Tài liệu Nghiên cứu xây dựng quy trình pilot sản xuất sinh khối bacillus spp. làm nguyên liệu probiotic cung cấp carotenoid

. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN H U T M Nghiên cứu xây dựng quy trình pilot sản xuất sinh khối Bacillus spp. làm nguyên liệu probiotic cung cấp carotenoid U N ÁN TIẾN S DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – năm 2014 . . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN H U T M Nghiên cứu xây dựng quy trình pilot sản xuất sinh khối Bacillus spp. làm nguyên liệu probiotic cung cấp carotenoid CHUY N NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM M SỐ: 62 73 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. TRẦN CÁT ĐÔNG GS.TS. NGUY N V N TH NH Thành phố Hồ Chí Minh – năm 2014 . . ời cam oan Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trình bày trong Luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Người viết cam đoan Trần Hữu Tâm . . Mục lục Lời cam đoan anh m c các chữ viết t t Danh m c các bảng Danh m c các hình anh m c các s đ ĐẶT VẤN ĐỀ Chư ng 1. T NG QU N T I LI U 1.1. Vi khuẩn Bacillus 1.2. Carotenoid 1.3. Các vi sinh vật sinh carotenoid 1.4. Nghiên cứu về vi khuẩn sinh carotenoid trên thế gi i và t i Việt Nam 1.5. Thực phẩm chức n ng 1.6. Probiotic 1.7. Thực phẩm chức n ng và probiotic đối v i sức khỏe 1.8. Lên men sản xuất sinh khối Chư ng 2. Đ I T NG, V T LI U, THI T V PH NG PH P NGHI N CỨU 2.1. Đối tượng 2.2. Vật liệu 2.3. Trang thiết b 2.4. Phư ng pháp nghiên cứu Chư ng 3. K T QUẢ NGHI N CỨU 3.1. Phân lập, sàng l c s b và đ nh danh vi khuẩn 3.2. Khảo sát các đặc điểm probiotic 3.3. Khảo sát điều kiện nuôi cấy và đường cong t ng trưởng 3.4. Khảo sát đặc điểm sinh carotenoid 3.5. Khảo sát môi trường thay thế 3.6. Khảo sát thông số lên men thu bào tử trong môi trường lỏng 3.7. Lên men thu bào tử 3.8. S b xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu sinh khối 3.9. Thử nghiệm đ c tính 3.10. Khả n ng hấp thu, tích lũy carotenoid từ T14 và 1.1 ở gan chu t 3.11. Khả n ng tr tiêu chảy do kháng sinh của DD1.1, AT14 3.12. Khả n ng ứng d ng của T14 và 1.1 trên m t số d ng chế phẩm . i iv vi ix x 1 3 3 6 16 19 21 22 23 25 28 28 28 29 30 49 49 55 63 65 70 81 86 99 105 111 111 115 . Chư ng 4. N LU N 4.1. Vi khuẩn sinh carotenoid 4.2. Môi trường thay thế 4.3. Lên men thu bào tử và tiêu chuẩn nguyên liệu sinh khối 4.4. Đ c tính của hai chủng T14 và DD1.1 4.5. Hấp thu, tích lũy carotenoid từ T14 và 1.1 ở gan chu t 4.6. Khả n ng điều tr tiêu chảy liên quan đến kháng sinh 4.7. Khả n ng ứng d ng bào tử T14 và 1.1 sinh carotenoid trên m t số d ng chế phẩm K T LU N KI N NGH NH M C C C C NG TR NH Đ C NG T I LI U TH M KHẢO PH L C . 120 120 124 127 129 130 131 132 134 136 PL-1 . Danh mục các ch vi t t t 2SG 2xSchaeffer's sporulation agar ADN Acid Deoxyribonucleic BHT Butylated Hydroxyl Toluene BLAST Basic Local Alignment Search Tool CDSM Chemically Defined Sporulation Medium CFU Colony Forming Unit CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute CMC Carboxymethyl cellulose DNS 3,5-dinitrosalicylic acid DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl DSM Difco Sporulation Medium EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid EtOH Ethanol FAO Food and Agriculture Organization Hb Hemoglobin HCT Hematocrit HDL High Density Lipoprotein HPLC High Performance Liquid Chromatography I Intermediate IBS Irritable Bowel Syndrome IL Interleukin LDL Low Density Lipoprotein MHA Muller Hilton Agar MIC Minimal Inhibitory Concentration NA Nutrient Agar Na CMC Sodium Carboxy Methyl Cellulose NAFLD Nonalcoholic Fatty Liver Disease NB Nutrient Both . . NCBI National Center for Biotechnology Information NK Natural Killer NMR Nuclear Magnetic Resonance OD Optical Density PCI Phenol Chloroform Isoamin Alcohol PCR Polymerase Chain Reaction PCV Packed cell volume PDA Photodiode Array Detector PVP Polyvinylpyrrolidone R Resistant rADN Ribosom Acid Desoxynucleic RBC Red Blood Cell RSM Response Surface Methodology S Susceptible SD Standard Deviation SDS Sodium Dodecyl Sulphat SGOT Serum Glutamic Oxaloacetic Transaminase SGPT Serum Glutamic Pyruvic Transaminase TCA Tricloacetic acid TSA Trypticase Soy Agar TSB Trypticase Soy Broth UV-Vis Ultra violet – Visible WBC White Blood Cell . . Danh mục các bảng ảng 1.1. Chế phẩm chứa carotenoid đang lưu hành t i VN ............................................ 14 ảng 1.2. Các vi sinh vật sinh carotenoid và các carotenoid đặc trưng ............................. 17 ảng 2.1. C chất cảm ứng và cách đ c kết quả thử nghiệm khả n ng sinh enzym .......... 34 ảng 2.2. Pha dung môi khảo sát tính tuyến tính ............................................................. 37 ảng 2.3. Môi trường từ d ch chiết tự nhiên .................................................................... 38 ảng 2.4. Tỉ lệ nguyên liệu trong d ch chiết ..................................................................... 39 ảng 2.5. Đ n v mã hóa theo CC ................................................................................. 40 ảng 2.6. ấu hiệu sức khỏe của chu t ........................................................................... 43 ảng 2.7. Lô chu t thử nghiệm........................................................................................ 46 ảng 2.8. ố trí thí nghiệm.............................................................................................. 46 ảng 3.1. Kết quả phân lập vi sinh vật từ các n i lấy mẫu ............................................... 49 ảng 3.2. Các chủng có khả n ng t o bào tử và màu s c trên môi trường SM ............... 50 ảng 3.3. Ho t tính chống oxy hóa của các mẫu đối chứng ............................................. 51 ảng 3.4. Ho t tính b t giữ gốc tự do PPH của các mẫu................................................ 52 ảng 3.5. Đỉnh hấp thu của m t số carotenoid đối chứng trong cloroform ....................... 53 ảng 3.6. Đỉnh hấp thu của các mẫu thử .......................................................................... 53 ảng 3.7. Kết quả đ nh danh ............................................................................................ 54 ảng 3.8. Khả n ng sinh enzym của các chủng vi khuẩn phân lập ................................... 55 ảng 3.9. Số lượng và phần tr m bào tử vi khuẩn sống sót trong môi trường acid............ 57 ảng 3.10. Số lượng và phần tr m bào tử vi khuẩn sống sót trong muối mật .................... 59 ảng 3.11. MIC chủng chuẩn v i kháng sinh .................................................................. 61 ảng 3.12. Thống kê số lo i kháng sinh b đề kháng bởi các chủng khảo sát.................... 62 ảng 3.13. Điều kiện phát triển thích hợp của 5 chủng .................................................... 64 ảng 3.14. Thời gian thế hệ và các đặc tính phát triển của 5 chủng .................................. 64 ảng 3.15. Kết quả khảo sát tính tuyến tính ..................................................................... 65 ảng 3.16. Kết quả đ lặp l i của phư ng pháp ............................................................... 66 ảng 3.17. Đỉnh chính trên s c k đ d ch chiết carotenoid của các chủng Bacillus ......... 68 ảng 3.18. Thời gian carotenoid đ t cao nhất của 5 chủng khảo sát ................................. 70 ảng 3.19. Hàm lượng carotenoid trên môi trường thay thế của các chủng Bacillus......... 70 ảng 3.20. Ảnh hưởng của hàm lượng nguyên liệu trong d ch chiết................................. 74 . i. ảng 3.21. Kết quả khảo sát khả n ng t o bào tử trên các lo i môi trường lỏng .............. 75 ảng 3.22. Kết quả khảo sát khả n ng t o bào tử trên các lo i môi trường r n ................ 76 ảng 3.23. Ảnh hưởng khoáng đến sinh khối, hàm lượng carotenoid ............................... 77 ảng 3.24. Hệ số tư ng quan R2 của mô hình trên môi trường lỏng và r n ...................... 79 ảng 3.25. Giá tr p của mô hình trên môi trường lỏng và r n .......................................... 79 ảng 3.26. Phư ng trình đáp ứng mô hình trên môi trường lỏng và r n ........................... 79 ảng 3.27. N ng đ khoáng cho lượng bào tử tối ưu và carotenoid theo dự đoán ............ 80 ảng 3.28. Kết quả khảo sát tỷ lệ truyền chủng trên T14............................................... 81 ảng 3.29. Kết quả khảo sát tốc đ khuấy trên T14....................................................... 82 ảng 3.30. Kết quả khảo sát lưu lượng oxy của T14 ..................................................... 83 ảng 3.31. Kết quả khảo sát lượng chủng đầu vào của ảng 3.32. ảng kết quả khảo sát tốc đ khuấy của ảng 3.33. Kết quả khảo sát pO2 của 1.1 ......................................... 84 1.1.............................................. 84 1.1 .................................................................... 85 ảng 3.34. Ứng d ng quy trình lên men thu bào tử T14 trên ĐK15K mẻ 7 L ............. 95 ảng 3.35. Ứng d ng quy trình lên men thu bào tử 1.1 trên Đ5K mẻ 7 L ................ 95 ảng 3.36. Giá thành của môi trường thay thế r n so v i th ch SM .............................. 97 ảng 3.37. Ứng d ng quy trình lên men thu bào tử T14 trong môi trường lỏng ............. 97 ảng 3.38. Ứng d ng quy trình lên men thu bào tử 1.1 trong môi trường lỏng ........... 97 ảng 3.39. Giá thành của môi trường thay thế lỏng so v i môi trường SM.................... 98 ảng 3.40. Chi phí cho 1 mẻ và giá của 109 bào tử/liều vi khuẩn sinh carotenoid............. 98 ảng 3.41. Tiêu chuẩn nguyên liệu sinh khối bào tử T14 .............................................. 99 ảng 3.42. Tiêu chuẩn nguyên liệu sinh khối bào tử DD1.1........................................... 100 ảng 3.43. Kiểm tra đ lặp l i của phư ng pháp đếm .................................................... 103 ảng 3.44. Khảo sát đ ổn đ nh của nguyên liệu chứa bào tử T14 hoặc 1.1 ........... 104 ảng 3.45. Cân nặng c thể chu t của liều thử nghiệm cao nhất .................................... 105 ảng 3.46. Thể tr ng chu t dùng theo thời gian thử nghiệm .......................................... 107 ảng 3.47. Cân nặng các c quan giữa các lô sau 60 ngày thử nghiệm .......................... 108 ảng 3.48. Các thông số huyết h c của chu t sau 60 ngày thử nghiệm .......................... 109 ảng 3.49. Thông số b ch cầu của chu t sau 60 ngày thử nghiệm ................................. 109 ảng 3.50. Thông số tiểu cầu của chu t sau 60 ngày thử nghiệm ................................... 109 ảng 3.51. Các chỉ số sinh hóa của máu chu t sau 60 ngày thử nghiệm ......................... 110 ảng 3.52. Hàm lượng carotenoid trong gan chu t sau 2 tháng thử nghiệm. .................. 111 . .i ảng 3.53. Tỷ lệ chu t chết sau bốn ngày thử nghiệm ................................................... 112 ảng 3.54. Tỷ lệ chu t khỏi tiêu chảy sau bốn ngày thử nghiệm .................................... 112 ảng 3.55. T ng cân trung bình của các lô chu t sử d ng liều từ 10 6 bào tử trở lên........ 114 ảng 3.56. T ng cân trung bình của các lô chu t sử d ng liều 2x10 5 bào tử................... 114 ảng 3.57. Đánh giá cảm quan của sữa chua bổ sung bào tử B. marisflavi DD1.1......... 116 ảng 3.58. Đánh giá cảm quan của sữa chua bổ sung bào tử B. infantis AT14 .............. 116 ảng 3.59. Đ ổn đ nh của bào tử vi khuẩn sinh carotenoid trong sữa chua ................... 117 ảng 3.60. Đ ổn đ nh của chế phẩm cốm ..................................................................... 118 ảng 3.61. Kết quả theo dõi mật đ bào tử trong 12 tháng đối v i hỗn d ch ................... 119 . . Danh mục các hình Hình 1.1. Các cấu tr c chính của bào tử Bacillus subtilis ................................................... 4 Hình 1.2. Chu trình hình thành bào tử và nảy mầm trở l i của Bacillus .............................. 5 Hình 1.3. Mô hình cấu tr c c bản của các carotenoid ....................................................... 7 Hình 1.4. Các d ng cấu tr c của carotenoid ....................................................................... 7 Hình 1.5. M t số carotenoid thường gặp ............................................................................ 8 Hình 1.6. V trí carotenoid trong màng tế bào .................................................................. 10 Hình 1.7. Sự t o thành vitamin từ β-caroten ................................................................. 11 Hình 3.1. Khuẩn l c của m t số chủng vi khuẩn phân lập ................................................ 49 Hình 3.2. M t số chủng Bacillus phân lập được trên môi trường SM ............................ 51 Hình 3.3. S c k đ của các carotenoid chuẩn ................................................................. 65 Hình 3.4. Đường tuyến tính của canthaxanthin ................................................................ 66 Hình 3.5. S c k đ HPLC của d ch chiết carotenoid từ các chủng Bacillus ..................... 67 Hình 3.6. Lượng carotenoid t o ra theo thời gian của 6 chủng khảo sát ............................ 69 Hình 3.7. S c k đ carotenoid của môi trường đối chứng ............................................... 71 Hình 3.8. S c k đ carotenoid của chủng 1.1 trên các môi trường ............................. 73 Hình 3.9. Tư ng tác K+-Ca2+, K+-Fe2+ v i bào tử 1.1 trên môi trường r n .................. 80 Hình 3.10. Tư ng tác K+-Ca2+, K+-Fe2+ v i carotenoid 1.1 trên môi trường r n .......... 80 Hình 3.11. Thu bào tử T14 trên h p và bào tử T14 trư c, sau tinh chế ....................... 96 Hình 3.12. Thu bào tử 1.1 trên h p và bào tử Hình 3.13. Sinh khối bào tử của T14 và 1.1 trư c, sau tinh chế ..................... 96 1.1 sau đông khô ....................................... 98 Hình 3.14. Vi phẫu thận, lách và ru t ............................................................................ 107 Hình 3.15. Vi phẫu gan .................................................................................................. 108 . . Danh mục các s ồ S đ 2.1. Sàng l c vi khuẩn dựa trên ho t tính chống oxy hóa và phổ UV-Vis ............... 31 S đ 2.2. Thu d ch chiết từ sinh khối vi khuẩn ............................................................... 31 S đ 2.3. Quy trình chiết carotenoid từ gan chu t .......................................................... 45 S đ 3.1. Quy trình nuôi cấy thu bào tử T14 trên môi trường r n ................................. 87 S đ 3.2. Quy trình nuôi cấy thu bào tử 1.1 trên môi trường r n ............................... 89 S đ 3.3. Quy trình nuôi cấy thu bào tử T14 trong môi trường lỏng............................. 91 S đ 3.4. Quy trình nuôi cấy thu bào tử 1.1 trong môi trường lỏng ........................... 93 . . ĐẶT VẤN ĐỀ Các gốc tự do và các d ng oxy ho t đ ng được hình thành từ quá trình chuyển hóa của c thể hoặc tác đ ng từ bên ngoài, sau khi hình thành, những tác nhân này sẽ tấn công các đ i phân tử như protein, lipid, polysaccharid, đặc biệt là acid nucleic t o nên các tổn thư ng, là m t trong những nguyên nhân của bệnh tật và sự lão hóa [40]. Để bổ sung cho c thể chống l i các gốc tự do và các d ng oxy ho t đ ng, các chất chống oxy hóa trong tự nhiên như flavonoid, polyphenol, carotenoid, … được cho là an toàn h n vì ít t o ra các d ng đ ng phân cấu tr c có khả n ng ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người so v i từ con đường tổng hợp hóa h c nên được quan tâm và nghiên cứu rất nhiều. Trong đó, carotenoid được quan tâm nhiều nhất, vì bên c nh chức n ng chống oxy hóa, carotenoid còn đóng vai trò là tiền tố của vitamin , làm giảm tỷ lệ m c các bệnh m n tính như ung thư, tim m ch [43],[53],[83]. Đ ng vật bậc cao không thể tự tổng hợp được carotenoid mà phải sử d ng carotenoid từ thực vật, tảo, nấm hoặc vi khuẩn thông qua chế đ n. Trên th trường, có rất nhiều chế phẩm chứa carotenoid, hầu hết các carotenoid sử d ng trong các chế phẩm này được chiết xuất từ thực vật hoặc bằng tổng hợp hóa h c. Trong những n m gần đây, việc dùng ngu n vi khuẩn để sản xuất m t số carotenoid quan tr ng đã được quan tâm nghiên cứu. Việc sử d ng vi khuẩn sinh carotenoid làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức n ng có nhiều ưu điểm như dễ nuôi cấy ở qui mô l n, t ng trưởng nhanh, sử d ng c chất rẻ tiền, ngoài ra còn có những giá tr c ng thêm như có thể bổ sung thêm các men trợ tiêu hóa, ổn đ nh trong bảo quản. Trong số các vi khuẩn sinh carotenoid, Bacillus có nhiều ưu điểm vì ch ng có khả n ng t o bào tử bền v i nhiệt nên dễ bảo quản và sản xuất [25],[96]. Hiện nay, trên thế gi i cũng chưa có nhiều nghiên cứu sâu và toàn diện về vi khuẩn Bacillus sinh carotenoid để cung cấp carotenoid, riêng t i Việt Nam, từ n m 2008 trở l i đây, nhóm nghiên cứu của Trần Cát Đông đã tham gia vào dự án Colorspore sàng l c các chủng vi khuẩn có khả n ng sinh carotenoid từ vùng biển và h ở Việt Nam, từ đó đến nay đã có khoảng 7 công bố dư i d ng bài báo khoa h c, dự án đã sàng l c được m t số chủng vi khuẩn Bacillus có khả n ng sinh carotenoid như: Bacillus indicus, Bacillus firmus, Bacillus alcalophilus, Bacillus catenulatus, Bacllus aquimaris,… có khả n ng t o bào tử ứng d ng làm thực phẩm chức n ng, mở ra nhiều triển v ng cho việc nghiên cứu vi khuẩn . . Bacillus để cung cấp carotenoid. Tuy nhiên, các nghiên cứu này mặc dù đã thu được m t số kết quả có giá tr và nghĩa, nhưng vẫn chưa đầy đủ, vì vậy vẫn đang tiếp t c triển khai. o đó đề tài Nghiên cứu xây dựng quy trình pilot sản xuất sinh khối Bacillus spp. làm nguyên liệu probiotic cung cấp carotenoid”, là m t hư ng tiếp cận m i, không những có nghĩa khoa h c mà còn có nghĩa thực tiễn, làm c sở để đưa ra những chế phẩm sử d ng vi khuẩn Bacillus làm ngu n cung cấp carotenoid. Đề tài được triển khai v i các m c tiêu sau: 1. Phân lập vi khuẩn Bacillus sinh carotenoid và khảo sát đặc điểm probiotic. 2. Khảo sát khả n ng sinh carotenoid từ các chủng vi khuẩn phân lập được. 3. Khảo sát môi trường thay thế và điều kiện nuôi cấy để xây dựng quy trình lên men. 4. Xây dựng quy trình lên men ở quy mô pilot để sản xuất sinh khối Bacillus làm nguyên liệu probiotic cung cấp carotenoid. 5. Xây dựng tiêu chuẩn c sở của nguyên liệu. 6. Nghiên cứu khả n ng ứng d ng sinh khối thu được. . . Chư ng 1. TỔNG QU N TÀI IỆU 1.1. Vi khuẩn Bacillus 1.1.1. Đặc iểm chung Theo Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Bacillus thu c gi i Bacteria, ngành Firmicutes, l p Bacilli, b Bacillales, h Bacillaceae, chi Bacillus, Geobacillus [73]. Vi khuẩn Bacillus được Ehrenberg mô tả s m nhất là Vibrio subtilis” vào n m 1835. N m 1872, Cohn đặt l i tên là Bacillus subtilis. Đó là thành viên của m t chi l n và đa d ng, được Cohn nghiên cứu đầu tiên, là m t phần của h Bacillaceae. Đặc điểm phân biệt của h này là sự t o bào tử, bào tử d ng tròn, oval, hoặc tr trong tế bào, do đó được g i là n i bào tử. ào tử ch u nhiệt, được Cohn mô tả đầu tiên ở B. subtilis và sau đó Kock mô tả sự xâm nhiễm ở B. anthracis [73]. Vi khuẩn Bacillus được phân lập từ nhiều n i như đất, nư c, thức n, ru t, phân, cỏ khô, cống rãnh…Tế bào hình que, thẳng hoặc gần thẳng, kích thư c 0,3 - 2,2 x 1,2 - 7 µm. Thường di đ ng, roi điển hình nằm ở hai bên thân. ào tử có khả n ng ch u nhiệt, chỉ có m t bào tử trong m t tế bào. Phản ứng Gram của Bacillus có thể thay đổi trong chu trình sống, tế bào trẻ ch c ch n Gram dư ng [73]. H Bacillaceae được Fischer trình bày có hệ thống n m 1895 thì n i bào tử được dùng trong khóa phân lo i vi khuẩn. Đặc điểm của chi Bacillus là tất cả có n i bào tử, hiếu khí, có thể b t bu c hay tùy , hình que và t o catalase. Tuy nhiên, cũng có m t số loài thu c chi Bacillus không t o bào tử như B. thermoamylovorans, B. halodenitrificans [73]. Phần l n các chi Bacillus phát triển tốt trên các môi trường dinh dưỡng thư ng m i g m các thành phần c bản như: pepton, cao th t, glucose, lactose, chất khoáng; mặc dù trong m t số trường hợp đặc biệt, các môi trường này cần được điều chỉnh pH hoặc n ng đ muối (pH từ 2 - 11, và n ng đ muối từ dư i 2 - 25%). Trong phòng thí nghiệm, v i điều kiện tối ưu, thời gian thế hệ của Bacillus khoảng 25 ph t [52],[73]. . . 1.1.2. Bào tử Cấu trúc của bào tử vi khuẩn Bacillus Quan sát bào tử khi không nhu m, thấy có l p màu đen ở mép rất sáng và chiết quang, cấu tr c bào tử g m nhiều l p: - Vỏ bào tử (spore coat): ao quanh l p màng ngoài, g m những protein di đ ng, phức t p, g m ba l p khác nhau. Có chức n ng bảo vệ l p peptidoglycan của bào tử khỏi b các tác nhân bên ngoài tấn công như enzym, UV, chất oxy hóa,… - Cortex: L p peptidoglycan dày đặc biệt, bao quanh màng trong. Cortex là thành phần quan tr ng gi p bào tử không b khử nư c, do đó t o sự bền vững và d ng sống tiềm sinh. L p cortex tích điện âm, trong quá trình nảy mầm, l p này sẽ nhanh chóng b thủy giải do enzym có sẵn trong bào tử. - Lõi bào tử (core): Đây là thành phần quan tr ng nhất của bào tử, bao g m đầy đủ các thành phần gần giống như tế bào sinh dưỡng như protein bào tư ng, ribosom, thể nhân chứa N. Tuy nhiên, thành phần bào tư ng của bào tử chứa khoảng 30 – 50% nư c, trong khi tế bào sinh dưỡng là 70 – 88% nư c. Vỏ ngoài Vỏ trong Cortex Lõi Nucleoid Hình 1.1. Các cấu trúc chính của bào tử Bacillus subtilis Ngu n: T. C. eaman và c ng sự, 1982” [22] Quá trình hình thành bào tử và nảy mầm của bào tử vi khuẩn Bacillus Khi gặp điều kiện bất lợi, vi khuẩn Bacillus có khả n ng hình thành n i bào tử. Quá trình bào tử hóa b t đầu từ cuối thời kỳ sinh trưởng, khi gặp điều kiện thức n c n kiệt hoặc có tích lũy sản phẩm trao đổi chất có h i. . . ào tử vi khuẩn Bacillus là có khả n ng ch u nhiệt, ch u chất đ c và enzym phân giải. Trong thời kỳ m i b t đầu hình thành n i bào tử, vi khuẩn Bacillus tiết ra chất kháng khuẩn tiêu diệt các vi khuẩn xung quanh. Ở các loài thu c chi Bacillus được nghiên cứu, quá trình hình thành bào tử tư ng tự nhau. Toàn b quá trình diễn ra trong khoảng từ 8 -10 giờ, b t đầu bằng việc phân chia N, tách m t nhiễm s c thể bao quanh bởi màng sinh chất t o thể nguyên sinh là d ng bào tử s khởi, và kết th c bằng việc hình thành vỏ bào tử, r t hết nư c t o thành bào tử trưởng thành và phóng thích ra khỏi tế bào mẹ. Sự nảy mầm bào tử là quá trình chuyển bào tử từ tr ng thái ngủ sang tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn. Quá trình này g m ba giai đo n: ho t hóa, nảy mầm và sinh trưởng. Có thể ho t hóa bào tử bằng cách nâng nhiệt trong thời gian ng n, h thấp pH, xử l hóa chất. Ví d bào tử B. subtilis có thể được ho t hóa bằng cách đun 65 oC trong 5 ph t. Tăng trưởng Giai đoạn VI,VII Trưởng thành, ly giải tế bào mẹ Nảy mầm Giai đoạn V Tạo vỏ Cortex Chu kỳ sinh dưỡng Thành tế bào Tạo bào tử Màng tế bào Sinh sản nhân đôi Phân bào bất đối xứng Giai đoạn IV tạo cortex Tiền bào tử Vách ngăn Tế bào mẹ Giai đoạn II Giai đoạn III Hình 1.2. Chu trình hình thành bào tử và nảy mầm trở lại của Bacillus Ngu n: J. Errington, 2003” [44] Môi trường kích thích tạo bào tử vi khuẩn Bacillus Hầu hết vi khuẩn Bacillus cần m t môi trường đặc biệt để có thể cảm ứng t o bào tử. Sự t o bào tử được cảm ứng sau pha t ng trưởng do n ng đ dinh dưỡng b c n kiệt, đặc biệt là việc thiếu ngu n carbon, nit , hoặc phospho. Có thể sử d ng các môi trường nhân t o để . . cảm ứng t o bào tử như SM ( ifico Sporulation Agar), 2SG (2xSchaeffer's sporulation agar). 1.1.3. Ứng dụng Vi khuẩn Bacillus được ứng d ng nhiều trong sản xuất enzym công nghiệp vì nó có khả n ng sinh các lo i enzym như amylase, alkaline phosphatase, cellulase, cyclodextran glucanotransferase, galactosidase, chitinase, glucose isomerase, glucanase, lipase, serin protease, urease,… Ngoài ra, Bacillus còn có khả n ng sinh các chất chuyển hóa s cấp như nucleotid xanthanylic acid, inosinic acid, guanilic acid,…. Trong điều kiện sống thiếu dinh dưỡng, vi khuẩn Bacillus còn có khả n ng sinh các lo i kháng sinh peptid như surfactin hay subtilin có ho t tính kháng khuẩn và kháng khối u [9],[109]. o khả n ng t o bào tử ch u nhiệt, sinh các lo i enzym ngo i bào và khả n ng đối kháng v i các vi sinh gây bệnh như Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, Candida albicans, E. coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, Shigella, Vibrio spp.,…nên Bacillus spp. được sử d ng làm probiotic trong ch n nuôi và thủy sản [8],[9]. Vi khuẩn Bacillus được ứng d ng nhiều làm probiotic để điều tr cũng như phòng bệnh ở người, trên th trường Việt Nam hiện cũng đang phát triển nhiều sản phẩm probiotic có tác d ng phòng tr bệnh như Enterogermina của công ty Sanofi-Synthelabo, là sản phẩm có thành phần là bào tử Bacillus clausii, có tác d ng cân bằng hệ vi khuẩn ru t, gi p phòng tr bệnh tiêu chảy cấp, tiêu chảy kéo dài. M t số vi khuẩn Bacillus cũng t o ra m t số lo i carotenoid như β-caroten, carotenoid C50 đang được nghiên cứu và ứng d ng làm probiotic vì đây là loài có khả n ng sinh bào tử t n t i trong những điều kiện nhiệt đ cao và môi trường acid của d ch v d dày [69]. 1.2. Carotenoid 1.2.1. Cấu trúc và phân loại Cấu trúc c bản Các carotenoid là các hợp chất được t o thành từ tám đ n v isopren (ip) có cấu tr c s p xếp b đảo ngược ở trung tâm của phân tử t o nên b khung carbon (C40). khung này có thể được thay đổi bằng cách: (1) t o vòng ở m t đầu hoặc cả hai đầu của phân tử để t o . . thành bảy nhóm cấu tr c khác nhau, (2) thay đổi mức hydro hóa và (3) thêm các nhóm chức chứa oxy [29], [37]. Isopren - ip ip ip ip ip ip ip ip ip Hình 1.3. Mô hình cấu trúc c bản của các carotenoid Hình 1.4. Các dạng cấu trúc của carotenoid ( ) Cấu tr c c bản của m t carotenoid không có vòng (lycopene) và m t carotenoid có hai vòng (ß-caroten). ( ) ảy cấu tr c khác nhau tìm thấy trong các carotenoid tự nhiên Ngu n: G. Britton, 1995” [29] Phân loại Các carotenoid có thể được phân lo i dựa trên cấu tr c hóa h c thành hai lo i như sau: (1) Caroten được t o thành từ carbon và hydro; (2) Oxycarotenoid hoặc còn g i là các xanthophyl được t o thành từ carbon, hydro và oxy. Nói m t cách khác, các carotenoid có chứa m t hoặc nhiều nhóm chức chứa oxy được g i là các oxycarotenoid hoặc xanthophyl, còn các carotenoid chỉ chứa hydrocarbon được g i là các caroten [37] . . Ngoài ra, các carotenoid còn được phân lo i thành carotenoid s cấp hoặc carotenoid thứ cấp dựa trên đặc điểm sinh tổng hợp của ch ng. Các carotenoid s cấp là nhóm các hợp chất cần cho thực vật trong quá trình quang tổng hợp (ß-caroten, violaxanthin, và neoxanthin), trong khi các carotenoid thứ cấp là các carotenoid có trong hoa, quả thực vật, có chức n ng t o màu (α-caroten, ß-cryptoxanthin, zeaxanthin, antheraxanthin, capsanthin, capsorubin) [37]. Hình 1.5. Một số carotenoid thường gặp Ngu n: F. Delgado-Vargas và c ng sự, 2000” [37] 1.2.2. Đặc iểm h a l Phản ứng oxy h a Đối v i các carotenoid, phần quan tr ng nhất của phân tử là chuỗi polyen. Đây là m t hệ giàu electron, có tính phản ứng cao, dễ b tấn công bởi các chất có ái lực điện tử, là đặc tính quan tr ng có liên quan đến phản ứng oxy hóa và hóa h c các gốc tự do [29]. .