Tài liệu Tác động kháng khuẩn của huyết tương giàu tiểu cầu lên vi khuẩn porphyromonas gingivalis

1 . BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Tác động kháng khuẩn của huyết tương giàu tiểu cầu lên vi khuẩn Porphyromonas gingivalis Mã số: Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Phạm Anh Vũ Thụy Tp. Hồ Chí Minh, 2018 . 2 . BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG Tác động kháng khuẩn của huyết tương giàu tiểu cầu lên vi khuẩn Porphyromonas gingivalis Mã số: Chủ nhiệm đề tài PGS.TS. Phạm Anh Vũ Thụy Tp. Hồ Chí Minh, 2018 . 3 . ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm nha chu là một bệnh lý phức tạp, đa yếu tố, đa vi khuẩn đặc trưng bởi sự phá huỷ các thành phần của mô nâng đỡ răng. Mảng bám dưới nướu ở người chứa tới 800 loại vi khuẩn [57] và các nghiên cứu đã chỉ ra rằng Porphyromonas gingivalis, một vi khuẩn Gram (-) kỵ khí, là một trong những bệnh nguyên chính của viêm nha chu mạn. Vi khuẩn tiết sắc tố đen này chứa nhiều yếu tố độc lực gây phá huỷ mô nha chu và ảnh hưởng trực tiếp cũng như gián tiếp tới đáp ứng viêm của vật chủ [55]. Các phương pháp điều trị viêm nha chu gồm phẫu thuật và không phẫu thuật có mục tiêu là loại bỏ mảng bám và các vi khuẩn gây bệnh. Tuy nhiên, kể cả khi các biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn được thực hiện chặt chẽ, vi khuẩn vẫn có thể xâm nhiễm và phát triển ở các mô phía dưới tổn thương [39]. Sự tồn tại của vi khuẩn có thể làm ảnh hưởng quá trình lành thương và tái sinh mô, ảnh hưởng tới kết quả điều trị. Do đó, làm thế nào để kháng khuẩn tốt là yếu tố quan trọng cho thành công của lành thương và phòng tránh tình trạng mạn tính. Huyết tương giàu tiểu cầu (platelet rich plasma, PRP) được phát triển gần đây như một biện pháp hỗ trợ lành thương và tái sinh mô, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực y khoa như chỉnh hình, da liễu, thẩm mỹ, nha khoa và phẫu thuật hàm mặt [65]. Hạt alpha có trong tiểu cầu có khả năng giải phóng một số lượng lớn peptide và các yếu tố tăng trưởng. Điều này giúp cho PRP có ảnh hưởng và thúc đẩy quá trình sinh học cần thiết cho quá trình lành thương và tái sinh mô [65]. Bên cạnh đó, tác động kháng khuẩn của vật liệu này cũng đã được báo cáo trong một số công trình nghiên cứu trên vi khuẩn trong miệng với các kết quả khác nhau [12], [21], [31]. Đối với vi khuẩn gây bệnh nha chu, đặc biệt là Porphyromonas gingivalis, các nghiên cứu về tác động của PRP lên sự phát triển của vi khuẩn bệnh nguyên này còn giới hạn. Ngoài ra, trong các nghiên cứu trước đây, PRP được thu thập từ máu của người tình nguyện khoẻ mạnh cũng như sử dụng các chủng vi khuẩn thương mại để nghiên cứu [17], [106]. Điều này đặt ra câu hỏi đối với vi khuẩn Porphyromonas gingivalis nuôi cấy trực tiếp từ mảng bám . 4 . dưới nướu của bệnh nhân viêm nha chu, PRP của người khoẻ mạnh và của bệnh nhân viêm nha chu có thể hiện tác động kháng khuẩn in vitro hay không, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với các mục tiêu: *Mục tiêu chính: Đánh giá tác động kháng khuẩn in vitro của PRP lên vi khuẩn Porphyromonas gingivalis nuôi cấy từ mảng bám dưới nướu của bệnh nhân viêm nha chu. *Mục tiêu cụ thể: 1. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của PRP lên vi khuẩn Porphyromonas gingivalis. 2. Xác định độ kháng bám dính vi khuẩn của PRP. 3. Xác định độ nhạy cảm của màng sinh học vi khuẩn Porphyromonas gingivalis với PRP. . 5 . CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thử nghiệm in vitro. 2.2 Vật liệu nghiên cứu A. Mẫu mảng bám dưới nướu để nuôi cấy vi khuẩn Mảng bám dưới nướu của bệnh nhân viêm nha chu. B. Mẫu huyết tương giàu tiểu cầu Được thu thập từ hai nhóm: - Nhóm người tình nguyện khoẻ mạnh đồng ý tham gia nghiên cứu. - Nhóm bệnh nhân viêm nha chu. 2.2.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu A. Mẫu mảng bám dưới nướu nuôi cấy vi khuẩn Thu thập mảng bám dưới nướu của nhóm bệnh nhân viêm nha chu (Nhóm 1) liên tục cho tới khi xuất hiện khuẩn lạc, thoả mãn các tiêu chuẩn sau: • Tuổi: 20-65. • Không sử dụng thuốc kháng sinh, kháng viêm, thuốc tránh thai trước khi tham gia nghiên cứu 3 tháng. • Được chẩn đoán viêm nha chu mạn mức độ trung bình và nặng theo tiêu chuẩn phân loại của Hiệp hội nha chu Hoa Kỳ năm 2015 (Bảng 2.1). B. Mẫu huyết tương giàu tiểu cầu Được thu thập từ hai nhóm thoả mãn các tiêu chuẩn sau: - Nhóm 2 (Nhóm người tình nguyện khoẻ mạnh) (4 người) • Tuổi: 20-65. • Khoẻ mạnh, không có triệu chứng nhiễm khuẩn, không có bệnh toàn thân. • Không có thói quen hút thuốc lá. . 6 . • Không sử dụng thuốc kháng sinh, kháng viêm, thuốc tránh thai trước khi tham gia nghiên cứu 3 tháng. • Tình trạng nha chu khoẻ mạnh, tất cả độ sâu khe nướu nhỏ hơn 3mm và không có hiện tượng phù nề hay chảy máu nướu. - Nhóm 3 (Nhóm bệnh nhân viêm nha chu) (4 người): • Tuổi: 20-65 • Không có thói quen hút thuốc lá, không có bệnh toàn thân. • Không sử dụng thuốc kháng sinh, kháng viêm, thuốc tránh thai trước khi tham gia nghiên cứu 3 tháng. • Được chẩn đoán viêm nha chu mạn mức độ trung bình và nặng theo tiêu chuẩn phân loại của Hiệp hội nha chu Hoa Kỳ năm 2015 [8]. tham gia trong hai nhóm được xét nghiệm công thức máu tổng quát khi tiến hành thu thập mẫu PRP để đảm bảo công thức máu bình thường và không có các bệnh lý tiểu cầu. 2.2.2 Tiêu chuẩn loại trừ - Bệnh nhân không hợp tác, khó khăn trong việc cung cấp thông tin, giao tiếp kém. - Bệnh nhân đang có thai. 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Vật liệu và phương pháp tiến hành 2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu vi khuẩn Quy trình lấy mẫu và nuôi cấy vi khuẩn được thực hiện theo phương pháp của Doan Nguyen và cộng sự (1999) [37]. Chuẩn bị môi trường vận chuyển: 2ml Wilkins chalgren anaerobic broth base (Himedia - M863) vào các ống ly tâm eppendorf. Lấy mẫu: Cô lập vùng răng lấy mẫu bằng gòn cuộn, làm sạch mảng bám trên nướu, sử dụng 2-4 côn giấy cỡ 35-40 đưa vào các túi nha chu từ . 7 . 5mm trở lên, giữ trong 30 giây và chuyển vào các ống eppendorf chứa môi trường vận chuyển, đưa ống mẫu vào túi chứa gói tạo môi trường kỵ khí (AnaeroPack®, Mitsubishi, Nhật Bản) và chuyển phòng thí nghiệm cấy mẫu. Cấy vi khuẩn từ mẫu: - Vi sinh vật được tách cơ học khỏi các côn giấy với máy trộn Vortex ở mức cao nhất trong 45 giây. Phần huyền phù vi khuẩn được pha loãng bậc 10 trong dung dịch vận chuyển. - Sử dụng que trải tiệt trùng cấy dung dịch pha loãng vào các đĩa petri chứa môi trường Wilkins Chalgren anaerobic agar có bổ sung 5% máu cừu (môi trường nuôi cấy). - Ủ các đĩa petri cùng túi kỵ khí trong bình GasPak ở 37ºC từ 7-10 ngày. Sau khi ủ, khuẩn lạc có kiểu hình đặc trưng được làm thuần và cấy chuyền, định danh bằng phương pháp MALDI-TOF, thực hiện bởi trung tâm Oucru, Bệnh viện nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh. Sau khi có kết quả là vi khuẩn cần tìm, gửi mẫu khuẩn lạc trong dung dịch Tris-EDTA đi giải trình tự với đoạn mồi đặc hiệu. - Lưu trữ vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy và glycerol 25% ở điều kiện âm sâu (nitơ lỏng). 2.3.1.2 Chuẩn bị huyết tương giàu tiểu cầu Quy trình thu thập PRP thực hiện theo các bước hướng dẫn của nhà sản xuất. Bước 1: Lấy ba ống máu, mỗi ống 8,5ml. Hút 100μl để đếm tiểu cầu. Bước 2: Đặt ba ống máu vào máy ly tâm. Ly tâm mẫu ở chế độ 2000 vòng/phút trong 10 phút. Đặt thêm một ống nước 8,5ml để cân bằng. Bước 3: Thu tiểu cầu. Lấy nhẹ nhàng ba ống máu ra khỏi máy ly tâm. Dùng pipette hút nhẹ nhàng dịch màu vàng bên trên lớp hồng cầu cho vào ống khác. Bước 4: Làm giàu tiểu cầu. Ly tâm ống chứa dịch vàng ở chế độ 3500 . 8 . vòng/phút trong vòng 5 phút. Sau đó hút nhẹ nhàng dịch màu vàng là huyết tương nghèo tiểu cầu phía trên ra ống khác, vừa hút vừa huyền phù đều, chừa lại khoảng 5ml ở đáy ống. Đếm số tiểu cầu bằng cách hút khoảng 100μl PRP, pha loãng với dung dịch amoni oxalat cho vào buồng đếm hồng cầu. Bước 5: Hoạt hoá tiểu cầu bằng ống chứa chất hoạt hoá. Ép khối đông đặc và huyền phù đều. Sử dụng xi lanh hút dịch PRP, gắn màng lọc và ép dịch PRP đi qua màng lọc vào ống PRP thành phẩm. Thu được 4-5ml dịch PRP vô trùng. Bước 6: Dán nhãn và phân nhóm mẫu PRP của hai nhóm người tham gia khoẻ mạnh và bệnh nhân viêm nha chu. 2.3.1.3 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu Quy trình thực hiện cho mỗi mẫu PRP: - Pha loãng dãy nhị phân của chế phẩm PRP (180μl/giếng) với 0,9% saline được bổ sung trong đĩa 96 giếng. - Chlorhexidine gluconate 0,12% được sử dụng như chứng dương và môi trường nuôi cấy không bổ sung huyết tương là chứng âm. - Với mỗi giếng, 20μl dung dịch huyền phù vi khuẩn pha loãng được thêm vào. Sau khi ủ kỵ khí ở nhiệt độ 37ºC trong 24 giờ, thêm vào mỗi giếng 20μl dung dịch resazurin và đánh giá sự đổi màu của dung dịch trong các giếng. Giá trị MIC là nồng độ thấp nhất trong dãy nồng độ thử nghiệm không làm đổi màu xanh của resazurin. Sử dụng resazurin đơn giản, cho kết quả nhanh chóng và dễ dàng quan sát. - Mỗi nghiệm thức được thực hiện trong 3 giếng và lặp lại ít nhất 3 lần với các kết quả tương đồng. 2.3.1.4 Thí nghiệm vi khuẩn bám vào đĩa nuôi cấy Quy trình thực hiện cho mỗi mẫu PRP - Vi khuẩn phát triển qua đêm trong môi trường nuôi cấy kỵ khí. Tổng thể tích 150μl huyết tương và dung dịch vi khuẩn được cho vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng vô trùng được xử lý bề mặt sẵn bởi nhà sản xuất. . 9 . - Các giếng đối chứng chỉ chứa môi trường nuôi vi khuẩn được tiến hành song song. - Các đĩa được ủ kỵ khí 24 giờ ở nhiệt độ 37ºC. Loại bỏ dịch nuôi cấy, rửa bằng dung dịch saline đệm phosphate (PBS) ở pH 7,2. Các vi khuẩn bám vào giếng được cố định với methanol trong 15 phút và thổi khô. Sau đó nhuộm các giếng bằng dung dịch tím kết tinh 0,1% trong 5 phút. Rửa sạch bằng nước cất. Đĩa được để khô và bổ sung 100μl ethanol 95% vào mỗi giếng. - Độ hấp thụ của mỗi giếng sau đó được đo bằng máy đọc phiến quang phổ tại bước sóng 595nm. - Mỗi nghiệm thức được thực hiện trong 3 giếng và thí nghiệm lặp lại ít nhất 3 lần với các kết quả tương đồng. 2.4 Xử lý, phân tích số liệu Kết quả nuôi cấy được trình bày dưới dạng hình ảnh. Kết quả thí nghiệm được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (TB ± ĐLC). Sử dụng kiểm định phi tham số Wilcoxon để so sánh sự khác biệt giữa các nhóm. Giá trị p<0,05 được cho là có ý nghĩa thống kê. Các phân tích được thực hiện bằng phần mềm Stata phiên bản 13 (Stata Corp, Hoa Kỳ). . 10 . . 11 . CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 3.1 Nuôi cấy vi khuẩn Porphyromonas gingivalis Mẫu mảng bám sau khi ủ xuất hiện khuẩn lạc có nghi ngờ sự hiện diện vi khuẩn Porphyromonas gingivalis là của bệnh nhân viêm nha chu thứ 21. Khuẩn lạc có hình tròn, tạo sắc tố màu đen bóng hoặc hơi gồ ghề, dạng lồi, tiêu huyết beta, kích thước khoảng 1-2mm. Sau khi làm thuần, mẫu khuẩn lạc được gửi định danh bằng phương pháp MALDI-TOF. Kết quả biểu thị vi khuẩn Porphyromonas gingivalis cần tìm. So sánh kết quả gửi giải trình tự bằng phương pháp Sanger với đoạn mồi đặc hiệu [96] với ngân hàng gen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) khẳng định chủng phân lập thuộc loài Porphyromonas gingivalis. Quá trình nuôi cấy phát hiện một số vi khuẩn khác như Actinomyces odontolyticus, Actinomyces oris, Actinomyces naeslundii, Staphylococcus capitis, Staphylococcus epidermimis, Neisseria macacae, Neisseria sicca, Streptococcus oralis, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Propionibacterium acnes. 3.2 Huyết tương giàu tiểu cầu Nghiên cứu thu được 4,5ml tới 5ml PRP ở mỗi đối tượng tham gia đồng ý cho máu. Dung dịch thu được đồng nhất, màu vàng nhạt, không có tạp chất cơ học lạ, không bị vẩn đục. Sau khi pha loãng PRP với dung dịch nuôi cấy, không quan sát thấy sự khác biệt giữa ống có PRP và ống không chứa PRP. Số lượng tiểu cầu trong PRP sau khi làm giàu tăng khoảng 2-5 lần so với số lượng tiểu cầu trong máu toàn phần (Bảng 3.1) . 12 . 3.3 Nồng độ ức chế tối thiểu PRP của tất cả các đối tượng tham gia nghiên cứu sau khi được pha loãng bậc 2, biểu diễn từ tỉ lệ 1/2 tới tỉ lệ 1/64. Sau khi sử dụng resazurin để xác định MIC, PRP của các đối tượng tham gia nghiên cứu thể hiện khả năng ức chế vi khuẩn ở nồng độ tối thiểu là 1/2, chỉ có một đối tượng người khoẻ mạnh có PRP thể hiện nồng độ ức chế tối thiểu vi khuẩn Porphyromonas gingivalis ở mức 1/4, qua sự đổi màu của các giếng có tỉ lệ pha loãng tương ứng. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.2 và Hình 3.6. . 13 . . 14 . . 15 . 3.4 Thí nghiệm kháng bám dính vi khuẩn Nghiên cứu đánh giá tác động ức chế bám dính vi khuẩn Porphyromonas gingivalis lên đáy các giếng của đĩa 96 giếng. Nồng độ PRP của tất cả các đối tượng thí nghiệm là 50%, ủ đĩa trong 24 giờ ở nhiệt độ 37ºC trong điều kiện kỵ khí. Nồng độ tiểu cầu thí nghiệm trung bình của nhóm người khoẻ mạnh là 466,9 ×106/ml. Nồng độ tiểu cầu trung bình của nhóm bệnh nhân viêm nha chu là 461,7×106/ml. Kết quả cho thấy tất cả các mẫu PRP đều làm giảm sự bám dính vi khuẩn lên đáy đĩa khi so sánh với nhóm chứng với p<0,05 (với nồng độ tiểu cầu trung bình của mỗi đối tượng trong nhóm khoẻ mạnh lần lượt là 551,2×106/ml; 528,7×106/ml; 500,3×106/ml; 287,3×106/ml và nồng độ tiểu cầu trung bình của mỗi đối tượng trong nhóm viêm nha chu lần lượt là 386,8 ×106/ml; 593,5×106/ml; 448,3×106/ml; 418,2 ×106/ml). Không có sự khác biệt giữa độ kháng bám dính của PRP nhóm khoẻ mạnh và nhóm viêm nha chu với p>0,05 (Biểu đồ 3.1 và 3.2). 3.5 Thí nghiệm nhạy cảm màng sinh học Nghiên cứu đánh giá khả năng loại bỏ vi khuẩn trong màng sinh học của các mẫu PRP nguyên chất sau khi ủ đĩa trong 2 giờ ở nhiệt độ 37ºC trong điều kiện kỵ khí. Nồng độ tiểu cầu thí nghiệm trung bình của nhóm người khoẻ mạnh là 933,75 ×106/ml. Nồng độ tiểu cầu trung bình của nhóm bệnh nhân viêm nha chu là 923,4×106/ml. Chỉ có hai mẫu PRP của nhóm người khoẻ mạnh (nồng độ tiểu đầu tương ứng là 1057,4×106/ml và 574,6×106/ml) và của nhóm bệnh nhân viêm nha chu (nồng độ tiểu cầu tương ứng là 1187×106/ml và 896,6×106/ml) làm giảm số lượng vi khuẩn trong màng sinh học có ý nghĩa so với nhóm chứng (p<0,05). Không có sự khác biệt giữa độ nhạy cảm màng sinh học của PRP nhóm khoẻ mạnh và nhóm viêm nha chu với p>0,05 (Biểu đồ 3.3 và 3.4). . 16 . . 17 . Chương 4: BÀN LUẬN 4.1 Phân lập và định danh vi khuẩn Porphyromonas gingivalis Viêm nha chu là bệnh viêm mạn, đa yếu tố dẫn tới sự phá huỷ các mô nâng đỡ răng và là nguyên nhân chính của hiện tượng mất răng. Các tổn thương viêm nha chu được chứng minh liên quan tới hệ vi khuẩn dưới nướu, chứa chủ yếu các loài vi khuẩn Gram (-), trong đó vi khuẩn tạo sắc tố đen Porphyromonas gingivalis được cho là bệnh nguyên chính [55]. Các nghiên cứu dịch tễ và thực nghiệm đã cho thấy Porphyromonas gingivalis cũng có liên quan tới các bệnh lý toàn thân như bệnh tim mạch, thiếu cân sơ sinh, viêm khớp dạng thấp và bệnh lý gan nhiễm mỡ không do rượu [72]. Nếu việc phát hiện và định lượng vi khuẩn Porphyromonas gingivalis trong viêm nha chu đã dần được thay thế bằng các phương pháp hiện đại như PCR [1], [2], nuôi cấy vi khuẩn vẫn giữ vai trò thiết yếu trong việc cung cấp nguồn vi khuẩn để thực hiện các nghiên cứu so sánh tỉ lệ vi khuẩn ở mẫu bệnh nhân viêm nha chu so với bệnh nhân khoẻ mạnh [104], các thử nghiệm về đặc điểm miễn dịch và tính chất enzym [45], [87], về phương pháp nuôi cấy [37] hay hoạt chất điều trị [61], [100], [106]. So với các vi khuẩn hiếu khí, các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc như Porphyromonas gingivalis đòi hỏi thời gian nuôi cấy dài và môi trường nuôi cấy không có oxy ở nhiệt độ tối ưu (35-37ºC). Các chủng vi khuẩn thương mại rút ngắn thời gian nuôi cấy, thay đổi từ 2-4 ngày, nhưng đối với các mẫu mảng bám/dịch nướu, thời gian để nuôi cấy vi khuẩn Porphyromonas gingivalis thay đổi từ 7 ngày [80], [82]; 10 ngày [77]; 7-14 ngày [24] cho tới 3 tuần [104]. Nghiên cứu này cần thời gian từ 7-10 ngày để quan sát thấy sự xuất hiện của Porphyromonas gingivalis trên môi trường thạch máu. Điều này tương đồng với các nghiên cứu nuôi cấy phân lập vi khuẩn bệnh nguyên nha chu trước đó [77], [82]. Bên cạnh đó, sự khác biệt trong việc nuôi cấy Porphyromonas gingivalis chính là môi trường nuôi cấy đặc hiệu dựa vào đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn này. . 18 . 4.3. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) MIC được định nghĩa là nồng độ ức chế tối thiểu mà một hoạt chất có thể ức chế sự phát triển trông thấy được của vi sinh vật sau thời gian ủ và được cho là tiêu chuẩn vàng để xác định tính nhạy cảm của vi khuẩn với các hoạt chất kháng khuẩn và do đó được sử dụng để kiểm tra các phương pháp thí nghiệm kháng sinh khác. MIC được sử dụng trong chẩn đoán để xác nhận một tình trạng kháng thuốc bất thường hoặc để khẳng định kết quả của các phương pháp thử nghiệm khác, hay do phương pháp khuếch tán qua thạch không phù hợp để sử dụng [9]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, hoạt chất thí nghiệm là PRP của các đối tượng tham gia nghiên cứu. Kết quả cho thấy nồng độ ức chế vi khuẩn Porphyromonas gingivalis tối thiểu của PRP của tất cả các đối tượng (theo tỉ lệ pha loãng PRP) là 1/2, trừ PRP của một đối tượng khoẻ mạnh biểu hiện giá trị 1/4 (tương ứng nồng độ tiểu cầu là 275,6 ×106/ml). Tỉ lệ 1/4 này tương ứng với kết quả của Yang và cộng sự (2015), trong đó giá trị MIC của PRP thí nghiệm trên Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum lần lượt là 1/4, 1/8, 1/2. Tuy nhiên với các đối tượng còn lại trong nghiên cứu của chúng tôi, vi khuẩn Porphyromonas gingivalis chỉ bị ức chế ở MIC 1/2, cao hơn so với kết quả trong nghiên cứu của Yang và cộng sự (2015) [106]. Sự khác biệt này có lẽ do tính chất của vi khuẩn khác nhau, cũng như PRP thu thập trên các đối tượng khác biệt. Vi khuẩn Porphyromonas gingivalis được phân lập từ mảng bám dưới nướu của chúng tôi được sử dụng trực tiếp để thí nghiệm với PRP. Trong khi đó, Yang và cộng sự (2015) sử dụng vi khuẩn sẵn có trong phòng thí nghiệm là ATCC 33237® [106]. Chính tác giả cũng nhấn mạnh rằng việc sử dụng chủng vi khuẩn thương mại, về ưu điểm, có kết quả dễ so sánh với các nghiên cứu khác, nhưng về nhược điểm, do trải qua rất nhiều lần cấy chuyền và đông khô, vi khuẩn có thể phần nào mất đi độc lực. Mặc dù ý kiến này tương đồng với các tác giả khác, tuy nhiên họ cũng nhấn mạnh điều này còn tuỳ thuộc vào từng chủng và dòng vi khuẩn hay nấm, và thông thường khi vi khuẩn trải qua từ 50-100 lần cấy chuyền mới bắt đầu mất đi một số độc lực [13]. Kết quả MIC của PRP trên . 19 . Porphyromonas gingivalis cũng cao hơn so với các vi khuẩn khác, có nghĩa là cần một nồng độ đậm đặc hơn của PRP để có thể ức chế được vi khuẩn này. Nghiên cứu của Drago và cộng sự (2014) cho thấy mức MIC của PRP thay đổi từ 1/8 tới 1/16 khi thử nghiệm trên Enterococcus faecalis, Streptococcus oralis, Streptococcus agalactiaea, Staphylococcus aureus [40]. Trong khi đó, với sự thay đổi thí nghiệm MIC bằng cách sử dụng kết hợp PRP pha loãng 1/2 với các kháng sinh, Rózalski và cộng sự (2013) thấy rằng với cùng hiệu quả kháng vi khuẩn, kết hợp PRP với oxacillin giảm lượng kháng sinh sử dụng từ 0,25mg/l còn 0,19mg/l. Tương tự, lượng vancomycin giảm từ 1,0mg/l (nhóm chứng) còn 0,5mg/l (nhóm có bổ sung PRP). Kết quả này giúp tác giả khẳng định tác động đồng vận của các protein kháng khuẩn của tiểu cầu với các kháng sinh như nafcillin, ampicillin và vancomycin. Tác động của hiện tượng này cũng cho thấy khả năng giảm sự bám dính vi khuẩn vào tiểu cầu, khi sự nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh tăng lên nhờ protein của tiểu cầu [81]. Kết quả kháng Porphyromonas gingivalis trong nghiên cứu này, dù ở nồng độ cao, cũng tương ứng với các nghiên cứu khác sử dụng phương pháp khuếch tán để thí nghiệm khả năng kháng vi khuẩn này của PRP. Theo nghiên cứu của Badade và cộng sự (2016), PRP có khả năng kháng được Porphyromonas gingivalis và Aggregatibacter actinomycetemcomitans với đường kính vùng kháng khuẩn trung bình lần lượt là 13mm và 13,8mm, trong khi đó PRF không thể hiện tính kháng hai vi khuẩn này [17]. Một nghiên cứu khác sử dụng phương pháp khuếch tán qua thạch của Aggour và cộng sự (2017) cũng cho thấy tính kháng Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetem-comytans, Candida albicans và Staphylococcus aureus. PRP trong nghiên cứu của Aggour và cộng sự (2017) được thu thập từ 10 bệnh nhân viêm nha chu và 10 người khoẻ mạnh, tác giả kết luận không có sự khác biệt về tính kháng vi khuẩn giữa hai nhóm [3]. Sự khác biệt giữa nghiên cứu của chúng tôi so với các nghiên cứu khác một phần do sự khác biệt phương pháp thử nghiệm tính kháng khuẩn. Như đã trình bày, bên cạnh phương pháp pha loãng trong dung dịch, phương pháp khuếch tán qua thạch như E-test hay pha loãng trong thạch . 20 . cũng được sử dụng để xác định tính kháng khuẩn. Tuy nhiên, do các phương pháp khác không phù hợp với vật liệu PRP, chúng tôi lựa chọn phương pháp pha loãng dung dịch để xác định MIC. Về khả năng kháng khuẩn của PRP, hạt alpha của tiểu cầu được cho là chứa các protein với khả năng kháng khuẩn. Rất nhiều chemokins tiết ra bởi tiểu cầu hoạt động, bao gồm CXCL4, thymosin-β4, các dẫn xuất của CXCL7 (PBP, CTAP-III, NAP-2) và CCL5 (RANTES) đều là chất diệt khuẩn [22], [108]. CTAP-III và NAP-2 ở phần tận cùng C có hai peptide, thrombicudune 1 và 2 (TC-1, TC-2) đã được chứng minh in vitro có khả năng diệt Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus và diệt nấm Cryptococcus neoformans. Trong khi các tác giả vẫn chưa đưa ra kết luận thống nhất rằng nồng độ tại chỗ của các protein hay sự thu hút hoá học bạch cầu quan trọng hơn đối với khả năng kháng khuẩn, nhiều nghiên cứu đã kết hợp kỹ thuật in vitro và in vivo để chứng minh rằng tác động kháng khuẩn có liên quan lâm sàng tới miễn dịch của vật chủ [22]. Hạt alpha còn chứa các bổ thể và các protein gắn bổ thể, tạo điều kiện cho sự loại bỏ vi sinh vật ra khỏi hệ tuần hoàn. Các hạt alpha tiết ra bổ thể C3 và C4, tham gia vào quá trình kích hoạt bổ thể. C3b gắn P-selectin, định vị đáp ứng viêm tại vùng tổn thương mạch. Các hạt alpha còn chứa các yếu tố điều hoà hoạt hoá bổ thể, như chất ức chế C1 hay yếu tố tiểu cầu H. Mặc dù vậy, sự thiếu hụt hạt alpha có ảnh hưởng gì trong quá trình kích hoạt và điều hoà bổ thể vẫn còn chưa được sáng tỏ [22]. Bên cạnh đó, vai trò của bạch cầu trong PRP vẫn là đối tượng gây tranh cãi. Theo một số tác giả, sự tăng nồng độ các bạch cầu trong PRP có khả năng cải thiện sự ổn định giá thể, tăng tiềm năng kháng khuẩn và điều hoà đáp ứng viêm [42]. Trong khi đó, một số tác giả khác khuyến cáo nên loại bỏ bạch cầu ra khỏi PRP, do các tế bào này tăng đáp ứng viêm thông qua sự tiết axit hydrolases, metalloproteases và các proteases tiền viêm khác [44]. Anitua (1999) cho thấy bạch cầu nhiều hơn không cải thiện đặc tính kháng khuẩn của P-PRP và việc bổ sung bạch cầu có thể tăng đáp ứng viêm tại vùng tác động do sự tiết của bạch cầu [10]. Vì lý do này, nghiên cứu của chúng tôi không khảo sát tỉ lệ bạch cầu có trong các mẫu PRP mà chỉ tập trung vào số .