Tài liệu Nghiên cứu xây dựng mô hình sàng lọc ảo trên các chất ức chế arginase 1 và arginase 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH ----------------- BỘ Y TẾ Huỳnh Nam Hải NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MÔ HÌNH SÀNG LỌC ẢO TRÊN CÁC CHẤT ỨC CHẾ ARGINASE 1 VÀ ARGINASE 2 Luận văn Thạc sĩ Dƣợc học Thành phố Hồ Chí Minh - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH ----------------- BỘ Y TẾ Huỳnh Nam Hải NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MÔ HÌNH SÀNG LỌC ẢO TRÊN CÁC CHẤT ỨC CHẾ ARGINASE 1 VÀ ARGINASE 2 Chuyên ngành: Công nghệ dƣợc phẩm và bào chế Mã số: 60.72.04.02 Luận văn Thạc sĩ Dƣợc học NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. THÁI KHẮC MINH Thành phố Hồ Chí Minh - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Huỳnh Nam Hải Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Dƣợc học – Khóa: 2015 - 2017 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MÔ HÌNH SÀNG LỌC ẢO TRÊN CÁC CHẤT ỨC CHẾ ARGINASE 1 VÀ ARGINASE 2 Huỳnh Nam Hải Thầy hƣớng dẫn: PGS.TS. Thái Khắc Minh Mở đầu và đặt vấn đề Arginase là một metalloenzym với 2 nhân Mn2+ có nhiệm vụ xúc tác phản ứng thủy phân Larginin thành L-ornithin và urea. Khi arginase hoạt động quá mức có thể dẫn đến các bệnh xơ vữa động mạch, tăng huyết áp phổi, rối loạn chức năng cƣơng dƣơng,…. Vì vậy, ức chế arginase là một giải pháp để điều trị những bệnh này. Đề tài đƣợc tiến hành nhằm mục đích xây dựng mô hình sàng lọc ảo để tìm kiếm các chất có hoạt tính ức chế arginase mới. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu Mô hình 2D-QSAR đƣợc xây dựng dựa trên thuật toán bình phƣơng tối thiểu từng phần PLS (MOE 2008.10) trên tập cơ sở dữ liệu gồm 43 dẫn xuất của acid 2(S)-amino-6boronohexanoic với hoạt tính ức chế arginase. Trên tập cơ sở dữ liệu gồm 465 chất, mô hình QSAR nhị phân đƣợc tiến hành bằng phƣơng pháp Binary (MOE 2008.10). Enzym arginase 1 (PDB 4HZE) và arginase 2 (PDB 4HWW) đƣợc chuẩn bị bằng công cụ LigX (MOE 2008.10) và ligand đƣợc tối thiểu hóa năng lƣợng bằng Sybyl X2.0. Công cụ FlexX tích hợp trong LeadIT2.1.8 đƣợc sử dụng để thực hiện docking. Kết quả đƣợc phân tích dựa trên sự kết hợp giữa điểm số docking và tƣơng tác giữa phối tử và protein. 10 chất có hoạt tính ức chế arginase 2 mạnh đại diện cho các cấu trúc khác nhau đƣợc chọn làm cơ sở dữ liệu xây dựng mô hình 3D-Pharmacophore. Tập đánh giá gồm 825 chất đƣợc sử dụng để kiểm tra độ tin cậy của mô hình. Ứng dụng mô hình sàng lọc ảo xây dựng đƣợc đem sàng lọc trên thƣ viện 295232 chất từ 4 cơ sở dữ liệu: ZINC, Drug bank, TCM và Natural product nhằm tìm ra các chất có tiềm năng ức chế arginase 2. Kết quả và bàn luận Mô hình 2D-QSAR đƣợc xây dựng trên các chất ức chế arginase 1 có các giá trị R2, RMSE, Q2, CCC lần lƣợt là 0,80; 0,34; 0,73; 0,89 và mô hình trên các chất ức chế arginase 2 là 0,80; 0,33; 0,71; 0,89. Kết quả mô hình QSAR nhị phân trên các chất ức chế arginase 1và arginase 2 có độ đúng đều trên 0,85 chứng tỏ độ chính xác cao của mô hình. Kết quả mô hình docking cho thấy vai trò quan trọng của các nhóm cho liên kết hydro nhƣ nhóm hydroxy, nhóm amino, nhóm carboxyl trong việc tạo liên kết với các acid amin Asp124, His126, Asp234 ở ARG-1 và Asp143, His120, Asp253 ở ARG-2. Mô hình 3D-Pharmacophore trên các chất ức chế arginase 2 đƣợc đề xuất gồm 2 điểm kỵ nƣớc, 2 điểm cho hydro và 1 điểm nhận hydro với độ nhạy, độ đặc hiệu và khả năng dự đoán lần lƣợt là 0,88; 0,93; 0,91. Ứng dụng mô hình dự đoán hoạt tính ức chế arginase trên thƣ viện 295232 chất thu đƣợc 6 chất tiềm năng có hoạt tính ức chế arginase 2. Kết luận Ứng dụng các mô hình sàng lọc ảo trên các chất ức chế arginase 1 và arginase 2 góp phần định hƣớng cho việc tổng hợp và sàng lọc các khung cấu trúc mới có hoạt tính ức chế arginase. Final essay for the degree of MA. In Pharm. – Academic year: 2015 - 2017 IN SILICO MODEL FOR SCREENING COMPOUNDS WITH INHIBITORY ACTIVITY AGAINST ARGINASE 1 AND ARGINASE 2 Nam-Hai Huynh Supervisor: Assoc. Prof. PhD. Khac-Minh Thai Introduction Arginase is a binuclear manganese metallo enzyme that catalyzes hydrolysis of L-arginine to urea and L-ornithine. Increased arginase activity can lead to a variety of diseases, including atherosclerosis, pulmonary hypertension, erectile dysfunction, … Thus, inhibiting arginase is a potential method to treat these diseases. The thesis was conducted to develop in silico models for the detection of novel arginase inhibitor. Materials and methods The 2D-QSAR model was built based on the PLS (MOE 2008.10) method with the database comprised of 43 derivatives of acid 2(S)-amino-6-boronohexanoic with arginase inhibitory activity. On the the database of 465 compounds, the binary QSAR model was built based on the Binary (MOE 2008.10) method. Enzyme arginase 1 (PDB 4HZE) and arginase 2 (PDB 4HWW) were prepared with the LigX application in the MOE 2008.10 software, and the ligands were energy-minimized in the Sybyl-X 2.0 software. The FlexX application in the LeadIT 2.0.2 software was used to conduct the docking process. The results were analyzed based on both the docking scores and the interaction between ligand and protein. 10 compounds with strong inhibitory activity against arginase 2 representing different chemical structures were selected as the database for designing the pharmacophore models. The testing set of 825 compounds was used to validate the predictive capacity of the models. Finally, in silico models were applied to screen 295232 structures from 4 database: ZINC, Drug bank, TCM and Natural product to indentify potential arginase 2 inhibitors. Result and discussion Two 2D-QSAR models were built based on arginase 1 inhibitors and arginase 2 inhibitors, have R2, RMSE, Q2, CCC values 0.80; 0.34; 0.73; 0.89 and 0.80; 0.33; 0.71; 0.89, respectively. The binary QSAR models have accuracy values above 0.8, demonstrating the high accuracies of the models. Docking results demonstrated important role of hydrogen bond donor groups such as hydroxyl group, amino group and carboxyl group toward Asp124, His126, Asp234 in ARG-1 and Asp143, His120, Asp253 in ARG-2. The 3D-pharmacophore models was built based on arginase 2 inhibitors consisted of 2 hydrophobic centers, 2 hydrogen bond donor and 1 hydrogen bond receptors with the sensitivity, the specificity and prediction ability respective 0.88; 0.93; 0.91. Application of models into library of 295.232 structures was resulted in 6 compounds considered as potential arginase 2 inhibitors. Conclusion The application of in silico model for screening compounds with inhibitory activity against arginase 1 and arginase 2 contributes to the synthesis and screening for new compounds with arginase inhibitory activity. MỤC LỤC Đ T VẤN ĐỀ......................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 1.1 ENZYM ARGINASE .................................................................................... 3 1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ ENZYM ARGINASE ................................................ 9 1.3 MÔ HÌNH SÀNG LỌC ẢO ......................................................................... 10 1.4 CÁC NGHIÊN CỨU IN SILICO ĐÃ THỰC HIỆN VỚI ARGINASE. ....... 14 CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................... 16 2.1. XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU .................................................................. 16 2.2. XÂY DỰNG MÔ HÌNH DOCKING .......................................................... 17 2.3. XÂY DỰNG MÔ HÌNH 2D-QSAR ........................................................... 23 2.4. XÂY DỰNG MÔ HÌNH QSAR NHỊ PHÂN .............................................. 31 2.5. XÂY DỰNG MÔ HÌNH 3D-PHARMACOPHORE ................................... 33 2.6. SÀNG LỌC ẢO TRÊN CƠ SỞ DỮ LIỆU .................................................. 39 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ........................................................................................ 40 3.1. MÔ HÌNH DOCKING TRÊN CÁC CHẤT ỨC CHẾ ARG-1 VÀ ARG-2 .. 40 3.2. MÔ HÌNH 2D-QSAR ................................................................................. 62 3.3. MÔ HÌNH QSAR NHỊ PHÂN .................................................................... 70 3.4. MÔ HÌNH 3D-PHARMACOPHORE TRÊN CÁC CHẤT ỨC CHẾ ARG-2 . 79 3.5. ỨNG DỤNG CÁC MÔ HÌNH SÀNG LỌC ẢO TRÊN CÁC CHẤT ỨC CHẾ ARG-2 ...................................................................................................... 85 CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN .................................................................................... 88 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................. 90 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 92 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ tắt Chữ nguyên ABH Acid 2(S)-amino-6-boronohexanoic ARG-2 Enzym arginase 2 ARG-1 Enzym arginase 1 BEC S-(2-boronoethyl)-L-cystein eNOS endothelial Nitric oxide synthases H-ARG Human arginase (enzym arginase của ngƣời) IC50 50% Inhibitory Concentration (nồng độ tối thiểu ức chế 50%) In silico Thực hiện trên máy tính In vitro Thực hiện trong ống nghiệm iNOS cytokine-inducible Nitric oxide synthases LDL Lipoprotein tỉ trọng thấp LOX-1 LDL receptor-1 nNOS neuronal Nitric oxide synthases nor-NOHA N-hydroxy-nor-L-arginin NOS Nitric oxide synthases OAT Ornithineamino Transferase PDB Protein Data Bank (ngân hàng protein) QSAR Quantitative Structure and Activity Relationship (mối quan hệ định lƣợng giữa cấu trúc và tác dụng sinh học) ROCK Rho kinase SMCs Tế bào cơ trơn TCM Cơ sở dữ liệu từ các thuốc cổ truyền Trung Hoa DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Dữ liệu sử dụng trong luận văn .............................................................. 16 Bảng 2.2. Cấu trúc một số chất ức chế ARG-1 và ARG-2 ...................................... 19 Bảng 2.4. Các nhóm thông số mô tả phân tử 2D tính bằng MOE ........................... 24 Bảng 2.5. Tập các chất xây dựng pharmacophore .................................................. 34 Bảng 3.1. Kết quả re-docking ................................................................................ 40 Bảng 3.2. Các chất không dock đƣợc vào khoang gắn kết...................................... 41 Bảng 3.3. Các chất có điểm số docking thấp và giá trị IC50 thấp ............................ 44 Bảng 3.4. Các chất không dock đƣợc vào khoang gắn kết...................................... 51 Bảng 3.5. Các chất có điểm số docking thấp và giá trị IC50 thấp ............................ 52 Bảng 3.6. So sánh khoang gắn kết giữa ARG-1 và ARG-2 .................................... 59 Bảng 3.7. So sánh tƣơng tác của phối tử trên ARG-1 và ARG-2 ............................ 61 Bảng 3.8. Mô hình QSAR trung gian từ tập xây dựng............................................ 62 Bảng 3.9. Bảng tƣơng quan giữa các thông số mô tả .............................................. 63 Bảng 3.10. Kết quả đánh giá nội mô hình 2D-QSAR ............................................. 63 Bảng 3.11. Kết quả đánh giá ngoại mô hình 2D-QSAR ......................................... 64 Bảng 3.12. Mô hình 2D-QSAR hoàn chỉnh............................................................ 64 Bảng 3.13. Mô hình QSAR trung gian từ tập xây dựng .......................................... 66 Bảng 3.14. Sự tƣơng quan giữa các thông số mô tả................................................ 67 Bảng 3.15. Kết quả đánh giá nội mô hình 2D-QSAR ............................................. 67 Bảng 3.16. Kết quả đánh giá ngoại mô hình 2D-QSAR ......................................... 68 Bảng 3.17. Mô hình 2D-QSAR hoàn chỉnh............................................................ 68 Bảng 3.18. Các thông số mô tả đƣợc chọn ............................................................. 70 Bảng 3.19. Kết quả đánh giá mô hình A ................................................................ 71 Bảng 3.20. Kết quả đánh giá mô hình B................................................................. 72 Bảng 3.21. Các thông số mô tả đƣợc chọn ............................................................. 75 Bảng 3.22. Kết quả đánh giá mô hình I .................................................................. 76 Bảng 3.23. Kết quả đánh giá mô hình II................................................................. 77 Bảng 3.24. Tập xây dựng 3D-pharmacophore ........................................................ 79 Bảng 3.25. Đánh giá các pharmacophore trên tập có hoạt tính, tập không hoạt tính81 Bảng 3.26. Đánh giá khả năng chọn lọc của mô hình 3D-pharmacophore .............. 82 Bảng 3.27. Các ngân hàng dữ liệu ......................................................................... 85 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc của ARG-1 và ARG-2 [7] .......................................................... 3 Hình 1.2. Tác động của tăng cƣờng hoạt tính của arginase....................................... 5 Hình 1.3. Phƣơng pháp xây dựng mô hình 2D-QSAR ........................................... 12 Hình 1.4. Phƣơng pháp xây dựng mô hình 3D-pharmacophore .............................. 14 Hình 2.1. Năng lƣợng tối thiểu cục bộ và năng lƣợng tối thiểu toàn phần .............. 21 Hình 2.2. Các bƣớc xây dựng mô hình 2D-QSAR ................................................. 26 Hình 2.3. Loại nhiễu bằng PCA ............................................................................. 27 Hình 2.4. Các bƣớc xây dựng mô hình 3D-Pharmacophore ................................... 34 Hình 2.5. Quy trình sàng lọc .................................................................................. 39 Hình 3.1. Biểu đồ thống kê điểm số docking các chất có điểm số docking âm ....... 43 Hình 3.2. WIPO_2012_058065_130_61 trong khoang xúc tác .............................. 45 Hình 3.3. Tƣơng tác của các chất có hoạt tính ức chế mạnh, điểm số docking tốt .. 47 Hình 3.4. Một số tƣơng tác mới khi thêm nhóm amin ............................................ 48 Hình 3.5. Tƣơng tác mới khi thêm nhóm carboxyl ................................................. 49 Hình 3.6. Biểu đồ thống kê điểm số docking các chất ............................................ 51 Hình 3.7. Khoang xúc tác của ARG-2.................................................................... 53 Hình 3.8. Tƣơng tác của các chất có hoạt tính ức chế mạnh, điểm số docking tốt .. 55 Hình 3.9. Tƣơng tác của WIPO_2012_058065_130_60 (IC50 0,1-250 nM).......... 56 Hình 3.10. Tƣơng tác mới khi thêm nhóm carboxy ................................................ 57 Hình 3.11. Tƣơng tác của nhóm thế amid .............................................................. 57 Hình 3.12. Tƣơng tác của nhóm sulfonamid .......................................................... 58 Hình 3.13. Gióng hàng ARG-1 và ARG-2 ............................................................. 59 Hình 3.14. So sánh khoang gắn kết giữa ARG-1 và ARG-2 ................................... 60 Hình 3.15. Sự tƣơng quan giữa giá trị pIC50 và giá trị dự đoán .............................. 65 Hình 3.16. Tƣơng quan giữa pIC50 dự đoán và pIC50 thực nghiệm ......................... 69 Hình 3.17. Mô hình A10 ........................................................................................ 83 Hình 3.18. So sánh mô hình 3D-pharmacophore và mô hình docking .................... 84 Hình 3.19. Sơ đồ quy trình sàng lọc ....................................................................... 85 Hình 3.20. Kết quả sàng lọc ................................................................................... 87 Đ T VẤN ĐỀ Trong vài năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu tập trung vào enzym arginase ở ngƣời, một metalloenzym với 2 nhân Mn2+ có vai trò xúc tác phản ứng thủy phân L-arginin thành L-ornithin và urea. Arginase có liên quan đến nhiều bệnh bao gồm xơ vữa động mạch, tăng huyết áp phổi, rối loạn chức năng cƣơng dƣơng, hen suyễn, chữa lành các tổn thƣơng, đa xơ cứng, cũng nhƣ một số bệnh nhiệt đới nhƣ sốt rét và leishmaniasis [2]. Việc phát triển những chất tăng cƣờng hay những chất ức chế chọn lọc arginase sẽ giúp làm rõ vai trò của enzym trong cơ chế gây bệnh và ứng dụng trong điều trị. Tuy nhiên, tìm kiếm một chất ức chế mới là một quá trình lâu dài và tốn kém từ giai đoạn tìm ra chất khởi nguồn, tối ƣu hóa, thử in vitro và thử lâm sàng. Chính vì vậy, việc xây dựng các mô hình sàng lọc ảo, để ứng dụng trong sàng lọc số lƣợng lớn các chất có sẵn trong ngân hàng dữ liệu, định hƣớng thiết kế và tổng hợp nhằm mục đích rút ngắn thời gian, công sức và chi phí để tìm ra những chất ức chế arginase là rất cần thiết. Các mô hình này cho phép tìm kiếm nhanh chóng các cấu trúc có khả năng gắn kết cao vào đích tác động từ một ngân hàng dữ liệu lớn của rất nhiều hợp chất hóa học. Tính đến thời điểm hiện tại, nhiều hợp chất đã đƣợc chứng minh có hoạt tính ức chế enzym arginase trên in vitro và mô hình thử nghiệm trên động vật. Những hợp chất này sẽ đƣợc sử dụng để xây dựng mô hình sàng lọc ảo các chất ức chế arginase bằng phƣơng pháp thiết kế thuốc dựa vào phối tử (ligand-based drug design). Mô hình này đƣợc ứng dụng để sàng lọc trên cơ sở dữ liệu các thuốc đang đƣợc sử dụng trên lâm sàng cũng nhƣ các hợp chất mới đƣợc tổng hợp hoặc phân lập từ tự nhiên. Dựa vào các chất sàng lọc đƣợc từ mô hình có thể tìm ra các khung cấu trúc mới có hoạt tính ức chế arginase, góp phần làm đa dạng hóa các chất khởi nguồn để nghiên cứu tối ƣu hóa cấu trúc. 1 Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu xây dựng mô hình sàng lọc ảo trên các chất ức chế arginase 1 và arginase 2” đƣợc thực hiện với mục tiêu nghiên cứu sau: Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu xây dựng mô hình sàng lọc ảo các chất ức chế arginase 1 (ARG-1) và arginase 2 (ARG-2). Mục tiêu cụ thể - Xây dựng mô hình mô tả phân tử docking để đánh giá khả năng gắn kết của các chất ức chế ARG-1 và ARG-2. - Xây dựng mô hình QSAR giúp dự đoán hoạt tính ức chế ARG-1 và ARG-2. - Xây dựng mô hình 3D-pharmacophore để sàng lọc các chất ức chế arginase. - Ứng dụng các mô hình trong việc sàng lọc các cấu trúc sẵn có để tìm ra những cấu trúc có hoạt tính ức chế arginase. 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ENZYM ARGINASE 1.1.1 Cấu trúc của enzym arginase Arginase là một enzym chứa mangan có vài trò chuyển L-arginin thành L-ornithin và urea. Nó đƣợc tìm thấy ở vi khuẩn, nấm, thực vật, động vật không xƣơng sống và có xƣơng sống. Enzym này xuất hiện đầu tiên ở vi khuẩn và đƣợc chuyển qua các tế bào nhân thực thông qua ty thể. Hầu hết các động, thực vật, vi khuẩn, và nấm men chỉ có arginase 2 nằm trong ty thể. Ở động vật khác mà chuyển hóa, đào thải lƣợng dƣ thừa nitơ nhƣ urea xuất hiện một enzym đồng dạng là arginase 1 nằm trong tế bào chất. Enzym arginase 1 thƣờng chỉ xuất hiện ở các loài sinh vật bậc cao [34]. Ở ngƣời, enzym arginase 1 chứa 322 acid amin và arginase 2 chứa 354 acid amin (Hình 1.1). Hai enzym này đƣợc mã hóa bởi các gen riêng biệt và trên những nhiễm sắc thể riêng biệt nhƣng lại giống nhau hơn 50% trình tự các acid amin và tƣơng đồng về chức năng của enzym. Các tiểu đơn vị với vùng hoạt động nằm trong một túi gắn kết sâu 15 Å. Hai ion Mn2+ nằm dƣới đáy của túi này tạo nên trung tâm hoạt động cho enzym. Các tiểu đơn vị thuộc họ α/β, với 8 chuỗi β tồn tại song song bên cạnh các vòng xoắn α. [7] ARG-1 ARG-2 Hình 1.1. Cấu trúc của ARG-1 và ARG-2 [7] 3 1.1.2 Vai trò của enzym arginase Arginase là enzym chuyển hóa L-arginin tạo thành L-ornithin và urea. Phản ứng này là bƣớc cuối cùng trong chu trình chuyển hóa urea ở gan. Ở ngƣời trƣởng thành, trung bình một năm bài tiết khoảng 10 kg urea. Hai dạng của arginase có cơ chế xúc tác giống nhau, đều cần các ion Mn2+ đóng vai trò nhƣ các cofactor. ARG-1 nằm trong tế bào chất và có nhiều ở gan, trong khi ARG-2 nằm trong ty thể và biểu hiện hoạt tính chủ yếu tại thận. Cả 2 dạng này đƣợc tìm thấy ở tế bào nội mô của mạch máu. Các arginase có 2 vai trò chính trong việc hằng định nội mô: thứ nhất, đào thải amoniac thông qua việc tổng hợp urea; thứ hai, sản xuất ornithin tiền thân cho prolin và các polyamin khác. Việc chuyển hóa thành các polyamin thông qua decarboxylase ornithine (ODC) là cần thiết cho sự tăng sinh tế bào và một số kênh ion. Prolin đƣợc sản xuất thông qua ornithineaminotransferase (OAT) là cần thiết cho việc tổng hợp collagen [34]. Các khuyết tật di truyền trong ARG-1 có thể dẫn đến vấn đề sức khỏe nghiêm trọng và thậm chí gây chết ngƣời. Ví dụ: trong tuyến sữa của động vật có vú, hoạt tính arginase tăng cao 25% để cung cấp prolin cho việc tổng hợp các protein sữa. Ornithin cũng là nguồn để tổng hợp các polyamin, trong thời kỳ mang thai hoạt tính arginase tăng 25 lần để cung cấp cho nhu cầu phát triển của thai nhi. Ở những bệnh nhân ung thƣ dạ dày và ung thƣ vú, ngƣời ta cũng nhận thấy có sự tăng cƣờng hoạt tính arginase để đáp ứng nhu cầu tăng sinh mô. Gần đây, ngƣời ta còn phát hiện hoạt tính arginase ở các tế bào ung thƣ đại tràng và ung thƣ vú. Ảnh hƣởng của sự tăng cƣờng hoạt động arginase đƣợc trình bày ở Hình 1.2. Sự tăng cƣờng hoạt động của arginase làm giảm nồng độ L-arginin, một acid amin bán thiết yếu. Việc cung cấp một lƣợng lớn L-arginin đƣợc báo cáo có thể ngăn chặn hoặc đảo ngƣợc rối loạn chức năng nội mô và khôi phục giãn mạch phụ thuộc nội mạc trong bệnh tiểu đƣờng, cao huyết áp và suy tim. Tuy nhiên, một số nghiên cứu ở động vật và con ngƣời không tìm thấy lợi ích khi sử dụng bổ sung lâu dài Larginin [23]. Việc giảm nồng độ L-arginin cũng có thể làm giảm số lƣợng tế bào lympho T trƣởng thành, cho phép sự tăng trƣởng khối u do giảm sự hình thành yếu tố độc tế bào NO bởi iNOS [29]. Tăng hoạt động của arginase làm giảm biểu hiện 4 của enzym iNOS do giảm lƣợng L-arginin cần cho sự dịch mã của iNOS [22]. Khi sự cung cấp L-arginin bị hạn chế, sự tổng hợp NO sẽ giảm đi, thay vào đó NOS sẽ dùng nhiều phân tử oxy hơn để tạo ra các superoxid. Các superoxid sẽ nhanh chóng phản ứng với NO tạo ra các peroxynitrit làm giảm nồng độ NO và bất hoạt NOS thông qua việc oxy hóa cofactor BH4 [18]. Sinh lý mạch bình thường Đào thải Nitơ sản xuất prolin và polyamin Bệnh lý Rối loạn chức năng mạch máu Tăng sản xuất prolin và các polyamin Xơ cứng thành mạch Hình 1.2. Tác động của tăng cƣờng hoạt tính của arginase Arginase và bệnh tim mạch Nhiều vấn đề về tim mạch có liên quan đến việc giảm sản xuất NO ở các tế bào nội mô mạch máu. Nhận ra việc tăng biểu hiện arginase làm giảm L-arginin cần cho tổng hợp NO. Ngoài ra, L-ornithin cũng là yếu tố chính liên quan đến sự thoái hóa và xơ cứng thành mạch. Dƣới đây là những nghiên cứu về những liên quan giữa arginase và bệnh tim mạch. 5 Tăng huyết áp Tăng huyết áp là một yếu tố nguy cơ chính của bệnh tim mạch. Nhiều nghiên cứu trên thú cho thấy mối liên quan giữa hoạt tính ARG-1 ở thành động mạch và tăng huyết áp trong lòng mạch [44]. Trái lại, việc tăng huyết áp ở động mạch phổi lại liên quan đến ARG-2 nhiều hơn. Các vấn đề mạch máu liên quan đến đái tháo đường Đái tháo đƣờng liên quan chặt chẽ với bệnh tim mạch. Đái tháo đƣờng type 1 và type 2 đều kết hợp với các rối loạn chức năng tim mạch. Sự giảm L-arginin trong huyết tƣơng đã đƣợc báo cáo ở bệnh nhân tiểu đƣờng [28, 13] và mô của chuột bị tiểu đƣờng. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự gia tăng hoạt động của arginase liên quan đến bệnh tiểu đƣờng và nồng độ glucose cao trong huyết tƣơng gây ra các rối loạn chức năng ở động mạch chủ, động mạch vành và các động mạch võng mạc [33, 12]. Xơ vữa động mạch Viêm, co mạch và sự hình thành huyết khối có liên quan đến bệnh sinh trong xơ vữa động mạch. Khiếm khuyết chức năng nội mô mạch máu đƣợc coi là một biểu hiện sớm và rất quan trọng trong xơ vữa động mạch, gây ra những bất thƣờng trong lòng động mạch và hình thành mảng bám. Nhiều bằng chứng chỉ ra rằng các sản phẩm oxy hóa của lipoprotein tỉ trọng thấp (OxLDL) là tham gia vào xơ vữa động mạch [35]. Sự tăng hoạt động của arginase đƣợc quan sát trong những bệnh nhân mắc xơ vữa động mạch và OxLDL dƣờng nhƣ là chất gây tăng hoạt động arginase thông qua oxy hóa LDL receptor-1 (LOX-1) và hoạt hóa Rho kinase (ROCK). ARG-2 đƣợc kích hoạt thông qua LOX-1. Tăng hoạt động của arginase gây ức chế eNOS và giảm tổng hợp NO. Hơn nữa, ức chế LOX-1 và ROCK làm suy yếu hoạt động arginase ở tế bào nội mô. Thiếu máu cục bộ cơ tim Tình trạng tăng hoạt tính của arginase huyết thanh đƣợc phát hiện sớm ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp và có sự tƣơng quan với mức độ hoại tử cơ tim. Smirnov và 6 cộng sự đã chứng minh điều này bằng thử nghiệm so sánh sự biểu hiện của arginase trong mô cơ tim ở ngƣời bình thƣờng và ngƣời bị nhồi máu cơ tim. Tăng biểu hiện và hoạt động của arginase đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của bệnh nhồi máu cơ tim, làm giảm sản xuất NO nội sinh dẫn đến suy yếu chức năng giãn mạch phụ thuộc nội mô ở động mạch vành. Các tình trạng trên đã đƣợc cải thiện đáng kể sau khi ức chế hoạt động của arginase. Jung và cộng sự chứng minh rằng sự ức chế hệ thống arginase làm giảm 51% kích thƣớc vùng nhồi máu ở chuột bị thiếu máu cục bộ trong 30 phút. Trong một mô hình thử nghiệm trên heo, truyền vào động mạch vành một chất ức chế arginase (nor-NOHA) 5 phút trƣớc khi tái tƣới máu sẽ làm giảm 50% kích thƣớc vùng nhồi máu [41]. Lão hóa và lão hóa tế bào Tuổi tác gây ra sự lão hóa tế bào nội mô có liên quan đến hoạt động quá mức của arginase ở ngƣời và động vật [3]. Các nghiên cứu ở chuột già đã chỉ ra có sự tăng lên về hoạt tính arginase, giảm số lƣợng NO cũng nhƣ tăng nồng độ superoxid so với chuột non. Hơn nữa, việc ức chế NOS và arginase làm giảm lƣợng superoxide ở chuột già. Bổ sung L-arginin lâu dài làm đẩy nhanh quá trình lão hóa tế bào nội mạc cùng với sự giảm của NO [39]. L-arginin gây ra sự lão hóa tế bào nội mạc đã đƣợc báo cáo liên quan đến tăng biểu hiện của ARG-2. Điều thú vị là, một nghiên cứu gần đây của Xiong và các đồng nghiệp đã chỉ ra rằng ARG-2 có thể gây ra sự lão hóa của SMCs mạch máu bằng một cơ chế liên quan đến sự hoạt hóa của p66Shc và p53 độc lập với hoạt tính của arginase trong chu trình urea. Rối loạn cương dương Có nhiều bằng chứng cho thấy NO là tác nhân gây ra sự cƣơng cứng ở dƣơng vật [9]. nNOS và eNOS là nguồn cung cấp NO cho sự giãn cơ trơn thể hang. Cả ARG-1 và ARG-2 đều hiện diện trong vật hang. Các nghiên cứu ở ngƣời và động vật đã cho thấy một liên kết giữa sự gia tăng hoạt động arginase vật hang và rối loạn chức năng cƣơng dƣơng [4]. Nguyên nhân là do sự cạnh tranh L-arginin với các NOS làm giảm nồng độ NO ở vật hang. 7 Ức chế arginase và ung thư [40] L-Arginin là chất nền phổ biến cho hai enzym, arginase và nitơ oxit synthase (NOS). Arginase chuyển L-arginin thành L-ornithin, tiền thân của các polyamin, là thành phần thiết yếu của sự tăng lên của tế bào. NOS chuyển L-arginin thành NO, ức chế sự phát triển của nhiều dòng tế bào. Các dòng tế bào ung thƣ vú của con ngƣời ban đầu đƣợc sàng lọc cho sự hiện diện của arginase và NOS. Hai dòng tế bào, BT-474 và MDA-MB-468, đƣợc tìm thấy có hoạt tính arginase tƣơng đối cao và hoạt tính NOS rất thấp. Một dòng tế bào khác, ZR-75-30 có biểu hiện hoạt tính NOS cao nhất và hoạt động arginase tƣơng đối thấp. Tốc độ tăng trƣởng của dòng tế bào MDA-MB-468 và BT-474 cao hơn dòng tế bào ZR-75-30. N-Hydroxy-Larginin (NOHA), một sản phẩm trung gian đƣợc hình thành trong quá trình chuyển đổi L-arginin thành NO, ức chế sự tăng sinh của các tế bào MDA-MB-468 có biểu hiện arginase cao và gây ra hiện tƣợng các tế bào tự chết theo chƣơng trình (apoptosis) sau 48 giờ. NOHA tác động đến những tế bào này trong pha S, làm tăng sự biểu hiện của p21 và giảm hàm lƣợng spermin. Những ảnh hƣởng của NOHA không đƣợc quan sát thấy ở dòng tế bào ZR-75-30, dòng tế bào biểu hiện NOS cao và arginase tƣơng đối thấp. Tác dụng của NOHA bị đối kháng nếu có sự hiện diện của L-ornithin (500 μM), trên dòng tế bào MDA-MB-468, thể hiện sự chuyển hóa qua arginase rất quan trọng đối với tăng trƣởng của tế bào. Ức chế arginase dẫn đến suy giảm spermin nội bào và các tế bào tự chết theo chƣơng trình đƣợc quan sát trong thử nghiệm định lƣợng đầu cuối deoxynucleotidyl transferase và sự cảm ứng caspase 3. Ngƣợc lại, dòng tế bào ZR-75-30 duy trì khả năng sống sót, nồng độ và L-ornithin và spermin với sự hiện diện của NOHA. Nghiên cứu đã kết luận rằng NOHA có ức chế sự tăng sinh tế bào và gây hiện tƣợng chết theo chƣơng trình ở tế bào ung thƣ vú có biểu hiện arginase, tác dụng này độc lập với NO. 8 1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ ENZYM ARGINASE Các chất ức chế arginase đầu tiên đƣợc phát triển thƣờng có tác dụng không chọn lọc và có nhiều tác dụng phụ do phải sử dụng với nồng độ cao. Ví dụ, norvalin có khả năng ức chế arginase nhƣng cũng là chất nền của amidotransferase [8]. Tƣơng tự, N-hydroxy-nor-L-arginin (nor-NOHA) là một chất ức chế mạnh cho arginase, nhƣng nó cũng là một là chất trung gian trong sản xuất NO từ L-arginin bởi NOS. α-Difluoromethylornithine có tác dụng ức chế nhẹ arginase mà không ức chế NOS. Tuy nhiên, nó lại ức chế decarboxylase ornithine [25]. Bên cạnh sản xuất urea, arginase cũng tham gia vào tổng hợp của polyamin và acid amin nhƣ ornithin, prolin và glutamat. Trong thực tế ornithin, leucin, valin, lysin, isoleucin và nor-valin đều có khả năng ức chế arginase, nhƣng ornithin là mạnh nhất [15]. Thời gian gần đây, các chất ức chế cạnh tranh arginase đã đƣợc phát triển với tính đặc hiệu cao hơn. Cấu trúc tinh thể của ARG-1 và ARG-2 đƣợc xác định đã mở đƣờng cho việc phát triển các chất ức chế đặc hiệu [10]. Dẫn xuất acid boronic của L-arginin [S-(2-boronoethyl)-L-cystein (BEC) và 2(S)-amino-6-boronohexanoic acid (ABH)] là những chất ức chế arginase có độ chọn lọc cao. Cả hai đều chứa acid boronic hay N-hydroxyguanidinium ở đầu có khả năng gắn kết với các cụm mangan, vùng xúc tác của arginase [3]. Một vài chất ức chế arginase đã đƣợc thƣơng mại hóa nhƣ nor-NOHA, BEC và ABH. Mặc dù đã có nhiều chất ức chế chuyên biệt đƣợc phát triển nhƣng chƣa có chất nào có khả năng ức chế chọn lọc isoform. Trong một vài trƣờng hợp sự tăng cƣờng biểu hiện arginase có tác dụng có lợi, trong các trƣờng hợp khác lại có hại. Ví dụ: sự tăng cƣờng biểu hiện của ARG-2 trên đại thực bào có liên quan đến tiến triển bệnh xơ vữa động mạch [37]. Trong khi sự tăng cƣờng biểu hiện của ARG-1 trên đại thực bào lại tăng cƣờng phân giải các mảng bám [36, 27]. Điều này có liên quan đến sửa chữa chức năng của các mô bị tổn thƣơng, trong khi hoạt động quá mức của ARG-2 xuất hiện khi có những bệnh lý hoặc tổn thƣơng ở hệ thần kinh trung ƣơng. Vì không có các chất ức chế chọn lọc, nên biện pháp can thiệp RNA đƣợc dùng để 9