Tài liệu Sàng lọc in vitro tác dụng ức chế tyrosinase của một số dược liệuthu hái ở miền nam việt nam

. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ----------------- NGUYỄN PHÚ LỘC SÀNG LỌC IN-VITRO TÁC DỤNG ỨC CHẾ TYROSINASE CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆUTHU HÁI Ở MIỀN NAM VIỆT NAM Chuyên ngành: Dược học cổ truyền Mã số: 60 72 04 06 Luận văn Thạc sĩ Dược học HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Huỳnh Ngọc Thụy Thành phố Hồ Chí Minh–2018 . . LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 7 năm 2018 Người viết cam đoan Nguyễn Phú Lộc . . TÓM TẮT Luận văn thạc sĩ – Khóa: 2015 – 2017 Chuyên ngành: Dược liệu – dược cổ truyền – Mã số: 60720406 SÀNG LỌC IN-VITRO TÁC DỤNG ỨC CHẾ TYROSINASE CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU THU HÁI Ở MIỀN NAM VIỆT NAM NGUYỄN PHÚ LỘC Thầy hướng dẫn: PGS.TS. HUỲNH NGỌC THỤY Mở đầu và đặt vấn đề: Nhu cầu tìm kiếm sản phẩm có tác dụng ức chế tyrosinase gần gũi từ tự nhiên là một hướng phát triển tiềm năng cho lĩnh vực mỹ phẩm có tác dụng làm sáng da khi tyrosinase là enzym tham gia chuyển hóa L-tyrosin và L-DOPA thành melanin. Trong bối cảnh tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về tác dụng ức chế tyrosinase và điều kiện thử nghiệm in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase chưa thống nhất, nghiên cứu được thực hiện nhằm tìm kiếm các loại dược liệu trong nước có tiềm năng phát triển thuốc làm sáng da và tìm hiểu các yếu tố ảnh hưởng đến mô hình thử nghiệm. Đối tượng nghiên cứu: một số dược liệu thu hái tại An Giang, Lâm Đồng và TP.HCM. Phương pháp nghiên cứu: Áp dụng quy trình cố định tyrosinase trên gel để định tính tác dụng ức chế tyrosinase trên sắc ký lớp mỏng (SKLM), đồng thời định tính tác dụng chống oxy hóa, mô hình DPPH. Khảo sát điều kiện thử nghiệm in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase trên đĩa 96 giếng và sàng lọc in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase để xác định dược liệu tiềm năng. Khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase của các phân đoạn thu được từ cao toàn phần trong ethanol 96% của dược liệu tiềm năng. Xác định IC50 của các phân đoạn tiềm năng, so sánh với thuốc chuẩn acid kojic. Kết quả và bàn luận: Định tính tác dụng ức chế tyrosinase trên SKLM: Quy trình cố định tyrosinase trên gel có thể được áp dụng trong điều kiện tại Việt Nam với thạch Himedia RM-201 ở tỉ lệ 1,2%. Các mẫu cao chiết ethanol từ thân Sa-kê, thân Gắm đen và thân Gắm vàng cho những vết có tác dụng ức chế tyrosinase nổi bật. Không có sự tương quan giữa các thành phần chính có tác dụng ức chế tyrosinase và tác dụng chống oxy hóa ở cao toàn phần. Sàng lọc in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase trên đĩa 96 giếng: Ở mô hình đo quang trên đĩa 96 giếng, nồng độ tyrosinase và L-tyrosin cho thời điểm đọc đĩa ổn định được xác định lần lượt là 37,5 U/ml và 1 mM, đọc đĩa sau 20 phút. Cao chiết thân Sa-kê được chọn là dược liệu tiềm năng với giá trị IC50 đo được là 5,870 ± 0,573 µg/ml. Từ thân Sa-kê thu được 3 phân đoạn C4, E4, E5 cho tác dụng ức chế tyrosinase mạnh với IC50 lần lượt là 1,7843 ± 0,4403 μg/ml, 1,7298 ± 0,2109 µg/ml, 1,296 ± 0,0850 μg/ml, thấp hơn thuốc chuẩn acid kojic (IC50 = 2,9637 ± 0,0726 µg/ml). Kết luận và kiến nghị: Cao chiết ethanol 96% từ thân Sa-kê được xác định là dược liệu tiềm năng, từ đó tìm được ba phân đoạn ức chế tyrosinase hiệu quả. Kết quả mở ra hướng nghiên cứu thành phần hóa học có hoạt tính từ dược liệu này. Từ khóa: tyrosinase, sàng lọc in-vitro, đĩa 96 giếng, sắc ký lớp mỏng, Artocarpus altilis. . . ABSTRACT Master thesis – Academic course: 2015 – 2017 Speciality: Pharmacohnosy – Traditional pharmacy – Speciality code: 60.720406 IN-VITRO SCREENING FOR TYROSINASE INHIBITORY ACTIVITY OF PLANTS COLLECTED IN SOUTHERN VIETNAM NGUYEN PHU LOC Supervisors: Dr. HUYNH NGOC THUY Introduction: Requirement for natural products with tyrosinase inhibitory activity is a promising strategy for development of skin whitening cosmetics as tyrosinase takes part in the biometabolism of L-tyrosine and L-DOPA to melanin. Because there were not many reports about tyrosinase inhibitory in Vietnam and test conditions were not unified among references, the purpose of this study was to search for herbal materials which are potential for skin whitening cosmetics and to learn about factors which affect test procedures. Materials: Herbal materials collected in An Giang, Lam Dong and Ho Chi Minh city. Methods: Qualitative screening on TLC for tyrosinase inhibitory with enzyme immobilisation, together with antioxidant activity on DPPH assay. Investigating test conditions for in-vitro screening on 96 well plates and screening for tyrosinase inhibitory activity to find potential materials. Investigating anti-tyrosinase activity of fractions from the most potential material, using kojic acid as standard drug. Results: Qualitative screening on TLC Tyrosinase immobilisation procedure could be applied in Vietnam with Himedia RM-201 at 1,2 %. Ethanol extracts from Ramulus Artocarpi altilis, Caulis Gneti latifolii and Caulis Gneti montani showed impressive active spots. No relationship was found between main active components for anti-tyrosinase activity and antioxidant activity in total extracts. In-vitro screening for tyrosinase inhibitory activity on 96 well plates. Tyrosinase and L-tyrosine concentration which provided stable plate reading time was found to be 37,5 U/ml and 1 mM, respectively, whereas plate reading time was 20 minutes. Ethanol 96% extract from Ramulus Artocarpi altilis was chosen to be the most potential material; the IC50 value was 5,870 ± 0,573 µg/ml. 3 solid-liquid extraction fractions C4, E4, E5 expressed effective anti-tyrosinase activity with IC50 values about 1,7843 ± 0,4403 μg/ml, 1,7298 ± 0,2109 µg/ml, and 1,296 ± 0,0850 μg/ml, respectively, lower than that of kojic acid (IC50 = 2,9637 ± 0,0726 µg/ml). Conclusion: Ramulus Artocarpi altilis as defined to be the most potential material, from which 3 active fractions was found for effective anti-tyrosinase activity. These results suggested further studies for active components of this material.. Từ khóa: tyrosinase, in-vitro screening, 96 well plates, thin layer chromatography (TLC), Artocarpus altilis. . . MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................................ i DANH MỤC BẢNG ................................................................................................................ ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT................................................................................................. iii DANH MỤC KÍ HIỆU .......................................................................................................... iii ĐẶT VẤN ĐỀ ...........................................................................................................................1 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................2 1.1. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................2 1.1.1. Khái niệm .............................................................................................................2 1.1.2. Khảo sát tác dụng chống oxy hóa, mô hình DPPH trên SKLM ...........................5 1.1.3. Sàng lọc in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase trên SKLM ....................................6 1.1.4. Sàng lọc in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase bằng phương pháp đo quang .........7 1.1.5. Những dược liệu được sàng lọc có tác dụng ức chế tyrosinase .........................14 1.1.6. Vấn đề mẫu thử cho tỉ lệ ức chế tyrosinase <0% ...............................................17 1.1.7. Tương quan giữa tác dụng ức chế tyrosinase và tác dụng chống oxy hóa .........17 1.1.8. Các dược liệu được quan tâm nghiên cứu ..........................................................18 1.2. TỔNG QUAN VỀ CHI ARTOCARPUS ............................................................19 1.2.1. Vị trí trong hệ thống phân loại thực vật .............................................................19 1.2.2. Mô tả thực vật ....................................................................................................19 1.2.3. Thành phần hóa học ...........................................................................................19 1.2.4. Tác dụng dược lý................................................................................................19 1.2.5. Công dụng ..........................................................................................................21 1.3. TỔNG QUAN VỀ CÂY SA-KÊ .........................................................................22 1.3.1. Mô tả thực vật ....................................................................................................22 1.3.2. Thành phần hóa học ...........................................................................................22 1.3.3. Tác dụng dược lý................................................................................................23 1.3.4. Công dụng ..........................................................................................................24 CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................25 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .............................................................................25 2.2. DUNG MÔI, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ .........................................................25 2.2.1. Dung môi, hóa chất ............................................................................................25 2.2.2. Dụng cụ, thiết bị .................................................................................................26 2.2.3. Nơi thực hiện đề tài ............................................................................................26 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................26 2.3.1. Chuẩn bị mẫu thử ...............................................................................................26 2.3.2. Chuẩn bị các dung dịch mẹ ................................................................................27 2.3.3. Thiết kế thí nghiệm ............................................................................................28 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................................43 3.1. CHUẨN BỊ MẪU THỬ .......................................................................................43 3.2. KHẢO SÁT TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA TRÊN SKLM .......................48 3.3. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN THỬ NGHIỆM ĐỊNH TÍNH TÁC DỤNG ỨC CHẾ TYROSINASE TRÊN SKLM .................................................................................50 . . 3.4. ĐỊNH TÍNH TÁC DỤNG ỨC CHẾ TYROSINASE TRÊN SKLM ...............51 3.5. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN THỬ NGHIỆM SÀNG LỌC IN-VITRO TÁC DỤNG ỨC CHẾ TYROSINASE TRÊN ĐĨA 96 GIẾNG ..............................................53 3.5.1. Thí nghiệm 4: Khảo sát bước sóng quan sát ......................................................54 3.5.2. Thí nghiệm 5: Khảo sát nồng độ cuối cùng của tyrosinase và L-tyrosin ...........57 3.5.3. Thí nghiệm 6: Khảo sát dung môi pha mẫu .......................................................58 3.6. SÀNG LỌC IN-VITRO TÁC DỤNG ỨC CHẾ TYROSINASE TRÊN ĐĨA 96 GIẾNG: ...............................................................................................................................60 3.7. XÁC ĐỊNH NGUYÊN LIỆU CÀNH SA-KÊ ....................................................63 3.7.1. Thí nghiệm 8: Khảo sát thực vật học .................................................................63 3.7.2. Thí nghiệm 9: Định tính sơ bộ thành phần hóa thực vật ....................................67 3.7.3. Thí nghiệm 10: Xác định nguyên liệu: ...............................................................67 3.7.4. Thí nghiệm 11: So sánh mẫu cành Sa-kê ở TpHCM và ở Long Xuyên: ...........68 3.8. KHẢO SÁT TÁC DỤNG ỨC CHẾ TYROSINASE CÁC PHÂN ĐOẠN TỪ CÀNH SA-KÊ (Ramulus Artocarpi altilis) .......................................................................69 3.8.1. Chuẩn bị cao chiết từ cành Sa-kê cho thử nghiệm sinh học ..............................69 3.8.2. Thí nghiệm 12: Sàng lọc các phân đoan chiết phân bố lỏng-lỏng .....................70 3.8.3. Thí nghiệm 13: Sàng lọc các phân đoan chiết phân bố rắn-lỏng .......................71 3.8.4. Xác định IC50 của các phân đoạn tiềm năng: .....................................................73 CHƯƠNG 4 - BÀN LUẬN................................................................................................76 4.1. Khảo sát điều kiện thí nghiệm định tính tác dụng ức chế tyrosinase trên SKLM .76 4.2. Định tính tác dụng ức chế tyrosinase trên SKLM .................................................76 4.3. Khảo sát điều kiện thí nghiệm sàng lọc tác dụng ức chế tyrosinase trên đĩa 96 giếng ...............................................................................................................................76 4.4. Khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase trên đĩa 96 giếng ..........................................77 4.5. Vấn đề mẫu thử cho tỉ lệ ức chế tyrosinase < 0% trên đĩa 96 giếng......................78 4.6. Tương quan giữa tác dụng ức chế tyrosinase và tác dụng chống oxy hóa ............78 4.7. Giả thiết về tương quan giữa kết quả khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase trên SKLM và trên đĩa 96 giếng ..................................................................................................79 4.8. Vị trí, vai trò của các mô hình thử nghiệm ............................................................79 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...............................................................................................81 TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................................83 PHỤ LỤC .......................................................................................................................... PL 1 . . DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Con đường sinh tổng hợp melanin .............................................................................2 Hình 1.2. Cơ chế phản ứng oxy hóa L-DOPA với xúc tác tyrosinase .......................................3 Hình 1.3. Cơ chế phản ứng oxy hóa L-tyrosin với xúc tác tyrosinase .......................................4 Hình 1.4. Phản ứng khử hóa gốc tự do DPPH ..........................................................................5 Hình 1.5. Bản mỏng minh họa mô hình TLC-DPPH .................................................................5 Hình 1.6. Một số kết quả định tính tác dụng ức chế tyrosinase trên SKLM ..............................6 Hình 1.7. Phản ứng ức chế tyrosinase ........................................................................................7 Hình 2.1. Quy trình chuẩn bị mẫu thử cho sàng lọc sinh học ..................................................27 Hình 2.2. Thiết kế bản mỏng cho thí nghiệm khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase .................29 Hình 2.3. Bố trí đĩa cho thử nghiệm 2.2...................................................................................34 Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của DMSO ...................................................36 Hình 2.5. Bố trí mẫu thử trên vi đĩa 96 giếng ..........................................................................37 Hình 2.6. Quy trình chuẩn bị các cao chiết phân bố lỏng – lỏng từ cành Sa-kê ......................40 Hình 3.1. SKLM thành phần hóa học của các cao chiết chloroform .......................................45 Hình 3.2. SKLM thành phần hóa học của các cao chiết ethanol .............................................46 Hình 3.3. SKLM thành phần hóa học của các cao chiết nước .................................................47 Hình 3.4. SKLM tác dụng chống oxy hóa của các cao chiết chloroform ................................48 Hình 3.5. SKLM tác dụng chống oxy hóa của các cao chiết ethanol ......................................49 Hình 3.6. SKLM tác dụng chống oxy hóa của các cao chiết nước ..........................................49 Hình 3.7. SKLM khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase của các mẫu chloroform .....................51 Hình 3.8. SKLM khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase của các cao chiết ethanol ....................52 Hình 3.9. SKLM khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase của các cao chiết nước ........................53 Hình 3.10. Phổ UV-Vis của phản ứng oxy hóa L-tyrosin với xúc tác tyrosinase ....................54 Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ tyrosinase từ 80 U/ml đến 30 U/ml ................................57 Hình 3.12. Diễn biến độ hấp thu tại 490 nm theo nồng độ tyrosinase và L-tyrosin trong DMSO ......................................................................................................................................57 Hình 3.13. Toàn cây, cụm lá, và quả non cây Sa-kê ................................................................63 Hình 3.14. Mủ trắng trên lá và rễ cây Sa-kê ............................................................................63 Hình 3.15. Vi phẫu cuống lá Sa-kê ..........................................................................................64 Hình 3.16. Vi phẫu gân chính lá Sa-kê ....................................................................................64 Hình 3.17. Vi phẫu phiến lá Sa-kê ...........................................................................................65 Hình 3.18. Vi phẫu cành Sa-kê ................................................................................................65 Hình 3.19. Các cấu tử tìm được khi soi bột cành Sa-kê ...........................................................66 Hình 3.20. SKLM cao chiết ethanol từ các mẫu cành Sa-kê ở TpHCM ..................................68 Hình 3.21. SKLM cao chiết từ mẫu cành Sa-kê ở TpHCM và mẫu ở Long Xuyên ................68 Hình 3.22. So sánh các phân đoạn LLE trên SKLM ................................................................70 Hình 3.23. So sánh các phân đoạn C- trên SKLM ...................................................................71 Hình 3.24. So sánh các phân đoạn E- trên SKLM ...................................................................71 Hình 3.25. SKLM khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase của các phân đoạn SLE ....................72 i . . DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các quy trình khảo sát in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase .......................................8 Bảng 1.2. Điều kiện thí nghiệm từ các tài liệu tham khảo .......................................................14 Bảng 1.3. Một số dược liệu tại Việt Nam đã được kết luận cho tác dụng ức chế tyrosinase trong các công bố quốc tế.........................................................................................................15 Bảng 1.4. Các dược liệu được quan tâm nghiên cứu ...............................................................18 Bảng 1.5. Tổng quan tác dụng dược lý của các loài Artocarpus .............................................20 Bảng 1.6. Một số hoạt chất đã được phân lập từ Sa-kê (Artocarpus altilis) ............................23 Bảng 2.1. Các mẫu dược liệu được dùng trong bài ..................................................................25 Bảng 2.2. Giai mẫu khảo sát tỉ lệ nồng độ tyrosinase/L-tyrosin ..............................................33 Bảng 2.3. Danh sách mẫu thử khảo sát nồng độ tyrosinase và L-tyrosin ................................33 Bảng 2.4. Danh sách mẫu thử khảo sát ảnh hưởng của DMSO ...............................................35 Bảng 2.5. Điều kiện thử nghiệm tác dụng ức chế tyrosinase trên đĩa 96 giếng .......................37 Bảng 3.1. Danh mục các chiết xuất thu được...........................................................................43 Bảng 3.2. Giá trị Rf của các vết có tác dụng chống oxy hóa cao chiết chloroform ................48 Bảng 3.3. Giá trị Rf của các vết có tác dụng chống oxy hóa ở cao chiết ethanol ....................49 Bảng 3.4. Giá trị Rf của các vết có tác dụng chống oxy hóa ở cao chiết nước ........................50 Bảng 3.5. Điểm đông đặc của gel thạch Himedia RM-201 .....................................................50 Bảng 3.6. Giá trị Rf của các vết có tác dụng ức chế tyrosinase ở cao chiết chloroform ..........51 Bảng 3.7. Giá trị Rf của các vết có tác dụng chống oxy hóa ở cao chiết ethanol ....................52 Bảng 3.8. Độ hấp thu tại 490 nm theo thời gian trên mô hình UV-Vis ...................................56 Bảng 3.9. Thời điểm đọc đĩa đề nghị của các mẫu ..................................................................58 Bảng 3.10. Tỉ lệ DMSO tối thiểu để hòa tan mẫu cao chiết ....................................................59 Bảng 3.11. Trạng thái vật lý của hỗn hợp mẫu thử trong đĩa 96 giếng ....................................59 Bảng 3.12. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của %DMSO đến kết quả thí nghiệm ......................59 Bảng 3.13. Tỉ lệ ức chế tyrosinase của các mẫu cao chiết .......................................................60 Bảng 3.14. Tỉ lệ ức chế tyrosinase của các mẫu cao chiết .......................................................61 Bảng 3.15. Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa thực vật trên mẫu cành Sa-kê.................67 Bảng 3.16. Các phân đoạn chiết rắn - lỏng ..............................................................................69 Bảng 3.17. Tỉ lệ ức chế tyrosinase (%) của các phân đoạn chiết lỏng - lỏng ..........................70 Bảng 3.18. Tỉ lệ ức chế tyrosinase (%) của các phân đoạn chiết rắn-lỏng ..............................73 Bảng 3.19. Kết quả khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase của các mẫu tiềm năng ...................73 ii . . DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT SKC: sắc kí cột SKGĐC: sắc kí giấy điều chế SKLM: sắc kí lớp mỏng SKLMĐC: sắc kí lớp mỏng điều chế HPLC: sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) RP-TLC: sắc kí lớp mỏng pha đảo (Reversed-Phase Thin Layer Chromatography) UV-Vis: phổ tử ngoại khả kiến (Ultraviolet-Visible spectroscopy) Cf: cloroform H2O, DW: nước, nước cất (distilled water) EA:ethyl acetat EtOH, Et: ethanol KA: acid kojic L-DOPA:L-3,4-dihydroxy phenylalanine MeOH, Me: methanol nHx:n-hexan PBS: dung dịch đệm phosphate (phosphate buffer solution) DANH MỤC KÍ HIỆU BS: mẫu trắng (blank sample) BC: mẫu chứng trắng (blank control) CS: mẫu chứng (controlsample) TC: mẫu chứng thử (test control) TS: mẫu thử (test sample) IC50: nồng độ ức chế 50% Gel 8:100: gel thử mang 8 U/cm2 tyrosinase và 100 nmol/cm2 L-tyrosin với thạch Himedia RM-201 1,2% trong PBS 50 mM, pH 6,5. iii . . ĐẶT VẤN ĐỀ Làn da trắng hồng là một nhu cầu làm đẹp quan trọng của phụ nữ Việt Nam. Để có làn da sáng, lượng melanin trong da phải được kiểm soát. Tyrosinase, một enzym quan trọng tham gia vào giai đoạn đầu chuyển hóa L-tyrosin và L-3,4-dihydroxy phenylalanin (L-DOPA) thành melanin [50], trở thành mối quan tâm chính trong công cuộc tìm kiếm sản phẩm giúp cải thiện làn da, làm sáng da. Các chất tổng hợp có tác dụng ức chế tyrosinase tổng hợp như hydroquinon, arbutin, acid azeloic… thường gặp các tác dụng không mong muốn như kích ứng, ban đỏ, ngứa, nhạy cảm da… cản trở đáng kể đến quá trình điều trị [23]. Qua quá trình sàng lọc, những sản phẩm dùng ngoài từ tự nhiên tỏ ra an toàn hơn và thật sự hiệu quả [23]. Tuy nhiên, các liệu pháp trị nám da có tác dụng tốt, an toàn nguồn gốc từ nước ngoài gặp hạn chế về giá thành khiến người dùng tiếp tục tìm các sản phẩm từ tự nhiên. Trong quá trình tham khảo tài liệu tìm hiểu về các qui trình thử nghiệm tác dụng ức chế enzym tyrosinase, nhận thấy cómột số vấn đề sau: - Các tác giả sử dụng quy trình với những điều kiện thí nghiệm khác nhau, đặc biệt là sự khác biệt về nồng độ cuối của tyrosinase và chất nền. - Kết quả thử nghiệm cho thấy có một số mẫu tăng tác dụng ức chế tyrosinase khi giảm nồng độ. - Các dược liệu và các chất có tác dụng ức chế tyrosinase đáng kể đồng thời cũng có tính chống oxy hóa tốt, gợi ý khả năng dùng thử nghiệm tác dụng chống oxi hóa làm thử nghiệm tiền sàng lọc tác dụng trước khi thực hiện thử nghiệm ức chế enzym tyrosinase. Nhằm góp phần tìm kiếm các loại dược liệu trong nước có tiềm năng phát triển thuốc làm sáng da, chúng tôi đặt vấn đề "Sàng lọc in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase của một số dược liệu được thu hái ở miền Nam Việt Nam" với mục tiêu chính là tìm một số cây thuốc có tác dụng ức chế tyrosinase để sau này phát triển các sản phẩm làm sáng da phù hợp với thị trường trong nước. Những mục tiêu cụ thể là: - Khảo sát điều kiện thích hợp cho phương pháp sàng lọc đã lựa chọn. - Sàng lọc in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase trên một số dược liệu nhằm tìm kiếm bộ phận dùng dược liệu và phân đoạn chiết cho tác dụng mạnh nhất. - Xác định IC50 cho cao chiết và các phân đoạn tiềm năng 1 . . CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.1.1. Khái niệm Tyrosinase và sinh tổng hợp melanin Tyrosinase là một enzym chứa đồng có mặt trong các tế bào sinh sắc tố trên da người và động vật. Enzym này xúc tác phản ứng hydroxyl hóa L-tyrosin tạo L-3,4-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) và phản ứng oxy hóa L-DOPA cho dopaquinon. Dopaquinon sau đó bị chuyển vị và oxy hóa tự nhiên tạo dopachrom có màu đỏ; qua một chuỗi phản ứng tự oxy hóa và trùng hợp, từ dopachrom sinh ra melanin (màu đen). Hình 1.1. Con đường sinh tổng hợp melanin [16] Nguyên tắc thử nghiệm tác dụng ức chế tyrosinase Phản ứng oxy hóa chất nền (L-tyrosin hoặc L-DOPA) với xúc tác tyrosinase được thực hiện với sự có mặt của mẫu thử. Mẫu thử có tác dụng ức chế tyrosinase là mẫu thử làm chậm (hoặc dừng) phản ứng, giảm lượng dopachrom sinh ra và ngăn cản sự tạo thành melanin. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tạo melanin Tyrosinase Tyrosinase từ nấm Agaricus bisporus là nguồn enzym chính dùng trong nghiên cứu tác dụng ức chế tyrosinase, cả cho mục đích dược học hoặc thực phẩm, vì có các đặc tính tương đồng với tyrosinase từ động vật; cụ thể, tyrosinase từ A.bisporus có khả năng phản ứng đặc biệt cao đối với L-tyrosin và L-DOPA. Vì các đặc tính của tyrosinase thay đổi theo nhà sản xuất và lô sản xuất, nguồn tyrosinase từ A.bisporus do Sigma-Aldrich cung cấp được sử dụng chủ yếu trong các nghiên cứu thực hiện thử nghiệm này. 2 . . Chất nền L-tyrosin (C9H11NO3; 118,2 g/mol, CAS 60-18-4) là chất rắn màu trắng, góc quay cực riêng αD từ -9.8° đến 11.2° (50 mg/ml,1 M HCl, 25 °C). Độ tan của L-tyrosin trong nước là 0,45 mg/ml (tương đương 2,48 mM) ở pH 3,2-7,5 và độ tan thay đổi theo pH. L-3,4-dihydroxy phenylalanin (L-DOPA) (C9H11NO4; 197,2 g/mol, CAS 59-92-7) là sản phẩm oxy hóa của L-tyrosin bởi tyrosin hydroxylase và là đồng phân của tiền chất dopamin, có độ tan trong nước là 3,30 mg/ml (tương đương 16,73 mM), kém bền trong kiềm, dễ bị oxy hóa. Trong các thí nghiệm khảo sát tác dụng ức chế tyrosinase, một trong hai loại chất nền L-tyrosin và L-DOPA đều có thể được lựa chọn. Tuy nhiên, cơ chế phản ứng có sự khác nhau giữa hai chất nền. Cơ chế phản ứng với chất nền L-DOPA L-DOPA có thể trực tiếp phản ứng với tyrosinase theo chu trình sau [43]: L-DOPA (D) EmD met-Tyrosinase (Em) H+ H2O H2O Dopaquinon (Q) deoxy-Tyrosinase (Ed) O2 + H oxy-Tyrosinase (Eox) EoxD L-DOPA 2 Dopaquinon L-DOPA + Dopachrom Hình 1.2. Cơ chế phản ứng oxy hóa L-DOPA với xúc tác tyrosinase[43] Cơ chế phản ứng với chất nền L-tyrosin, ảnh hưởng của khoảng trễ Dạng tồn tại chủ yếu của tyrosinase (85% là met-tyrosinase [16]) khi tương tác trực tiếp với L-tyrosin thành dạng bất hoạt nên phải qua trung gian một o-diphenol để chuyển dần sang dạng hoạt động (oxy-tyrosinase) [43]: 3 . . Hình 1.3. Cơ chế phản ứng oxy hóa L-tyrosin với xúc tác tyrosinase[43] Khoảng thời gian để tyrosinase chuyển sang dạng hoạt động với L-tyrosin được gọi là khoảng trễ (lag period) [13]. Các yếu tố môi trường có thể ảnh hưởng đến khoảng trễ và thay đổi diễn biến của phản ứng. Ngoài ra, lượng dư L-tyrosin có thể tự ức chế phản ứng. Các yếu tố môi trường pH: pH ≤ 5 giúp hoạt hóa enzym, làm mất khoảng trễ. pH 7,0 giúp chuyển hóa nhanh chóng dopaquinon thành dopachrom qua dopaquinon-H+ [48]. Oxy hòa tan: vì phản ứng chuyển dạng enzym tiêu thụ oxy, có khả năng hàm lượng oxy hòa tan có ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng. Chất cho proton, o-dihydro phenol: sự hiện diện của các chất này trong mẫu thử có thể rút ngắn hoặc làm mất thời gian trễ [50]. Chất ức chế tyrosinase Các chất ức chế tyrosinase có tác dụng ngăn cản hoạt động của tyrosinase, làm giảm lượng dopaquinon và dopachrom sinh ra, từ đó kiềm hãm sự hình thành melanin. Về cơ chế tác dụng, các chất ức chế tyrosinase được phân thành các nhóm: - Chất bất hoạt tyrosinase đặc hiệu: ức chế enzym không thuận nghịch - Chất ức chế tyrosinase đặc hiệu: theo cơ chế cạnh tranh thuận nghịch [16] + Chất ức chế cạnh tranh (competitive) + Chất ức chế không cạnh tranh (uncompetitive) + Chất ức chế phi cạnh tranh (non-competitive) + Chất ức chế dạng hỗn hợp (mixed) [16] 4 . . Về cấu trúc hóa học, chất ức chế tyrosinase tự nhiên được phân thành các nhóm: - Dẫn chất phenol: phenol đơn giản, acid hữu cơ, flavonoid, stilben, coumarin - Dẫn chất benzaldehyd và benzoat - Các lipid mạch dài, steroid và triterpen Trong đóhầu hết hoạt chất từ tự nhiên thuộc nhóm các dẫn chất phenol. [16] 1.1.2. Khảo sát tác dụng chống oxy hóa, mô hình DPPH trên SKLM Mô hình DPPH là mô hình được sử dụng phổ biến nhất để khảo sát tác dụng chống oxy hóa. Mô hình này có thể thực hiện trên ống nghiệm, trên bản mỏng hay trên đĩa 96 giếng. Mô hình DPPH thực hiện trên SKLM được giới thiệu bởi Hostettmann, K. và cộng sự (1997). Nguyên tắc: Dung dịch DPPH trong methanol hoặc ethanol 96% có màu tím. Các chất chống oxy hóa khử DPPH thành DPPHH có màu vàng. Hình 1.4. Phản ứng khử hóa gốc tự do DPPH Quy trình thực hiện: - Chuẩn bị bản mỏng và khai triển với pha động thích hợp - Phun hoặc nhúng dung dịch DPPH trong methanol lên bản mỏng - Để yên trong tối. Quan sát sau 5 phút hoặc đến 30 phút Đánh giá kết quả: Vết có tác dụng có màu vàng trên nền tím (Hình 1.5) [14]. Hình 1.5. Bản mỏng minh họa mô hình TLC-DPPH [14] Thuốc thử: 0,2% (w/v) DPPH trong methanol. 5 . . Các yếu tố ảnh hưởng đến thí nghiệm Có thể dùng dung dịch DPPH với nhiều nồng độ khác nhau 0,2% [14], 0,1% [45], 0,05% [21] hoặc 0,04% [57] (w/v) trong methanol. Phản ứng có thể được quan sát tại 30 phút sau khi tẩm thuốc thử hoặc mỗi 5 phút trong vòng 30 phút [14]. Ánh sáng, oxy không khí là các yếu tố chính khiến nền DPPH kém ổn định, gây giới hạn về thời gian quan sát do đó việc ủ bản mỏng trong bóng tối là cần thiết [14]. Nhiệt độ ủ thấp là thiết yếu khi sàng lọc trên các mẫu bay hơi [14]. Hoạt tính của các hợp chất được so sánh dựa trên cường độ màu và diện tích vết. 1.1.3. Sàng lọc in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase trên SKLM Wangthong, S. và cộng sự (2007) [55] đã giới thiệu quy trình thử nghiệm tác dụng ức chế tyrosinase trên SKLM bằng cách phun lần lượt dung dịch enzym và chất nền; sau đó, García, P. và cộng sự (2015) [24] đã áp dụng thành công việc cố định enzym trong gel SKLM. Cách thực hiện: - Chuẩn bị bản mỏng và triển khai với pha động thích hợp. - Tẩm hỗn hợp phản ứngvào bản mỏng đã khai triển: + Phun lần lượt dung dịch tyrosinase và L-tyrosin lên bản mỏng [55]. + Pha gel chứa dung dịch L-tyrosin và tyrosinase; rót gel lên bản mỏng [24]. - Để yên phản ứng trong một thời gian nhất định. Đánh giá kết quả: - Quy trình phun các dung dịch thử: vết có tác dụng sáng màu trên nền xám [55]. - Quy trình cố định enzym: vết có tác dụng sáng màu trên nền nâu đỏ [24]. Phun hỗn hợp phản ứng [55] Silicagel 60 F254(Merck) 2,6 U/cm2 tyrosinase 40 nmol/cm2 L-tyrosin 10 phút Cố định tyrosinase trong gel ở bản mỏng pha thuận [24] Silicagel 60 F254(Merck) 8,0 U/cm2 tyrosinase 100 nmol/cm2 L-tyrosin Thạch đa dụng (Britania) 20 phút Cố định tyrosinase trong gel ở bản mỏng pha đảo [25] Silicagel 60 RP-18 F254 (Merck) 8,0 U/cm2 tyrosinase 100 nmol/cm2 L-tyrosin Poloxamer 407 (Pluronic) 20 phút Hình 1.6. Một số kết quả định tính tác dụng ức chế tyrosinase trên SKLM 6 . . Ảnh hưởng của các điều kiện thí nghiệm đến đánh giá kết quả Với quy trình phun hoặc nhúng hỗn hợp phản ứng: - Mật độ enzym và L-tyrosin cần để phát hiện các hoạt chất cơ bản là 2 – 4 U/cm2 và 20 – 60 nmol/cm2; để phát hiện hoạt chất ở lượng nhỏ (5-20 ng) cần 4 – 8 U/cm2 tyrosinase và 10 – 100 nmol/cm2 L-tyrosin [55]. - Các vết không thấm nước sẽ tạo thành vết dương giả, phải dùng Triton-X để tăng tính thấm [53]. - Kết quả kém ổn định [24]. Với quy trình cố định enzym trong gel: - Mật độ 4 – 8 U/cm2 tyrosinase và 40 – 100 nmol/cm2 L-tyrosin giúp phát hiện 3,89 – 14,76 ng acid kojic trên lý thuyết [24]. Kết quả này thống nhất với khảo sát của Wangthong, S. và cộng sự [55]. - Hai yếu tố chính ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm là mật độ phủ tyrosinase và L-tyrosin; nhiệt độ và thời gian ủ ít ảnh hưởng, có thể ủ tại 20 oC trong 20 phút. - García, P. và cộng sự (2015) đã triển khai SKLM với 100 µg cao chiết và 100 ng acid kojic. Mật độ phủ enzym và chất nền là 8 U/cm2 và 100 nmol/cm2 [24]. - Chưa có báo cáo về vết dương tính giả. 1.1.4. Khảo sát in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase bằng mô hình đo quang Nguyên tắc: Các chất ức chế tyrosinase ngăn cản sự chuyển hóa L-tyrosin thành L-DOPA và dopaquinon, từ đó giảm lượng dopachrom sinh ra. Tác dụng ức chế tyrosinase được xác định bằng cách so sánh lượng dopachrom sinh ra ở mẫu thử với mẫu chứng qua độ hấp thu tại 450 nm [51], 470 nm [15], 475 nm [36], hoặc 490 nm [26] (hình 1.7.) Không màu Không màu Không màu Màu xám Màu đỏ Hình 1.7. Phản ứng ức chế tyrosinase Bảng 1.1 tóm tắt các quy trình thử nghiệm từ tài liệu tham khảo 7 . . Bảng 1.1. Các quy trình khảo sát in-vitro tác dụng ức chế tyrosinase Nguồn Dụng tài liệu cụ đo Iida et al., cuvet (1995) [28] 3 ml Chất nền Tyrosinase 0,55 mM tyrosin 30 U Đệm PBS 10 mM pH 6.8 PBS 19 mM pH 6.8 0,85 mM L-DOPA Kubo et al. cuvet (1995) [34] 3 ml 1 ml 2,5 mM L-DOPA 0,1 ml 138 U/ml dm: nước 1,8 ml PBS 100 mM pH 6,8 Lee et al., cuvet (1997) [38] 2 ml 0,5 ml * 0,1 mg/ml L-tyrosin 70 U 0,5ml PBS 0,5 mM, pH 6,8 L-DOPA 500 μM Khanom, Tadasa & Kayahara, 2000 [35] cuvet 3 ml Baurin et al., cuvet (2002) [11] 1 ml PBS 50 mM pH 6.8 1,0 ml 0,3 mg/ml L-tyrosin dm: nước 0,1 ml * 480 U/ml 1,0 ml đệm McIlvaine pH 6.8 25μl L-dopa 0,5 mM L-tyrosin 10mM 50μl * 1600 U/ml 875μl PBS50 mM pH 6,5 Mẫu 300 μg/ml Cao MeOH-H2O 50% (5g/100ml) dm: đệm 0,1 ml Cao MeOH tách phân đoạn H2O, EA và nHx dm: DMSO 0,5,ml 33 μg/ml, 330 μg/ml Cao MeOH-H2O 80% dm: đệm - Như trên 100 μg/ml, 500 μg/ml 0,9 ml 100 μg/ml Cao MeOH PĐ MeOH-H2O 50% PĐ aceton-H2O 60% PĐ H2O Dm: DMSO 10% - 25 μl ~ 10μl cao chiết PG-nước khử ion 50% (100g/1000ml) dm: đệm 8 . Quy trình Đối chiếu - Pha 3ml hỗn hợp thử Acid kojic - Ủ ở 37oC trong 10phút - Đọc hấp thu ở 475 nm - Pha 3ml hỗn hợp thử. Ủ tại 25oC trong 1,75-2,75 phút - Đọc hấp thu ở 475 nm - Trộn chất nền, mẫu và đệm Không - Ủ tại 25 oC trong 10 phút - Thêm tyrosinase - Đo hấp thu ở 475 nm - Pha hỗn hợp thủ Không - Ủ tại 37 oC trong 10 phút - Đọc hấp thu ở 475 nm - Pha hỗn hợp thử - Ủ tại 37 oC trong 2 ngày - Đọc hấp thu ở 475 nm - Trộn dung dịch đệm, L-tyrosin và mẫu thử. Ủ 10 phút tại 30 oC - Thêm tyrosinase. Ủ tại 30 oC trong 10 phút - Dừng phản ứng: 0,1ml sodium azid 1M - Đọc hấp thu ở 475 nm - Trộn chất nền, đệm và mẫu Morus thử. Thêm tyrosinase. Theo dõi alba (lá) độ hấp thu tại 475nm theo thời gian. Nguồn mẫu Osaka, Nhật Bản Bolivia Chuncheon, Hàn Quốc Bangladesh Brazil . Nguồn tài liệu Kim et al., (2003) [32] Dụng cụ đo cuvet 1,5 ml Chất nền Tyrosinase Đệm Mẫu 0,15 mg L-tyrosin 105 U PBS 0,05 mM pH 6,8 Arung et al., cuvet (2005) [9] 1 ml 333 μl 2,5 mM L-tyrosin L-DOPA 33 μl 1380 U/ml 600μl PBS0,1M pH 6,5 Masuda et al. (2005) [40] đĩa 96 giếng 40μl 2,5mM L-DOPA 40 μl 46 U/ml 80 μl PBS pH 6.8 - 40 μl - 500μg/ml - dm: DMSO 5% Heo et al, (2007) [26] đĩa 96 giếng 40μl * 2.5mM - L-DOPA 40 μl * 125 U/ml 80 μl PBS 0,1M pH 6,8 - 40 μl - dm: MeOH 20% - 1 mg/ml Hwang & Lee, (2007) [27] đĩa 96 giếng 40μl * 1.5mM L-tyrosin 40 U Kamkaen et al, (2007) [31] đĩa 96 giếng 20 µl * 0,85 mM L-DOPA 20µl 1000 U/ml 220 μl *0,1M đệm phosphat pH 6.5 20 µl đệm phosphat pH 6.8 (0,1M) 2 μl ≤ 666μg/ml - Cao methanol - Cao nước 100 µl 312,5µg/ml Cao hexane, EtOAc, MeOH, cao PG- nước - 10 μg/ml và 100μg/ml - Cao methanol - dm: đệm - 33 μl - 100μg/ml - Cao MeOH - dm: đệm 9 . Quy trình Đối chiếu Nguồn mẫu - Pha chế 1.5 ml dung dịch thử. - Ủ tại 37 oC trong 10 phút Acid kojic Kyungbuk, Hàn Quốc - Trộn chất nền và đệm. Ủ trong 10 phúttại 25 oC - Thêm mẫu thử và tyrosinase. - Theo dõi sự tăng hấp thu tại 470nm - Hòa mẫu, tyrosinase, đệm - Ủ 23oC trong 10 phút - Thêm chất nền và ủ 23oC trong 10 phút. - Đo độ hấp thu tại 475nm - Hòa dung dịch mẫu, đệm và tyrosinase.Ủ 5 phút tại 25oC. - Thêm L-DOPA. - Đo độ hấp thu tại 490nm - Hòa tyrosinase vào dung dịch mẫu thử. Thêm chất nền và đệm - Ủ tại 37oC trong 10 phút - Đo độ hấp thu tại 475nm - Hòa tyrosinase + đệm + mẫu + chất nền - Ủ tại 25oC trong 10 phút - Đọc hấp thu tại 475 nm Acid kojic Indonesia Onikawa, Nhật Bản L-ascorbic acid Kanwong, Hàn Quốc Hàn Quốc Acid kojic 500 µg/ml Nakhonnayok, Thái Lan . Nguồn tài liệu Chan et al., 2008 [15] Dụng cụ đo đĩa 96 giếng Momtaz et al. (2008) [41] đĩa 96 giếng Arung et al., (2009) [8] đĩa 96 giếng Chen et al.,(2009) [17] đĩa 96 giếng Chất nền Tyrosinase Đệm Mẫu Quy trình 40μl 2,5mM L-DOPA 40 μl 31 U/ml 80 μl PBS 0,1M pH 6,8 40μl 500μg/ml Cao methanol dm: DMSO 10% 70 μl 500μg/ml dm: DMSO 3% - Cao methanol 40:200 - Pha hỗn hợp phản ứng. Mẫu trắng: không thêm chất nền. - Ủ 10 phút. Đo độ hấp thu tại 475 nm, đối chiếu 700 nm - Hòa mẫu + tyrosinase. - Ủ5 phút ở nhiệt độ phòng. - Thêm chất nền - Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng. - Đọc hấp thu tại 492nm - Hòa chất nền và đệm. Để yên ở 25oC. Thêm mẫu & tyrosinase - Nếu dùng L-DOPA, đo quang ngay ở 475 nm - Nếu dùng L-tyrosin, ủ 20 phút ở 25oC & đo quang - Hòa hỗn hợp mẫu thử tyrosinase và đệm. - Ủ tại 37oC trong 5 phút - Thêm chất nền và ủ tại 37oC trong 30 phút - Đo hấp thu tại 475nm 110μl L-tyrosin 2mM L-DOPA 12mM 330μl L-DOPA 2,5mM L-tyrosin 330μM 30 μl 333 U/ml PBS pH 6,8 33μl 1380 U/ml 600μl PBS 0,1M, pH 6,5 33μl 100 μg/ml, 500μg/ml Cao methanol Dm: DMSO 16,5% 80μl 0,1mg/ml L-tyrosin 40μl 50 U/ml 120μl PBS pH 6,8 40μl 500μg/ml Cao aceton DMSO ≤ 0,25% 10 . Đối chiếu Nguồn mẫu Malaysia Arbutin & acid kojic ĐH Pretoria Nam Phi Acid kojic Kalimantan Indonesia Acid kojic 0,1mg/ml Đài Loan . Nguồn tài liệu Lai, Lim & Tan, (2009) [36] Dụng cụ đo đĩa 96 giếng T.Y.Lim, et al, (2009) [39] đĩa 96 giếng Senol et al., (2009) [66] đĩa 96 giếng Bartubara et al., (2010) [10] Moon et al., (2010) [42] Chất nền Tyrosinase 40μl 2,5mM L-DOPA 40μl 0,02mg/ml 80 μl PBS 0,1M pH 6,8 40μl 2,5mM L-DOPA 40μl 2,5mM L-DOPA 40μl 0,02mg/ml 80 μl PBS 0,1M pH 6,8 80 μl PBS 1/15M pH 6.8 đĩa 96 giếng 110μl L-tyrosin 2 mM L-DOPA 12mM 30μl 333 U/ml đĩa 96 giếng 1,5mM L-tyrosin 100 U/ml 40 μl 46 U/ml Đệm PBS 100mMpH 6,7 Mẫu 40 μl 500 μg/ml DMSO 10% Cao methanol 40 μl * 500 μg/ml DMSO 10% Cao methanol 40 μl DMSO 5% 500μg/ml PĐ EtOAc và MeOH - 70μl - 7,81-2000 μg/ml Cao methanol hoặc ethanol 50% 20mg/ml trong DMSO, hòa loãng trong đệm 500 μg/ml Cao ethanol 80% 11 . Quy trình Đối chiếu Nguồn mẫu - Hòa hỗn hợp thử - Để yên 30 phút - Đo hấp thu tại 475nm Acid kojic quercetin Kuala Lampur, Malaysia - Hòa hỗn hợp thử - Để yên 30 phút - Đo hấp thu tại 475nm - Hòa mẫu, tyrosinase, đệm - Ủ 23oC trong 10 phút - Thêm chất nền và ủ 23oC trong 10 phút. - Đo độ hấp thu tại 475nm - Hòa dung dịch mẫu thử và tyrosinase. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. - Thêm chất nền. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. - Đọc hấp thu tại 492nm - Hòa mẫu, tyrosinase vào dung dịch đệm.Ủ 15 phút ở 37oC - Thêm chất nền. - Đọc hấp thu tại 490nm Acid kojic quercetin Malaysia Thổ Nhĩ Kỳ Acid kojic IC50MP: 11.3μg/ml IC50DP: 40,2μg/ml Indonesia Arbutin: IC50 : 180,3μg/ ml Jeju, Hàn Quốc