Tài liệu Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa và đánh giá một số tác dụng sinh học của sâm việt nam (panax vietnamensis ha et grushv., araliaceae)

. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH DƯƠNG HỒNG TỐ QUYÊN NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA SÂM VIỆT NAM (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV., ARALIACEAE) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP. HỒ CHÍ MINH, Năm 2019 . . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH DƯƠNG HỒNG TỐ QUYÊN NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA SÂM VIỆT NAM (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV., ARALIACEAE) NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 62720406 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. GS.TS. NGUYỄN MINH ĐỨC 2. PGS.TS. NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG TP.HỒ CHÍ MINH, Năm 2019 . . LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố ở bất kỳ nơi nào. Tác giả luận án Dương Hồng Tố Quyên . . MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.....................................................................ii DANH MỤC CÁC BẢNG.......................................................................................v DANH MỤC CÁC HÌNH.....................................................................................vii MỞ ĐẦU..................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................3 1.1. TỔNG QUAN VỀ CHI PANAX.......................................................................3 1.2. SÂM VIỆT NAM..........................................................................................15 1.3. NGHIÊN CỨU VỀ TIÊU CHUẨN HÓA SÂM VIỆT NAM.......................27 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP..............................................32 NGHIÊN CỨU.......................................................................................................32 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.......................................................................32 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................................35 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.............................................................58 3.1. XÂY DỰNG VÀ ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ SAPONIN TRONG SÂM VIỆT NAM TRỒNG...........................58 3.2. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN SÂM VIỆT NAM TRỒNG............................82 3.3. ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA SÂM VIỆT NAM TRỒNG 6 TUỔI............................................................................................86 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN...................................................................................110 4.1. XÂY DỰNG VÀ ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI MỘT SỐ SAPONIN TRONG SÂM VIỆT NAM TRỒNG........................ .110 4.2. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN SÂM VIỆT NAM TRỒNG..........................115 4.3. ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA SÂM VIỆT NAM TRỒNG 6 TUỔI...........................................................................................117 KẾT LUẬN..........................................................................................................134 KIẾN NGHỊ.........................................................................................................136 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN........................ TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... . . DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt ADN AOAC AST ALT AF AAPH CCl4 CY CS. DCF-DA DĐVN DAD EC50 EDTA ELSD EP ESI FST GGABA GSH HPLC HEPES I.P LD50 MDA MMS NO NS OD OCT P. PPD Từ đầy đủ Acid deoxyribonucleic Aspartate aminotransferase Alanine aminotransferase Asymetric factor (2,2’- azobis (2-amidinopropane hydrochloride)) Carbon tetrachlorid Cyclophosphamide Cộng sự 2’,7‘-Dichlorodihydrofluoresceindiacetat Dược điển Việt Nam Diode Array Detector Effective Concentration 50% Ethylenediaminetetra acid Evaporative light scattering detector European Pharmacopeia Electrospray Ionization Forced swimming test Ginsenoside Gamma-aminobutyric acid Glutathione High Perfomance Liquid Chromatography (4-(2-hydroxyethyl)-1piperazineethanesulfonic acid) Intraperitoneally Lethal dose 50% Malonyl dialdehyde Majonoside Mass Spectroscopy Nitrogen oxide Nhân sâm Optical Density Ocotillol Panax Protopanaxadiol . Nghĩa tiếng Việt Hệ số bất đối Cyclophosphamid Detector dãy diốt quang Nồng độ kháng oxy hóa 50% Acid Ethylenediaminetetra Đầu dò tán xạ ánh sáng bay hơi Dược điển Châu Âu Ion hóa phun điện Thực nghiệm bơi bắt buộc Ginsenosid Acid aminobutyric Glutathion Sắc ký lỏng hiệu năng cao Acid (4-(2-hydroxyethyl)-1piperazineethanesulfonic) Tiêm phúc mô Liều chết 50% Malonyl dialdehyd Saponin majonosid Phổ khối Mật độ quang Saponin nhóm ocotillol Chi Panax Nhóm Protopanaxadiol . Từ viết tắt PPT Q-TOF-MS ROS Rt SKĐ SKLM Sâm VN Sâm VN-MH TBA TCA TST TNF Từ đầy đủ Nghĩa tiếng Việt Protopanaxatriol Nhóm Protopanaxatriol Quadrupole Time of Flight Mass Máy đo phổ khối tứ cực – Spectrometer thời gian bay Reactive Oxygen Species Gốc tự do oxy hóa Retention time Thời gian lưu Sắc ký đồ Sắc ký lớp mỏng Sâm Việt Nam Sâm Việt Nam trồng Sâm Việt Nam mọc hoang Thiobarbituric acid Acid thiobarbituric Trichloroacetic acid Acid Trichloroacetic Tail suspension test Thực nghiệm treo đuôi chuột Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử khối u . . DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các loài sâm được chấp nhận thuộc chi Panax.........................................3 Bảng 1.2. Chỉ tiêu kiểm nghiệm vài loài sâm theo chuyên luận Dược điển..............9 Bảng 1.3. Thành phần saponin trong Sâm Việt Nam...............................................18 Bảng 1.4. Một số tác dụng dược lý khác của Sâm Việt Nam...................................25 Bảng 2.5. Cách pha dung dịch đường chuẩn...........................................................38 Bảng 2.6. Nồng độ các giai mẫu mẫu xây dựng đường tuyến tính HPLC-DAD.....41 Bảng 3.7. Thông số của detector phổ khối áp dụng định lượng saponin.................59 Bảng 3.8. Kết quả HPLC-MS nhận dạng ion của 5 saponin đối chiếu....................61 Bảng 3.9. Hàm lượng saponin chiết bằng siêu âm và chiết lắc...............................62 Bảng 3.10. Saponin chiết với methanol tại 3 nồng độ định lượng bằng HPLC-MS 62 Bảng 3.11. Hàm lượng saponin chiết tại 3 nhiệt độ định lượng bằng HPLC-MS....62 Bảng 3.12. Hàm lượng saponin chiết tại 3 thời gian định lượng bằng HPLC-MS. .63 Bảng 3.13. Tính tương thích của hệ thống HPLC-MS định lượng saponin.............63 Bảng 3.14. Thời gian lưu của 5 saponin trên HPLC-MS sau 6 lần tiêm mẫu..........64 Bảng 3.15. Dữ liệu xác nhận khối lượng ion của một số saponin chuẩn.................64 Bảng 3.16. Kết quả phương trình tính tuyến tính....................................................66 Bảng 3.17. Độ lặp lại trong ngày của phương pháp HPLC-MS..............................66 Bảng 3.18. Độ lặp lại liên ngày của phương pháp HPLC-MS.................................67 Bảng 3.19. Kết quả độ đúng trong định lượng G-Rg1 bằng HPLC-MS..................68 Bảng 3.20. Kết quả độ đúng trong định lượng M-R2 bằng HPLC-MS..................68 Bảng 3.21. Độ đúng của phương pháp định lượng V-R2 bằng HPLC-MS.............68 Bảng 3.22. Kết quả độ đúng định lượng G-Rb1 bằng HPLC-MS..........................69 Bảng 3.23. Kết quả độ đúng của phương pháp định lượng G-Rd bằng HPLC-MS 69 Bảng 3.24. Giới hạn phát hiện và định lượng 5 saponin bằng HPLC-MS...............69 Bảng 3.25. Hàm lượng 4 saponin chiết xuất tại ba nồng độ MeOH........................72 Bảng 3.26. Hàm lượng 4 saponin chiết tại mức nhiệt độ khác nhau........................72 Bảng 3.27. Hàm lượng saponin theo thời gian chiết xuất........................................73 Bảng 3.28. Hàm lượng 4 saponin từ số lần chiết xuất khác nhau............................73 . . Bảng 3.29. Giá trị các thông số sắc ký ứng với pic G-Rg1 trong mẫu chuẩn..........73 Bảng 3.30. Giá trị các thông số sắc ký ứng với pic M-R2 trong mẫu chuẩn...........74 Bảng 3.31. Giá trị các thông số sắc ký ứng với pic G-Rb1 trong mẫu chuẩn..........74 Bảng 3.32. Giá trị các thông số sắc ký ứng với pic G-Rd trong mẫu chuẩn............74 Bảng 3.33. Diện tích pic tương ứng với các nồng độ của mẫu đối chiếu................78 Bảng 3.34. Phương trình hồi quy của chất chuẩn G-Rg1, G-Rb1, G-Rd, M-R2.....78 Bảng 3.35. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng bằng HPLC-DAD..............79 Bảng 3.36. Độ lặp lại trong ngày của phương pháp HPLC-DAD...........................79 Bảng 3.37. Kết quả độ lặp liên ngày của phương pháp HPLC-DAD......................80 Bảng 3.38. Kết quả độ đúng của phương pháp HPLC-DAD định lượng G-Rg1.....80 Bảng 3.39. Kết quả độ đúng của phương pháp HPLC-DAD định lượng M-R2......81 Bảng 3.40. Kết quả độ đúng của phương pháp HPLC-DAD định lượng G-Rb1.....81 Bảng 3.41. Kết quả độ đúng của phương pháp HPLC-DAD định lượng G-Rd.......81 Bảng 3.42. Kết quả hàm lượng một số saponin trong Sâm Việt Nam trồng............86 Bảng 3.43. Khối lượng cao toàn phần và saponin toàn phần...................................86 Bảng 3.44. Hàm lượng 5 saponin trong cao Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi.................87 Bảng 3.45. Thời gian bơi tuyệt đối các nhóm chuột thử nghiệm Brekhman...........88 Bảng 3.46. Thời gian bơi tương đối các nhóm chuột trên thực nghiệm Brekhman. 89 Bảng 3.47. Thời gian bơi tuyệt đối của thử nghiệm bơi điều chỉnh tốc độ dòng.....89 Bảng 3.48. Thời gian bơi tương đối trên thực nghiệm bơi điều chỉnh tốc độ dòng. 90 Bảng 3.49. Hoạt tính kháng oxy hóa trên tế bào Hep G2........................................91 Bảng 3.50. Hoạt độ AST, ALT trong huyết tương trên thực nghiệm CCl4...............92 Bảng 3.51. Hàm lượng MDA, GSH trong gan chuột trên thực nghiệm CCl4..........94 Bảng 3.52. Hàm lượng MDA và GSH trong gan chuột trên thực nghiệm CY.........95 Bảng 3.53. Sự thay đổi trọng lượng cơ thể của các lô chuột trong thử nghiệm.......96 Bảng 3.54. Hoạt độ AST, ALT trong huyết tương trên thực nghiệm ethanol...........97 Bảng 3.55. Kết quả hàm lượng MDA, GSH trong gan chuột vào tuần 8................98 Bảng 3.56. Tiềm thời và thời gian ngủ của các lô chuột sau các tuần thí nghiệm. . .99 Bảng 3.57. Tác dụng cao Sâm Việt Nam trên tiềm thời và thời gian ngủ..............100 Bảng 3.58. Thời gian ra sáng và số lần ra sáng của các lô chuột liều duy nhất.....102 . . Bảng 3.59. Thời gian ở sáng và số lần ra sáng điều trị sau 7 ngày........................103 Bảng 3.60. Thời gian bất động của các lô chuột thí nghiệm liều duy nhất............104 Bảng 3.61. Thời gian bất động các lô chuột điều trị sau 7 và 14 ngày..................105 Bảng 3.62. Thời gian ở ngăn sáng và số lần ra ngăn sáng trên thực nghiệm.........107 Bảng 3.63. Thời gian bất động của chuột trên thực nghiệm FST và TST.............107 Bảng 3.64. Hàm lượng MDA, GSH tế bào não chuột trầm cảm do cô lập............109 Bảng 4.65. So sánh hiệu năng của detector Q-TOF-MS và DAD..........................114 Bảng 4.66. So sánh tác dụng dược lý Sâm VN với Nhân Sâm và Sâm VN-MH...130 . . DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Khung cơ bản của các saponin thuộc chi Panax.......................................5 Hình 1.2. Bộ phận trên mặt đất (A) và bộ phận dưới mặt đất của Sâm Việt Nam (B) ................................................................................................................................. 16 Hình 3.3. SKĐ thăm dò chương trình pha động điều kiện 1...................................58 Hình 3.4. SKĐ tổng ion (TIC) từ 5 saponin đối chiếu của HPLC-MS....................60 Hình 3.5. SKĐ extract ion (EIC) của từng saponin đối chiếu trên HPLC-MS........60 Hình 3.6. Phổ MS của 5 saponin đối chiếu.............................................................61 Hình 3.7. Phổ MS của 5 saponin đối chiếu sau khi lần lượt cắt phân tử đường......65 Hình 3.8. SKĐ của mẫu thử tại điều kiện 3............................................................71 Hình 3.9. SKĐ độ tinh khiết của 4 saponin trong hỗn hợp mẫu đối chiếu..............75 Hình 3.10. SKĐ độ tinh khiết pic của 4 saponin định lượng trong mẫu thử...........76 Hình 3.11. SKĐ mẫu trắng......................................................................................77 Hình 3.12 SKĐ mẫu đối chiếu của 4 saponin.........................................................77 Hình 3.13. SKĐ của 4 saponin định lượng trong mẫu thử......................................77 Hình 3.14. SKĐ của mẫu thử thêm 4 saponin của mẫu đối chiếu...........................77 Hình 3.15. Bộ phận dưới mặt đất của Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi..........................82 Hình 3.16.Vi phẫu thân rễ Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi............................................83 Hình 3.17. Vi phẫu rễ củ Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi..............................................84 Hình 3.18. Đặc điểm bột thân rễ và rễ củ của Sâm Việt Nam.................................85 Hình 3.19. Sắc ký lớp mỏng mẫu Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi................................85 Hình 3.20. SKĐ cao toàn phần Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi....................................87 . . MỞ ĐẦU Sâm Việt Nam (còn gọi là Sâm Ngọc linh, Sâm Khu 5, Sâm Đốt Trúc) được tìm thấy ở vùng núi Ngọc Linh tỉnh Kon Tum vào năm 1973. Đến năm 1985, được xác định tên khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv., họ Nhân sâm (Araliaceae) [3]. Hiện nay, Sâm Việt Nam được lựa chọn là cây thuốc hàng đầu trong chương trình phát triển sản phẩm quốc gia đến năm 2020. Năm 2011, Bộ Y Tế đã triển khai xây dựng đề án: “Chương trình quốc gia bảo tồn, phát triển nguồn dược liệu trong nước và các sản phẩm từ dược liệu giai đoạn từ nay đến năm 2020 và tầm nhìn đến 2030. Xây dựng hồ sơ 40 dược liệu có tiềm năng khai thác và phát triển thị trường”. Trong đó cây Sâm Việt Nam được chọn đứng vị trí đầu tiên trong danh sách, cho thấy dược liệu này có vai trò quan trọng trong chiến lược phát triển dược liệu của nước ta. Sâm Việt Nam được thế giới biết đến như là một loài Sâm mới và có giá trị cao như Nhân Sâm. Cho đến nay, Sâm Việt Nam được trồng tại một số vùng đặc hữu như Kon Tum và Quảng Nam. Trên thị trường, Sâm Việt Nam thường bị giả mạo bởi những dược liệu khác, nhiều trường hợp không những không có tác dụng điều trị mà còn có thể gây độc hại cho người dùng. Vì vậy việc kiểm nghiệm đánh giá chất lượng Sâm Việt Nam là vấn đề cần thiết. Bên cạnh đó, sự phát hiện một thứ của cây Sâm Việt Nam là Panax vietnamensis var. Fuscidiscus có hình thái giống Sâm Việt Nam, mọc hoang tại Vân Nam thuộc Trung Quốc và Lai Châu của Việt Nam. Cây sâm này đã được đánh giá bước đầu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cho thấy trong thành phần saponin có nhóm ocotillol như Sâm Việt Nam [33]. Saponin nhóm ocotillol chỉ phát hiện trong Sâm Việt Nam mà không có trong Nhân sâm gồm một số hợp chất tiêu biểu như majonosid-R2, vinaginsenosid-R1, vinaginsenosid-R2,...Tuy nhiên, vài nghiên cứu trước đã công bố phương pháp định lượng một số saponin thuộc nhóm này bằng phương pháp HPLC với detector dãy diod quang (DAD) hay detector tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD) [75] nhưng vẫn chưa xác định chính xác hàm lượng riêng biệt từng chất như vinaginsenosid-R2. Do đó, việc nghiên cứu phương pháp định lượng các . . saponin thuộc nhóm ocotillol góp phần tiêu chuẩn hóa và xây dựng thương hiệu quốc gia về Sâm Việt Nam là vấn đề quan trọng có tính cấp thiết. Về mặt tác dụng dược lý, các kết quả nghiên cứu trước đây được tiến hành trên mẫu Sâm Việt Nam mọc hoang với nhiều tác dụng như: tăng lực, chống stress, bảo vệ gan, cải thiện trí nhớ [3], [51], [53]. Tuy nhiên, nguồn sâm sử dụng trên thị trường chủ yếu hiện nay từ nguồn sâm trồng. Cho đến nay, chưa có nghiên cứu một cách hệ thống về tác dụng dược lý của Sâm Việt Nam trồng, nếu sử dụng các kết quả nghiên cứu trước đây của sâm mọc hoang cho sâm trồng thì sẽ không thuyết phục. Vì các lý do cần thiết trên, đề tài về “Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa và đánh giá một số tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam” được tiến hành, nguyên liệu dùng sử dụng từ nguồn Sâm Việt Nam trồng tại Trại Dược liệu Trà Linh thuộc vùng núi Ngọc Linh, bản địa của cây Sâm Việt Nam. Đề tài được thực hiện với các mục tiêu nghiên cứu: 1. Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng đồng thời một số saponin chính trong Sâm Việt Nam trồng bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép phổ khối (HPLC-MS) và phương pháp sắc ký lỏng với detector dãy diod quang (HPLC– DAD). 2. Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn Sâm Việt Nam trồng. 3. Đánh giá một số tác dụng sinh học của Sâm Việt Nam trồng 6 năm tuổi: - Tác dụng tăng lực của cao Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi. - Tác dụng bảo vệ gan của cao Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi. - Tác dụng chống stress tâm lý của cao Sâm Việt Nam trồng 6 tuổi. - Tác dụng chống stress tâm lý của một số saponin thuộc nhóm ocotillol. . . CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ CHI PANAX 1.1.1. Phân loại thực vật chi Panax Hiện nay, một số nhà thực vật học đã nghiên cứu phân loại các loài thuộc chi Panax. Tuy nhiên, theo thời gian sự phân loại này có nhiều thay đổi. Theo The Plant list (Bảng 1.1), có 13 loài thuộc chi Panax được chấp nhận [146]. Tại Việt Nam có 4 loài thuộc chi Panax (P.) được công bố là Sâm vũ diệp (P. bipinnatifidus Seem.), Tam thất (P.notoginseng (Burkill) F.H.Chen), Tam thất hoang (P. stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) và Sâm Việt Nam (P. vietnamensis Ha et Grushv.) [15]. Bảng 1.1. Các loài sâm được chấp nhận thuộc chi Panax STT 1 Tên loài P. bipinnatifidus Seem. Tên Tiếng việt Sâm vũ diệp Phân bố Nam Trung Quốc, Bắc Việt Nam 2 3 4 P. bipinnatifidus var. angustifolius (Burk ill) J.Wen P. ginseng C. A. Meyer P. japonicus C. A. Meyer Nhân sâm Sâm Nhật 5 P. notoginseng (Burkill) F. H. Chen Tam thất 6 7 8 9 10 11 P. pseudoginseng Wall. P. quinquefolius L. P. sokpayensis Shiva K.Sharma & Pandit P. stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng P. trifolius L. P. vietnamensis Ha et Grushv. Tam thất hoang Sâm lùn Sâm Việt Nam Đông Bắc Á Nhật Bản và Nam Trung Quốc Vân Nam, Trung Quốc Đông Himalaya Bắc Mỹ Himalaya Bắc Việt Nam Bắc Mỹ Núi Ngọc Linh, Việt Nam 12 13 P. wangianus S.C.Sun. P. zingiberenusis C.Y. Wu et K .M. Feng Sâm gừng Sâm Mỹ Nam Trung Quốc 1.1.2. Thành phần hóa học các loài thuộc chi Panax 1.1.2.1. Thành phần hóa học Trong các loài thuộc chi Panax, thành phần hoá học chủ yếu là saponin, polysaccharid, polyacetylen, acid béo, acid amin, nguyên tố đa và vi lượng [139]. . . Saponin: Còn gọi là sapogenin glycosid là dạng glycosid bao gồm phần sapogenin có cấu trúc steroid hay triterpen gắn với một hay nhiều phân tử đường. Ginsenosid là nhóm saponin triterpen của các loài thuộc chi Panax được nghiên cứu rất nhiều về hóa học cũng như tác dụng dược lý, kết quả cho thấy ginsenosid là thành phần hoạt tính của sâm. Saponin của sâm thường được sử dụng làm chất đánh dấu để đánh giá chất lượng các loài sâm và các sản phẩm liên quan [32]. Polysaccharid: Nhóm hợp chất tan trong nước là những polysaccharid acid, có hoạt tính chống phân bào và tăng cường miễn dịch. Những nghiên cứu gần đây cho thấy polysaccharid acid như ginsan có hoạt tính kích thích hệ miễn dịch [32]. Polyacetylen: Nhóm hợp chất hữu cơ với nối đôi và nối ba liên hợp. Hai polyacetylen chính trong Nhân sâm là panaxynol và falcarintrol (panaxytriol). Ngoài ra, acetyl panaxydol and panaxydolchlorohydrin được phân lập từ Nhân sâm. Flavonoid và tinh dầu: Bên cạnh nhóm hợp chất liệt kê trên, một vài flavonoid và tinh dầu đã được phân lập và định danh từ các loài thuộc chi Panax. Thành phần saponin của các loài thuộc chi Panax Các saponin trong chi Panax được phân loại cơ bản theo cấu trúc khung genin (dammaran, olean) và theo mạch nhánh C-17 khác nhau. Bên cạnh đó còn có một vài saponin không thuộc cấu trúc này được liệt kê vào mục saponin cấu trúc khác. Khung dammaran: Saponin nhóm này được phân chia thành 3 nhóm (Hình 1.1) gồm có nhóm Protopanaxadiol (PPD): Ginsenosid-Ra1, -Ra2, -Ra3, -Rb1, -Rb2, -Rb3, notoginsenosid-Rs1, -Rs2, quinquenosid-R1, malonyl-ginsenosid- Rb1, -Rb2, -Rc và -Rd. Đây là nhóm ginsenosid có nhiều thành phần nhất trong các cấu trúc dammaran của chi Panax. Protopanaxatriol (PPT): Gồm các ginsenosid chính là GRe, -Rf, -Rg1 và N-R1, N-R2. Sự khác biệt chính của PPT và PPD là sự hiện diện của nhóm hydroxyl hay đường gắn vào vị trí C-6 của PPT. Ocotillol (OCT): Nhóm này có vòng epoxy gắn vào vị trí C-20. Majonosid-R2 trong Sâm Việt Nam là đại diện cho nhóm này. Saponin cấu trúc acid oleanolic (OA): Saponin nhóm này có phần aglycon có cấu trúc bao gồm các chikuset-susaponin và đại diện là G-Ro là triterpen 5 vòng [32], [139]. Saponin có mạch nhánh C-17 khác nhau chiếm hơn . . 50% các saponin phân lập từ các loài Panax. Ngoài ra, còn có các saponin có khung không phổ biến khác. Protopanaxadiol (PPD) Ocotillol (OCT) Protopanaxatriol (PPT) Acid Oleanolic (OA) Hình 1.1. Khung cơ bản của các saponin thuộc chi Panax Từ năm 1963 - 2014, có 289 saponin đã được phân lập từ các loài thuộc chi Panax. Saponin có khung PPD và PPT phổ biến trong các loài Panax, trong khi nhóm ocotillol ít hơn và còn lại rất ít là saponin có cấu trúc acid oleanolic [139], [140]. 1.1.2.2. Phương pháp xác định saponin trong loài thuộc chi Panax Saponin trong chi Panax được chứng minh là thành phần chính thể hiện tác dụng dược lý. Do đó, saponin được xem là chỉ số đánh giá chất lượng của sâm và sản phẩm được bào chế từ sâm. Hiện nay, nhiều phương pháp phân tích đã được nghiên cứu và phát triển định lượng saponin trong chi Panax. Saponin được định lượng bằng phương pháp HPLC kết hợp với detector là UV [56] hay detector tán xạ bay hơi (ELSD) [66]. Saponin trong chi Panax có cấu trúc đa dạng, do có cấu trúc khá tương đồng chỉ khác nhau cấu tạo phần đường, sắc ký lỏng kết hợp với detector phổ khối (LC-MS) là phương pháp hiện đại và hiệu quả để phân tích saponin [130]. . . 1.1.2.3. Sự liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính chống oxy hóa của ginsenosid Ginsenosid đã được xem là thành phần chính thể hiện tác dụng dược lý của chi Panax, tác dụng chống oxy hóa của ginsenosid trên in vivo đã được công bố. Tại sao khả năng chống oxy hóa của các ginsenosid lại khác nhau, một số công bố nghiên cứu đánh giá về sự liên quan giữa cấu trúc và tác dụng chống oxy hóa của ginsenosid. Liu và cộng sự (CS.) đã nghiên cứu mối liên quan cấu trúc và tác dụng của 11 ginsenosid thuộc 2 nhóm PPD, PPT và sapogenin của chúng dựa trên AAPH (2,2’- azobis (2-amidinopropane hydrochlorid)) – là yếu tố gây tán huyết hồng cầu của người; AAPH cung cấp gốc tự do peroxyl (ROO•) với một tỷ lệ ổn định tại nhiệt độ 37 °C [86]. Tác dụng của sapogenin trên sự tán huyết hồng cầu của người gây bởi AAPH Sapogenin (khung dammaran triterpen) sau khi loại bỏ các gốc đường, còn lại khung PPD và PPT. Khi gia tăng nồng độ sapogenin nhóm PPD hay PPT đều làm tăng tỷ lệ tán huyết gây bởi AAPH, thậm chí khi không có AAPH thì sapogenin PPD cũng gây tán huyết trên hồng cầu. Các sapogenin thể hiện tác dụng như chất tiền oxy hóa [86]. Tác dụng của các ginsenosid trên sự tán huyết hồng cầu của người gây bởi AAPH Nhóm PPD có chuỗi đường gắn vào vị trí số 3 trên khung dammaran triterpen gồm có ginsenosid Rg3, G-Rd, G-Rc, G-Rh2, G-Rb1 và G-Rb3. Nhóm PPT có chuỗi đường gắn vào vị trí số 3 trên khung dammaran triterpen gồm G-Rg1, G-Rg2, GRh1, G-Re và G-R1. Khi có sự gia tăng nồng độ của ginsenosid-Rg3 hay G-Rh2 thì sự tán huyết cũng gia tăng; G-Rg2 ở nồng độ cao có thể ngăn chặn sự tán huyết. Do đó G-Rg3, G-Rh2 và G-Rg2 có tác dụng như là chất tiền oxy hóa. Các G-Rb1, GRc, G-R1, G-Rd, G-Re, G-Rb3, G-Rg1 và G-Rh1 có tác dụng giảm tỷ lệ tán huyết gây bởi AAPH. Các ginsenosid này có tác dụng như chất chống oxy hóa [86]. So sánh cấu trúc của ginsenosid nhóm tiền oxy hóa và nhóm chống oxy hóa, cho thấy khi không có mặt gốc đường gắn vào vị trí 20 trên khung dammaran triterpen như G-Rh2, G-Rg3 và G-Rg2 là chất tiền oxy hóa. Ginsenosid-Rh1 có 1 glucose gắn vào vị trí số 6 trên khung dammaran triterpen thể hiện tác dụng chống oxy hóa. Do đó, ginsenosid có gốc đường ở vị trí 20 hay glucose tại vị trí 6 trên khung genin . . thể hiện tác dụng chống oxy hóa. Khả năng chống oxy hóa giảm dần theo thứ tự G-Rc > G-Rb1, G-Re > G-Rd > G-R1 > G-Rg1 > G-Rb3 > G-Rh1. Các gốc đường gắn vào vị trí khác nhau, thể hiện mức độ tán huyết gây bởi AAPH khác nhau, cho thấy có sự tương tác phức tạp giữa các gốc đường và các sapogenin. Để làm rõ hơn về mối liên quan giữa cấu trúc và tác dụng của ginsenosid, Liu và CS. đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ hồng cầu của ginsenosid toàn phần, 12 ginsenosid riêng biệt gồm có G-Rb1, G-Rb3, G-Rc, G-Rd, G-Re, G-Rg1, G-Rg2, G-Rg3, G-Rh1, G-Rh2, G-R1, pseudoginsenosid-F11 và sapogenin protopanaxadiol, protopanaxatriol trên hồng cầu người chống lại sự tán huyết gây ra bởi hemin [79]. Tác dụng bảo vệ hồng cầu chống lại sự tán huyết của sapogenin nhóm PPT tương tự như các ginsenosid trong nhóm; cho thấy vị trí gốc đường gắn vào vị trí số 6 hoặc 20 trên khung genin không tác dụng đến tác dụng này. Nhóm hydroxyl ở vị trí số 3 có vai trò thể hiện tác dụng bảo vệ hồng cầu. Đối với G-Re có chuỗi đường glucose - rhamnose có tác dụng cao hơn G-R1 có chuỗi đường glucose - glucose, cho thấy vai trò của đường rhamnose thể hiện tác dụng chống lại sự tán huyết [79], [87]. Sapogenin nhóm PPD thúc đẩy sự tán huyết do không có nhóm hydroxyl ở vị trí số 6 trên khung như nhóm PPT, cho thấy nhóm hydroxyl có vai trò bảo vệ hồng cầu. G-Rc và G-Rd thể hiện tác dụng bảo vệ hồng cầu chống lại tán huyết hiệu quả, cấu trúc G-Rc giống với G-Rd ngoại trừ G-Rc có đường xylose gắn với đường glucose tại vị trí 20. Ginsenosid-Rb1 khác với G-Rb3 trên kết nối của hai chuỗi glucose ở vị trí số 20 trên khung và vị trí số 3 trên phân tử đường glucose trên G-Rb1, sự khác biệt này giúp G-Rb1 thể hiện tác dụng trội hơn. Liu và CS. đã cung cấp thông tin chính nhóm hydroxyl hoặc các gốc đường gắn ở vị trí số 6 quan trọng đối với hiệu quả bảo vệ hồng cầu của ginsenosid trên tán huyết gây ra bởi hemin [79]. Tuy nhiên, nghiên cứu khác của Chae và CS. đã công bố kết quả về khả năng chống oxy hóa của các ginsenosid và sự liên quan quan giữa cấu trúc và tác dụng [28]. Tác giả cho rằng số gốc đường không tác dụng đến khả năng chống oxy hóa của ginsenosid như G-Rh1 và G-Rh2 có 1 phân tử đường trong khi đó G-Rf, G-Rg2, GRg3 có hai gốc đường nhưng khả năng ức chế gốc tự do không có khác biệt. Bên cạnh đó, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về khả năng chống oxy hóa giữa . . ginsenosid hai nhóm PPT và PPD: Ví dụ như ginsenoside-Rh1 và G-Rh2 sở hữu có gốc đường glucose tại C-6 và C-3 tương ứng, khác nhau vị trí gốc đường nhưng tác dụng chống oxy hóa của chúng không có khác biệt. 1.1.3. Kiểm nghiệm sâm thuộc chi Panax theo chuyên luận Dược điển Saponin là thành phần chính trong các loài sâm thuộc chi Panax và có tác dụng sinh học. Vì vậy, các chuyên luận Dược điển của một số nước xây dựng chỉ tiêu định tính, định lượng dựa vào thành phần saponin chính như G-Rg1, G-Rb1. Các chỉ tiêu phân tích kiểm nghiệm Sâm theo Dược điển một số quốc gia như: Châu Âu (EP 80), Mỹ (USP 38, NF33), Nhật Bản (JP 17), Trung Quốc (CP 2015), Hàn Quốc (KP X) và Dược điển Việt Nam V được trình bày trong Bảng 1.2. . . Bảng 1.2. Chỉ tiêu kiểm nghiệm vài loài sâm theo chuyên luận Dược điển Đối tượng Panax ginseng Dược điển Định tính Mô tả, vi phẫu, soi bột, thử SKLM tinh khiết, mất khối lượng do làm khô, tro toàn phần, tro không tan trong HCl Mô tả, vi phẫu, soi bột, thử SKLM tinh khiết, mất khối lượng do làm khô Mô tả, vi phẫu, soi bột, thử Phản tinh khiết, mất khối lượng ứng do làm khô, tro toàn phần. hóa học SKLM Mô tả, vi phẫu, soi bột, dư SKLM lượng thuốc trừ sâu, mất khối lượng do làm khô, tro toàn phần Mô tả, vi phẫu, soi bột, thử Phản tinh khiết, mất khối lượng ứng do làm khô, tro toàn phần hóa học SKLM Mô tả, vi phẫu, soi bột, Phản mất khối lượng do làm ứng khô, tro toàn phần, tro hóa học không tan trong HCl SKLM Mô tả, vi phẫu, soi bột, thử SKLM tinh khiết, mất khối lượng do làm khô Mô tả, vi phẫu, soi bột, dư SKLM lượng thuốc trừ sâu, mất khối lượng do làm khô, tro toàn phần, tro không tan trong acid Định lượng HPLC Hàm lượng HPLC G-Rg1 ≥ 0,20% G-Rb1 ≥ 0,10% HPLC G-Rg1 ≥ 0,10% G-Rb1 ≥ 0,20% HPLC G-Rg1 + G-Re ≥ 0,30% G-Rb1 ≥ 0,20% HPLC G-Rg1 ≥ 0,10% G-Rb1 ≥ 0,20% HPLC G-Rg1 + G-Re ≥ 0,30% G-Rb1 ≥ 0,20% HPLC Saponin toàn phần ≥ 4% G-Rb1 ≥ 0,20% Không ít hơn 16% dược liệu khô kiệt G-Rg1+ G-Rb1 + NR1 ≥ 5% DĐVN V Mô tả, vi phẫu, soi bột, Phản mất khối lượng do làm ứng khô, tro toàn phần hóa học SKLM Chất chiết được HPLC DĐVN V Mô tả, vi phẫu, soi bộ, mất SKLM khối lượng do làm khô, tro toàn phần, tỷ lệ vụn nát, tạp chất HPLC EP 8.0 USP 40NF35 JP 17 CP201 5 KP X DĐVN V Panax quinquefoliu s Panax notoginseng Panax vietnamensis USP 40NF35 CP201 5 . Chỉ tiêu thông thường Chất chiết được HPLC G-Rg1 + G-Rb1 ≥ 0,40% Không ít hơn 16% dược liệu khô kiệt NR1 ≥ 0,4% G-Rg1 + G-Rb1 + NR1 ≥ 5% G-Rb1 ≥ 0,5% G-Rd ≥ 0,5% G-Rg1≥ 1,5% M-R2 ≥ 0,4% 0. 1.1.4. Sơ lược về loài sâm trồng thuộc chi Panax 1.1.4.1. Nhân sâm Phân bố: Nhân sâm (Panax ginseng C. A. Meyer) mọc hoang trong rừng ở khu vực khí hậu mát từ Hàn Quốc và phía bắc miền đông Trung Quốc cho đến phía đông Siberia. Hiện nay, Nhân sâm mọc hoang khan hiếm và rất đắt tiền nên Nhân sâm được trồng thành công tại Hàn Quốc, Trung Quốc và Nhật Bản [105]. Sản phẩm Nhân sâm trên thị trường chủ yếu có nguồn gốc trồng trọt từ các vùng trên. Sản phẩm từ Nhân sâm trồng (NS) đã được nghiên cứu và tiêu chuẩn hóa, thành một số sản phẩm thương mại trên thị trường như Ginseng 115. Phân loại Nhân sâm theo điều kiện trồng: Có 3 hình thức để canh tác Nhân sâm là Vườn sâm (Nhân sâm trồng), rừng sâm (Nhân sâm trồng trong rừng), cấy ghép Nhân sâm mọc hoang. Vườn sâm được trồng trong điều kiện nhân tạo với thời gian trồng và thu hoạch từ 4 -7 năm, rừng sâm dùng hạt giống của vườn sâm gieo vào môi trường tự nhiên, không có bất kỳ tác động nhân tạo và có thời gian sinh trưởng trên 10 năm. Nhân sâm nuôi cấy mô: Cấy ghép cây giống Nhân sâm mọc hoang vào môi trường nhân tạo hoặc bán nhân tạo. Hình thái thực vật: Bộ phận trên mặt đất của NS mọc hoang và NS chưa có công bố có sự khác biệt. Tuy nhiên, Choi và CS. đã công bố kết quả nghiên cứu về một số khác biệt giữa NS trồng trên núi (địa lý của khu vực trồng giống với NS mọc hoang) so với NS trồng trong vườn sâm [31]. Nhân sâm núi có rễ kéo dài nhưng NS thì rễ mọc thẳng, dày, ngắn hơn NS núi .Về chiều dài, đường kính và trọng lượng của NS núi thì nhỏ hơn NS trong vườn. Trọng lượng NS núi 15 năm tuổi nhỏ hơn NS vườn 3 năm tuổi [31]. Phân biệt Nhân sâm trồng và mọc hoang: Mặc dù có tên khoa học giống nhau nhưng giá trị của 3 loại Nhân sâm trồng trong vườn sâm, trồng trên núi và mọc hoang có giá trị khác nhau đáng kể trên thị trường. Để phân biệt 3 loại NS trên, Liu và CS. đã dùng phương pháp quang phổ hồng ngoại để xác định một cách khá nhanh chóng 3 loại này. Kết quả chỉ ra rằng hàm lượng tinh bột trong NS vườn nhiều hơn trong NS núi và NS hoang dại; hàm lượng canxi oxalat và chất béo trong NS hoang dại nhiều hơn 2 loại NS còn lại và hàm lượng acid béo trong NS trồng trên núi cao hơn hai loại NS trong vườn và mọc hoang [82]. .