Tài liệu Ngiên cứu phân lập và giám định một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn actinobaccilus pleuropneumoniae gây viêm phổi lợn tại thái nguyên

TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA NÔNG - LÂM - NGƢ ----------------------- LƢU THỊ TRÀ MY NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA VI KHUẨN ACTINOBACCILUS PLEUROPNEUMONIAEGÂYVIÊM PHỔI LỢN TẠI THÁI NGUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NgànhThú Y „ Phú Thọ, 2018 TRƢỜNG ĐẠI HỌC HÙNG VƢƠNG KHOA ĐẠI NÔNG - LÂM - NGƢ TRƢỜNG HỌC HÙNG VƢƠNG ----------------------KHOA NÔNG - LÂM - NGƢ LƢU THỊ TRÀ MY NGUYỄN LAN HƢƠNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA VI KHUẨN TÊN ĐỀ TÀI ACTINOBACCILUS PLEUROPNEUMONIAEGÂYVIÊM NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH MỘT SỐ PHỔI LỢN TẠI THÁI NGUYÊN ĐẶC ĐIỂM SINH HOÁT CỦA VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS GÂY VIÊM PHỔI LỢN TẠI THÁI NGUYÊN KHÓA LUẬN TỐTTHỰC NGHIỆP ĐẠI BÁO CÁO TẬP 2 HỌC Ngành: Thú Y Ngành: Thú Y NGƢỜI HƢỚNG DẪN: 1. TS. NGUYỄN NGỌC MINH TUẤN NGƢỜI HƢỚNG DẪN: PGS. TS. CAOĐỖ VĂN 2.Th.S TẤT ĐẠT Ths.S: PHAN THỊ PHƢƠNG THANH Phú Thọ, 2018 Phú Thọ, 2018 i LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản khóa luận, tôi luôn nhận đƣợc sự giúp đỡ của nhiểu tổ chức và cá nhân. Nhân dịp này tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo nhà trƣờng, Ban lãnh đạo khoa Nông Lâm Ngƣ trƣờng đại học Hùng Vƣơng, Ban lãnh đạo công ty cổ phần Marphavet đã tạo điều kiện cho tôi đƣợc theo học chƣơng trình đào tạo đại học tại trƣờng và thực tập tại công ty. Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể thầy cô trong bộ khoa Chăn nuôi Thú y, trƣờng Đại học Hùng Vƣơng; cán bộ công nhân viên, đặc biệt cán bộ phòng kiểm nghiệm vaccin công ty Marphavet đã nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy hƣớng dẫn khoa học là TS. Nguyễn Ngọc Minh Tuấn giảng viên trƣờng đại học Hùng Vƣơng và Ths. Đỗ Tất Đạt phó giám đốc công ty Marphavet đã trực tiếp hƣớng dẫn giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành khóa luận. Tôi luôn biết ơn gia đình, bạn bè và các sinh viên đại học đã động viên, sát cánh bên tôi và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này. Xin trân thành cảm ơn. Phú Thọ, tháng 4 năm 2018 Sinh viên thực hiện Lƣu Thị Trà My ii MỤC LỤC Chƣơng 1 ............................................................................................................... 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu của nghiên cứu: ............................................................................... 2 1.3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu .................................................................. 2 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn........................................................................ 3 CHƢƠNG 2........................................................................................................... 4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 4 2.1. Đặc điểm của vi khuẩn A. pleuropneumonia ................................................. 4 2.1.1. Hình thái, kích thƣớc và đặc tính nuôi cấy ................................................. 4 2.1.2. Đặc tính sinh hóa ......................................................................................... 5 2.1.3.Cấu trúc kháng nguyên................................................................................. 5 2.1.4. Các yếu tố độc lực ....................................................................................... 5 2.1.5. Khả năng đề kháng với kháng sinh ........................................................... 11 2.2. Bệnh viêm phổi - màng phổi ở lợn do A. pleuropneumoniae ...................... 12 2.2.1.Triệu chứng ................................................................................................ 12 2.2.2. Bệnh tích ................................................................................................... 13 2.2.3. Các biện pháp phòng bệnh ........................................................................ 13 2.2.4. Điều trị bệnh .............................................................................................. 14 2.3. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn A. pleuropneumoniae ở trong và ngoài nƣớc…………………………………………………………………………….15 CHƢƠNG 3......................................................................................................... 17 NỘI DUNG, ĐỊA ĐIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 17 3.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ................................................................ 17 3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu................................................................................ 17 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ................................................................................... 17 3.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 17 3.3. Thời gian, địa điểm, nguyên vật liệu dùng cho nghiên cứu ......................... 17 iii 3.3.1. Thời gian nghiên cứu ................................................................................ 17 3.3.2. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................. 17 3.3.3. Nguyên liệu và dụng cụ dùng cho nghiên cứu .......................................... 17 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 19 3.4.1. phƣơng pháp thu thập mẫu ........................................................................ 19 3.4.2. Phƣơng pháp lấy mẫu ................................................................................ 20 3.4.3. Phƣơng pháp phân lập ............................................................................... 20 3.4.4. Phƣơng pháp nhuộm Gram kiểm tra hình thái vi khuẩn ........................... 22 3.4.5. Phản ứng sinh hóa ..................................................................................... 23 3.4.6. Phƣơng pháp xác định A. Pleuropneumoniae bằng kỹ thuật PCR ........... 24 3.4.7. Phƣơng pháp xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập đƣợc ......................................... 28 3.5. Phƣơng pháp phân tích số liệu .................................................................... 29 CHƢƠNG 4......................................................................................................... 30 KẾT QUẢ............................................................................................................ 30 4.1. Kết quả tách khuẩn lạc nghi Actinobacillus pleuropneumoniae phân lập đƣợc từ mẫu phổi lợn trên môi trƣờng thạch ...................................................... 30 4.2. Kết quả nhuộm gram .................................................................................... 31 4.3. Kết quả xác định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng A. pleuropneumoniae phân lập đƣợc ....................................................................... 32 4.4. Kết quả chạy phản ứng PCR định danh A. pleuropneumoniae.................... 37 4.5. Kết quả xác định triệu chứng, bệnh tích điển hình của lợn mắc bệnh viêm phổi dovi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae gây ra tại Thái Nguyên ..... 39 4.6. Kết quả xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập đƣợc ....................................................................... 41 4.7. Kết quả thử nghiệm một số phác đồ điều trị lợn nghi mắc viêm phổi dính sƣờn do A. pleuropneumoniae............................................................................. 42 CHƢƠNG 5......................................................................................................... 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 46 iv 5.1. Kết luận ........................................................................................................ 46 5.2. Đề nghị ......................................................................................................... 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 47 PHỤ LỤC .............................................................................................................. 1 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU A. pleuropneumoniae: Actinobacillus pleuropneumoniae AGID: Agargel Immuno Diffuse AGPT: Agar Gel Precipitin Test bronchiseptica: Bordetella bronchiseptica BHI: Brain Heart Infusion CAMP: Christie - Atkinson - Munch - Peterson Es: Công sự D.S.A: Dextrose Starch Agar DNA: Deoxyribo Nucleic Acid ELISA: Enzyme - Linked Immuno Sorbant Assay Fg : Greenish Fluorescent F0: parasuis: Orange Fluorescent Haemophilus parasuis pleuropneumoniae : Haemophilus pleuropneumoniae M. hyopneumoniae: Mycoplasma hyopneumoniae MR: Methyl red MT: Môi trƣờng NAD: Nicotinamide Adenine Dinucleotide PBS: Phosphat buffer solution Nf: Not Fluorescent P. multocida: Pasteurella multocida PCR: Polymerase Chain Reaction PRRS: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome TSA: Tryptic Soy Agar VK: Vi khuẩn VP: Voges - Proskauer VPDS: Viêm phổi dính sƣờn YPC: Yaest extract pepton, L.cystine vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Trình tự Nucleotide của OmlA ........................................................... 27 Bảng 3.2: Thành phần phản ứng PCR xác định gen OmlA ................................ 28 Bảng 3.3: Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn ................................... 29 Bảng 4.1: Kết quả giám định vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập đƣợc từ phổi của lợn nghi mắc bệnh viêm phổi dính sƣờn. ............................................. 30 Bảng 4.2: Kết quả xác định một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập đƣợc ....................................................................... 36 Bảng 4.3: Kết quả các phản ứng lên men đƣờng của chủng vi khuẩn nghi vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập đƣợc ........................................................ 36 Bảng 4.4: Kết quả PCR ....................................................................................... 38 Bảng 4.5: Kết quả quan sát thu thập triệu chứng của lợn nghi mắc bệnh do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumonie .............................................................. 39 Bảng 4.6: Kết quả quan sát bệnh tích của lợn nghi mắc bệnh do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumonie ......................................................................... 40 Bảng 4.7: Kết quả xác định mức độ mẫn cảm với một số kháng sinh của các chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập đƣợc ......................................... 41 Bảng 4.8: Kết quả điều trị thử nghiệm lợn nghi mắc lợn mắc viêm phổi dính sƣờn ..................................................................................................................... 43 vii DANH MỤC HÌNH Hình 3.1: Cách tiến hành nhuộm Gram .............................................................. 22 Hình 4.1: Hình thái khuẩn lạc A. pleuropneumoniae trên thạch máu ................ 31 Hình 4.2: Hình thái khuẩn lạc A. pleuropneumoniae sau khi nhuộm gram........ 32 Hình 4.3: phản ứng Voges - proskauer (VP)....................................................... 33 Hình 4.4: phản ứng Urease.................................................................................. 33 Hình 4.5: phản ứng thử nghiệm Catalase ............................................................ 34 Hình 4.6: phản ứng thử nghiệm CAMP .............................................................. 34 Hình 4.7: phản ứng Indol .................................................................................... 35 Hình 4.8: phản ứng Oxidase................................................................................ 35 Hình 4.9: Hình ảnh chạy PCR các khuẩn lạc nghi A. pleuropneumoniae .......... 38 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Tính cấp thiết của đề tài Trong những năm qua, chăn nuôi lợn ở nƣớc ta có sự phát triển mạnh mẽ theo hƣớng chăn nuôi công nghiệp tập trung, đóng góp lớn cho sự phát triển kinh tế xã hội ở các địa phƣơng. Tuy nhiên xu hƣớng lại không theo tính quy hoạchdẫn đếntình trạng giá heo giảm do đầu ra không đảm bảo.Theo Bộ NN&PTNT sau nhiều tháng chạm đáy, giá lợn hơi những tháng cuối năm đang có dấu hiệu tăng trở lại nhƣng vẫn không đủ để ngƣời chăn nuôi có lãi. Tình trạng giá thấp kéo dài, khó khăn trong khâu tiêu thụ khiến ngƣời chăn nuôi lợn giảm đàn, bỏ đàn, treo chuồng. Theo kết quả điều tra chăn nuôi kỳ 01/10/2017, đàn lợn cả nƣớc có 27,4 triệu con; giảm 5,7%; sản lƣợng thịt lợn hơi xuất chuồng đạt 3,7 triệu tấn; tăng 1,9%.Không những gặp nhiều rủi ro về giá cả, thị trƣờng, chăn nuôi lợn còn gặp vấn đề khó khăn và nan giải đó là các loại dịch bệnh luôn tiềm ẩn, ảnh hƣởng nhiều tới hiệu quả sản xuất. Trong các bệnh thƣờng gặp và gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi lợn hiện nay ngoài các bệnh truyền nhiễm thƣờng gặp thì bệnh viêm phổi đóng một vai trò quan trọng trong việc gây tổn thất lớn cho chăn nuôi lợn ở nƣớc ta. Bệnh viêm phổi do vi khuẩn là một trong những nguyên nhân chính gây chết nhiều lợn tại các địa phƣơng hiện nay, với nhiều căn nguyên gây bệnh và bệnh lại rất đa dạng, triệu chứng bệnh khác nhau. Đặc biệt là bệnh viêm phổi- viêm phổi màng phổi, do Actinobaccilus pleuropneumonie gây tổn thất nghiêm trọng cho ngƣời chăn nuôi. Vi khuẩn A.pleuropneumoniae gây ra dƣới thể viêm phổi đã gây chết rất nhiều lợn ở các lứa tuổi, đặc biệt quan trọng là lợn mắc bệnh viêm phổi màng phổi bị chết. Ngoài vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae serovar 2 và 5 thƣờng gặp gây ra chiếm tỷ lệ cao thì có thể còn do các serovar khác nhƣ 1, 7, 9... gây ra. Do đó rất cần đƣợc quan tâm nghiên cứu để có biện pháp làm giảm thiệt hại do vi khuẩn A. pleuropneumoniae gây ra. Nếu không có biện pháp ngăn ngừa thì khả năng lây lan rất cao gây thiệt hại lớn cho đàn lợn nuôi. Vì vậy, việc nghiên cứu phân lập và xác định một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn là rất cần thiết từ đó biết đƣợc vai trò 2 gây ra một số đặc điểm triệu chứng lâm sàng của lợn mắc bệnh viêm phổi- viêm phổi màng phổi. Kết quả này có thể sử dụng để tiếp tục những nghiên cứu sâu hơn nhằm chẩn đoán nhanh bệnh, biện pháp phòng và trị do vi khuẩn A.pleuropneumoniae gây ra. Để có cơ sở xây dựng biện pháp phòng bệnh đạt hiệu quả cao, góp phần xác định đúng pháp đồ điều trị, giảm thời gian điều trị và nâng cao hiệu quả điều trị, thúc đẩy chăn nuôi gia súc nói chung và chăn nuôi lợn nói riêng phát triển bền vững, tạo ra sản phẩm an toàn vệ sinh thực phẩm, có sức cạnh tranh cao trên thị trƣờng, chúng tôi tiến hành đề tài: "Ngiên cứu phân lập và giám định một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Actinobaccilus pleuropneumoniae gây viêm phổi lợn tại Thái Nguyên” 1.2. Mục tiêu của nghiên cứu: - Phânlập, xác địnhđặc điểm nuôi cấy, đặc tính sinh hóa của A.pleuropneumoniaegây bệnh viêm phổi ở lợn tại Thái Nguyên. - Xác định đƣợc triệu chứng, bệnh tích lợn bị bệnh viêm phổi dính sƣờn do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae gây ra. - Xác định độ mẫn cảm của vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae với kháng sinh. - Đƣa ra phác đồ điều trị nhanh và đạt hiệu quả đối với bệnh viêm phổi dính sƣờn 1.3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu * Đối tượngnghiên cứu: - Lợn ở các lứa tuổi nghi mắc bệnh viêm phổi do vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae gây ra ở địa bàn tỉnh Thái Nguyên. - Vi khuẩn gây viêm phổi lợn: Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae. * Phạm vi nghiên cứu: - Một số địa điểm trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên và phòng thí nghiệm công ty Marphavet. 3 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn * Ý nghĩa khoa học - Phân lập,xác định vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniaegây bệnh viêm phổi ở lợn tại Thái Nguyên. - Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học phục vụ cho nghiên cứu tiếp theo về bệnh viêm phổi- màng phổi ở lợn. * Ý nghĩa thực tiễn - Đề tài đánh giá đƣợc vai trò vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae trong hội chứng PRRS. Điều này phục vụ cho công tác phòng và điều trị bệnh viêm phổi- màng phổi ở lợn. 4 CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Đặc điểm của vi khuẩn A.pleuropneumonia 2.1.1. Hình thái, kích thƣớc và đặc tính nuôi cấy Vi khuẩnActinobacillus pleuropneumoniaethuộc họ Pasteurellae, thuộc giống Actinobacillus, trƣớc đây còn có tên là Haemophilus parahaemolyticushay Haemophilus pleuropneumoniae đã đƣợc xác định là nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm phổi - màng phổi truyền nhiễm ở lợn. A. pleuropneumoniae là vi khuẩn có dạng cầu trực khuẩn nhỏ, bắt màu gram âm, kích thƣớc khoảng0,3-0,5 x 0,6-1,4 µm. Vi khuẩn không di động, không sinh nha bào, có khả năng hình thành giáp mô, tuy nhiên một số chủng không có giáp mô cũng đã đƣợc quan sát thấy. Dƣới kính hiển vi điện tử phát hiện vi khuẩn có nhung mao với kích thƣớc 0,5-2 x 60-450 nm. Loại có vỏ (capsule) là polysaccharide đƣợc tìm thấy ở hầu hết các serotype của vi khuẩn A. pleuropneumoniae,còn loại không có vỏ thì ít tìm thấy hơn. A.pleuropneumoniae là một loại vi khuẩn khó phân lập trên các môi trƣờng thông thƣờng và thƣờng phụ thuộc vào yếu tố V (hay chính là NAD: Nicotinamide Adenine Dinucleotide). Dovậy, khi nuôi cấy A.pleuropneumoniae cần các môi trƣờng giàu dinh dƣỡng. Trên môi trƣờng thạch máu vi khuẩn không phát triển trên môi trƣờng thạch máu thông thƣờng mà chỉ có thể mọc trên thạch máu đã đƣợc bổ sung NAD hoặc có cấy kèm vi khuẩn S. aureus. Sau 24 giờ nuôi cấy, vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc mọc xung quanh đƣờng cấy S. aureusvới kích thƣớc 0,5-1 mm và hình thành một vùng dung huyết β. Vùng dung huyết này thƣờng đƣợc quan sát rõ hơn trên môi trƣờng thạch có bổ sung 5-7% máu cừu. Ngoài ra, vi khuẩn A. pleuropneumoniae còn gây một vùng dung huyết tăng cƣờng trong vùng dung huyết bán phần, xung quanh đƣờng cấy S. aureuscó độc tố dung huyết β gọi là hiện tƣợng CAMP (Kilian, 1976) [26]. Hiện tƣợng CAMP này liên quan tới sự có mặt của 3 loại độc tố của A. pleuropneumoniae bao gồm ApxI, ApxII và ApxIII. Trên môi trƣờng TSA: Trong thành phần của môi trƣờng này đƣợc bổ sung Yeast Extract (YE) và huyết thanh ngựa. Sau 24 - 48 giờ nuôi cấy, vi khuẩn tạo 5 thành khuẩn lạc nhỏ, màu trắng trong, dƣới ánh sáng đèn điện có màu xám xanh. Trên môi trƣờng thạch chocolate: Sau 24 giờ nuôi cấy, vi khuẩn tạo thành khuẩn lạc nhầy, màu trắng xám. Vi khuẩn A. pleuropneumoniae thuộc biotype 1 có thể phân biệt đƣợc với H. parasuis bởi khả năng gây dung huyết trên thạch máu khi có S. aureus cấy kèm (Kilian M., 1976) [26]. 2.1.2. Đặc tính sinh hóa Vi khuẩn A.pleuropneumoniae lên men đƣờng glucose, xylose, mannitol, mannose và không lên men đƣờng arabinose, lactose, raffinose, sorbitol. Dƣơng tính với phản ứng urease, oxidase, CAMP, O.N.P.G, âm tính với phản ứng sinh Indol và không mọc trên thạch MacConkey (Trịnh Quang Hiệp và cs, 2004 [5]; Cù Hữu Phú và cs, 2005 [6]; Đặng Xuân Bình và cs, 2007 [2]; Nguyễn Thị Thu Hằng, 2010 [4]). 2.1.3.Cấu trúc kháng nguyên Vi khuẩn A. pleuropneumoniae từ lâu đã đƣợc nhiều nghiên cứu xác định là nguyên nhân chính gây nên bệnh viêm phổi - màng phổi ở lợn và đƣợc chia thành 2 biotype chính dựa trên nhu cầu cần sử dụng NAD (Nicotinamide Adenine Dinucleotide) hay còn gọi là yếu tố V cho quá trình sinh trƣởng của vi khuẩn. Biotype 1 cần có NAD, còn biotype 2 thì không đòi hỏi NAD trong quá trình nuôi cấy, song vẫn cần có các pyridine nucleotid đặc hiệu hoặc các chất tiền thân của pyridine nucleotid cho quá trình tổng hợp NAD. Biotype 1 có độc lực cao hơn biotype 2. Biotype 1 có 12 serotype khác nhau dựa trên sự khác nhau của capsule polysaccharide (CPS) và của lipopolysaccharide (LPS) thành tế bào. Ở biotype 2 có serotype 2, 4, 7 và 9 có chung nhóm quyết định kháng nguyên nhƣ biotype 1. Trong những năm gần đây, serotype 13 và 14 thuộc biotype 2 đƣợc phát hiện và đƣợc mô tả có kháng nguyên khác với biotype 1 (Nielsen và cs, 1997) [34]. Blackall và cs (2002) [9] đã phát hiện ra serotype 15 thuộc biotype 1 ở 9 chủng vi khuẩn phân lập đƣợc tại Australia. 2.1.4. Các yếu tố độc lực Nhiều nghiên cứu đã cho thấy độc lực ở các serotype khác nhau của vi khuẩn A. pleuropneumoniae phần lớn đƣợc quyết định bởi các ngoại độc tố mà chúng sản 6 sinh ra (Devenishvà cs, 1990 [13]; (Freyvà Bosse, 1993) [18]). Polysaccharide vỏ, lipopolysaccharide, protein màng, protein thu nhận sắt, yếu tố bám dính, ngoại độc tố và một vài loại enzym có liên quan cũng đóng vai trò quan trọng đối với độc lực của vi khuẩn A. pleuropneumoniae. Hiểu biết về thành phần và cấu trúc kháng nguyên chủ yếu liên quan đến độc tính, độc lực của vi khuẩn sẽ cung cấp các thông tin quan trọng, là cơ sở khoa học cho việc phát triển kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh đặc hiệu cũng nhƣ chế tạo vaccine phòng bệnh. - Vai trò của ngoại độc tố (Exotoxin): Nhiều nghiên cứu đã cho thấy mức độ độc lực khác nhau của các serotype vi khuẩn A. pleuropneumoniae phần lớn có liên quan đến ngoại độc tố (Apx) sản sinh từ vi khuẩn và đóng vai trò chính trong quá trình gây bệnh cho lợn (Devenish và cs, 1990 [13]. Các nhà khoa học đã xác định độc lực của vi khuẩn A.pleuropneumoniae có liên quan đến bốn loại protein độc tố. Các độc tố này đƣợc xếp vào nhóm RTX-toxin và đặt tên là độc tố Apx, bao gồm ApxI,ApxII, ApxIII (Frey và Bosse, 1993) [18]; Cho và Chae, 2001 [11]). Tính độc của mỗi loại độc tố này có thể thay đổi và phụ thuộc vào các serotype khác nhau của vi khuẩn A. Pleuropneumoniae. + ApxII là độc tố làm tan huyết, gây dung giải tế bào ở mức độ trung bình và có trọng lƣợng phân tử khoảng 103 -105 kDa (Frey và Nicolet, 1988) [16]. Trƣớc đây ApxII đƣợc gọi là HlyII, ClyII hay CytII (Frey và Nicolet, 1990) [17]. Tất cả các serotype của A. pleuropneumoniae đều tiết ApxII, ngoại trừ serotype 10 và 14 (Kamp và cs, 1994 [25]; Rayamajhi và cs, 2005 [36]). Operon mã hóa ApxII chỉ chứa các gen apxIICA và thiếu các gen bài tiết tƣơng ứng. Sự tiết ApxII phụ thuộc vào gen apxIBD và gen này đƣợc tìm thấy ở tất cả các serotype của A. pleuropneumoniae, ngoại trừ serotype 3. + ApxIII là độc tố không làm tan huyết, nhƣng lại là độc tố dung giải tế bào mạnh với trọng lƣợng phân tử 120 kDa. Trƣớc kia ApxIII đƣợc đặt tên là cytolysin III (ClyIII), độc tố viêm màng phổi - pleurotoxin (Ptx), hay độc tố chống đại thực bào - macrophage toxin (Mat) (Rycroft và cs, 1991a [37]; Macdonald và Rycroft, 1992 [29]; Jansen và cs, 1993 ). ApxIII đƣợc phân biệt với 2 độc tố ApxI và ApxII 7 do không gây dung huyết, nhƣng lại gây dung giải mạnh các tế bào khác. ApxIII giống 50% với ApxI và HlyIcủa vi khuẩn E. coli (Jansen và cs 1993). Vùng gen điều hòa (operon) mã hóa cho ApxIII chứa các gen apxIIICABD và giống với vùng gen điều hòa (operon) cho apxI(Chang và cs, 1993) [10]. Protein độc tố ApxIII đƣợc tiết ra bởi serotype 2; 3; 4; 6; 8 và 15 của A. pleuropneumoniae(Rayamajhi và cs, 2005) [36]. + ApxIV (ApxIVA) là độc tố RTX thứ 4 của A. pleuropneumoniae đã đƣợc phát hiện và đề xuất đặt tên là ApxIVA. Gen ApxIVA đƣợc phát hiện thấy ở tất cả các serotype của A. pleuropneumoniae và điều đó chứng tỏ nó có tính chất đặc trƣng cho loài. Vai trò của độc tố ApxIV với vật chủ nhƣ thế nào trong quá trình gây bệnh hiện chƣa đƣợc nghiên cứu kỹ, song đã có một số công trình nghiên cứu chứng minh sự tồn tại của ApxIVA trong cơ thể sống và đƣợc tạo ra từ gen độc tố của vi khuẩn A. pleuropneumoniae (Liu và cs, 2009). Không có serotype nào của A. pleuropneumoniae có khả năng sản sinh ra cả ba loại độc tố Apx, chủ yếu là có khả năng tạo ra 2 độc tố. Các serotype 1; 5; 9; 11 và 13 sản sinh ra ApxI và ApxII; serotype 2; 3; 4; 6; 8 và 15 sản sinh ra ApxII và ApxIII. Một số lƣợng nhỏ các serotype chỉ sản sinh một độc tố Apx nhƣ serotype 10 sản sinh ApxI, serotype 7 và serotype 12 sản sinh ApxII (Frey và Nicolet, 1990 [17]; Frey và cs, 1993 [18], 1994 [19]). Độc lực của các serotype A. pleuropneumoniae thay đổi từ mức độ mạnh đến yếu. Sự thay đổi này tùy thuộc vào loại độc tố mà mỗi serotype tiết ra. Những serotype sản sinh ra một hoặc hai độc tố thƣờng có độc lực mạnh hơn những serotype không sản sinh ra độc tố (Frey và Nicolet, 1990) [17]. A. pleuropneumoniae serotype 5 thể đột biến không sản sinh ra ApxI hoặc ApxII đã không còn độc lực đối với lợn hoặc chuột thí nghiệm. Điều này cho thấy độc tố là yếu tố quan trọng xác định độc lực của vi khuẩn A. pleuropneumoniae serotype 5. Đồng thời tác giả đã làm thí nghiệm gây đột biến các chủng A. pleuropneumoniae serotype 5 để không sản sinh ra ApxI hoặc ApxII và sau đó dùng các chủng đã đột biến làm giống gốc sản xuất vaccine cũng cho thấy động vật thí nghiệm không có khả năng bảo hộ đối với các chủng tự nhiên. Kết quả nghiên cứu chứng minh các 8 độc tố là cần thiết để kích thích đáp ứng miễn dịch chống lại khả năng gây bệnh của các chủng A. pleuropneumoniae serotype 5. Thành phần heptose và glucose trong LPS của A. pleuropneumoniae cao hơn so với ở một vài loài vi khuẩn Gram âm khác nhƣ E. coli. Jensen và Bertram (1986) [24] đã tìm thấy LPS từ vi khuẩn A. pleuropneumoniae có độc lực cao thuộc serotype 5 có nhiều galactose hơn thể phân lập không độc cùng serotype 5. LPS thành tế bào có ý nghĩa quan trọng trong việc gây ra đáp ứng miễn dịch của vật chủ sau khi A. pleuropneumoniae xâm nhiễm. - Polysaccharide vỏ vi khuẩn (Capsule polysaccharide - CPS):Vi khuẩn A. pleuropneumoniae đƣợc bao bọc bên ngoài bởi một lớp vỏ có bản chất là các polysaccharide. Lớp vỏ polysaccharide này tích điện âm và đƣợc cấu tạo bởi các đơn vị Oligosaccharide, các polymer của axit teichoic gắn kết với nhau bởi các cầu nối phosphate diester, hoặc các polymer Oligosaccharide gắn kết với nhau bởi các cầu nối phosphate. Polysaccharide vỏ vi khuẩn là một trong những thành phần quyết định độc lực của vi khuẩn và cũng là một nhân tố quyết định tính đặc hiệu serotype của vi khuẩn (Ward và Inzawa, 1997) [38]. Polysaccharide vỏ vi khuẩn là yếu tố xác định đặc trƣng của hiện tƣợng phát ánh ngũ sắc trên bề mặt khuẩn lạc trong môi trƣờng nuôi cấy. Lớp vỏ của A. pleuropneumoniae có độ dầy từ 80 - 230 nm tùy thuộc vào các serotype khác nhau. Đã có những ý kiến cho rằng sự khác biệt về độ dầy lớp vỏ dẫn đến sự khác nhau về độc lực. Các chủng A. pleuropneumoniae độc lực cao có lớp vỏ dầy, trong khi một số chủng không độc có lớp vỏ mỏng hoặc dễ dàng bị phá vỡ. Quan sát dƣới kính hiển vi điện tử cho thấy những chủng có độc lực có kích thƣớc lớn hơn và có lớp vỏ bám dính dầy hơn so với những chủng ít độc; lớp vỏ của vi khuẩn A. pleuropneumoniae không chỉ có ý nghĩa trong quá trình gây bệnh mà còn có vai trò quan trọng trong chẩn đoán và dịch tễ. Các serotype có lớp vỏ dầy có độc lực mạnh hơn so với các serotype có lớp vỏ mỏng (Jensen và Bertram, 1986 [24]; Jacobsen và cs, 1996 22). Điều này cho thấy lớp vỏ vi khuẩn có thể là một trong những yếu tố ảnh hƣởng đến độc lực của các serotype khác nhau. Lớp vỏ của A. pleuropneumoniae có đặc tính chống lại thực bào 9 và đƣợc coi là lá chắn chủ yếu của vi khuẩn chống lại hệ thống bảo vệ của vật chủ. Những chủng A. pleuropneumoniae có vỏ bình thƣờng có khả năng kháng lại với hiện tƣợng tiêu diệt vi khuẩn qua trung gian bổ thể của huyết thanh lợn khi có kháng thể đặc hiệu. Ngƣợc lại, với các chủng A. pleuropneumoniae đột biến thiếu hụt vỏ thì bị tiêu diệt bởi huyết thanh bình thƣờng. Cơ chế mà lớp vỏ vi khuẩn tạo nên sự kháng lại các hoạt tính diệt khuẩn đã đƣợc phát hiện, cho thấy thành phần cấu thành lớp vỏ vi khuẩn không ngăn cản hoạt hóa bổ thể hay sự kết dính của C3 (một thành phần của bổ thể) lên vi khuẩn nhƣng lại hạn chế lƣợng kháng thể và sự lắng đọng bổ thể C9 lên bề mặt vi khuẩn trong huyết thanh bình thƣờng. - Các protein màng ngoài (Outer membrane proteins - OMPs):Protein màng ngoài của A. pleuropneumoniae có trọng lƣợng phân tử 43 kDa và có thể thay đổi tùy theo hàm lƣợng NAD cung cấp trong môi trƣờng nuôi cấy. Các protein mang sắt nằm trên màng ngoài, sau đó các đặc tính cùng chuỗi gen của chúng cũng đƣợc Gonzalez và cs (1995) [22]; Chung và cs (2007) 12 nghiên cứu xác định. Vi khuẩn A. pleuropneumoniae sản sinh một vài loại protein màng ngoài (OMPs) và các protein này đƣợc cho là có vai trò trong đáp ứng miễn dịch. Hơn nữa, các kháng thể kháng OMPs của A. pleuropneumoniae đƣợc chứng minh tác động nhƣ một chất opsonin quan trọng chống đại thực bào và bạch cầu đơn nhân. A. pleuropneumoniae có khả năng tổng hợp hai protein mới khi đƣợc nuôi trong môi trƣờng thiếu sắt và có các kháng thể chống lại chúng. Hiện tƣợng xuất hiện các polypeptid này chỉ có đƣợc ở trong cơ thể sống. Các nhà nghiên cứu đã quan sát thấy có một số receptor transferrin đặc hiệu ở lợn và khả năng phát triển của A. pleuropneumoniae với transferrin vận chuyển sắt. Các phân tích về mặt di truyền các yếu tố mã hóa cho receptor các protein transferrin đƣợc nhận dạng bởi hai gen nằm trên một operon. Theo quy định gen tbpB (mã hóa cho protein Tbp2 có khối lƣợng phân tử dao động từ 59,8 đến 65,5 kDa) và gen tbpA (mã hóa cho protein Tbp1 với trọng lƣợng chính xác 102,2 kDa). Theo các chứng minh ngƣợc dòng trên operon tbp gợi ý rằng các ion sắt ở môi trƣờng điều khiển gen tbp qua protein Fur (Gerlach và cs, 1992) [20]. - Các protein thu nhận sắt:Khả năng cạnh tranh và hấp thụ sắt đƣợc xem là 10 một trong những yếu tố độc lực quan trọng của A. pleuropneumoniae giúp vi khuẩn tồn tại trong cơ thể vật chủ. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy vi khuẩn A. pleuropneumoniae có thể sử dụng transferrin của vật chủ (Gerlach và cs, 1992) [20] và hemoglobin (Archambault và cs 1999) [7], cũng nhƣ sử dụng các loại siderophore khác nhau của nhiều vi sinh vật khác (Diarra và cs, 1996) làm nguồn cung cấp sắt cho sinh trƣởng. Các nghiên cứu cũng đã xác định chắc chắn có sự tồn tại của các thụ thể trên bề mặt màng tế bào A. pleuropneumoniae đặc hiệu cho các nguồn thu nhận sắt. Nghiên cứu của Jacques (2004) [23] cho biết vi khuẩn A. pleuropneumoniae cóprotein gắn kết hemoglobin và các receptor ferric hydroxamate. Chính protein gắn transferrin đã giúp cho A. pleuropneumoniae đƣợc cung cấp đầy đủ sắt trong một thời gian ngắn sau quá trình xâm nhập gây nhiễm trùng. - Các yếu tố độc lực khác: Ngoài các yếu tố độc lực chính nhƣ trên vi khuẩn A. pleuropneumoniae còn có một số thành phần khác cũng có vai trò quan trọng trong sinh bệnh học, bao gồm: + Fimbriae là yếu tố bám dính chính lên tế bào niêm mạc đƣờng hô hấp của vật chủ của A. pleuropneumoniae trong quá trình xâm. Dƣới kính hiển vi điện tử, fimbriaecó đƣờng kính từ 0,5 - 2 nm, dài từ 60 - 450nm. + Ngƣng kết tố: Hiện tƣợng ngƣng kết hồng cầu đã đƣợc xác định ở một số chủng vi khuẩn A. pleuropneumoniae phân lập đƣợc, tuy nhiên cũng có một số chủng A. pleuropneumoniae không có đặc tính ngƣng kết cũng đã đƣợc xác định. + HlyX protein: Vi khuẩn A. pleuropneumoniae có chứa gen hlyX (cfp) quy định khả năng dung giải hồng cầu, biểu hiện phản ứng CAMP có mặt ở hầu hết các chủng A. pleuropneumoniae phân lập đƣợc (Macdonald và Rycroft, 1993) [30]. + Protease: Vi khuẩn A. pleuropneumoniae tiết ra protease có khả năng phân giải gelatin, IgA, IgG và hemoglobin. + Enzym superoxide dismutase (SOD) là một trong những yếu tố độc lực vì nó giúp cho vi khuẩn tồn tại trong suốt quá trình gây nhiễm. Trình tự cấu trúc của enzym này đã đƣợc xác định bởi Langford và cs (1996) [27]. 11 + Urease: Hoạt động của urease góp phần vào khả năng gây nhiễm trùng của vi khuẩn A. pleuropneumoniae trên đƣờng hô hấp của lợn và sau đó làm phát sinh bệnh. Hoạt động urease cũng góp phần gây bệnh do quá trình này cung cấp cho vi khuẩn nguồn nitrogen, từ đó trực tiếp hoặc gián tiếp gây tổn thƣơng tế bào thực bào và tế bào nội mạc của vật chủ. 2.1.5. Khả năng đề kháng với kháng sinh Việc sử dụng kháng sinh không cần thiết làm cho A. pleuropneumoniae kháng lại nhiều loại kháng sinh.Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn A. pleuropneumoniae đƣợc quyết định bởi thành phần plasmid có trong tế bào vi khuẩn và plasmid này có trọng lƣợng phân tử thấp (2,3-3,6) x106 dalton. Cơ sở của hiện tƣợng kháng này với Ampicillin là do vi khuẩn tiết ra men β-lactamase. Những plasmid này không có vật liệu gen để thúc đẩy sự dẫn truyền tới vi khuẩn khác và sự xuất hiện của plasmid này gợi ý về kết quả của một quá trình chọn lọc của vi khuẩn A. pleuropneumoniae. Đặc tính kháng kháng sinh có khả năng truyền bằng plasmid. Ở Việt Nam, Trịnh Quang Hiệp và cs (2004) [5] kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của 29 chủng Actinobacillus phân lập từ trại chăn nuôi lợn tập trung thuộc công ty giống Thái Bình và Hải Phòng đã xác định các loại kháng sinh tác dụng tốt là amikacin (94,95%), amoxicilin (88,89%), rifampicin (83,33%); oxacillin và ceftazidine cùng là (77,78%). Sự mẫn cảm với kháng sinh của A. pleuropneumoniae cũng đƣợc Cù Hữu Phú và cs (2005) [6] cho biết ít mẫn cảm nhất là kanamycin (45,45%), neomycin (50%), lincomycin (63,64%). Nguyễn Thị Thu Hằng (2010) [4] khi nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh của các các chủng A. pleuropneumoniae phân lập đƣợc ở lợn thuộc các tỉnh miền Bắc đã cho thấy các chủng A.pleuropneumoniae phân lập đƣợc mẫn cảm nhất với kháng sinh ceftriaxone, chiếm tỷ lệ 73,01%; tiếp theo là các kháng sinh ampicillin, amoxicillin, ceftazidine lần lƣợt là 63,49%; 58,73% và 55,56%. Một số kháng sinh đang đƣợc sử dụng nhiều có tỷ lệ kháng thuốc khá cao nhƣ lincomycin bị kháng tới 93,65%; tiếp đến là erythromycin, neomycin và gentamicin 85,71%; 80,95% và 49,21%. Nghiên cứu của Tiêu Quang An và Nguyễn Hữu Nam (2011) [1] cho biết, các chủng A.