Tài liệu Sàng lọc các chất có khả năng ức chế phosphodiesterase 9 trong điều trị bệnh alzheimer

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ----------------- ĐINH VĂN TOÀN SÀNG LỌC CÁC CHẤT CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ PHOSPHODIESTERASE 9 TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH ALZHEIMER LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ----------------- ĐINH VĂN TOÀN SÀNG LỌC CÁC CHẤT CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ PHOSPHODIESTERASE 9 TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH ALZHEIMER Chuyên ngành : Công nghệ dược phẩm – Bào chế Mã số : 60.72.04.02 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. THÁI KHẮC MINH Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2017 Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dược học – Khóa: 2015 - 2017 SÀNG LỌC CÁC CHẤT CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ PHOSPHODIESTERASE 9 TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH ALZHEIMER Đinh Văn Toàn Thầy hướng dẫn: PGS. TS. Thái Khắc Minh Mở đầu Các chất ức chế phosphodiesterase 9 (PDE9) là những chất có tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh Alzheimer. Trong đề tài này, tiến hành xây dựng mô hình 2DQSAR, 3D-pharmacophore và docking nhằm góp phần sàng lọc các chất có khả năng ức chế PDE9 có tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh Alzheimer. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Mô hình 2D-QSAR được xây dựng bằng phần mềm MOE 2015.10 trên cơ sở dữ liệu gồm 477 chất ức chế PDE9 thu thập từ 8 bài báo khoa học và 15 bằng sáng chế. Thuật toán HipHop trong phần mềm Discovery studio 2017 R2 được sử dụng để xây dựng mô hình 3D-pharmacophore trên cơ sở dữ liệu gồm 6 chất ức chế mạnh. Mô hình mô tả phân tử docking được xây dựng bằng công cụ CDocker trong phần mềm Discovery studio 2017 R2, sử dụng các cấu trúc protein từ ngân hàng dữ liệu protein. Ứng dụng các mô hình trên để sàng lọc ảo các chất có khả năng ức chế PDE9 trên sáu thư viện lớn với tổng cộng 380.330 chất. Kết quả và bàn luận Kết quả đã xây dựng thành công một mô hình 2D-QSAR, một mô hình 3Dpharmacophore và một mô hình mô tả phân tử docking có khả năng sàng lọc tốt. Kết quả sàng lọc ảo thu được ba chất có khả năng ức chế PDE9 tốt, chứa nhiều khung cấu trúc mới, với giá trị IC50 ≤ 50 nM, điểm số phù hợp ≥ 2,5, điểm số docking -CE > 0, -CIE > 0 và có ít nhất hai liên kết hydro với acid amin GLN453. Kết luận Ba mô hình sàng lọc ảo, cùng với Luật 4 CNS Lipinski đã giúp sàng lọc nhanh chóng các chất có khả năng ức chế PDE9 tốt với các khung cấu trúc mới và có tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh Alzheimer. Kết quả tạo nền tảng cho việc định hướng thiết kế, tổng hợp và xác định hoạt tính sinh học nhằm tìm ra nhiều chất có hoạt tính ức chế PDE9 tốt, có khả năng vượt qua hàng rào máu não và an toàn. Final thesis for the degree of Master Pharm. - Academic year: 2015 – 2017 SCREENING FOR PHOSPHODIESTERASE 9 INHIBITORS IN TREATMENT OF ALZHEIMER’S Van-Toan Dinh Supervisor: Assoc. Prof., Ph. D. Khac-Minh Thai Introduction Phosphodiesterase 9 (PDE9) inhibitors are potentially applied in the treatment of Alzheimer's disease. In this study, 2D-QSAR, 3D-pharmacophore and molecular docking models will be the built in order to help screen PDE9 inhibitors those are applied in Alzheimer's disease treatment. Materials and Methods The 2D-QSAR model was built using MOE 2015.10 software on a database of 477 PDE9 inhibitors collected from eight scientific papers and 15 patents. The HipHop algorithm in Discovery studio 2017 R2 software is used to build a 3D-pharmacophore model based on a database of six strongly inhibitors. The molecular docking model is built using the CDocker in the Discovery studio 2017 R2 software, which uses protein structures from the protein data bank. These three models were applied in virtual screening of PDE9 inhibitors on six big databases with a total of 380,330 substances. Results and Discussion The results have successfully built a 2D-QSAR model, a 3D-pharmacophore model, and a molecular docking model which well screening. The results of the virtual screening were obtained by three substances with good inhibitory activity against PDE9, many new scaffolds, IC50 ≤ 50 nM, fit value ≥ 2,5, docking score -CE > 0, CIE > 0 and have at least two hydrogen bonds with GLN453. Conclusions The three virtual screening models, along with Lipinski’s CNS Ro4, have rapidly screened PDE9 inhibitors with new scaffolds and potential applications in the treatment of Alzheimer's disease. The results provide the basis for design, synthesis, and identification of biological activity to find many substances with good PDE9 inhibitory activity, able to cross the blood-brain barrier and safety. LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ luận văn nào khác. Tác giả Đinh Văn Toàn i MỤC LỤC Mục lục ........................................................................................................................ i Danh mục các chữ viết tắt .......................................................................................... ii Danh mục các bảng ................................................................................................... iv Danh mục các hình .................................................................................................... vi Lời cảm ơn ................................................................................................................ ix Mở đầu ........................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3 1.1. Phosphodiesterase 9 .........................................................................................3 1.2. Sàng lọc ảo .....................................................................................................12 1.3. Phương pháp 2D-QSAR.................................................................................13 1.4. Phương pháp 3D-pharmacophore ..................................................................18 1.5. Phương pháp docking.....................................................................................20 CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................22 2.1. Quy trình thực hiện nghiên cứu 2D-QSAR....................................................22 2.2. Quy trình thực hiện nghiên cứu 3D-pharmacophore .....................................34 2.3. Quy trình thực hiện nghiên cứu mô hình mô tả phân tử docking ..................39 2.4. Quy trình thực hiện sàng lọc ảo các chất có khả năng ức chế PDE9 .............43 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................44 3.1. Mô hình 2D-QSAR dự đoán hoạt tính ức chế PDE9 xác định bằng phương pháp phóng xạ .......................................................................................................44 3.2. Mô hình 2D-QSAR dự đoán hoạt tính ức chế PDE9 xác định bằng phương pháp chất nền cGMP .............................................................................................46 3.3. Mô hình 3D-pharmacophore ..........................................................................49 3.4. Mô hình mô tả phân tử docking .....................................................................56 3.5. Sàng lọc ảo các chất có khả năng ức chế PDE9.............................................67 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ........................................................................................78 Kết luận và kiến nghị ................................................................................................81 Tài liệu tham khảo .....................................................................................................82 Phụ lục ...................................................................................................................PL-1 ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2D-QSAR Two-Dimensions-QSAR (QSAR 2 chiều) 2D-QSAR-RA Mô hình 2D-QSAR trên tập dữ liệu xác định hoạt tính bằng phương pháp phóng xạ 2D-QSAR-GS Mô hình 2D-QSAR trên tập dữ liệu xác định hoạt tính bằng phương pháp chất nền cGMP 3D-QSAR Three-Dimensions-QSAR (QSAR 3 chiều) 4D-QSAR Four-Dimensions-QSAR (QSAR 4 chiều) Aβ Amyloid beta BQSAR Binary QSAR (QSAR nhị phân) cAMP Cyclic adenosine monophosphate (AMP vòng) CCC Concordance Correlation Coefficient (Hệ số tương quan phù hợp) -CE -CDocker_Energy (Năng lượng CDocker) -CIE -CDocker_Interaction_Energy (Năng lượng tương tác CDocker) cGMP Cyclic guanosine monophosphate (GMP vòng) CHARMM Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics (trường lực CHARMM) CNS Central Nervous System (Hệ thần kinh trung ương) Da Dalton (đơn vị khối lượng nguyên tử) E Enzyme GMP Guanosine monophosphate GS cGMP as Substrate (Chất nền cGMP) HCTN Hợp chất tự nhiên HQSAR Hologram-QSAR IC50 50% Inhibitory Concentration (Nồng độ tối thiểu ức chế 50%) Km Michaelis-Menten constant (Hằng số Michaelis-Menten) LOO Leave-One-Out (Bỏ-một-ra) MH Mô hình MOE Molecular Operating Environment (Phần mềm MOE) iii MSE Mean Square Error (Sai số bình phương trung bình) P Product (Sản phẩm) PC Principal Component (Thành phần cơ bản) PCA Principal Component Analysis (Phân tích thành phần cơ bản) PDB Protein Data Bank (Ngân hàng dữ liệu protein) PDE Phosphodiesterase PDEStrIAn PhosphoDiEsterase Structure and ligand Interaction Annotated database (Cơ sở dữ liệu cấu trúc phosphodiesterase và tương tác phối tử) PLS Partial Least Squares (Bình phương tối thiểu từng phần) QSAR Quatitative Structure Activity Relationship (Mối tương quan định lượng giữa cấu trúc và tác dụng sinh học) RA Radioactivity Assay (Phương pháp định lượng phóng xạ) RMSE Root Mean Square Error (Sai số bình phương trung bình) RMSD Root Means Square Deviation (Độ lệch bình phương trung bình) S Substrate (Chất nền) SAR Structure Activity Relationship (Mối tương quan giữa cấu trúc và tác dụng sinh học) SPA Scintillation Proximity Assay (Phương pháp định lượng nhấp nháy gần) STT Số Thứ Tự TCM Traditional Chinese Medicine (Các bài thuốc Y học cổ truyền Trung Hoa) Vmax Maximum enzyme activity (Hoạt tính enzym tối đa) iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các acid amin tương tác với cGMP trong vùng 5 Å của khoang gắn kết ...................................................................................................................................12 Bảng 2.1. Phương pháp thử hoạt tính ức chế PDE9 từ các bài báo khoa học và bằng sáng chế. ....................................................................................................................23 Bảng 2.2. Các khung cấu trúc cơ bản trong phương pháp phóng xạ. .......................24 Bảng 2.3. Các khung cấu trúc cơ bản trong phương pháp chất nền cGMP. .............26 Bảng 2.4. Các nhóm thông số mô tả phân tử 2D tính toán bởi phần mềm MOE 2015.10. .....................................................................................................................28 Bảng 2.5. Phân loại hoạt tính sinh học của các chất ức chế PDE9. ..........................35 Bảng 2.6. Các khung cấu trúc cơ bản của tập ức chế mạnh. .....................................35 Bảng 2.7. Tập kiểm tra mô hình 3D-pharmacophore. ..............................................37 Bảng 2.8. Các thông số đánh giá mô hình 3D-pharmacophore ...............................39 Bảng 3.1. Ý nghĩa của thông số mô tả xây dựng mô hình 2D-QSAR trên tập RA. .44 Bảng 3.2. Các chất loại nhiễu bằng PCA và Z-score trên tập RA. ...........................45 Bảng 3.3. Ý nghĩa của thông số mô tả xây dựng mô hình 2D-QSAR trên tập GS. ..47 Bảng 3.4. Các chất loại nhiễu bằng PCA và Z-score trên tập GS.............................47 Bảng 3.5. Kết quả đánh giá mô hình 2D-QSAR trên tập GS....................................48 Bảng 3.6. Tập xây dựng mô hình 3D-pharmacophore. .............................................50 Bảng 3.7. Kết quả đánh giá 10 mô hình 3D-pharmacophore trên tập xây dựng. .....51 Bảng 3.8. Kết quả đánh giá 10 mô hình 3D-pharmacophore trên tập kiểm tra. .......53 Bảng 3.9. Kết quả đánh giá mô hình 3 sau khi sử dụng giá trị điểm số phù hợp ≥ 2,5 ...................................................................................................................................55 Bảng 3.10. Thông số mô tả của mô hình 3D-pharmacophore số 3. ..........................55 Bảng 3.11. Các cấu trúc tinh thể PDE9 thu thập được từ ngân hàng dữ liệu protein ...................................................................................................................................57 Bảng 3.12. Kết quả docking lặp lại trên cấu trúc PDE9 mã 4QGE. .........................59 Bảng 3.13. Thành phần khoang gắn kết ban đầu xác định được của chuỗi A và B của PDE9 mã 4Y86. ........................................................................................................60 v Bảng 3.14. Kết quả docking lặp lại trên cấu trúc PDE9 mã 4Y86. ..........................61 Bảng 3.15. Số chất dock được vào cấu trúc PDE9 mã 4Y86....................................63 Bảng 3.16. Các acid amin tham gia tạo liên kết hydro, tương tác kỵ nước nhiều nhất trong khoang gắn kết với 85 chất ức chế. .................................................................66 Bảng 3.17. Các thư viện ứng dụng để sàng lọc ảo các chất có hoạt tính ức chế PDE9 ...................................................................................................................................67 Bảng 3.18. So sánh Luật 5 Lipinski và Luật 4 CNS Lipinski. ..................................68 Bảng 3.19. Kết quả sau khi áp dụng Luật 4 CNS Lipinski. ......................................68 Bảng 3.20. Kết quả các chất có IC50 ≤ 50 nM sau khi sàng lọc bằng mô hình 2DQSAR. .......................................................................................................................69 Bảng 3.21. Kết quả 5 chất có hoạt tính ức chế PDE9 tốt nhất trên mô hình 2D-QSAR ...................................................................................................................................69 Bảng 3.22. Kết quả sau khi sàng lọc bằng mô hình 3D-pharmacophore. .................71 Bảng 3.23. Kết quả 5 chất có điểm số phù hợp tốt nhất sau khi sàng lọc bằng mô hình 3D-pharmacophore. ...................................................................................................71 Bảng 3.24. Kết quả sau khi sàng lọc bằng mô hình docking. ...................................73 Bảng 3.25. Kết quả 3 chất thu được sau khi sàng lọc ảo. .........................................74 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Phản ứng thủy phân cAMP và cGMP nhờ phosphodiesterase ..................3 Hình 1.2. Con đường dẫn truyền tín hiệu trong tế bào thông qua tín hiệu thứ hai cAMP và cGMP .....................................................................................................................3 Hình 1.3. Cấu trúc 16 chuỗi xoắn alpha của vùng xúc tác của PDE9 .......................4 Hình 1.4. Bề mặt khoang gắn kết của PDE9 ..............................................................5 Hình 1.5. Cơ chế xúc tác của PDE9 trong phản ứng thủy phân cGMP ......................6 Hình 1.6. Công thức hóa học của PF-04181366 (IC50 = 1,8 nM), BAY 73-6691 (IC50 = 22 nM) và PF-04447943 (IC50 = 89 nM) với khung cấu trúc pyrazolopyrimidinon ...................................................................................................................................10 Hình 1.7. Công thức hóa học của các chất ức chế PDE9 với các khung cấu trúc mới ...................................................................................................................................10 Hình 1.8. Xếp chồng của PDE9 (màu xanh lá) lên PDE1 (màu xanh da trời) và PDE8 (màu cam) ..................................................................................................................11 Hình 2.1. Các bước xây dựng mô hình 2D-QSAR dự đoán hoạt tính ức chế PDE9 ...................................................................................................................................22 Hình 2.2. Công thức hóa học của chất ức chế PDE9 mạnh nhất và yếu nhất trong cơ sở dữ liệu xây dựng mô hình 2D-QSAR. ..................................................................27 Hình 2.3. Loại chất gây nhiễu bằng PCA. ................................................................30 Hình 2.4. Các bước xây dựng mô hình 3D-pharmacophore. ....................................34 Hình 2.5. Sơ đồ tập kiểm tra mô hình 3D-pharmacophore ......................................39 Hình 2.6. Các bước xây dựng mô hình mô tả phân tử docking. ...............................40 Hình 2.7. Quy trình thực hiện sàng lọc ảo các chất có khả năng ức chế PDE9. .......43 Hình 3.1. Mối tương quan giữa giá trị pIC50 dự đoán và thực nghiệm từ mô hình 2DQSAR trên tập RA (phân chia đa dạng). ...................................................................46 Hình 3.2. Mối tương quan giữa giá trị pIC50 dự đoán và thực nghiệm từ mô hình 2DQSAR trên tập GS (phân chia đa dạng). ...................................................................49 Hình 3.3. Mười mô hình 3D-pharmacophore thu được từ tập xây dựng. .................52 Hình 3.4. Bảng đồ nhiệt giá trị điểm số phù hợp của 10 mô hình trên tập fit...........54 vii Hình 3.5. Bảng đồ nhiệt giá trị điểm số phù hợp của 10 mô hình trên tập nonfit.....54 Hình 3.6. (a) Mô hình 3D-pharmacophore số 3, (b) Mô hình 3D-pharmacophore số 3 với chất ức chế JMC_2014_57_10304_3r (chất có IC50 thấp nhất trong tập kiểm tra (IC50 = 0,6 nM, điểm số phù hợp = 3,06)), (c) công thức hóa học của chất ức chế JMC_2014_57_10304_3r. .........................................................................................56 Hình 3.7. Công thức hóa học của các phối tử đồng kết tinh. ....................................58 Hình 3.8. Xếp chồng của 3 phối tử trong khoang gắn kết của PDE9 mã 4QGE, phối tử WYQ-C36D đồng kết tinh (màu xanh), phối tử WYQ-C36D chưa xử lý (màu vàng), phối tử WYQ-C36D đã xử lý (màu xám). .....................................................59 Hình 3.9. Khoang gắn kết của PDE9 mã 4Y86, (a) hình cầu xác định khoang gắn kết ban đầu của chuỗi A, (b) hình cầu xác định khoang gắn kết ban đầu của chuỗi B, (cf) xếp chồng các hình cầu xác định khoang gắn kết cũ và mới trong cả 2 chuỗi. ....61 Hình 3.10. Xếp chồng của 3 phối tử trong khoang gắn kết của PDE9 mã 4Y86, phối tử (S)-C33 đồng kết tinh (màu xanh), phối tử (S)-C33 chưa xử lý (màu vàng) và phối tử (S)-C33 đã xử lý (màu xám). ................................................................................62 Hình 3.11. Tương tác của phối tử với khoang gắn kết của PDE9 mã 4Y86, (a) Phối tử (S)-C33 đồng kết tinh, (b) phối tử (S)-C33 chưa xử lý (-CE = 8,28 Kcal/mol, -CIE = 45,76 Kcal/mol), (c) phối tử (S)-C33 đã xử lý (-CE = 7,11 Kcal/mol, -CIE = 43,94 Kcal/mol). ..................................................................................................................62 Hình 3.12. Công thức hóa học của BMCL_2009_19_2537_11 (IC50 = 46 nM) và khoảng cách của 2 nguyên tử xa nhất trong cấu dạng bền nhất. ...............................64 Hình 3.13. Kết quả docking và 3D-pharmacophore của JMC_2014_57_10304_5 (IC50 = 25,9 nM, -CE = 23,83 Kcal/mol, -CIE = 46,41 Kcal/mol, điểm số phù hợp = 3,94)...........................................................................................................................64 Hình 3.14. Kết quả docking và 3D-pharmacophore của BMCL_2009_19_2537_1 (IC50 = 10 nM, -CE = 20,09 Kcal/mol, -CIE = 43,88 Kcal/mol, điểm số phù hợp = 2,91)...........................................................................................................................65 Hình 3.15. Tần suất tạo (a) liên kết hydro và (b) tương tác kỵ nước của các acid amin tại khoang gắn kết với 85 chất ức chế. ......................................................................66 viii Hình 3.16. Sàng lọc bằng mô hình 2D-QSAR. .........................................................69 Hình 3.17. Sàng lọc bằng mô hình 3D-pharmacophore. ...........................................70 Hình 3.18. Sàng lọc bằng mô hình docking. .............................................................72 Hình 3.19. Các tương tác và các điểm pharmacophore của hợp chất NH00176 ......75 Hình 3.20. Các tương tác và các điểm pharmacophore của hợp chất GK01836 ......75 Hình 3.21. Các tương tác và các điểm pharmacophore của hợp chất ZINC03848734 ...................................................................................................................................76 Hình 3.22. Công thức hóa học của N-[(4,6-dimethylpyrimidin-2-yl)aminocarbonyl] benzensulfonamid. ....................................................................................................77 Hình 3.23. Tổng quát quá trình sàng lọc ảo các chất có khả năng ức chế PDE9. ....77 ix LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn bộ quý Thầy Cô của trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là quý Thầy Cô bộ môn Hóa Dược, quý Thầy Cô đã tạo mọi điều kiện để em hoàn thành tốt luận văn của em. Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến Thầy PGS. TS. Thái Khắc Minh. Trong suốt quá trình làm luận văn, Thầy luôn quan tâm động viên, theo sát và chỉ bảo tận tình. Thầy luôn sẵn sàng giảng giải và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu để em hiểu rõ và thực hiện tốt luận văn của em. Thầy đã dành rất nhiều thời gian để góp ý và chỉnh sửa cho luận văn của em được đầy đủ và hoàn thiện hơn. Cảm ơn các bạn lớp Cao học chuyên ngành Công nghệ Dược phẩm và Bào chế khóa 2015 - 2017 đã cùng mình chia sẻ những khó khăn trong học tập. Cảm ơn anh chị em đồng nghiệp thuộc phòng nghiên cứu – phát triển của Công ty cổ phần dược phẩm SAVI đã hỗ trợ và chia sẻ công việc chuyên môn. Em xin cảm ơn quý Thầy Cô trong Hội đồng phản biện đã dành thời gian quý báu theo dõi và góp ý cho luận văn của em được hoàn thiện hơn. Cuối cùng, em muốn gửi lời cảm ơn đến gia đình, những người luôn bên cạnh, yêu thương, ủng hộ và động viên em trong suốt quá trình học tập. Chúc tất cả sức khỏe và thành công! 1 MỞ ĐẦU Bệnh Alzheimer là dạng phổ biến nhất của hội chứng suy giảm trí nhớ, có liên quan đến tuổi tác, đặc trưng bởi sự suy giảm nhận thức, giảm khả năng ngôn ngữ và sự hiện diện của các mảng Aβ (amyloid beta) [57]. Hiện nay, có khoảng 46,8 triệu người bị Alzheimer và các bệnh liên quan đến mất trí nhớ trên toàn thế giới, đến năm 2050 sẽ lên đến 131,5 triệu người, tăng gấp 3 lần so với hiện nay, điều này có nghĩa cứ mỗi 3,2 giây lại có 1 người bị chứng mất trí nhớ [51]. Trong đó, có khoảng 58% người bệnh sống ở các nước đang phát triển, tỷ lệ dự đoán sẽ tăng lên đến 63% vào năm 2030 và 68% vào năm 2050 [51]. Điều trị và chăm sóc người bệnh mỗi năm tiêu tốn hơn 818 tỷ đô (USD), tương đương 1,09% GDP toàn cầu [51]. Đây thực sự là gánh nặng đối với hệ thống y tế và xã hội [51]. Ở Việt Nam, theo ước tính của Hội Thần kinh Việt Nam, hiện nay có tới 370.000 người bị Alzheimer, nhưng mỗi năm chỉ có khoảng hơn 1.000 bệnh nhân được chẩn đoán và điều trị [74]. Nguyên nhân gây bệnh Alzheimer hiện nay vẫn chưa hiểu rõ, tuy nhiên bệnh Alzheimer có một số đặc trưng về bệnh lý như sự tích tụ các mảng bám Aβ, viêm, ứng kích oxy hóa, thiếu hụt acetylcholin, giảm nồng độ nitric oxyd/ guanylyl cyclase hòa tan/ guanosin monophosphat vòng (con đường tín hiệu NO/sGC/cGMP) [57]. Ở não, con đường tín hiệu NO/sGC/cGMP đóng một vai trò quan trọng trong việc điều hòa dẫn truyền và tính mềm dẻo (plasticity) của khớp thần kinh (synap), liên quan mật thiết đến khả năng học hỏi và trí nhớ [57]. Trong dịch não tủy của bệnh nhân bị Alzheimer nhẹ, nồng độ cGMP giảm rõ rệt so với nhóm chứng không bị bệnh mất trí nhớ [38]. Enzym phosphodiesterase (PDE) làm giảm nồng độ cGMP do thủy phân cGMP thành dạng bất hoạt 5’-GMP [38]. Trong số 11 họ của enzym PDE, hiện nay họ PDE9 được xem là mục tiêu tiềm năng trong điều trị bệnh Alzheimer vì enzym này phân bố chủ yếu ở các vùng não liên quan đến nhận thức như vỏ não, hồi hải mã, đồng thời PDE9 có tính đặc hiệu và ái lực cao nhất với cGMP so với các họ PDE khác [11], [35], [64]. Bằng chứng tiền lâm sàng cho thấy ức chế PDE9 giúp cải thiện trí nhớ trong nhiều mô hình trên động vật của bệnh Alzheimer [35], [38]. Hiện nay nhiều công ty dược phẩm lớn như Pfizer, Bayer, Boehringer, Eisai,...đang nghiên cứu 2 các chất ức chế PDE9 để điều trị Alzheimer, hai chất đang được nghiên cứu ở pha I: PF-04447943 (IC50 = 0,8 nM, công ty Pfizer), E-2027 (IC50 = 3,5 nM, công ty Eisai), và một chất đang được nghiên cứu ở pha II: BI-409306 (IC50 = 52 nM, công ty Boehringer) [79]. Đã 20 năm kể từ khi nhóm thuốc ức chế cholinesterase gồm galantamin, donepezil và rivastigmin được chấp thuận để điều trị Alzheimer, từ đó đến nay vẫn chưa có thuốc mới điều trị Alzheimer được chấp thuận. Do đó cần nhanh chóng tìm ra các thuốc mới để điều trị hoặc làm chậm sự tiến triển của bệnh. Việc triển khai các thử nghiệm in vitro trên hàng triệu chất để xác định hiệu quả trị liệu là rất cần thiết nhưng đòi hỏi chi phí rất lớn và thời gian rất dài. Hiện nay việc áp dụng kỹ thuật sàng lọc ảo để giúp đánh giá nhanh chóng một tập hợp lớn các chất bằng phần mềm thông minh trên máy vi tính, nhằm rút ngắn thời gian, giảm chi phí và có thể ứng dụng để chọn lọc các chất chuyên biệt đã trở nên phổ biến [62]. Vì vậy, việc xây dựng các mô hình in silico để sàng lọc các chất có hoạt tính ức chế PDE9 là cần thiết, từ đó định hướng cho việc thiết kế và tổng hợp các thuốc điều trị Alzheimer thế hệ mới trong tương lai. Mục tiêu chung: - Sàng lọc các chất có khả năng ức chế PDE9 có tiềm năng ứng dụng điều trị bệnh Alzheimer bằng các phương pháp dược tin học. Mục tiêu cụ thể: - Xây dựng cơ sở dữ liệu các chất ức chế PDE9 và thu thập giá trị IC50 của các chất đó. - Xây dựng mô hình 2D-QSAR giúp dự đoán hoạt tính ức chế PDE9 của các chất. - Xây dựng mô hình 3D-pharmacophore giúp sàng lọc các chất có khả năng ức chế PDE9. - Xây dựng mô hình mô tả phân tử docking giúp đánh giá khả năng gắn kết của các chất. - Sàng lọc ảo các chất có khả năng ức chế PDE9 trên dữ liệu lớn các chất thông qua ba mô hình trên. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. PHOSPHODIESTERASE 9 Phosphodiesterase hay Phosphodiesterase nucleotid vòng là một siêu họ enzym thủy phân liên kết este của cAMP và cGMP phụ thuộc ion kẽm và magne, quá trình thủy phân tạo thành hợp chất 5’-AMP và 5’-GMP tương ứng, dẫn đến gián đoạn tín hiệu tế bào [55], [63]. Phản ứng thủy phân cAMP, cGMP, và con đường dẫn truyền tín hiệu trong tế bào thông qua tín hiệu thứ hai cAMP và cGMP được trình bày trong Hình 1.1 và Hình 1.2. Hình 1.1. Phản ứng thủy phân cAMP và cGMP nhờ phosphodiesterase [63]. Hình 1.2. Con đường dẫn truyền tín hiệu trong tế bào thông qua tín hiệu thứ hai cAMP và cGMP [55]. 4 1.1.1. Cấu trúc của PDE9 Hiện nay, họ PDE9 chỉ có 1 gen pde9A mã hóa, nên PDE9 còn có tên khác là PDE9A [18]. PDE9 là phosphodiesterase đặc hiệu và có ái lực cao với cGMP hơn so với bất kỳ PDE khác, cụ thể giá trị Km và Vmax của PDE9 đối với cGMP lần lượt là 139 ± 19 nM và 1,53 ± 0,24 µM.phút-1.mg-1, đối với cAMP lần lượt là 181 ± 17 µM và 0,08 ± 0,015 µM.phút-1.mg-1 [55]. Hiện nay PDE9 có 20 biến thể do quá trình cắt-nối có lựa chọn ở đầu N [55]. Cấu trúc của PDE9 gồm 3 vùng: vùng cắt-nối ở đầu N, vùng xúc tác bảo tồn (conserve) ở đầu C và vùng điều hòa nằm giữa vùng đầu N và đầu C [55]. Vùng xúc tác bảo tồn ở đầu C chứa 16 chuỗi xoắn alpha từ acid amin 181 đến 506 (Hình 1.3), chia làm 3 vùng nhỏ là vùng cuộn vòng (cyclin-fold) đầu N, vùng liên kết và vùng xoắn ốc đầu C [55]. Khoang gắn kết của thụ thể với phối tử (chất nền hoặc chất ức chế) ở giao diện của 3 vùng này, khoang gắn kết gồm 4 phần: (i) phần liên kết với kim loại, (ii) túi chính, (iii) túi kỵ nước và (iv) vùng nắp (Hình 1.4) [55]. Ion kẽm (Zn2+) và ion magne (Mg2+) hiện diện ở phần liên kết với ion kim loại và tham gia vào tương tác với phối tử và với một vùng giàu histidin ở khoang gắn kết [55]. Túi kỵ nước thành phần chính là TRP416, LEU420, LEU421, PHE251 và VAL417 [55]. Túi chính chứa GLN453 góp phần vào tính chọn lọc các phối tử nhờ hai liên kết hydro [55]. Cấu trúc của phức hợp giữa PDE9 và IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthin, IC50 > 200 µM) cho thấy vùng điều hòa đầu N không ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym (Hình 1.3) [55]. Hình 1.3. Cấu trúc 16 chuỗi xoắn alpha của vùng xúc tác của PDE9 [25]. 5 Hình 1.4. Bề mặt khoang gắn kết của PDE9 [55]. 1.1.2. Cơ chế xúc tác của PDE9 Sử dụng phương pháp bẫy đông tinh thể (crystallographic freeze-trapping) đã xác định được cơ chế phản ứng enzym của quá trình thủy phân cGMP nhờ PDE9 [55]. Khoang gắn kết của PDE9 chứa 2 cation kim loại M1 và M2 (Mn2+ - Mn2+ hoặc Mn2+ - Mg2+ hoặc Mg2+ - Mg2+ hoặc Mg2+ - Zn2+), và 6 phân tử H2O W0, W1, W2, W3, W4 và W5 [55]. Khi chưa có phối tử, các ion kim loại hình thành liên kết phối trí với một số acid amin và các phân tử nước [55]. M1 tạo 4 liên kết phối trí với ASP293, ASP402, HIS292 và HIS256 của khoang gắn kết và 2 liên kết phối trí với 2 phân tử nước W0 và W1 [55]. W1 chiếm một phần trong khoang gắn kết [55]. M2 tạo 1 liên kết phối trí với ASP293 và 5 liên kết phối trí với 5 phân tử nước W0, W2, W3, W4 và W5 (Hình 1.5 (A)) [55]. Khi cGMP gắn kết vào khoang gắn kết, W1 và W2 bị thay thế và các nhóm phosphat trục và xích đạo của cGMP sẽ hình thành các liên kết phối trí với M1 và M2 tương ứng. Kết quả của quá trình này hình thành phức hợp ES (Hình 1.5 (B)) [55]. W0 đóng vai trò như 1 tác nhân ái nhân giúp tách phân tử nước của cGMP để tạo thành 5’-GMP, đây là giai đoạn giới hạn tốc độ phản ứng trong đó ion kim loại hoạt động như một acid lewis đóng vai trò xúc tác phản ứng thủy phân [55]. HIS252 hoạt động như một acid thông thường [55]. Tính đặc hiệu của PDE9 với cGMP có thể do sự hình thành liên kết hydro giữa nhóm guanin của phối tử với GLN453, trong đó GLN453 được định hướng bất biến nhờ tương tác giữa nguyên tử 6 Nε của GLN453 và nguyên tử Oε của GLU406 [55]. Hình 1.5 thể hiện cơ chế xúc tác của PDE9 trong phản ứng cắt liên kết phosphodieste vòng của cGMP với sự tham gia của các ion kim loại [40]. Hình 1.5. Cơ chế xúc tác của PDE9 trong phản ứng thủy phân cGMP [40]. (A) Khoang gắn kết có 2 ion kim loại M1 và M2 khi chưa có phối tử; (B) Chất nền cGMP tương tác với khoang gắn kết của PDE9 dẫn đến hình thành phức hợp ES; (C) Chuyển đổi từ phức hợp ES thành phức hợp EP sau khi cắt đứt liên kết 3’-5’, trong đó 5’-GMP vẫn còn tương tác với khoang gắn kết của PDE9; (D) Một phần tương tác của 5’-GMP trong khoang gắn kết của PDE9. 1.1.3. Sự phân bố của PDE9 trong cơ thể Ở động vật có vú, PDE9 phân bố khắp các mô ngoại trừ máu, nhưng tập trung nhiều nhất là ở não, lá lách, ruột non và thận. Trong não, PDE9 là phosphodiesterase hiện diện nhiều nhất, phân bố ở các vùng não liên quan đến nhận thức như vỏ não, hồi hải mã [35] và gần như tất cả các con đường tín hiệu tế bào đều đi qua cGMP. Sự điều tiết quá trình tổng hợp và phân hủy của cGMP có sự khác biệt ở các vùng não khác nhau, tùy thuộc vào trạng thái sinh lý và bệnh lý. Tín hiệu cGMP là quan trọng đối với nhiều chức năng của não, như tính mềm dẻo của synap, dẫn truyền hình ảnh, học