Tài liệu Nghiên cứu tổng hợp dẫn chất carboxymethyl beta cyclodextrin từ beta cyclodextrin để ứng dụng trong phân tích dược chất quang hoạt bằng phương pháp điện di mao quản 2017 hđ nckh

. BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP DẪN CHẤT CARBOXYMETHYL BETA CYCLODEXTRIN TỪ BETA CYCLODEXTRIN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH DƢỢC CHẤT QUANG HOẠT BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN /2017/HĐ-NCKH Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Thị Minh Phƣơng ThS. Trần Quốc Thanh Tp. Hồ Chí Minh 9-2018 . . BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP DẪN CHẤT CARBOXYMETHYL BETA CYCLODEXTRIN TỪ BETA CYCLODEXTRIN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH DƢỢC CHẤT QUANG HOẠT BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN /2017/HĐ-NCKH Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Tp. Hồ Chí Minh, 9-2018 . . Danh sách những thành viên tham gia nghiên cứu đề tài PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn ThS. Nguyễn Thị Minh Phƣơng ThS. Trần Quốc Thanh Nguyễn Thị Kiều Hảo . . MỤC LỤC 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 13 2. TỔNG QUAN ........................................................................................................... 15 2.1. TỔNG QUAN VỀ β-CYCLODEXTRIN ............................................................... 15 2.2. TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP TỔNG HỢP CARBOXYMETHYL β – CYCLODEXTRIN TỪ β –CYCLODEXTRIN ............................................................. 16 3. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 17 3.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................................ 17 3.2. NGUYÊN LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU .................................... 18 3.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................................... 19 3.3.1. Khảo sát quy trình tổng hợp ................................................................................. 19 3.3.2. Xác định cấu trúc và độ tinh khiết của sản phẩm................................................. 20 3.3.3. Tối ƣu hóa quy trình tổng hợp carboxymethyl β-cyclodextrin ............................ 21 4. KẾT QUẢ ................................................................................................................. 25 4.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT QUY TRÌNH TỔNG HỢP CARBOXYMETHYL βCYCLODEXTRIN ......................................................................................................... 25 4.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT VÀ CẤU TRÚC SẢN PHẨM CM.... 26 4.3. KẾT QUẢ TỐI ƢU HÓA QUY TRÌNH TỔNG HỢP CARBOXYMETHYL-CYCLODEXTRIN ......................................................................................................... 31 5. KẾT LUẬN ............................................................................................................... 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC . . DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT β-CD : Beta-cyclodextrin CD : Cyclodextrin DMSO DS : Dimethyl sulfoxid : Độ thế (Degree of Substitution) EtOAc : Ethyl acetat IPA : Isopropyl alcohol IR : Phổ hồng ngoại (Infrared Spectrophotometry) m : Multiplet (mũi đa) MCA : Acid monocloroacetic MS : Khối phổ (Mass Spectrometry) NMR : Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) Phổ 1H-NMR pic : Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton : Đỉnh, mũi TLC : Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) . . DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Các thiết bị dùng trong đề tài......................................................................... 19 Bảng 3.3. Bảng mã hóa các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu suất phản ứng ......................... 22 Bảng 3.4. Ma trận quy hoạch thực nghiệm .................................................................... 23 Bảng 4.1. Kết quả Rf của sản phẩm CM trong 2 hệ dung môi ...................................... 27 Bảng 4.2. Dữ liệu phổ IR của sản phẩm CM1 ............................................................... 28 Bảng 4.3. Phân tích dữ liệu phổ ESI-MS (+) của sản phẩm CM1 ................................. 29 Bảng 4.4. Biện giải phổ 1H-NMR (D2O, 500 MHz) của sản phẩm CM1 ..................... 29 Bảng 4.5. Biện giải phổ 13C-NMR (D2O, 125 MHz ) của sản phẩm CM ...................... 31 Bảng 4.6. Sự thay đổi hiệu suất các phản ứng theo thời gian. ....................................... 31 Bảng 4.7. Sƣ thay đổi hiệu suất các theo nhiệt độ ......................................................... 32 Bảng 4.8. Sự thay đổi hiệu suất phản ứng theo tỉ lệ mol MCA và β-CD ...................... 34 Bảng 4.9. Sự thay đổi hiệu suất phản ứng theo tốc độ khuấy ........................................ 34 Bảng 4.10. Khoảng giá trị khảo sát của các yếu tố ........................................................ 35 Bảng 4.11. Kết quả quy hoạch thực nghiệm .................................................................. 35 Bảng 4.12. Các thông số tối ƣu dự đoán bởi công cụ Prediction Optimizer ................. 40 Bảng 4.13. Kết quả phản ứng ở điều kiện dự đoán ........................................................ 40 . . DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Công thức cấu tạo và cấu trúc 3D của β-CD.................................................. 15 Hình 4.1. Sắc ký lớp mỏng của nguyên liệu β-CD và sản phẩm CM ............................ 27 Hình 4.2. Cấu trúc CM-β-CD ......................................................................................... 28 Hình 4.3. Ảnh hƣởng của thời gian lên hiệu suất phản ứng .......................................... 32 Hình 4.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng ........................................... 33 Hình 4.5. Ảnh hƣởng của tỉ lệ mol MCA và β-CD đến hiệu suất phản ứng.................. 34 Hình 4.7. Kết quả về sự tƣơng quan giữa các yếu tố lên hiệu suất phản ứng đƣợc xuất ra từ phần mềm. ...................................................................................................... 36 Hình 4.8. Tƣơng quan giữa các yếu tố với hiệu suất và giữa các yếu tố với nhau ........ 37 Hình 4.9. Mô hình bề mặt đáp ứng 3D của các yếu tố đối với hiệu suất ....................... 39 Hình 4.10. Mô hình bề mặt đáp ứng của hiệu suất theo các đƣờng đồng mức .............. 39 Hình 4.11. Đƣờng biểu diễn hiệu suất ở các điều kiện phản ứng .................................. 39 . . DANH MỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: PHỔ IR CỦA NGUYÊN LIỆU β- CYCLODEXTRIN PHỤ LỤC 2: PHỔ IR CỦA SẢN PHẨM CARBOXYMETHYL βCYCLODEXTRIN (CM) PHỤ LỤC 3: PHỔ ESI-MS (+) CỦA SẢN PHẨM CM PHỤ LỤC 4: PHỔ 1H-NMR (D2O, 500 MHZ) MỞ RỘNG CỦA SẢN PHẨM CM PHỤ LỤC 5: PHỔ 13C-NMR (D2O, 125 MHZ) MỞ RỘNG CỦA SẢN PHẨM CM . . THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG 1. Thông tin chung: - Tên đề tài: Nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất carboxymethyl β-cyclodextrin từ βcyclodextrin để ứng dụng trong phân tích dƣợc chất quang hoạt bằng phƣơng pháp điện di mao quản - Mã số: - Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Minh Phƣơng Điện thoại: 0909810668 Email: [email protected] - Đơn vị quản lý về chuyên môn (Khoa, Tổ bộ môn): Bộ môn PT-KN, khoa Dƣợc - Đồng chủ nhiệm đề tài: Trần Quốc Thanh Điện thoại: 0903389214 Email: [email protected] - Đơn vị quản lý về chuyên môn (Khoa, Tổ bộ môn): Bộ môn Bào chế, khoa Dƣợc - Thời gian thực hiện: 10/2017 – 10/2018 2. Mục tiêu: Xây dựng qui trình tổng hợp dẫn chất carboxymethyl β-cyclodextrin từ β-cyclodextrin 3. Nội dung chính: - Khảo sát các điều kiện tổng hợp dẫn chất carboxymethyl β-cyclodextrin. - Tối ƣu hóa các điều kiện tổng hợp theo mô hình Box-Behnken - Xây dựng qui trình tổng hợp dẫn chất carboxymethyl β-cyclodextrin từ βcyclodextrin. 4. Kết quả chính đạt đƣợc (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, ...) - Xây dựng và tối ƣu hóa đƣợc quy trình tổng hợp methoxcarbonyl β-cyclodextrin ở điều kiện tối ƣu là: thời gian 7 giờ, nhiệt độ 59 C, tỉ lệ mol giữa acid . . monocloroacetic và β-cyclodextrin 26,7; đạt hiệu suất dự đoán là 79,50%. Hiệu suất thực nghiệm tối ƣu là 78,01%. Sản phẩm carboxymethyl-β-cyclodextrin xác định cấu trúc phù hợp với DS=8. - Công bố bài báo trên tạp chí Y học TpHCM chuyên đề Dƣợc, phụ bản tập 22, số 1, 2018 . 3. 1. MỞ ĐẦU Hiện nay các xí nghiệp dƣợc phẩm trong và ngoài nƣớc đang cạnh tranh mạnh mẽ trong việc nghiên cứu đƣa ra thị trƣờng chế phẩm của các dạng đồng phân riêng lẻ nhƣ: S-amlodipin, levofloxacin, levocetirizin, S-omeprazol, ....có tác dụng tốt hơn, ít tác dụng phụ và ít độc tính hơn dạng racemic. Ví dụ levofloxacin là đồng phân Lcủa ofloxacin, có tác dụng diệt khuẩn mạnh gấp 8 - 128 lần so với đồng phân D- và khoảng 2 lần so với ofloxacin racemic. [3] Nhƣ vậy, việc phân tách các đồng phân quang học ngày càng trở thành một vấn đề quan trọng trong lĩnh vực kiểm nghiệm dƣợc phẩm trên thế giới nói chung và ở nƣớc ta nói riêng. Điều kiện tiên quyết trong các phƣơng pháp dùng để phân tách các dƣợc chất quang họạt nhƣ sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), điện di mao quản (CE) đó chính là phải có tác nhân quang hoạt phù hợp, đôi khi cần phải phối hợp nhiều tác nhân quang hoạt với nhau. Các tác nhân quang hoạt thông dụng nhất là -cyclodextrin (-CD) và dẫn xuất của -CD [4] [5] [6] [7] [11] [12] [13], hiện nay các dẫn xuất của -CD thƣơng mại còn ít, giá thành cao. Để tiếp tục phát triển kỹ thuật điện di mao quản và góp phần ứng dụng kỹ thuật này vào việc phân tách các đồng phân quang học, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi trong việc kiểm tra chất lƣợng các thuốc chứa hoạt chất có tính quang hoạt. Đồng thời sẽ giảm bớt chi phí cho các nhà phân tích, nhất là trong điều kiện còn nhiều khó khăn ở các phòng thí nghiệm nƣớc ta. Chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp và tối ƣu hóa quy trình tổng hợp dẫn chất carboxymethyl β-CD từ β-CD để ứng dụng trong phân tích dƣợc chất quang hoạt bằng phƣơng pháp điện di mao quản”.với những mục tiêu: - Khảo sát các điều kiện về nhiệt độ, thời gian phản ứng, tỷ lệ chất tham gia phản ứng,… để xác định các yếu tố ảnh hƣởng hiệu suất của quá trình tổng hợp dẫn chất carboxymethyl β-CD. - Dùng phần mềm tối ƣu hóa các điều kiện phản ứng theo mô hình BoxBehnken. . 4. - Xây dựng qui trình tổng hợp dẫn chất carboxymethyl β-CD từ βcyclodetrin. - Tinh chế đƣợc sản phẩm carboxymethyl β-CD. . 5. 2. TỔNG QUAN 2.1. TỔNG QUAN VỀ β-CYCLODEXTRIN β-CD hay còn gọi là cyclomaltodextrin là oligosacchrid vòng của 7 đơn vị Dglucopyranose liên kết với nhau bởi cầu nối α-1,4 glucosid, các đơn vị glucose có cấu trúc dạng ghế (Hình 2.1) nên phân tử β-CD có dạng hình nón cụt, bên trong là khoang rỗng. Do đó β-CD có thể hình thành phức hợp chủ thể-khách thể nhờ tƣơng tác nội phân tử với nhiều loại khách thể khác nhau bao gồm các phân tử chất hữu cơ, ion vô cơ, hợp chất vô cơ và hữu cơ, thậm chí có thể tạo phức với các khí. [4] [6] [7] Khối lƣợng phân tử: 1134,98 Đƣờng kính khoang : 6,0-6,5 Å Độ tan trong nƣớc ở 25 C: 1,85 g/100ml Nhiệt độ nóng chảy: 255-265 C Năng suất quay cực: = 162 ± 3 OH HO O OH O HO O O OH O HO HO OH OH O O HO HO O HO O OH HO O HO OH HO OH O OH O HO O O HO Hình 2.1. Công thức cấu tạo và cấu trúc 3D của β-CD β-CD dù có độ tan là thấp nhất nhƣng đƣợc sử dụng thông dụng nhất vì là dạng CD tự nhiên phổ biến và giá rẻ. [7] Để cải thiện độ tan của β-CD khuynh hƣớng hiện nay của các nhà khoa học là dùng β-CD để tạo các dẫn xuất có độ tan trong nƣớc tốt hơn nhƣ dẫn xuất methyl, . 6. hydroxypropyl, carboxymethyl,… khi đó đƣờng kính của β-CD không bị thay đổi nhƣng chiều sâu các lỗ hang giảm xuống. Mục đích biến đổi này là nhằm thay đổi độ hòa tan, thay đổi khả năng tạo phức (độ bền phức, độ chọn lọc khách thể …) hoặc thêm các nhóm chức năng đặc hiệu làm xúc tác. [2] [5] Đối với các dẫn xuất của β-CD, có thêm khái niệm là độ thế (DS). DS là số trung bình của các nhóm hydroxyl bị thế bởi một nhóm chức khác trên phân tử β-CD. Vì β-CD có 7 đơn vị mắt xích glucopyranose và mỗi mắt xích glucopyranose có 3 nhóm hydroxyl nên dẫn xuất β-CD sẽ có DS tối đa là 21. 2.2. TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP TỔNG HỢP CARBOXYMETHYL β –CYCLODEXTRIN TỪ β –CYCLODEXTRIN Phản ứng gắn nhóm methoxcarbonyl vào các gốc hydroxyl ở vị trí carbon số 2, 3 và 6 của phân tử β-CD có bản chất là phản ứng thế ái nhân. [4] Dẫn chất CM-β-CD lần đầu tiên đƣợc tổng hợp năm 1967 bởi Parmerter và cộng sự từ phản ứng giữa β-CD và natri monocloroacetat trong môi trƣờng hỗn hợp 2propanol và nƣớc; sản phẩm tổng hợp đƣợc có độ thế 0,066. Sau đó, để cải thiện độ tan của sản phẩm, Lammer và cộng sự đã tổng hợp dẫn chất muối natri của CM-βCD với phƣơng pháp tƣơng tự. Cơ chế phản ứng thế carboxymethyl- β-CD OCH2COO  OH O O O + Cl HO OH NaOH, to OH O OOCH2CO O O 7 -Cyclodextrin O  OCH2COO  7 Carboxymethyl--Cyclodextrin Một số quy trình tổng hợp carboxymethyl trên thế giới: - Quy trình 1 [ A.Z.M. Badruddoza, A.S.H. Tay, P.Y. Tan, K. Hidajat, M.S. Uddin, 2010]: Cho hỗn hợp 10 g β-CD ( 8,8 mmol) và 9,3 g NaOH (232,7 mmol) trong 37 ml nƣớc phản ứng với 27 ml dung dịch acid monocloroacetic nồng độ 16,3%. Đun . 7. hồi lƣu, khuấy trộn trong 5 giờ ở 50 0C. Sau đó điều chỉnh đến pH= 6 – 7 bằng acid clohydric. Kết tủa trong lƣợng dƣ methanol. Lọc và sấy dƣới áp suất giảm. Kết quả thu đƣợc 6 g CM-β-CD; DS=3,1; H%=51,79% [1] . - Quy trình 2 [Stanley M. Parmerter và cộng sự, 1967]: Cho 50 g β-CD vào 200 ml 2-propanol, vừa khuấy đều vừa thêm 100 ml dd NaOH 30%. Khuấy đều trong 30 phút. Thêm từ từ 18 g natri monocloroacetat trong 30 phút. Khuấy liên tục qua đêm ở 55 0C. Trung hòa hỗn hợp sau phản ứng bằng HCl đến pH=7. Tủa sản phẩm bằng 2 lít methanol. Lọc thu tủa. Tiếp tục lọc thu tủa từ dịch lọc 3 lần nữa. Sản phẩm đƣợc xác định là CM-β-CD với DS=0,066 (theo tài liệu này thì không có hiệu suất phản ứng hay khối lƣợng sản phẩm thu đƣợc) [10]. Hiện nay, hầu hết các tác giả đều thực hiện phản ứng giữa β-CD và acid monocloroacetic (MCA) trong môi trƣờng nƣớc, trong điều kiện xúc tác kiềm mạnh nhƣ natri hydroxyd. Sản phẩm đƣợc tinh chế bằng methanol nhƣng có một số điểm khác nhau nhƣ: - Hỗn hợp sau phản ứng hoặc đƣợc trung tính hóa [8], hoặc không [9]. - Kết tủa sản phẩm trong hỗn hợp methanol – nƣớc với tỷ lệ nƣớc thay đổi hoặc methanol dƣ. 3. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu là dẫn xuất carboxymethyl β-CD đƣợc tổng hợp từ nguồn nguyên liệu ban đầu là β-CD với tác nhân là DMC, sản phẩm đƣợc tạo thành do sự gắn nhóm carboxymethyl ở các vị trí -OH của β-CD trong môi trƣờng kiềm. Carboxymethyl β-CD: R = −CH2COOH hoặc –H. . 8. Sản phẩm đƣợc tinh chế bằng cách hòa tan lại trong nƣớc rồi tủa lại trong các dung môi nhƣ methanol, acetone,.. để xác định cấu trúc và độ tinh khiết. Sau đó tiến hành tối ƣu hóa quy trình tổng hợp cho hiệu suất tối ƣu nhất. 3.2. NGUYÊN LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 3.2.1. Nguyên liệu – Hóa chất β-Cyclodextrin Nguồn gốc: Himedia Hàm lƣợng: ≥ 99% Công thức phân tử: C42H70O35 Công thức cấu tạo: Khối lƣợng phân tử: 1135,0 g/mol Năng suất quay cực: +162,0 Acid monocloroacetic Nguồn gốc: Sigma-Aldrich Công thức phân tử: C2H3ClO2 Hàm lƣợng: ≥ 99% Công thức cấu tạo: . 9. Khối lƣợng phân tử: 94,50 g/mol Năng suất quay cực: 61,0 – 63,0o Nhiệt độ sôi: 189,0 C Kali carbonat, dung dịch amoniac, ethanol tuyệt đối, isopropyl alcohol, aceton, diethyl ether, ethyl acetat: nguồn gốc: Trung Quốc 3.2.2. Dụng cụ, thiết bị Bảng 3.1. Các thiết bị dùng trong đề tài STT Tên thiết bị Mã số Nguồn gốc 1 Cân kỹ thuật TE412 Sartorius Đức 2 Cân phân tích PRACTUM 224-1S Sartorius Đức 3 Máy bơm chân không DOA P504ABN Gast Mỹ 4 Máy cô quay áp suất giảm R 210S Buchi Thụy Sĩ 5 Máy đo phổ IR Shimazdu Nhật 6 Máy đo phổ MS Bruker Đức 7 Máy đo phổ NMR Bruker Đức 8 Máy khuấy từ có gia nhiệt Stuart CB162 Anh 9 Tủ sấy WM 500CO Memmert Đức Phần mềm Modde 5.0: Tối ƣu hóa các yếu tố của quy trình tổng hợp ảnh hƣởng đến hiệu suất của phản ứng. Phần mềm Excel 2010: Phân tích thống kê dữ liệu và vẽ đồ thị. 3.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Khảo sát quy trình tổng hợp Cho vào bình cầu 1 g β-CD (0,88 mmol), thêm 3 g natri hydroxyd (0,075 mmol) đã đƣợc hòa tan trong 7 ml nƣớc, đun hồi lƣu ở 80 0C trong 1 giờ 30 phút. Thêm 3g MCA (31,75 mmol) đã hòa tan trong 3 ml nƣớc vào hỗn hợp phản ứng, tiếp tục đun ở 120 0C, tiến hành chấm sắc ký lớp mỏng theo dõi sự tạo thành của sản phẩm theo thời gian. . 0. Điều chỉnh pH hỗn hợp sau phản ứng đên pH = 6. Thu sản phẩm bằng cách thêm 150 ml methanol vào dung dịch sau phản ứng, lọc thu lấy tủa. Tủa đƣợc hòa lại trong 4 ml nƣớc cất, tủa lại trong 80 ml methanol. Rửa sản phẩm bằng methanol 3 lần, mỗi lần 5 ml. Sản phẩm đƣợc sấy ở 60 0C. 3.3.2. Xác định cấu trúc và độ tinh khiết của sản phẩm 3.3.2.1. Phƣơng pháp xác định độ tinh khiết - Sắc ký lớp mỏng (TLC): Dịch chấm sắc ký: β-CD và sản phẩm đƣợc hòa tan trong nƣớc Hệ dung môi khai triển : 2 hệ Isopropyl alcohol – Nƣớc – Etthyl acetat (5 : 4: 1) Butanol – Nƣớc – Ethanol (3 : 3,5 : 2) Phát hiện bằng hơi iod bão hòa - Nhiệt độ nóng chảy: đƣợc xác định trên máy đo điểm chảy Gallenkamp Sanyo. - Năng suất quay cực: Hòa tan mẫu trong nƣớc, nồng độ mẫu đo khoảng 0,1%. 3.3.2.2. Phƣơng pháp xác định cấu trúc Phổ hồng ngoại (IR) đƣợc đo trên máy quang phổ hồng ngoại Shimazdu (Nhật) tại Bộ môn Hóa hữu cơ, Khoa Dƣợc, Đại Học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR): Phồ 1H-NMR và 13C-NMR đo trong dung môi D2O, tần số máy lần lƣợt 500 MHz và 125 MHz tại trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh. Khối phổ (MS) đo trên máy Bruker LC-MS tại trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh. 3.3.2.3. Xác định DS và tính hiệu suất Tính DS dựa vào phổ 1H-NMR (D2O, 500 MHz) của sản phẩm thu đƣợc. Tính hiệu suất phản ứng: . 1. H(%) = 100 mlt = M1 Trong đó: - H: hiệu suất của phản ứng - mc: khối lƣợng cân CM-β-CD - mlt: khối lƣợng lý thuyết CM-β-CD - m0: khối lƣợng cân β-CD - M0: khối lƣợng phân tử β-CD - M1: khối lƣợng phân tử CM-β-CD 3.3.3. Tối ƣu hóa quy trình tổng hợp carboxymethyl β-cyclodextrin Đề tài sẽ tiến hành khảo sát sự ảnh hƣởng của các yếu tố đến hiệu suất phản ứng nhƣ: thời gian phản ứng, nhiệt độ phản ứng, tỉ lệ mol của MCA và β-CD, tốc độ khuấy, khảo sát khoảng giới hạn ảnh hƣởng và chọn ra 3 yếu tố có ảnh hƣởng nhất để tiến hành tối ƣu hóa nhờ sự trợ giúp của phần mềm Modde 5.0. 3.3.3.1. Khảo sát yếu tố thời gian Để đánh giá ảnh hƣởng của thời gian tới hiệu suất phản ứng, tiến hành phản ứng ở các thời gian khác nhau trong khoảng 3 – 8 giờ, nhiệt độ đƣợc giữ cố định ở 70 0C, tỉ lệ mol giữa MCA và β-CD là 15. Thời gian đƣợc tính kể từ khi nhiệt độ dịch phản ứng đạt nhiệt độ khảo sát. Xác định thời gian tại đó đạt hiệu suất phản ứng cao nhất để tiến hành các phản ứng khảo sát tiếp theo. 3.3.3.2. Khảo sát yếu tố nhiệt độ Khảo sát sự ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng, tiến hành phản ứng ở các nhiệt độ khác nhau trong khoảng 50 – 80 0C, tỉ lệ mol giữa MCA và β-CD là 15. Thời gian phản ứng là thời gian cho hiệu suất cao nhất trong khoảng đã khảo sát. Xác định nhiệt độ tại đó hiệu suất phản ứng đạt giá trị cao nhất. . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 22 3.3.3.3. Khảo sát tỉ lệ mol giữa MCA và β-CD Tiến hành các phản ứng ở thời gian và nhiệt độ cho hiệu suất phản ứng cao nhất ở các khoảng đã khảo sát. Tỉ lệ mol giữa MCA và β-CD đƣợc khảo sát ở các mức 15, 20, 25, 30, 35. Xác định tỉ lệ mol giữa MCA và β-CD mà tại đó hiệu suất phản ứng cao nhất. 3.3.3.4. Khảo sát tốc độ khuấy Tiến hành các phản ứng ở thời gian, nhiệt độ và tỉ lệ mol giữa acid monocloroacetic: β-CD cho hiệu suất phản ứng cao nhất ở các khoảng đã khảo sát. Tốc độ khuấy đƣợc khảo sát ở các mức 1; 1,5; 2; 2,5 tƣơng ứng với khoảng 170 vòng/phút với 425 vòng/phút. Xác định tốc độ khuấy mà tại đó hiệu suất phản ứng cao nhất. 3.3.3.5. Bố trí thí nghiệm và xác định các thông số tối ƣu theo mô hình BoxBehnken Để tìm ra đƣợc thông số của các yếu tố cho hiệu suất cao nhất, sử dụng phần mềm Modde 5.0 để bố trí thí nghiệm 3 yếu tố ở các mức đã giới hạn theo mô hình BoxBehnken, với tổng số thí nghiệm là 15 (Bảng 3.4), trong đó có 12 thí nghiệm biên và 3 thí nghiệm trung tâm. Các yếu tố khảo sát sẽ đƣợc mã hóa trong hệ tọa độ không thứ nguyên với tọa độ của mức cơ sở bằng 0, trùng với gốc hệ trục tọa độ. Các yếu tố mã hóa sẽ nhận 2 giá trị -1 và +1 tƣơng ứng với mức dƣới và mức trên của mức cơ sở. 3 yếu tố đƣợc chọn để bố trí thí nghiệm lần lƣợt là X1, X2, X3, ta có bảng mã hóa các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu suất (Bảng 3.3) và ma trận quy hoạch thực nghiệm (Bảng 3.4). Bảng 3.2. Bảng mã hóa các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu suất phản ứng Yếu tố X1 . Các mức Mức dƣới -1 Mức cơ sở 0 Mức trên +1 n n0 N