Tài liệu Phân lập và giám định một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn escherichia coli và salmonella spp. tại phòng thí nghiệm của công ty cp thuốc thú y marphavet

TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA NÔNG - LÂM - NGƢ ĐỖ THỊ QUỲNH PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HÓA CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI VÀ SALMONELLA SPP. TẠI PHÒNG THÍ NGHIỆM CỦA CÔNG TY CP THUỐC THÚ Y MARPHAVET KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Thú Y PHÚ THỌ, 2018 i TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA NÔNG - LÂM - NGƢ ĐỖ THỊ QUỲNH PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HÓA CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI VÀ SALMONELLA SPP. TẠI PHÒNG THÍ NGHIỆM CỦA CÔNG TY CP THUỐC THÚ Y MARPHAVET KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành: Thú Y NGƢỜI HƢỚNG DẪN: TS. NGUYỄN THỊ QUYÊN Th.S NGUYỄN VĂN THĂNG PHÚ THỌ, 2018 i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, tôi luôn nhận đƣợc sự giúp đỡ của các Thầy cô và cán bộ công nhân viên tại cty cổ phần thuốc thú y Marphavet. Nhân dịp này, tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám đốc, phòng kiểm nghiệm thuốc thú y Marphavet, khoa Nông Lâm Ngƣ, trƣờng Đại học Hùng Vƣơng đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ngƣời hƣớng dẫn khóa luận của tôi là TS. Nguyễn Thị Quyên và GĐ Phòng kinh doanh cty cổ phần thuốc thú y Nanovet thuộc tập đoàn Đức Hạnh là Th.S Nguyễn Văn Thăng đã trực tiếp hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi luôn biết ơn gia đình, thầy cô và bạn bè học đã động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn./. Việt Trì, ngày 7 tháng 5 năm 2018 SINH VIÊN ĐÕ THỊ QUỲNH ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU BHI : Brain Heart Infusion CP : Cổ phần CFU : Colony Forming Unit Cs : Cộng sự DHL : Deoxycholate Hydrogen sulfide Lactose DNA : DeoxyriboNucleic Acid E. coli : Escherichia coli EMB : Eosin Methylene Blue ETEC : EnteroToxigenic E. coli LPS : LipoPolySaccharide PCR : Polymerase Chain Reaction RR : Relative Risk S. choleraesuis : Salmonella choleraesuis S. dublin : Salmonella dublin S. enteritidis : Salmonella enteritidis S. gallinarum : Salmonella gallinarum S. pullorum : Salmonella pullorum S. typhimurium : Salmonella typhimurium ST : Heat- stabile Toxin SS : Salmonella Shigella TSA : Tryptic Soya Agar iii MỤC LỤC TRANG BÌA PHỤ.................................................................................................i LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ............................................. iii MỤC LỤC ............................................................................................................ iv DANH MỤC BẢNG ........................................................................................... vii MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài .................................................................................... 1 2. Mục tiêu của nghiên cứu ................................................................................... 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn........................................................................... 2 3.1. Ý nghĩa khoa học............................................................................................ 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................................ 2 CHƢƠNG 1........................................................................................................... 3 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ............................................................. 3 1.1. Một số hiểu biết về vi khuẩn E. coli ............................................................... 3 1.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli ............... 3 1.1.2. Đặc tính nuôi cấy,sinh hóa của vi khuẩn E. coli ......................................... 5 1.1.3. Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E. coli....................................................... 6 1.1.4. Vai trò của vi khuẩn E. coli trong hội chứng tiêu chảy ............................ 10 1.1.5. Bệnh phù đầu lợn con do vi khuẩn E. coli ............................................... 12 1.2. Một số hiểu biết về vi khuẩn Salmonella ...................................................... 14 1.2.1. Đặc điểm hình thái .................................................................................... 14 1.2.2 Đặc tính nuôi cấy........................................................................................ 15 1.2.3. Đặc tính sinh hoá ...................................................................................... 15 1.2.4. Sức đề kháng của vi khuẩn Salmonella .................................................... 16 1.2.5. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella.......................................... 16 1.2.6. Bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn ............................................... 18 1.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc .................................................. 21 1.3.1. Tình hình nghiên cứu ở nƣớc ngoài .......................................................... 21 iv 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc .............................................................. 22 CHƢƠNG 2......................................................................................................... 24 ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................... 24 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu................................................................................... 24 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................ 24 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................. 24 2.2.2. Thời gian nghiên cứu ................................................................................ 24 2.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 24 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 24 2.4.1. Nguyên vật liệu dùng cho nghiên cứu....................................................... 24 2.4.2. Phƣơng pháp thu thập mẫu ........................................................................ 25 2.4.3. Phƣơng pháp xác định số lƣợng và giám định một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli.................................................................................................... 26 2.4.4. Phƣơng pháp xác định số lƣợng và giám định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Salmonella ............................................................................................ 28 2.4.5. Phƣơng pháp xác định Salmonella và E. coli bằng kỹ thuật PCR ............ 31 2.4.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu ......................................................................... 36 CHƢƠNG 3......................................................................................................... 37 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................................. 37 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm và mẫu phân ....................... 37 3.2. Kết quả xác định số lƣợng vi khuẩn E. coli và Salmonella spp. trong mẫu phân ..................................................................................................................... 38 3.3. Kết quả giám định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli ........................... 40 3.5. Kết quả giám định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Salmonella ................... 42 3.6. Kết quả phản ứng sinh hóa với chất chỉ thị màu Andrade ........................... 43 3.7. Kết quả phản ứng thử oxydaza ..................................................................... 44 3.8. Kết quả phản ứng thử Catalaza .................................................................... 45 3.9. Kết quả phản ứng PCR của vi khuẩn Salmonella ........................................ 45 3.10. Kết quả phản ứng PCR của vi khuẩn E. coli .............................................. 46 CHƢƠNG 4......................................................................................................... 48 v KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 48 4.1. Kết luận ........................................................................................................ 48 4.2. Đề nghị ......................................................................................................... 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 50 vi DANH MỤC BẢNG STT 1 2 3 4 5 6 Tên bảng Bảng 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn từ bệnh phẩm và phân lợn tiêu chảy Bảng 3.2. Kết quả xác định số lƣợng vi khuẩn E. coli và Salmonella trong mẫu phân Bảng 3.3. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hóa của các mẫu E. coli phân lập đƣợc từ phân của lợn bị tiêu chảy. Bảng 3.4. Kết quả xác định đặc tính lên men đƣờng của các chủng E. coli phân lập đƣợc Bảng 3.5. Kết quả giám định đặc tính sinh hóa của các mẫu Salmonella phân lập đƣợc ở phân lợn tiêu chảy Bảng 3.6. Kết quả phản ứng sinh hóa với chất chỉ thị màu Andrade mồi Stn-F/R Trang 37 39 41 42 43 44 7 Bảng 3.9. Kết quả phản ứng PCR của vi khuẩn Salmonella 46 8 Bảng 3.10. Kết quả phản ứng PCR của vi khuẩn E. coli 47 vii MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trong nhiều năm gần đây, cùng với sự phát triển của nền kinh tế, ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi lợn nói riêng của nƣớc ta đã có những bƣớc phát triển mạnh mẽ, trở thành ngành sản xuất quan trọng, chiếm tỷ trọng đáng kể trong xuất khẩu các sản phẩm chăn nuôi và góp phần xóa đói giảm nghèo. Theo Quyết định số 10/2008/QĐ-TTg ngày 16/01/2008 của Thủ tƣớng Chính phủ[8] về Chiến lƣợc phát triển chăn nuôi đến năm 2020 [1], mục tiêu của định hƣớng là: Phát triển nhanh quy mô đàn lợn ngoại theo hƣớng trang trại, công nghiệp ở nơi có điều kiện về đất đai, kiểm soát dịch bệnh và môi trƣờng; duy trì ở quy mô nhất định hình thức chăn nuôi lợn lai, lợn đặc sản phù hợp với điều kiện chăn nuôi của nông hộ và của một số vùng. Tỷ trọng chăn nuôi trong nông nghiệp đến năm 2020 đạt trên 42%, trong đó năm 2010 đạt khoảng 32% và năm 2015 đạt 38%; đảm bảo an toàn dịch bệnh và vệ sinh an toàn thực phẩm, khống chế có hiệu quả các bệnh nguy hiểm trong chăn nuôi; các cơ sở chăn nuôi, nhất là chăn nuôi theo phƣơng thức trang trại, công nghiệp và cơ sở giết mổ, chế biến gia súc, gia cầm phải có hệ thống xử lý chất thải, bảo vệ và giảm ô nhiễm môi trƣờng ... Tuy nhiên, song song với sự phát triển chăn nuôi thì ngành chăn nuôi lợn ở nƣớc ta vẫn luôn phải đối mặt với những khó khăn, thách thức về chất lƣợng con giống, thức ăn, giá cả thị trƣờng,… Đặc biệt là bệnh dịch vẫn thƣờng xuyên xảy ra gây thiệt hại lớn về kinh tế. Trong đó có một số bệnh thƣờng xuyên xảy ra không những ảnh hƣởng đến mục tiêu phát triển chăn nuôi mà còn đe dọa ảnh hƣởng đến sức khỏe của con ngƣời. Bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E. coli và bệnh do vi khuẩn Salmonella vẫn gây tổn thất nặng nề cho ngành chăn nuôi lợn trong toàn quốc. Bệnh do Salmonella gây ra thƣờng ở dạng nhiễm trùng máu cấp tính hoặc viêm ruột non. Tuy nhiên, hai thể bệnh này thƣờng ít khi xảy ra đồng thời với nhau. Vi khuẩn Salmonella và E. coli gây tiêu chảy cho lợn ở các lứa tuổi, đặc biệt ở lợn trƣớc và sau cai sữa trong chăn nuôi trang trại quy mô lớn hay chăn nuôi nông hộ với quy mô nhỏ. 1 Việc nghiên cứu vi khuẩn E. coli và Salmonella gây tiêu chảy ở lợn là việc làm cần thiết, để từ đó có cơ sở xây dựng biện pháp phòng bệnh đạt hiệu quả cao, góp phần thúc đẩy chăn nuôi lợn phát triển bền vững, tạo ra sản phẩm an toàn vệ sinh thực phẩm, có sức cạnh tranh cao trên thị trƣờng. Xuất phát từ tình hình thực tiễn đáp ứng cơ sở khoa học cho việc phòng chống bệnh tiêu chảy ở lợn, chúng tối tiến hành nghiên cứu đề tài:“ Phân lập và giám định một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Escherichia coli và Salmonella spp. tại phòng thí nghiệm của công ty CP thuốc thú y Marphavet.” 2. Mục tiêu của nghiên cứu Phân lập và giám định vi khuẩn E. coli và Salmonella spp. từ các mẫu bệnh phẩm và phân lợn con tiêu chảy. Xác định đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc Xác định vai trò gây bệnh của vi khuẩn E. coli và Salmonella spp. trong hội chứng tiêu chảy của lợn. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3.1. Ý nghĩa khoa học Công trình đã chứng minh vai trò của vi khuẩn E. coli và Salmonella spp. trong hội chứng tiêu chảy. Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là cơ sở khoa học phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo về hội chứng tiêu chảy ở lợn con, đồng thời đóng góp tƣ liệu tham khảo, nghiên cứu cho cán bộ thú y và ngƣời chăn nuôi. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Chứng minh đƣợc vai trò gây bệnh của vi khuẩn E. coli và Salmonella spp. trong hội chứng tiêu chảy ở lợn. Điều này phục vụ cho công tác phòng và điều trị hội chứng tiêu chảy ở lợn con. 2 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Một số hiểu biết về vi khuẩn E. coli Vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, nhóm Escherichiae, giống Escherichiae, loài Escherichiacoli. Trƣớc đây đƣợc gọi là Bacterium coli commune hay Bacillus coli communis, lần đầu tiên phân lập đƣợc từ phân trẻ em bị tiêu chảy năm 1885 và đƣợc đặt theo tên của ngƣời bác sỹ nhi khoa Đức Theobald Escherich (1857 - 1911) ( Nguyễn Vĩnh Phƣớc, 1974 [7] Nguyễn Nhƣ Thanh và cs., 1997 [12]; Lê Văn Tạo, 1997[9] ). Đây là vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn thƣờng trực ở trong ruột, chiếm tới 80% các vi khuẩn hiếu khí. Hầu hết E. coli không gây bệnh, chỉ một số ít các chủng E. coli có khả năng gây bệnh cho gia súc trong đó có tiêu chảy. Trong điều kiện bình thƣờng, E. coli khu trú thƣờng xuyên ở phần sau của ruột, ít khi có ở dạ dày hay đoạn đầu ruột non của động vật. Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng phát triển nhanh về số lƣợng, độc lực, gây loạn khuẩn, bội nhiễm đƣờng tiêu hoá và trở thành nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy (Nguyễn Bá Hiên, 2012) [4]. 1.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli 1.1.1.1. Đặc điểm hình thái Vi khuẩn E. coli là một trực khuẩn hình gậy ngắn, có kích thƣớc 2 - 3µm × 0,3 – 0,6µm; ở môi trƣờng nuôi cấy, trong canh khuẩn già, xuất hiện những trực khuẩn dài 4 – 8 µm. Trong cơ thể ngƣời và động vật, vi khuẩn thƣờng có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Phần lớn vi khuẩn E. coli có khả năng di động do có lông ở xung quanh thân, không sinh nha bào, có thể có giáp mô. Vi khuẩn bắt màu gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu, khoảng giữa nhạt hơn. Nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc nhầy để nhuộm, có thể thấy giáp mô, nhƣng khi soi tƣơi thì thƣờng không nhìn thấy đƣợc. 1.1.1.2. Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên Vi khuẩn E. coli đƣợc chia làm các serotype khác nhau dựa vào cấu trúc kháng nguyên thân O, giáp mô K, lông H và kháng nguyên bám dính F. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli gây bệnh trên gia súc rất đa dạng và phức tạp 3 với 4 nhóm kháng nguyên chính là các kháng nguyên O (kháng nguyên thân), H (kháng nguyên lông), K (kháng nguyên giáp mô), và F (kháng nguyên bám dính) (Gyles C.L., Fairbrother J.M., 2010) [22]. Bằng phản ứng ngƣng kết, các nhà khoa học đã tìm ra đƣợc 250 serotype O, 89 serotype K, 56 serotype H và một số serotype F. Khi xác định serotype đầy đủ của 1 chủng vi khuẩn E. coli thì phải xác định đủ cả 3 loại kháng nguyên nói trên. Kháng nguyên O (Kháng nguyên thân - Ohne Hauch) đƣợc coi nhƣ là một yếu tố độc lực có thể tìm thấy ở thành tế bào và có liên hệ trực tiếp với hệ thống miễn dịch. Kháng nguyên O khi gặp kháng huyết thanh tƣơng ứng sẽ xảy ra phản ứng ngƣng kết. Ngƣng kết kháng nguyên O tạo thành những hạt nhỏ, khó tan. Kháng nguyên H (kháng nguyên lông - Hauch) là thành phần lông của vi khuẩn, có bản chất protein, kém bền vững hơn so với kháng nguyên O. Kháng nguyên H không phải là yếu tố độc lực của vi khuẩn, nhƣng có khả năng tạo miễn dịch mạnh. Phản ứng miễn dịch xảy ra nhanh hơn so với kháng nguyên O. Kháng nguyên H của vi khuẩn E. coli không có vai trò bám dính, không có tính độc và cũng không có ý nghĩa trong đáp ứng miễn dịch phòng vệ nên ít đƣợc quan tâm nghiên cứu,nhƣng nó có ý nghĩa rất lớn trong xác định giống loài của vi khuẩn (Orskov F. 1978) [29] Kháng nguyên K (Kháng nguyên vỏ bọc Capsular), còn đƣợc gọi là kháng nguyên bề mặt (OMP - Outer membrane protein) hoặc kháng nguyên vỏ bọc (Capsular). Vai trò của kháng nguyên K chƣa đƣợc thống nhất. Có rất nhiều ý kiến cho rằng, nó không có ý nghĩa về độc lực của vi khuẩn, vì thấy rằng độc lực của chủng E. coli có kháng nguyên K cũng giống độc lực của chủng không có kháng nguyên K (Orskov F. 1978)[29]. Tuy nhiên, có ý kiến khác cho rằng, nó có ý nghĩa về độc lực vì nó tham gia bảo vệ vi khuẩn trƣớc những yếu tố phòng vệ của vật chủ. Tuy vậy, phần lớn các ý kiến đều thống nhất kháng nguyên K có hai nhiệm vụ sau: hỗ trợ trong phản ứng ngƣng kết của kháng nguyên O, nên thƣờng ghi liền công thức serotype của vi khuẩn là Ox: Ví dụ nhƣ: E. coli O139: K88, O149: K88... 4 Tạo ra hàng rào bảo vệ cho vi khuẩn chống lại tác động của ngoại cảnh và hiện tƣợng thực bào, yếu tố phòng vệ của vật chủ. Kháng nguyên F (Kháng nguyên Fimbriae- Kháng nguyên bám dính): Hầu hết các chủng E. coli gây bệnh đều sản sinh ra một hoặc nhiều kháng nguyên bám dính. Các chủng không gây bệnh thì không có kháng nguyênbám dính. Kháng nguyên bám dính giúp vi khuẩn bám vào các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào biểu mô ruột và trên lớp màng nhày để xâm nhập và gây bệnh, đồng thời chống lại khả năng đào thải vi khuẩn của nhu động ruột. Một số loại kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E. coli thuộc nhóm ETEC (Enterotoxigenic E. coli) gây bệnh chủ yếu cho lợn là F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F18 và F41 (Carter G.R. và cs., 1995) [15]. 1.1.2. Đặc tính nuôi cấy,sinh hóa của vi khuẩn E. coli 1.1.2.1. Đặc tính nuôi cấy Theo Nguyễn Nhƣ Thanh và cs., (19970 [12], Nguyễn Quang Tuyên (2008) [10] vi khuẩn E. coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện, có thể sinh trƣởng ở phổ nhiệt độ khá rộng (từ 5- 400C), nhiệt độ thích hợp là 370C và phổ pH rộng (pH từ 5,5 - 8,0), pH thích hợp nhất là từ 7,2-7,4. Khi nuôi cấy trên các môi trƣờng, để trong tủ ấm ở 370C và sau 24 giờ vi khuẩn sẽ phát triển nhƣ sau: + Môi trƣờng thạch thƣờng: Hình thành những khuẩn lạc tròn, ƣớt, bóng láng không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đƣờng kính từ 2 - 3mm. Nuôi lâu, khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc rộng ra, có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng R (Rough) và M (Mucous). + Môi trƣờng nƣớc thịt: Phát triển rất tốt, môi trƣờng đục đều có lắng cặn màu tro nhạt ở dƣới đáy, đôi khi có màu xám nhạt, canh trùng có mùi phân hôi thối. + Môi trƣờng MacConkey: Khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không trầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trƣờng. + Môi trƣờng thạch máu: Khuẩn lạc to, ƣớt, lồi, viền không gọn, màu xám nhạt, một số chủng có khả năng và gây ra hiện tƣợng tan máu. + Môi trƣờng Simmon citrat: Khuẩn lạc không màu trên nền xanh lục. 5 + Môi trƣờng Endo: Khuẩn lạc màu đỏ. + Môi trƣờng EMB: Khuẩn lạc màu tím đen. + Môi trƣờng SS: Khuẩn lạc có màu đỏ. 1.1.2.2. Đặc tính sinh hóa Theo Nguyễn Quang Tuyên (2008)[10] phản ứng lên men đƣờng: Vi khuẩn E. coli lên men sinh hơi các loại đƣờng Lactose, Fructose, Glucose, Levulose, Galactose, Xylose, Manitol; lên men không chắc chắn các loại đƣờng Duncitol, Saccarose và Salixin. Hầu hết các chủng vi khuẩn E.coli đều lên men đƣờng Lactose nhanh và sinh hơi, đây là đặc điểm quan trọng để phân biệt vi khuẩn E.coli và Salmonella vì Salmonella không lên men đƣờng Lactose. Một số phản ứng sinh hoá khác: Phản ứng Indol và MR dƣơng tính, phản ứng H2S, VP, Citrat âm tính. 1.1.3. Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E. coli 1.1.3.1. Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn E. coli Theo Đào Trọng Đạt và cs., (1996) [3] để có thể gây bệnh, đầu tiên vi khuẩn E. coli phải bám dính vào tế bào nhung mao ruột bằng các yếu tố bám dính nhƣ kháng nguyên F. Sau đó, nhờ các yếu tố xâm nhập (Invasion), vi khuẩn sẽ xâm nhập vào tế bào biểu mô của thành ruột. Ở đó, vi khuẩn phát triển, nhân lên và phá huỷ lớp tế bào biểu mô gây viêm ruột, đồng thời sản sinh độc tố đƣờng ruột Enterotoxin. Độc tố đƣờng ruột tác động vào quá trình trao đổi muối, nƣớc, làm rối loạn chu trình này. Nƣớc từ cơ thể tập trung vào lòng ruột làm căng ruột, cùng với khí do lên men ở ruột gây nên một tác dụng cơ học, làm nhu động ruột tăng, đẩy nƣớc và chất chứa ra ngoài, gây nên hiện tƣợng tiêu chảy. Sau khi đã phát triển ở thành ruột, vi khuẩn vào hệ lâm ba, đến hệ tuần hoàn, gây nhiễm trùng máu. Trong máu, vi khuẩn chống lại hiện tƣợng thực bào, gây dung huyết, làm cho cơ thể thiếu máu. Từ hệ tuần hoàn, vi khuẩn đến các tổ chức cơ quan. Ở đây, vi khuẩn lại phát triển nhân lên lần thứ hai, phá huỷ tế bào tổ chức, gây viêm và sản sinh độc tố gồm Enterotoxin và Verotoxin, phá huỷ tế bào tổ chức, gây tụ huyết và xuất huyết. 6 1.1.3.2. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli Các yếu tố gây bệnh của E. coli bao gồm khả năng kháng khuẩn, yếu tố bám dính, khả năng xâm nhập, yếu tố gây dung huyết và khả năng sản xuất độc tố. Các chủng vi khuẩn E. coli không có các yếu tố trên thì không có khả năng gây bệnh. Dựa vào các yếu tố gây bệnh nói trên, ngƣời ta đã phân loại vi khuẩn E. coli thành các loại sau: Enterotoxigenic E. coli (ETEC), Enteropathogenic E. coli (EPEC), Adherence Enteropathogenic E. coli (AEEC) và Verotoxingenic E. coli (VTEC) (Lê Văn Tạo, 1997) [9]. Trong đó, các chủng vi khuẩn thuộc nhóm ETEC và VTEC thƣờng gây bệnh tiêu chảy cho lợn con sơ sinh và lợn sau cai sữa (Fairbrother J.M. 1992) [19]. * Yếu tố kháng khuẩn Nhiều chủng vi khuẩn E. coli có khả năng sản sinh ra chất kháng khuẩn có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt các loại vi khuẩn khác, gọi là ColicinV. Vì vậy, yếu tố này cũng đƣợc coi là một trong các yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli gây bệnh (Smith H.W. và cs., 1967) [32]. * Yếu tố bám dính Để gây bệnh, các chủng ETEC phải bám dính lên trên tế bào biểu môcủa ruột non. Hầu hết các chủng ETEC đều có mang một hoặc nhiều các yếu tố bám dính nhƣ: F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F17, F18, F41, F42 và F165. Ở lợn, các chủng vi khuẩn ETEC gây bệnh tiêu chảy thƣờng mang các yếu tố bám dính sau đây: F4 (K88):F4 hay còn gọi là K88 là một kháng nguyên không chịu nhiệt. Bằng việc sử dụng các kháng huyết thanh đặc hiệu, Orskov I. và cs., (1964) [28] đã phân biệt đƣợc hai loại khác nhau của F4 là F4ab và F4ac. Loại thứ 3 đƣợc phát hiện bởi Guinee và Jansen đƣợc đặt tên là F4ad (Guinee và cs., 1979) [21]. Sợi F4 giúp cho vi khuẩn bám đƣợc vào receptor tƣơng ứng của nó trên tế bào biểu mô của lông nhung ruột non, từ đó vi khuẩn có thể xâm nhập cố định và phát triển đƣợc ở thành ruột non. Yếu tố bám dính F4 đƣợc mang trong vi khuẩn E. coli thuộc nhóm ETEC, gây bệnh tiêu chảy ở lợn trƣớc và sau cai sữa (Nagy B. và cs., 1999) [27]. 7 F5 (K99): F5 trƣớc kia đƣợc cho là kháng nguyên bám dính của E. coli chỉ gây bệnh ở bê, nghé và cừu. Tuy nhiên, hiện nay chúng cũng đƣợc tìm thấy với tỷ lệ thấp ở các chủng ETEC phân lập từ lợn tiêu chảy (Links và cs., 1985) [26]. Sự sản sinh F5 phụ thuộc vào nhiều yếu tố của vi khuẩn nhƣ: Tốc độ sinh trƣởng, pha sinh trƣởng, nhiệt độ và alanine trong môi trƣờng Các gen mã hóa cho sự tổng hợp F5 nằm trên ADN của plasmid (Isaacson, 1977) [23]. F6 (987p): Các nhà khoa học cho rằng, fimbriae này đóng vai trò quan trọng trong việc gây bệnh của ETEC. F6 của ETEC ở lợn có thể giúp vi khuẩn bám vào cả các receptor cấu tạo bởi glycoprotein và glycolipid trên riềm trải của các tế bào biểu mô ruột (Dean và cs., 1989, 1994) [16,17]. F6 bám dính ở màng nhầy để phân phối độc tố đƣờng ruột tối đa đến vật chủ. F18: F18 là tên đặt cho nhân tố bám dính 8813. Bởi vậy, một loại fimbriae mới đã đƣợc đề nghị công nhận là F18ab và F18ac (Rippinger và cs., 1995) [31]. Một nghiên cứu của Nagy và cs., (1996) [27] thấy rằng F18ab và F18ac khác nhau về mặt sinh học. F18ab ít thấy thể hiện ở cả trong điều kiện thực tế và trong phòng thí nghiệm. Chúng thƣờng thấy cùng với việc sản xuất SLT-2e ở các chủng VTEC, trong khi F18ac thể hiện rất rõ ở cả trong thực tế và trong phòng thí nghiệm, chúng mang các đặc tính của các chủng ETEC. Một đặc điểm đáng chú ý ở F18ac là chúng không bám vào riềm bàn chải của lợn sơ sinh trong điều kiện thực tế và trong phòng thí nghiệm (Nagy và cs., 1992), [27] cũng không tập trung ở lớp màng nhầy của ruột ở lợn con mới sinh (Casey và cs. Điều này ngƣợc với F5 và F6, chúng bám vào các tế bào biểu mô ruột. Khả năng bám này ở lợn cai sữa nhiều hơn so với lợn sơ sinh. Lý do xác đáng để giải thích về việc tăng sự mẫn cảm với bám dính của F18ab và F18ac theo tuổi của lợn vẫn chƣa đƣợc làm rõ, nhƣng có thể là do sự tăng dần các receptor đặc hiệu ở lông nhung của ruột lợn từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi. Sự thiếu hụt các receptor của F18ab và F18ac ở lợn sơ sinh có thể giải thích cho lý do vì sao chỉ thấy các chủng VTEC và ETEC ở lợn cai sữa (Nagy và cs., 1999) [27]. 8 * Yếu tố xâm nhập của vi khuẩn E. coli Là một khái niệm dùng để chỉ quá trình chƣa đƣợc xác định một cách rõ ràng mà nhờ đó vi khuẩn E. coli qua đƣợc hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy (mucosa) trên bề mặt niêm mạc để xâm nhập vào tế bào biểu mô (Epithel), đồng thời sinh sản và phát triển trong lớp tế bào này. Trong khi đó, những vi khuẩn khác không có khả năng xâm nhập, không thể qua đƣợc hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy hoặc khi qua đƣợc hàng rào này, sẽ bị giữ lại bởi tế bào đại thực bào của tổ chức hạ niêm mạc (Giannella và cs., 1976) [20]. * Độc tố của vi khuẩn E. coli Vi khuẩn E. coli sản sinh nhiều loại độc tố: Enterotoxin, Verotoxin, Neurotoxin. Mỗi loại độc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra. Nhóm độc tố đường ruột (Enterotoxin) gồm hai loại: Độc tố chịu nhiệt (Heat Stable Toxin - ST): Độc tố này chịu đƣợc nhiệt độ 1000C trong vòng 15 phút. Độc tố ST chia thành hai nhóm STa và STb dựa trên đặc tính sinh học và khả năng hòa tan trong methanol. STa kích thích sản sinh ra GMP mức cao trong tế bào, ngăn trở hệ thống chuyển Na+ và Cl-, làm giảm khả năng hấp thu chất điện giải và nƣớc ở ruột. STa thƣờng thấy ở ETEC gây bệnh ở lợn < 2 tuần tuổi và ở lợn lớn. STb kích thích vòng nucleotid phân tiết dịch độc lập ở ruột, nhƣng phƣơng thức tác dụng của STb vẫn chƣa đƣợc hiểu rõ. STb hoạt động ở ruột non lợn, nhƣng không hoạt động ở ruột non chuột, bê và bị vô hoạt bởi Trypsin. Cả STa và STb đều có vai trò quan trọng trong việc gây tiêu chảy do các chủng E. coli gây bệnh ở bê, nghé, dê, cừu, lợn con và trẻ sơ sinh. Nhóm độc tố tế bào (Shiga /Verotoxin): Độc tố Vero (VTs) hay Shiga (SLTs) là thuật ngữ đƣợc sử dụng trƣớc đây. Gần đây, các nhà khoa học đã đề nghị sử dụng tên độc tố Shiga (Stx) cho tất cả những độc tố tế bào này. Stx sản sinh bởi E. coli bao gồm 2 nhóm: Stx1và Stx2. Độc tố Shiga ở lợn là một loại trong nhóm độc tố Stx2 với một số khác biệt trong đặc tính sinh học. Stx1 và Stx2 gây độc cho tế bào Hela. Stx2e kém độc hơn, nhƣng gây độc mạnh cho tế bào Vero. 9 * Vai trò gây bệnh của các loại kháng nguyên Theo ý kiến của nhiều tác giả, mặc dù các vi khuẩn E. coli có nhiều loại kháng nguyên. Trong đó, có loại tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ, có loại không tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ nhƣng đều tham gia vào quá trình gây bệnh bằng cách tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào tế bào vật chủ và tham gia vào quá trình kháng lại các yếu tố phòng vệ tự nhiên của vật chủ. Các kháng nguyên tham gia quá trình trên phải kể đến là kháng nguyên O, kháng nguyên K, kháng nguyên F. * Yếu tố dung huyết (Hly) Để phát triển trong cơ thể, vi khuẩn E. coli cần đƣợc cung cấp sắt. Hầu hết những chủng E. coli gây bệnh thƣờng có khả năng gây dung huyết. Để chiếm dụng sắt của vật chủ, vi khuẩn E. coli tiết men Heamolyzin phá vỡ hồng cầu, giải phóng sắt trong nhân HEM. Có 4 kiểu dung huyết của vi khuẩn E. coli là: -haemolysin, haemolysin, -haemolysin, -haemolysin, nhƣng quan trọng nhất là kiểu haemolysin và -haemolysin (Ketyle và cs., 1975) [25]. 1.1.4. Vai trò của vi khuẩn E.coli trong hội chứng tiêu chảy Bệnh xảy ra ở tất cả các lứa tuổi của lợn, nhƣng tỷ lệ mắc bệnh, mức độ trầm trọng và tỷ lệ chết tập trung vào lợn con từ 4 tuần tuổi đến sau cai sữa Theo Đào Trọng Đạt và cs., (1996)[3] bệnh do các serotype E. coli O8, O141, O147, O149, và O157, trong đó O149 F4 thƣờng chiếm tỷ lệ cao. Các chủng E. coli này do lợn con bị nhiễm từ môi trƣờng, từ vú mẹ khi bú hoặc có sẵn trong ruột, gặp điều kiện thuận lợi phát triển nhân lên với số lƣợng lớn, chiếm tỷ lệ áp đảo các vi khuẩn đƣờng ruột khác, đồng thời tiếp nhận các yếu tố gây bệnh trong quá trình phát triển, gặp khi cơ thể lợn chịu các tác động bất lợi nhƣ: chăm sóc nuôi dƣỡng kém, thay đổi thức ăn đột ngột, nhiệt độ, độ ẩm, thời tiết chuồng nuôi thay đổi vi khuẩn tác động gây bệnh. Các serotype E. coli gây bệnh tiêu chảy thƣờng mang các yếu tố bám dính F4, F6 và F5; độc tố đƣờng ruột, chủ yếu LT1 và ST1, đôi khi có Stx2e hoặc LT, 10 STa và STb. Cơ chế gây bệnh tiêu chảy ở lợn giống nhƣ ở bệnh lợn con phân trắng, nhƣng do hệ thống thần kinh của lợn đã hoàn chỉnh, điều tiết đƣợc các chức năng sinh lý, lợn đã ăn các thức ăn tinh và thô thay cho bú sữa, nên phân có màu vàng. 1.1.4.1. Triệu chứng Theo trung tâm Chẩn đoán và cố vấn thú y của Công ty cổ phần chăn nuôi CP Việt Nam (2010) [13], khi lợn bị tiêu chảy do vi khuẩn E. coli, triệu chứng trƣớc tiên là lợn bị tiêu chảy với mức độ khác nhau, đi ngoài nhiều lần trong ngày, phân có nhiều nƣớc, do đi ngoài mất nƣớc nên lợn gầy còm, hốc hác, dơ xƣơng, hông hõm, xƣơng sƣờn, xƣơng sống nhô lên, lợn cụp đuôi hoặc đuôi hay vẫy qua vẫy lại. Lợn ăn ít, uống nƣớc nhiều. Xuất hiện những vùng da tím tái ở mũi, chóp tai và bụng. Một vài lợn có biểu hiện thần kinh, đi vòng tròn theo một chiều nhất định hoặc liệt 2 chân sau, vào giai đoạn cuối lợn nằm nghiêng chân bơi chèo, xác gầy và bẩn. Tiêu chảy nhiều nƣớc, phân thƣờng có màu nâu hoặc xanh xám. Lợn con theo mẹ, lợn con trƣớc và sau cai sữa mắc bệnh, không điều trị kịp thời, bị mất nƣớc, trụy tim, mạch nhanh, tỷ lệ chết cao. Lợn con bị tiêu chảy sau khi khỏi bệnh còi cọc, khả năng tăng trọng kém. Lợn choai, lợn mẹ, lợn lớn, lợn đực giống mắc bệnh thƣờng nhẹ, tỷ lệ chết thấp hơn, nhiều con tự khỏi, không ảnh hƣởng đến phát triển sau này. 1.1.4.2. Bệnh tích mổ khám Theo Đào Trọng Đạt và cs., (1996) [3] sự biến đổi bệnh tích ở lợn bị tiêu chảy do vi khuẩn E. coli phụ thuộc rất nhiều vào tuổi mắc bệnh, thời gian kéo dài của bệnh, nhìn chung xác lợn chết do tiêu chảy thƣờng gầy, bẩn, thân bê bết phân, mắt trũng sâu, tím tái ở mũi, tai. Phổi nhợt nhạt và khô, hạch treo ruột bị tụ huyết tím bầm. Niêm mạc mắt, miệng nhợt nhạt. Niêm mạc ruột, dạ dày xuất huyết, nếu bị tiêu chảy lâu niêm mạc bị tróc từng mảng. Trực tràng bị loét chảy máu. Gan mất màu, có những nốt hoại tử trên mặt. Cơ tim nhão, mất trƣơng lực. Bàng quang xẹp, niêm mạc xuất huyết. Dạ dày chứa đầy thức ăn. Xuất huyết ở niêm mạc đƣờng cong lớn của dạ dày. Ruột non chứa đầy dịch loãng, niêm mạc phù nhẹ và xuất huyết. Chất chứa trong các đoạn ruột có trạng thái khác nhau từ 11 nhiều nƣớc đến sền sệt, nhƣng đều có mùi đặc trƣng. Trong ruột già thức ăn có dạng nhày, màu xanh xám hoặc vàng xám. Niêm mạc đƣờng tiêu hóa có nhiều vết loét, nhƣng vết loét sâu và nặng thƣờng thấy ở niêm mạc đƣờng cong lớn của dạ dày. Một số trƣờng hợp lợn tiêu chảy trong phân toàn máu do niêm mạc đƣờng tiêu hóa bị tổn thƣơng sâu vì bị nhiễm E. coli có khả năng sản sinh kháng nguyên bám dính F4 mạnh. Quan sát bệnh tích vi thể thấy lẫn trong lớp tế bào lông nhung là vi khuẩn E. coli. Lớp tế bào lông nhung bị phá hủy nặng. 1.1.5. Bệnh phù đầu lợn con do vi khuẩn E. coli Bệnh phù đầu lợn con do một số serotype kháng nguyên O của E. coli sau đây gây ra: O138, O139K12H1, O141K85q, O141K85ac. Ở Việt Nam, Nguyễn Khả Ngự (2000) [6] phân lập, định type vi khuẩn E. coli gây bệnh phù đầu lợn ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long đã phát hiện đƣợc 11 serotype, nhƣng chiếm tỷ lệ cao nhất là O26 và O139. Theo Trịnh Quang Tuyên (2004) [11] khi phân lập E. coli gây bệnh phù đầu ở trại chăn nuôi tập trung các tỉnh phía Bắc, phát hiện 7 serotype trong đó chủ yếu là O139 chiếm 34,8% và O138 chiếm 18,5%. Để gây đƣợc bệnh, ngoài các yếu tố gây bệnh có ở E. coli gây tiêu chảy cần phải có yếu tố bám dính F18 thay cho F4, độc tố tế bào (Stx2e), độc tố thần kinh và các yếu tố gây dung huyết mà chủ yếu là αhaemolytic. Nhờ các yếu tố gây bệnh, vi khuẩn vào máu gây nhiễm trùng huyết, trong máu yếu tố dung huyết phá vỡ hồng cầu làm máu loãng, độc tố tế bào vừa phá hủy tế bào tổ chức gây bệnh tích, vừa tăng tính thành mạch, nƣớc từ hệ tuần hoàn đi vào mô bào gây hiện tƣợng phù. Độc tố thần kinh tác động vào trung ƣơng thần kinh gây nên các triệu chứng thần kinh nhƣ: run rẩy và co giật. 1.1.5.1. Triệu chứng Theo Nguyễn Khả Ngự (2000) [6] theo dõi bệnh ở đồng bằng sông Cửu Long thấy bệnh xảy ra ở hai thể: quá cấp tính rất hay gặp và cấp tính ít gặp hơn. Trong trƣờng hợp quá cấp tính, lợn thƣờng chết nhanh, không có biểu hiện triệu chứng. Những trƣờng hợp bệnh cấp tính, lợn nằm tụm thành đống ở góc chuồng, ít hoạt động. Lợn đi loạng choạng, mất thăng bằng, run rảy, ho, nhiều nƣớc mũi 12