Tài liệu So sánh hiệu quả phương pháp nhuộm hematoxylin eosin khi thay thế dung dịch có hợp chất hoạt động bề mặt sodium linear alkylbenzene sulfonate

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ Y TẾ ----------------- TRẦN THỊ KHUÊ NỮ SO SÁNH HIỆU QUẢ PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HEMATOXYLIN EOSIN KHI THAY THẾ DUNG DỊCH CÓ HỢP CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT SODIUM LINEAR ALKYLBENZENE SULFONATE LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2019 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ Y TẾ ----------------- TRẦN THỊ KHUÊ NỮ SO SÁNH HIỆU QUẢ PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HEMATOXYLIN EOSIN KHI THAY THẾ DUNG DỊCH CÓ HỢP CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT SODIUM LINEAR ALKYLBENZENE SULFONATE Ngành: Kỹ thuật xét nghiệm y học Mã số : 8720601 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN VĂN THẮNG PGS.TS. TRẦN ANH TUẤN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2019 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các tài liệu trích dẫn, số liệu, kết quả nêu trong luận văn là hoàn toàn trung thực, được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 05 năm 2018 đến tháng 06 năm 2019 dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Nguyễn Văn Thắng và PGS.TS. Trần Anh Tuấn. Đề tài nghiên cứu này là duy nhất và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào. Tác giả luận văn Trần Thị Khuê Nữ . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT – ANH ................................................... i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................... ii DANH MỤC BẢNG .................................................................................... iii DANH MỤC BIỂU ĐỒ ............................................................................... iv DANH MỤC SƠ ĐỒ .................................................................................... v DANH MỤC HÌNH ..................................................................................... vi ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 4 1.1. Vài nét về lịch sử phát triển của kỹ thuật hiển vi học ............................... 4 1.2. Các bước tiến hành kỹ thuật mô học ........................................................ 4 1.3. Hóa chất thay thế clear-rite 3 ................................................................. 29 1.4. Dung dịch có thành phần LAS nồng độ 1,7% ........................................ 32 1.5. Các nghiên cứu ngoài nước ................................................................... 33 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 37 2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 37 2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 38 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................. 50 3.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu ............................................................. 50 3.2. Chất lượng nhuộm nhân và tế bào chất của 2 phương pháp nhuộm ....... 54 3.3. Độ trong, tương phản và đồng nhất của 2 phương pháp nhuộm HE ....... 55 3.4. Hiệu quả của nhuộm HE thường quy và nhuộm HE cải tiến .................. 62 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN .......................................................................... 68 4.1. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu ...................................................... 68 4.2. Chất lượng nhuộm nhân và nhuộm tế bào chất ...................................... 68 4.3. Độ trong, tương phản và đồng nhất của phương pháp nhuộm HE .......... 72 4.4. Hiệu quả của nhuộm HE thường quy và nhuộm HE cải tiến .................. 77 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. KẾT LUẬN ................................................................................................. 82 KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. i ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT – ANH TIẾNG VIỆT TIẾNG ANH Bảng dữ liệu an toàn hóa chất Material Safety Data Sheet Chất liệu di truyền Deoxyribonucleic Axit Cơ quan Quản lý An toàn và Occupational Safety and Sức khỏe Nghề nghiệp Health Administration Dung dịch rửa chén (bát) Dish washing liquid Điểm số nhuộm nhân The parameter of nuclear stain Độ đồng nhất Uniformity of stainning Độ trong rõ Clarity of stainning Độ tương phản, sắc nét Crispness of stainning Hệ thống hài hoà toàn cầu về Globally Harmonized System of phân loại và ghi nhãn hoá chất Classification and Labeling of Chemicals Khối mô đúc parafin Block Nhuộm tế bào chất Cytoplasmaic stainning Thông tin di truyền Ribonucleic Axit Tế bào hình đài Goblet cell . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TÊN VIẾT TẮT TÊN ĐẦY ĐỦ BV Bệnh viện DNA Deoxyribonucleic Axit GHS Hệ thống hài hoà toàn cầu về phân loại và ghi nhãn hóa chất GPB Giải phẫu bệnh HE Heamatoxylin-Eosin LAS Chất hoạt động bề mặt Sodium Linear Alkybenzene Sulfonate MSDS Bảng dữ liệu an toàn hóa chất OSHA Cơ quan Quản lý An toàn và Sức khỏe Nghề nghiệp RNA Ribonucleic Axit . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Quy trình nhuộm HE với dung dịch Toluen/ Xylen ...................... 14 Bảng 1.2: Phân tích kết quả nhuộm HE ........................................................ 23 Bảng 1.3: Màu sắc các thành phần tế bào của nhuộm HE ............................. 24 Bảng 1.4: Những lỗi thường gặp trong phương pháp nhuộm HE .................. 28 Bảng 1.5: Tóm tắt cỡ mẫu nghiên cứu nhuộm HE với LAS .......................... 36 Bảng 2.1: Quy trình nhuộm HE thường quy ................................................. 43 Bảng 2.2: Quy trình nhuộm HE cải tiến........................................................ 44 Bảng 2.3: Hóa chất sử dụng cho phương pháp nhuộm HE cải tiến ............... 49 Bảng 3.1: Thời gian cố định (giờ)................................................................. 52 Bảng 3.2: Độ trong rõ ở tiêu bản của 2 phương pháp nhuộm ........................ 55 Bảng 3.3: Tỉ lệ độ đồng nhất ........................................................................ 56 Bảng 3.4: Điểm số của tiêu bản ở 2 phương pháp nhuộm ............................. 62 Bảng 3.5: Thời gian nhuộm .......................................................................... 64 Bảng 3.6: Cơ cấu giá tiêu bản ....................................................................... 64 Bảng 3.7: So sánh ưu và khuyết điểm của clear-rite 3 và LAS 1,7% ............ 65 Bảng 3.8: So sánh hiệu quả của nhuộm HE thường quy và HE cải tiến ........ 66 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. iv DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1.1: So sánh kết quả nhuộm HE với xylen và HE LAS 1,7%........... 35 Biểu đồ 3.1: Phân bố người bệnh theo tuổi ................................................... 50 Biểu đồ 3.2: Tỉ lệ loại bệnh phẩm ................................................................. 51 Biểu đồ 3.3: Bệnh phẩm cố định .................................................................. 52 Biểu đồ 3.4: Bệnh phẩm xử lý ...................................................................... 53 Biểu đồ 3.5: Tỉ lệ tiêu bản tẩy parafin........................................................... 53 Biểu đồ 3.6: Tỉ lệ nhuộm nhân ..................................................................... 54 Biểu đồ 3.7: Tỉ lệ nhuộm tế bào chất ............................................................ 54 Biểu đồ 3.8: Tỉ lệ độ tương phản .................................................................. 55 Biểu đồ 3.9: Tổng hợp các tỉ lệ nhuộm ......................................................... 56 Biểu đồ 3.10: Tỉ lệ tiêu bản nhuộm HE thường quy và HE cải tiến .............. 63 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. v DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1: Các bước tiến hành nghiên cứu ................................................... 40 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Ký hiệu tượng hình của dung dịch xylen ...................................... 16 Hình 1.2: Sự oxid của Hematoxylin ............................................................. 18 Hình 1.3: Cấu trúc Eosin .............................................................................. 22 Hình 1.4: Nhuộm Hematoxylin Eosin trên mô gan ....................................... 23 Hình 1.5: Dữ liệu an toàn hóa chất clear-rite 3 ............................................. 31 Hình 3.1: Chất lượng nhuộm nhân trên tiêu bản mô túi mật ......................... 57 Hình 3.2: Nhuộm tế bào chất trên tiêu bản mô túi mật.................................. 57 Hình 3.3: Chất lượng độ trong, rõ trên tiêu bản mô túi mật .......................... 58 Hình 3.4: Chất lượng độ tương phản trên tiêu bản mô túi mật ...................... 58 Hình 3.5: Chất lượng đồng nhất trên tiêu bản mô túi mật ............................. 59 Hình 3.6: Không đạt nhuộm nhân trên tiêu bản mô ruột ............................... 60 Hình 3.7: Không đạt nhuộm tế bào chất trên tiêu bản mô tuyến tiền liệt ....... 60 Hình 3.8: Tiêu bản không đạt độ trong rõ ..................................................... 60 Hình 3.9: Tiêu bản không đạt độ tương phản ................................................ 61 Hình 3.10: Không đạt độ đồng nhất trên tiêu bản mô thận ............................ 61 Hình 3.11: Tiêu bản không đủ tiêu chuẩn chẩn đoán ..... .............................. 61 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nhuộm Hematoxylin-Eosin (HE) là một phương pháp nhuộm thường quy trong xét nghiệm mô bệnh học, được sử dụng rộng rãi nhất và là tiêu chuẩn trong chẩn đoán mô bệnh học [27], [29]. Để chẩn đoán được mô bệnh, các bệnh phẩm sau khi được cắt lọc/ phẫu tích thành những mảnh mô có kích thước phù hợp, mô được xử lý qua các bước như: khử nước (được máy xử lý mô tự động thực hiện), đúc (vùi) mô, cắt lát mảnh 3-4µ𝑚, nhuộm và cuối cùng được bác sĩ giải phẫu bệnh (GPB) - tế bào bệnh học dịch (đọc) tổn thương [2]. Để quan sát được thành phần cấu trúc của mô, các mảnh cắt phải được nhuộm màu tương phản của cấu trúc nhân và thành phần tế bào chất. Trên tiêu bản nhuộm, bác sĩ GPB có thể quan sát cấu trúc màng nhân, hạt nhân, chất nhiễm sắc cũng như sự bắt màu của thành phần tế bào chất, chất nền: sợi colagen, hồng cầu, sợi chun. Trong phương pháp nhuộm HE phải đi qua nhiều bước như: tẩy parafin, khử nước, nhuộm nhân, nhuộm tế bào chất. Trong đó, bước dùng hóa chất xylen hay toluen để tẩy parafin trong mô là quan trọng, quyết định nhiều đến chất lượng nhuộm tiêu bản. Tuy nhiên xylen, toluen độc hại đối với con người và môi trường [3], [22], [37], [47]. Một số hóa chất thay thế xylen được sản xuất. Các chất thay thế có thể là hóa chất hydrocacbon béo, hydrocacbon thơm, dầu dừa, ... Các hóa chất đó có chức năng tương tự như toluen, xylen: làm trong sáng mô, tẩy parafin trong phương pháp nhuộm HE. Hiện nay các phòng xét nghiệm GPB đang sử dụng hóa chất clear-rite 3 [49] để thay thế hóa chất toluen, xylen. Các bệnh viện (BV) như: BV Chợ Rẫy, BV Nhân dân Gia Định, Đại học Y Dược, BV Bình Dân, BV Nhi Đồng I, BV Ung Bướu thành phố Hồ Chí Minh, BV Ung Bướu Cần Thơ, BV Vimec. Tuy nhiên hầu hết các sản phẩm thay xylen, toluen có giá thành cao và không phải là ít nguy hiểm hơn [12], [38]. Theo phân loại của cơ quan Quản lý An toàn và Sức khỏe Nghề nghiệp . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 2 (Occupational Safety and Health Administration - OSHA) [22], thành phần hóa chất clear-rite 3 được phân loại lớp 1B nguy cơ gây ung thư, hóa chất dễ cháy loại 2 [43], [49], cũng có ảnh hưởng đến cơ quan đích là gan và thận khi tiếp xúc hóa chất lâu dài hoặc thường xuyên, nguy cơ đột biến tế bào mầm và nguy cơ gây ung thư, có nguy hiểm về đường hô hấp và có thể gây tổn thương các cơ quan do phơi nhiễm kéo dài hoặc tiếp xúc thường xuyên. Các nghiên cứu dùng nước chanh của tác giả Ananthaneni Anuradha và cộng sự [8] hay dùng dầu bách hương/ tuyết tùng để thay thế xylen trong phương pháp nhuộm HE [24], tuy nhiên giá thành cao. Một số tác giả sử dụng dung dịch có chứa thành phần LAS nồng độ 1,7% để thay thế dung dịch toluen, xylen, có thể xem là thân thiện với môi trường hơn. Falkeholm và cộng sự [18], lần đầu tiên đã nghiên cứu dung dịch có chứa thành phần LAS 1,7 % để thay thế dung dịch xylen và alcool trong quy trình nhuộm HE, với chi phí rẻ tiền và ít độc hại hơn. Nghiên cứu của Madhuri R Ankle và cộng sự [9], cũng dùng dung dịch có chứa thành phần LAS nồng độ 1,7% tẩy parafin, khử nước và làm trong mô, nghiên cứu cho thấy kết quả dùng dung dịch có chứa thành phần LAS nồng độ 1,7% ngang bằng với dung dịch xylen và alcool trong giai đoạn tẩy parafin. Ngoài ra một số tác giả sử dụng dung dịch có chứa thành phần LAS dao động từ 1,5%-2,0% [8], [42]. Vì hóa chất clear-rite 3 ảnh hưởng đến sức khỏe khi tiếp xúc thường xuyên. Với mong muốn môi trường phòng xét nghiệm GPB an toàn ít độc hại hơn. Chúng tôi tiến hành nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm HE với dung dịch chứa chất hoạt động bề mặt Sodium Linear Alkylbenzene Sulfonate (LAS) - dung dịch tẩy rửa thông thường, thay thế hóa chất clear-rite 3 hiện đang sử dụng. Ở nghiên cứu này chúng tôi sử dụng dung dịch chất tẩy rửa sunlight pha Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử. Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn. Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 3 loãng 1,7%, do hãng Unilever sản xuất (dựa vào hầu hết các NC trước đây sử dụng nồng độ 1,7%) nhằm: MỤC TIÊU 1. So sánh chất lượng nhuộm nhân, nhuộm tế bào chất của phương pháp nhuộm HE với hóa chất clear-rite 3 và alcool (HE thường quy) và phương pháp nhuộm HE sử dụng dung dịch có thành phần LAS 1,7% (HE cải tiến). 2. So sánh độ trong rõ, tương phản và đồng nhất của phương pháp nhuộm HE thường quy và phương pháp nhuộm HE cải tiến. 3. So sánh hiệu quả của phương pháp nhuộm HE thường quy và phương pháp nhuộm HE cải tiến. Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử. Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn. Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vài nét về lịch sử phát triển của kỹ thuật hiển vi học Kỹ thuật khám nghiệm đại thể giúp cho chúng ta quan sát một cách có hệ thống toàn diện các phủ tạng hoặc mối liên quan giữa chúng với nhau cũng như mối liên quan của các tổ chức trong cùng một phủ tạng, hoặc chức phận của chúng một cách khái quát, nhưng các kỹ thuật nghiên cứu tế bào và tổ chức phát hiện cho chúng ta những cấu trúc tinh tế nhất không những ở phạm vi tế bào mà còn đi sâu tới những tiểu phần của tế bào [2]. Do hầu hết các tổ chức và phủ tạng đều quá dày nên không thể soi trực tiếp dưới kính hiển vi, nên các nhà tổ chức học đầu tiên đã quan sát những màng mỏng hoặc các vật liệu đã bị tước hoặc ép. Do đó, các sự liên quan cấu trúc đã bị phá vỡ và tế bào chết rất nhanh chóng đưa đến những nhận định sai lệch, không chính xác [2]. Cuối của thế kỷ XIX, không những người ta đã tìm hiểu về các tế bào sống hoặc sống sót mà còn chú ý đến những tế bào chết được bảo quản theo nhiều cách cắt mỏng rồi nhuộm với nhiều loại phẩm nhuộm. Kính hiển vi được cải tiến, máy cắt mỏng ra đời, hàng loạt các kỹ thuật cố định ra đời và nhuộm sáng tạo [2] với mục đích biểu hiện hình ảnh cấu trúc và làm tăng độ tương phản cấu trúc, dễ dàng quan sát dưới kính hiển vi như kỹ thuật nhuộm HE, kỹ thuật nhuộm papanicolaou (PAP), kỹ thuật nhuộm Pariodic axit schiff (PAS), được dùng trong chẩn đoán GPB. 1.2. Các bước tiến hành kỹ thuật mô học 1.2.1. Cố định Cố định là làm bất động những cấu trúc của tổ chức cũng như tế bào nhưng vẫn tôn trọng mức tối đa hình thái của chúng. Nói cách khác, cố định một tổ chức là giết những thành phần của tổ chức đó nhưng vẫn bảo quản chúng trong Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử. Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn. Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 5 một tình trạng gần với lúc sống nhất [2]. Cố định mô bệnh phẩm thích hợp để xét nghiệm là trung tâm của tất cả các xét nghiệm mô học [13], [17]. 1.2.1.1. Dung dịch cố định Việc dùng dung dịch cố định mô bệnh phẩm phù hợp để xét nghiệm mô học là vô cùng quan trọng, là trọng tâm của tất cả các xét nghiệm mô học, một số dung dịch cố định đóng vai trò là chất gắn màu cho các quá trình nhuộm màu cụ thể [14], [15]. Ngược lại, chất cố định đôi khi ức chế một số kỹ thuật nhuộm. Vì cố định là bước đầu tiên trong kỹ thuật mô học, kỹ thuật nhuộm được thực hiện sau khi cố định và những kỹ thuật tiếp theo, nên cần phải dùng dung dịch cố định phù hợp [34]. Nếu không chú ý đến quá trình này, một loạt các xét nghiệm được thực hiện trong phòng thí nghiệm mô bệnh học sẽ không hiệu quả và thực tế là có thể không thể khắc phục được mô bệnh phẩm [47]. Khi chọn một dung dịch cố định nên có sự cân bằng giữa những lợi ích và bất lợi mà mỗi loại dung dịch cố định có. Chúng bao gồm những thay đổi hoặc mất mát phân tử từ các mô cố định, gây sưng hoặc co rút các mô, sự thay đổi chất lượng của nhuộm hóa mô miễn dịch, ảnh hưởng đến phân tích sinh hóa và khả năng duy trì cấu trúc của các bào quan tế bào. Mục tiêu chính của sự cố định các loại mô là duy trì các đặc điểm hình thái rõ ràng và nhất quán [47]. Để quan sát hình ảnh vi thể của các tiêu bản nhuộm màu, các mối liên quan vi thể ban đầu giữa các tế bào, các thành phần tế bào (ví dụ như tế bào chất và nhân), thành phần ngoại bào phải được duy trì. Thành phần hóa học của mô cũng phải được duy trì. Nhiều thành phần hóa học trong mô có thể hòa tan trong dung dịch nước hoặc môi trường chất lỏng khác, do đó các thành phần hòa tan không được mất trong quá trình cố định và xử lý mô. Giảm thiểu sự mất mát của các thành phần tế bào bao gồm protein, nhân và lipid, ngăn chặn sự phá hủy các cấu trúc phân tử như màng tế bào chất, mạng lưới nội chất trơn, mạng lưới nội chất thô, màng tế bào hạt nhân, màng nhân. Nếu các thành phần hòa tan trong tế bào chất mất, Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử. Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn. Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 6 nhuộm màu bị giảm hoặc thay đổi các hình ảnh vi thể của mô, ví dụ ty thể bị mất hoặc bị phá hủy [47]. Trong chẩn đoán GPB, sự lựa chọn dung dịch cố định cho hầu hết các nhà GPB là dung dịch formaldehyde đệm trung tính 10% [2]. Formaldehyde đệm trung tính 10% là dung dịch thường được sử dụng nhất vì là chất có sẵn trên thị trường, chi phí thấp, không cháy nổ, giết vi khuẩn nhanh chóng [4], không kết tủa protein nhưng cố định hoàn toàn bằng cách làm cho chúng không hoà tan, cố định các lipid phức tạp kể cả ty lạp thể (mitochondrion) và bộ Golgi, tuy không tác dụng trực tiếp lên lipid nhưng vẫn bảo toàn được chúng [2]. Không làm co mô nhưng gây cứng mô. Cấu trúc tế bào bảo toàn tốt. Nhược điểm của dung dịch formaldehyde đệm trung tính 10% là phản ứng với hematin tạo nên sắc tố màu nâu hay kết tủa đen. Hơi formaldehyde độc nên cần đậy kín bình [2] sau mỗi lần sử dụng. Dung dịch formaldehyde đệm trung tính 10%, hoạt động hiệu quả, có thể sử dụng với hầu hết các loại mô, môi trường đệm trung tính giúp ổn định môi trường không ảnh hưởng đến thành phần cấu trúc của mô. Nếu dung dịch cố định không được đệm, ở độ pH khác có thể gây ra co rút hạt nhân, cường độ nhuộm tế bào chất thay đổi [48]. Quá trình cố định formaldehyde không tạo ra "sự cố định quá mức", nghĩa là các mô không bị cứng lại một cách quá mức [20], tạo điều kiện thuận tiện cho parafin ngấm vào mô. Thành phần methylene hydrate có trong dung dịch formaldehyde đệm trung tính 10%, phản ứng với một số chuỗi bên của protein để tạo thành các nhóm bên hydroxymethyl, sự hình thành chuỗi bên hydroxymethyl là phản ứng chính, đặc trưng và hình thành các liên kết ngang. Formaldehyde cũng phản ứng với protein hạt nhân và axit nucleic (Kok & Boon, 2003, Leong, 2005). Nó thâm nhập giữa axit nucleic và protein, ổn định Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử. Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn. Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 7 axit nucleic, cố định nucleotide bằng cách phản ứng với các nhóm amin tự do như với protein. Trong Deoxyribonucleic axit (DNA) các phản ứng liên kết ngang được bắt đầu tại các vùng giàu adenine - thymidine và tăng liên kết ngang khi nhiệt độ tăng. Các nhóm phản ứng có thể kết hợp với các nhóm hydro hoặc với nhau để tạo thành cầu metylen. Formaldehyde chủ yếu bảo tồn các liên kết peptide-protein và cấu trúc chung của các bào quan tế bào. Formaldehyde có thể tương tác với axit nucleic nhưng ít ảnh hưởng đến carbohydrate và bảo quản lipit nếu các dung dịch có chứa canxi (Bayliss High & Lake, 1996) [17]. Bệnh phẩm lấy ra khỏi cơ thể cố định ngay (không quá 30 phút kể từ khi bệnh phẩm được lấy ra khỏi cơ thể) trong formaldehyde trung đệm tính 10%, do các khoa, phòng lâm sàng gửi tới [1]. 1.2.1.2. Thể tích cố định Thể tích và nồng độ dung dịch cố định có tác động rõ rệt đến vận tốc xuyên thấm và vận tốc cố định [2], do đó phải dùng tối thiểu thể tích dung dịch cố định ≥ 10 lần thể tích bệnh phẩm, để cố định tối ưu và nhanh chóng [47], là lượng dung dịch cần thiết đủ cố định mẫu bệnh phẩm. Những bệnh phẩm lớn, nên cắt lát có độ dày 1,5cm để dung dịch cố định có thể xuyên qua mô được dễ dàng [13]. Phần lớn thể tích mô xác định khối lượng dung dịch cố định cần thiết, độ dày sẽ quyết định tốc độ cố định [16], [41]. 1.2.1.3. Thời gian cố định Thời gian cố định phụ thuộc vào loại bệnh phẩm, độ dày bệnh phẩm, vận tốc xuyên thấm và vận tốc cố định của dung dịch cố định, nồng độ dung dịch cố định, nhiệt độ [2]. Theo luật khuyếch tán nó giảm dần từ lúc ngâm bệnh phẩm vào dung dịch Công thức tính: e =d√𝑡 Trong đó, e = độ ngấm sâu vào, tính theo milimet Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử. Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn. Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 8 d = hệ số xuyên thấm t = thời gian hoạt động của dung dịch tính theo giờ. Như vậy, hệ số d sẽ bằng bề dày của tổ chức mô được một dung dịch có nồng độ đã biết đi qua trong một giờ. Vận tốc cố định là hiện tượng hóa học: nó tương ứng với thời gian cần thiết cho việc kết tủa hoặc làm cho các thành phần tế bào không bị hòa tan. Như vậy, nếu vận tốc xuyên thấm chậm nhưng vận tốc cố định nhanh thì cần lấy bệnh phẩm nhỏ, cắt mỏng và không ngâm lâu trong dung dịch cố định. Trái lai, nếu vận tốc xuyên thấm nhanh, vận tốc cố định chậm có thể cắt bệnh phẩm tương đối to và dày nhưng cần ngâm lâu trong dung dịch cố định [2]. Tương tự tài liệu [47], thời gian cố định xấp xỉ bằng bình phương độ sâu mà dung dịch cố định phải thâm nhập và hầu hết các dung dịch cố định, chẳng hạn như formaldehyde đệm trung tính 10% sẽ thâm nhập mô đến độ sâu khoảng 1mm trong một giờ. Điều quan trọng cần lưu ý là các thành phần của chất cố định sẽ thâm nhập vào các mô ở các mức độ khác nhau, vì vậy sẽ tốt hơn nếu các chất cố định này được sử dụng với các mẫu bệnh phẩm cắt mỏng hay nếu mẫu bệnh phẩm lớn thì hãy thực hiện cắt thành những lát có độ dày 1,5cm để dung dịch cố định có thể xuyên qua mô dễ dàng [15]. Ngoài ra, protein làm bất hoạt các chất cố định, đặc biệt là trong máu hoặc chất lỏng có máu, vì vậy những mẫu bệnh phẩm phải được rửa bằng nước muối trước khi đưa vào dung dịch cố định [48]. 1.2.1.4. Bệnh phẩm cố định đạt Là bệnh phẩm không bị “sống” hoặc “quá chín” [2]. Bệnh phẩm “sống” thường mềm, vẫn còn thấy màu hồng đỏ của tổ chức mô bị thoái hóa, hoại tử. Nó dễ sinh ra các tổn thương và hình ảnh giả tạo. Khi nhuộm hình ảnh bắt màu không đẹp. Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử. Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn. Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 9 Nguyên nhân gây bệnh phẩm “sống” có thể là bệnh phẩm cắt quá dày, thời gian ngâm bệnh phẩm quá ngắn, thể tích dung dịch cố định không đủ, nồng độ dung dịch không đủ. Bệnh phẩm “quá chín”, mô khá cứng chắc, giòn khi cắt. Dù cẩn thận, khi cắt mảnh, mô vẫn bị vỡ, nát vụn và khi nhuộm tính bắt màu bị giảm rõ, nhân tế bào dễ bị nhăn nhúm. Nguyên nhân bệnh phẩm “quá chín” do thời gian cố định quá dài. Nếu mô cố định không được đầy đủ, có thể dẫn đến hình thái thay đổi và ảnh hưởng đến đặc tính nhuộm màu của mô [47]. Sau cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua khâu kỹ thuật sau: 1.2.2. Khử nước Bệnh phẩm sau khi cố định đủ thời gian và đạt yêu cầu, được bác sĩ GPB cắt lọc bệnh phẩm ở vị trí cần xét nghiệm với kích thước theo quy định, mô được xử lý bằng máy chuyển mô chuyên dụng. Xử lý mô được thiết kế để loại bỏ tất cả nước có thể ra khỏi mô, thay thế nó bằng môi trường hỗ trợ cung cấp đủ độ cứng để cho phép cắt mảnh mô mà không làm tổn thương nhu mô hoặc biến dạng [47]. Bệnh phẩm sau xử lý đạt là bệnh phẩm trong, bóng [1], vừa đủ cứng, không quá mềm cũng không quá cứng, mô không bị đục. Để bệnh phẩm đạt sau xử lý, điều quan trọng là trong tất cả các lần nhúng, ngâm mô vào các loại hóa chất như forrmaldehyde 10% pH 7,2, alcool, clear-rite 3, parafin của quá trình xử lý mô phải tuân thủ đúng thời gian, nồng độ là cần thiết, thời gian ngâm mô trong các loại hóa chất không quá ít hoặc quá nhiều [13]. Bất kỳ giai đoạn ngâm mô trong xử lý mô mà dung dịch không được đẩy hết ra khỏi các mô, parafin không thể xâm nhập vào mô hoặc thời gian ngâm mô trong parafin không đủ, các mô sẽ không được xử lý tốt [47]. Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ và Quy định truy cập tài liệu điện tử. Ghi rõ nguồn tài liệu khi trích dẫn.