định và bệnh viện Nguyễn Tri Phương. Các bệnh viện được chọn là các bệnh viện có phòng xét nghiệm vi sinh đủ khả năng và đạt quy trình chuẩn để nuôi cấy phân lập vi khuẩn từ các bệnh phẩm đàm hay bệnh phẩm chứa đàm. 2.3. Cỡ mẫu Đây là nghiên cứu mô tả cắt ngang khảo sát tỷ lệ các tác nhân vi khuẩn gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng nên công thức tính cỡ mẫu tối thiểu áp dụng cho trường hợp ước tính một tỷ lệ như sau n Z (21 / 2) p(1  p) d2 Với Z là trị số tra từ bảng phân phối chuẩn, Z(1-α/2) = 1,96 p là tỷ lệ phát hiện tác nhân vi khuẩn gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng ở người lớn nhập viện. Căn cứ vào kết quả nghiên cứu của Lý Khánh Vân và Phạm ùng Vân về tác nhân gây bệnh viêm phổi mắc phải cộng đồng với tỷ lệ vi khuẩn là 69% [24] chọn p = 69% = 0,69 d là sai số, với mong muốn độ chính xác (độ tin cậy) là 94%, chọn sai số 6% = 0,06. .