Tài liệu Phân lập và xây dựng phương pháp định lượng flavonolignan trong dược liệu và chế phẩm từ cúc gai (silybum marianum (l.) gaertn.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ----------------- LA HOÀNG ANH PHÂN LẬP VÀ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOLIGNAN TRONG DƯỢC LIỆU VÀ CHẾ PHẨM TỪ CÚC GAI (SILYBUM MARIANUM (L.) GAERTN.) LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ----------------- LA HOÀNG ANH PHÂN LẬP VÀ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOLIGNAN TRONG DƯỢC LIỆU VÀ CHẾ PHẨM TỪ CÚC GAI (SILYBUM MARIANUM (L.) GAERTN.) Ngành: Kiểm nghiệm thuốc – độc chất Mã số: 8720210 LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGÔ THỊ THANH DIỆP Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 . i LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. La Hoàng Anh . ii Luận văn thạc sỹ dược học. Khóa 2016 – 2018 Ngành: Kiểm nghiệm thuốc & độc chất – Mã số: 8720210 PHÂN LẬP VÀ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOLIGNAN TRONG DƯỢC LIỆU VÀ CHẾ PHẨM TỪ CÚC GAI (SILYBUM MARIANUM (L.) GAERTN.) Học viên: La Hoàng Anh NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGÔ THỊ THANH DIỆP Từ khóa: HPLC, Cúc gai, Silymarin, Silybin, Silychristin. Mở đầu: Cúc gai là một loại dược liệu có nguồn gốc từ Địa Trung Hải, được di thực vào nước ta trồng và phát triển tốt ở nơi có khí hậu mát mẻ như Sapa, Lào Cai, Tam Đảo. Thành phần hóa học của Cúc gai chứa flavonolignan, đặc biệt là silymarin, đã được chứng minh có tác dụng tốt trong điều trị bệnh gan trên in vitro và in vivo. Các loại thuốc và thực phẩm chức năng từ Cúc gai đã bắt đầu xuất hiện trên thị trường. Việc tiêu chuẩn hóa dược liệu Cúc gai tạo nguồn nguyên liệu cho sản xuất các chế phẩm thuốc điều trị bệnh gan thận, đồng thời kiểm tra chất lượng các chế phẩm có nguồn gốc từ Cúc gai đang lưu hành trên thị trường là một vấn đề đang được quan tâm hiện nay. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Đối tượng: Hạt của cây Cúc gai Silybum marianum (L.) Gaertn được thu mua năm 2017 của hãng Starwest Botanicals (nguồn gốc: Croatia). Hạt được sấy khô, xay thành bột thô. Phương pháp nghiên cứu: Dùng phương pháp đun hồi lưu với sinh hàn, hạt Cúc gai được loại hết dầu béo với petroleum ether, sau đó được chiết kiệt với methanol, đuổi hết methanol. Cắn thu được đem phân lập thành các chất tinh khiết bằng sắc ký cột và HPLC điều chế. Cấu trúc được xác định dựa vào dữ liệu phổ UV, IR, MS và NMR. Định lượng silybin trong hạt Cúc gai và chế phẩm từ Cúc gai trên máy HPLC Waters Alliance e2695, đầu dò PDA Waters 2998 với cột Knauer C18 (5 µm, 250 mm × 4,6 mm). Kết quả: Từ 400g hạt Cúc gai, sau khi đã loại dầu béo còn 260g, chiết với methanol nóng rồi rửa cắn bằng cloroform thu được 31g cắn. Sử dụng 15g cắn để phân lập được hợp chất là Silybin là hỗn hợp của Silybin A, Silybin B, Isosilybin A, Isosilybin B (SA: 52mg) và Silychristin (NS: 19mg). Định lượng silybin trong hạt Cúc gai và chế phẩm từ Cúc gai bằng máy HPLC. Kết quả cho thấy hàm lượng silybin trong hạt Cúc gai khoảng 1,79 mg/g và trong chế phẩm đạt khoảng 49 mg/viên (FY) và 41 mg/viên (ZE). Kết luận: Những kết quả này là tiền đề cho những nghiên cứu về kiểm nghiệm dược liệu Cúc gai cũng như tác dụng dược lý sau này. . iii Master’s thesis of Pharmacy. Academic course: 2016 – 2018 Major: Drug quality control & Toxicology – Speciality code: 8720210 ISOLATION AND DEVELOPMENT OF QUANTITATIVE PROCEDURE FOR FLAVONOLIGNAN IN (MATERIALS AND PRODUCTS OF) SILYBUM MARIANUM (L.) La Hoang Anh Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Ngo Thi Thanh Diep Keywords: HPLC, Silybum marianum (L.), Silymarin, Silybin, Silychristin. Introduction: Silybum marianum (L.) is a medicinal herbs originating from the Mediterranean, have planted in Vietnam and grown well in cool weather such as Sapa, Lao Cao, Tam Dao. The chemical composition in Silybum marianum (L.) includes flavonolignan, especially silymarin, has been verified to be effective in treating liver disease in vitro and in vivo. Drugs and dietary supplements from Silybum marianum (L.) have sold in pharmacies. Standardization of Silybum marianum to produce raw materials for production for treatment of liver or kidney disease, and controlling the quality of products from Silybum marianum (L.). Materials and Methods Materials: Seeds of Silybum marianum (L.) were purchased in 2017, Starwest Botanicals branch (origin: Croatia). Seeds are dried, milled into raw powder. Methods of study: Using reflux heating method, seeds of Silybum marianum (L.) was defatted with petroleum ether, then extracted with methanol and removed methanol. This extract was isolated to pure compounds by column chromatography techniques and preparative HPLC. Structures of isolated compounds were determined by UV, IR, MS and NMR data. Quantification in seeds of Silybum marianum (L.) and product from Silybum marianum (L.) was performed on the HPLC Waters Alliance e2695, detector PDA Waters 2998, column Knauer C18 (5 µm, 250 mm × 4,6 mm). Results: Defatted 400 g seeds of Silybum marianum (L.) to 260 g, extracted with methanol, rinsed extract with cloroform, got 31 g. Using 15 g, 2 compounds were isolated as Silybin, includes Silybin A, Silybin B, Isosilybin A, Isosilybin B (SA: 52 mg) and pure Silychristin (NS: 19 mg). Quantification in seeds of Silybum marianum (L.) and product from Silybum marianum (L.) was performed on the HPLC. The results showed that the content of Silybin in seeds of Silybum marianum (L.) were 1,79 mg/g and in product were 49 mg/tablet (FY); 41 mg/hard capsule (ZE) respectively. Conclusion: These results are the first step for further studies on quality control in Silybum marianum (L.) as well as its pharmacological effects in the future. . iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................. i MỤC LỤC ....................................................................................................................... iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................. vi DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ .......................................................... ix ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC............................................................. 3 1.1.1. Tên gọi ......................................................................................................... 3 1.1.2. Mô tả thực vật .............................................................................................. 3 1.1.3. Sinh thái và phân bố .................................................................................... 4 1.1.4. Bộ phận dùng ............................................................................................... 5 1.1.5. Hạt Cúc gai .................................................................................................. 5 1.2. TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC ............................................. 6 1.3. TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM HẠT CÚC GAI TRONG DƯỢC ĐIỂN VIỆT NAM V ................................................................................................ 10 1.4. TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC ................................................... 14 1.5. TỔNG QUAN VỀ SILYMARIN – SILYBIN - SILYCHRISTIN................. 16 1.6. MỘT SỐ CHẾ PHẨM TỪ CÚC GAI TRÊN THỊ TRƯỜNG ...................... 19 1.7. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SILYMARIN ... 21 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 24 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ....................................................................... 24 2.1.1. Nguyên vật liệu .......................................................................................... 24 2.1.2. Dung môi hóa chất, chất chuẩn.................................................................. 25 2.1.3. Trang thiết bị .............................................................................................. 25 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................. 26 2.2.1. Chiết xuất ................................................................................................... 26 . v 2.2.2. Phân lập và tinh chế ................................................................................... 27 2.2.3. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được ................................... 29 2.2.4. Xây dựng quy trình định lượng Silybin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao .......................................................................................................... 31 2.2.5. Đánh giá quy trình định lượng Silybin trong hạt Cúc gai và chế phẩm .... 36 2.2.6. Ứng dụng quy trình định lượng Silybin để định lượng hàm lượng Silybin trong hạt Cúc gai và chế phẩm. .............................................................................. 42 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................. 43 3.1. CHIẾT XUẤT ................................................................................................. 43 3.2. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ .......................................................................... 43 3.2.1. Tách các phân đoạn bằng sắc ký cột cổ điển (SKC) ................................. 43 3.2.2. Tinh chế ..................................................................................................... 45 3.2.3. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được.................................... 48 3.3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG SILYBIN TRONG DƯỢC LIỆU VÀ CHẾ PHẨM CÚC GAI BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC ................... 62 3.3.1. Khảo sát điều kiện HPLC .......................................................................... 62 3.3.2. Qui trình định lượng Silybin trong hạt Cúc gai ......................................... 62 3.3.3. Đánh giá quy trình định lượng Silybin ...................................................... 63 3.3.4. Ứng dụng quy trình định lượng Silybin ....................................................... 75 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ........................................................................................ 75 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC . vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Từ nguyên Ý nghĩa Trung bình X ACN Acetonitril AR Analytical Reagent Hóa chất phân tích Hệ số bất đối As AU Area under CCl4 Tetracloromethan CHCl3 Cloroform d Doublet Đỉnh đôi* Distortionless DEPT Enhancement by Polarization Transfer* DMSO Dimethyl sulfoxid EA Ethyl Acetat F Trắc nghiệm Fisher H2 O Nước H2 O2 Hydroxy H3PO4 Acid phosphoric peroxyd High Performance HPLC Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao IR Chromatography InfraRed Hồng ngoại J Hằng số ghép* k Hệ số dung lượng LC/MS Sắc kí lỏng đầu dò khối phổ LD50 Liều gây chết 50 % vật thử nghiệm MeOH Methanol MHz Mega Hertz* MS Mass Spectroscopy . Khối phổ vii N Số đĩa lý thuyết n Cỡ mẫu NMR Nuclear Magnetic Cộng hưởng từ hạt nhân* PDA Photodiode array Resonance Dãy diod quang Rf Hệ số lưu Rs Độ phân giải RSD Độ lệch chuẩn tương đối s second giây s Singlet Đỉnh đơn* SD Độ lệch chuẩn SKC Sắc ký cột cổ điển SKLM Sắc ký lớp mỏng Spic TLC STT Diện tích pic t Trắc nghiệm Student TB Trung bình TLTK Tài liệu tham khảo Số thứ tự TMS Trimethylsiloxan TP Toàn phần tR Thời gian lưu UV Ultraviolet Tử ngoại Viện kiểm nghiệm VKN VS Vanillin sulfuric α Độ chọn lọc Δ Chemical shift *: Được sử dụng trong phổ NMR . Độ chuyển dịch hóa học* viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần và tác dụng của một số chế phẩm từ Cúc gai ............................ 19 Bảng 2.1. Khảo sát các hệ dung môi pha động để chọn hệ thích hợp chạy HPLC ....... 33 Bảng 3.1. Kết quả tách các phân đoạn từ cắn toàn phần bằng SKC ............................. 45 Bảng 3.2. Kết quả tính % diện tích pic của 4 pic hỗn hợp SA bằng HPLC .................... 53 Bảng 3.3. Kết quả tính % diện tích pic của 2 pic hỗn hợp chuẩn Silybin VKN bằng HPLC .............................................................................................................................. 55 Bảng 3.4. Kết quả tính % diện tích pic của NS ............................................................... 56 Bảng 3.5. Bảng so sánh dữ liệu phổ 13C (125 MHz) và phổ 1H (500 MHz) của NS so với Silychristin........................................................................................................... 59 Bảng 3.6. Thời gian lưu của các pic chính trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn, mẫu thử hạt Cúc gai, mẫu thử chế phẩm. ..................................................................................... 65 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên mẫu chuẩn và mẫu hạt Cúc gai, mẫu chế phẩm.......................................................................................................... 68 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên mẫu chế phẩm ........................ 69 Bảng 3.9. Kết quả thẩm định độ lặp lại của quy trình định lượng Silybin trong mẫu thử hạt Cúc gai. .............................................................................................................. 70 Bảng 3.10. Kết quả thẩm định độ lặp lại của quy trình định lượng Silybin trong mẫu thử chế phẩm. ................................................................................................................. 70 Bảng 3.11. Kết quả thẩm định độ chính xác trung gian của quy trình định lượng Silybin trong mẫu thử hạt Cúc gai. ................................................................................ 71 Bảng 3.12. Kết quả thẩm định độ chính xác trung gian của quy trình định lượng Silybin trong mẫu thử chế phẩm .................................................................................... 72 Bảng 3.13. Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình định lượng Silybin trong hạt Cúc gai. .......................................................................................................................... 73 Bảng 3.14. Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình định lượng Silybin trong chế phẩm. .............................................................................................................................. 74 Bảng 3.15. Kết quả định lượng Silybin trong 3 mẫu. .................................................... 75 . ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Một số hình ảnh cây Cúc gai (Silybum marianum (L.) Gaertn) ...................... 3 Hình 1.2. Vị trí Cúc gai trong hệ thống phân loại thực vật ............................................ 4 Hình 1.3. Hình thái hạt Cúc gai ....................................................................................... 5 Hình 1.4. Đặc điểm vi học hạt Cúc gai ........................................................................... 6 Hình 1.5. Cấu trúc hóa học 4 đồng phân của Silybin ...................................................... 8 Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của Silychristin và Silydianin ............................................. 9 Hình 1.7. Một số chế phẩm trên thị trường ................................................................... 20 Hình 3.1. Kết quả thăm dò pha động hệ 4 ..................................................................... 43 Hình 3.2. Sắc ký đồ các phân đoạn chứa SA ................................................................ 46 Hình 3.3. Sắc ký đồ các phân đoạn chứa hợp chất NS .................................................. 47 Hình 3.4. Sắc ký đồ khảo sát tách NS trong phân đoạn XIII bằng HPLC phân tích .... 47 Hình 3.5. Sắc ký đồ toàn phân đoạn đem tách lấy NS trên máy HPLC điều chế ......... 48 Hình 3.6. Sắc ký lớp mỏng SA trên 3 hệ dung môi ...................................................... 49 Hình 3.7. Sắc ký lớp mỏng NS trên 3 hệ dung môi ...................................................... 49 Hình 3.8. Sắc ký đồ (HPLC) của SA ............................................................................ 51 Hình 3.9. Phổ hấp thu UV của các pic hỗn hợp SA .................................................. 51 Hình 3.10. Phổ 3D của SA ........................................................................................... 52 Hình 3.11. Độ tinh khiết của các pic hỗn hợp SA ......................................................... 52 Hình 3.12. Sắc ký đồ (HPLC) của chuẩn VKN ............................................................ 53 Hình 3.13. Phổ hấp thu UV của chuẩn VKN ............................................................. 54 Hình 3.14. Phổ 3D của chuẩn VKN ............................................................................ 54 Hình 3.15. Sắc ký đồ (HPLC) của NS .......................................................................... 55 Hình 3.16. Phổ hấp thu UV của NS ............................................................................ 55 Hình 3.17. Phổ 3D của chuẩn VKN ............................................................................. 56 Hình 3.18. Độ tinh khiết của NS ................................................................................... 56 Hình 3.19. Phổ IR của Silybin chuẩn ............................................................................ 57 Hình 3.20. Phổ IR của SA ............................................................................................. 57 Hình 3.21. Phổ IR của NS ............................................................................................. 58 . x Hình 3.22. Phổ MS (ES+) của NS.................................................................................. 58 Hình 3.23. Bảng kết quả tính số khối của NS trên máy đo MS .................................... 59 Hình 3.24. Cấu trúc hóa học của Silychristin (NS) ....................................................... 61 Hình 3.25. Tương quan giữa nồng độ và diện tích pic Silybin .................................... 64 Hình 3.26. Sắc ký đồ thẩm định tính đặc hiệu .............................................................. 65 Hình 3.27. Phổ UV của các pic trên sắc ký đồ mẫu thử hạt Cúc gai và mẫu thử chế phẩm có thời gian lưu tương ứng với các pic Silybin trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn. .. 66 Hình 3.28. Độ tinh khiết pic của các pic trên sắc ký đồ mẫu thử hạt Cúc gai và mẫu thử chế phẩm có thời gian lưu tương ứng với các pic Silybin trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn. ............................................................................................................................. 67 Sơ đồ 2.1. Sơ đồ chiết xuất dược liệu hạt Cúc gai ...................................................... 27 Sơ đồ 2.2. Sơ đồ chiết đề nghị mẫu thử Cúc gai ........................................................... 32 . 1 Luận văn thạc sỹ dược học La Hoàng Anh ĐẶT VẤN ĐỀ Từ thời xa xưa con người đã biết dựa vào thiên nhiên để tồn tại và phát triển, trong đó có việc bảo vệ sức khỏe. Tổ tiên của chúng ta đã biết sử dụng những loại cây cỏ có sẵn trong tự nhiên để chống lại bệnh tật. Những thế kỷ gần đây, các nhà khoa học đã và đang tập trung vào nghiên cứu các loại dược liệu để tìm ra thêm chứng cứ khoa học, đồng thời tìm phương pháp sử dụng mới hoặc kết hợp Đông - Tây y mang lại hiệu quả điều trị tốt hơn. Trong cơ thể, gan đóng vai trò là bộ máy chuyển hóa các chất. Một trong những chức năng chính của gan là tham gia quá trình giải độc các chất nội sinh cũng như ngoại sinh. Trong trường hợp bệnh lý hoặc quá tải chất độc trong gan, các tế bào gan bị hủy hoại làm tổn thương gan, dần dần tổn thương không hồi phục dẫn đến xơ gan, ung thư gan. Bệnh gan chiếm một tỉ lệ lớn trong cộng đồng, trong đó viêm gan siêu vi là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ biến nhất thế giới. Khoảng 2 tỷ người trên thế giới đã hoặc đang nhiễm virus viêm gan B, tập trung ở châu Á và châu Phi. Theo Tổ chức Y tế thế giới, viêm gan B là một trong 10 nguyên nhân gây tử vong hàng đầu. Việt Nam là một trong những nước có tỉ lệ nhiễm viêm gan B cao. Người bị viêm gan mãn tính có nguy cơ ung thư gan cao gấp 20 lần so với người bình thường và 40 % trong số đó tử vong vì ung thư gan [27]. Cúc gai là một loại dược liệu có nguồn gốc từ Địa Trung Hải, được di thực vào nước ta trồng và phát triển tốt ở nơi có khí hậu mát mẻ như Sapa, Lào Cai, Tam Đảo. Thành phần hóa học của Cúc gai chứa flavonolignan, đặc biệt là silymarin, đã được chứng minh có tác dụng tốt trong điều trị bệnh gan trên in vitro và in vivo [3]. Cúc gai được sử dụng rộng rãi như một phương thuốc dân gian điều trị các bệnh hiểm nghèo về gan, thận hiện đang phổ biến ở nước ta. Bên cạnh đó, các loại thực phẩm chức năng từ Cúc gai đã bắt đầu xuất hiện trên thị trường với tác dụng hỗ trợ điều trị trong các trường hợp bệnh về gan như xơ gan, viêm gan siêu vi,…[4]. Việc tiêu chuẩn hóa dược liệu Cúc gai tạo nguồn nguyên liệu cho sản xuất các chế phẩm thuốc điều trị bệnh gan thận, đồng thời kiểm tra chất lượng các chế phẩm có nguồn . 2 Luận văn thạc sỹ dược học La Hoàng Anh gốc từ Cúc gai đang lưu hành trên thị trường, góp phần nâng cao sức khỏe người dân là một vấn đề đang được quan tâm và rất cấp thiết hiện nay. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và xây dựng phương pháp định lượng flavonolignan trong dược liệu và chế phẩm từ Cúc gai” với các mục tiêu như sau: 1. Phân lập, xác định cấu trúc một đến hai flavonolignan từ hạt Cúc gai. 2. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng các flavonolignan phân lập được trong dược liệu (hạt Cúc gai). 3. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng các flavonolignan phân lập được trong chế phẩm từ Cúc gai. 4. Áp dụng quy trình đã xây dựng và thẩm định để xác định hàm lượng flavonolignan trong dược liệu và chế phẩm từ Cúc gai trên thị trường. . 3 Luận văn thạc sỹ dược học CHƯƠNG 1. La Hoàng Anh TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.1.1. Tên gọi Tên khoa học: Silybum marianum (L.) Gaertn, Asteraceae. Tên đồng nghĩa: Carduus marianus L. Tên gọi khác: kế thánh, kế sữa, kế đức mẹ. Hình 1.1. Một số hình ảnh cây Cúc gai (Silybum marianum (L.) Gaertn) 1.1.2. Mô tả thực vật Cây thảo hai năm cao 30-150 cm, có thân thẳng và phân nhánh, có rễ trụ, to, dài và dày. Lá xanh, không có lá kèm, bóng loáng, thường có nhiều đốm trắng dọc theo các gân, mép có răng dạng gai mà gai lại có màu vàng và rất nhọn; các lá phía trên và ở giữa ôm lấy thân; các lá ở dưới rất to, có phiến chia thùy và có cuống. Cụm hoa đầu đơn độc rộng 3-8 cm. Lá bắc ngoài và giữa có một phần phụ hình tam giác màu lục thu lại thành một gai to, ở gốc có 4-6 gai nhỏ ngắn hơn ở mỗi bên. Hoa tía hơi giống nhau, đều có 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu một ô với 2 lá noãn và 2 vòi nhụy phình ở gốc [6]. . 4 Luận văn thạc sỹ dược học La Hoàng Anh Giới Thực vật Ngành Ngọc lan Lớp Ngọc lan Bộ Cúc Họ Cúc Chi Silybum Loài S.marianum Hình 1.2. Vị trí Cúc gai trong hệ thống phân loại thực vật [5]. 1.1.3. Sinh thái và phân bố Chi Silybum Adans trên thế giới chỉ có 2 loài S.marianum (L.) Gaertn. và S.eburneum Coss. et Durr. Loài S.marianum được Viện Dược liệu nhập hạt giống từ Hungary vào cuối những năm 70 của thế kỷ trước. Cúc gai vốn có nguồn gốc ở vùng Địa Trung Hải của châu Âu, sau cây phát tán tự nhiên và được trồng ở cả vùng Nam Âu, Bắc Phi, Trung Đông và cả ở Bắc Mỹ [4]. Ở Việt Nam, Cúc gai được trồng chủ yếu ở Hà Nội và Lào Cai. Cúc gai thuộc loại cây thân thảo sống 1-2 năm. Cây ưa sáng, ưa ẩm và sinh trưởng phát triển tốt ở vùng núi có khí hậu mát mẻ quanh năm. . 5 Luận văn thạc sỹ dược học La Hoàng Anh 1.1.4. Bộ phận dùng Toàn cây hoặc quả - Herba seu Fructus Silybi. Thu hái cây và các cụm hoa rồi phơi khô, khi cần đập lấy quả [7]. 1.1.5. Hạt Cúc gai Đặc điểm hình thái Hạt chắc, dài, hình oval, dài khoảng 6-8 mm, rộng 3 mm, dày 1,5 mm, bề mặt nhẵn và sáng bóng với màu xám hoặc màu nâu nhạt biến đổi dần thành những đường sọc màu nâu đậm theo chiều dọc, nhìn tổng thể có màu xám nhạt hoặc màu nâu. Hạt thuôn hơn ở đáy, đỉnh có phần mở rộng hơn màu vàng nhạt, và phần này dài khoảng 1 mm. Cắt ngang thấy phần viền hẹp, màu nâu, 2 lá mầm lớn, dày và có dầu màu trắng [8]. Hình 1.3. Hình thái hạt Cúc gai Đặc điểm vi học Xay dược liệu thành bột, bột có màu vàng nâu xen kẽ những đốm đậm. Quan sát dưới kính hiển vi bằng dung dịch cloral hydrat thấy các mảnh vỡ của màng vỏ quả ngoài gồm các tế bào không màu, hình đa giác, tùy theo hướng quan sát thấy một khoang ở giữa khá lớn hoặc như một khe nhỏ; có một số tế bào nhu mô có màu đỏ tươi [8]. . 6 Luận văn thạc sỹ dược học (a) La Hoàng Anh (b) (c) (d) Hình 1.4. Đặc điểm vi học hạt Cúc gai [21]. (a) Lớp vỏ quả ngoài với các tế bào vách của ngoại bì, lớp màu đỏ bên dưới, trung bì, nội bì và các cương bào của vỏ hạt (b) Tế bào vách ngoại bì, lớp màu đỏ bên dưới và trung bì (c) Cương bào của lớp vỏ hạt (d) Lớp màng đơn của nội nhũ với những giọt dầu trên bề mặt và mô của các lá mầm bên dưới 1.2. TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC Đã xác định sự có mặt của 89 chất hữu cơ và 23 nguyên tố vi lượng trong loài S.marianum. Các nhóm hợp chất tự nhiên có trong Cúc gai bao gồm dầu béo, . 7 Luận văn thạc sỹ dược học La Hoàng Anh flavonolignan, flavonoid, phytosterol, polyacetylen triterpenoid, lignan, tannin, acid amin và một số chất khác. Cho đến nay đã phân lập và xác định cấu trúc được 16 flavonolignan thuộc 3 nhóm đồng phân, trong đó có 4 cặp đồng phân lập thể. Các chất này là đặc trưng hóa học của chi. Flavonolignan chính trong Cúc gai là Silymarin (1-4 % thành phần quả khô). Silymarin là một hỗn hợp ít nhất 3 flavonolignan polyphenol gồm Silybin (Silybinin), Silydianin và Silychristin. Silybin là chất đầu tiên được biết có kiểu cấu trúc kết hợp bởi Taxifolin và alcol coniferylic và nhóm chất mới này được gọi là nhóm flavonolignan. . 8 Luận văn thạc sỹ dược học La Hoàng Anh Hình 1.5. Cấu trúc hóa học 4 đồng phân của Silybin Việc xác định cấu trúc không gian của Silybin là một quá trình lâu dài và khó khăn. Arnone và cộng sự (1979) đã chứng minh Silybin là một hỗn hợp 2 đồng phân lập thể với tỉ lệ 1 : 1 do quan sát thấy tín hiệu cộng hưởng từ của H-7’ và nhóm methoxy bị chia thành 2 nhóm pic có cùng cường độ khi đo phổ trong benzen-d. Sau đó có 2 nhóm nghiên cứu là Kim Nam Cheol và cộng sự (2003) và Lee D.Y.W và cộng sự (2003) đã thành công trong việc tách riêng chúng nhờ HPLC pha đảo điều chế và xác định cấu trúc lập thể của chúng là Silybin A và Silybin B. Silydianin được B. Janiak và cộng sự phân lập lần đầu tiên vào năm 1960. Chất này cũng là một flavonolignan và là đồng phân của Silybin. Hai chất này khác nhau ở cách liên kết của Taxifolin với alcol coniferylic. Cùng với Silybin và Silydianin, một flavonolignan khác là Silychristin cũng được Wagner H. và cộng sự phân lập và xác định cấu trúc năm 1971. Đến năm 1976, chính Wagner đã khẳng định cấu trúc. Nhưng đến năm 1982 Zanarotti A đã xác định cấu hình ở các vị trí α và β của vòng dihydrofuran được xác định là αR và βS. Gần đây Smith và cộng sự (2005) đã phân lập và xác định cấu trúc được thêm 1 đồng phân lập thể của Silychristin và đặt tên là Silychristin B. .