Tài liệu Nghiên cứu thu nhận các dạng peptide có hoạt tính sinh học từ bã nấm men bia bằng phương pháp thủy phân giới hạn bởi protease

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI --------------------------------------- CAO HẢI YẾN NGHIÊN CỨU THU NHẬN CÁC DẠNG PEPTIDE CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ BÃ NẤM MEN BIA BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY PHÂN GIỚI HẠN BỞI PROTEASE Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TS. ĐẶNG THỊ THU 2. PGS.TS. QUẢN LÊ HÀ Hà Nội – Năm 2017 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật Công nghệ sinh học LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Đặng Thị Thu và PGS.TS. Quản Lê Hà - Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Trương Quốc Phong – Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện về cơ sở vật chất trong quá trình nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. Nhân dịp này tôi cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô trong Viện đã nhiệt tình giảng dạy và giúp đỡ trong quá trình học tập. Qua đây, tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Phòng vi sinh - Trung tâm Chất lượng nông lâm sản và thủy sản vùng 1, các bạn sinh viên, học viên, nghiên cứu sinh đã giúp đỡ tôi trong quá trình thí nghiệm. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã động viên giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Học Viên Cao Hải Yến Cao Hải Yến - 2015B 1 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật Công nghệ sinh học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: luận văn tốt nghiệp “Nghiên cứu thu nhận các dạng peptide có hoạt tính sinh học từ bã nấm men bia bằng phương pháp thủy phân giới hạn bởi protease” được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. TS. Đặng Thị Thu, PGS.TS. Quản Lê Hà - Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, ĐH Bách Khoa Hà Nội và Nghiên cứu sinh Phạm Thị Thu Hiền cùng sự giúp đỡ của tập thể các cán bộ nghiên cứu, nghiên cứu sinh, học viên, sinh viên đang học tập và làm việc tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển CNSH, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội. Nội dung luận văn có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tác phẩm, tạp chí và trang web theo danh mục tài liệu kham khảo của luận văn. Hà Nội, ngày 28 tháng 9 năm 2017 Tác giả Cao Hải Yến Cao Hải Yến - 2015B 2 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật Công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ACE Angiotensin I Converting Enzyme ACEI Angiotensin-converting enzyme inhibitors BHI DPPH Brain Heart Infusion broth 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl ĐC Đối chứng HA Hippuric axit HHL Hippuryl-Histidyl-Leucine IC50 Inhibitory concentration 50% MIC Minimum inhibitory concentration OPA Ortho-Phthaladehyde RASS The renin-angiotensin-aldosterone system HPLC High-performance liquid chromatography TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose agar TBX Tryptone Bile X-Glucuronide agar XLD Xylose lysine deoxycholate agar Cao Hải Yến - 2015B 3 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật Công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình Hình 1.1. Biều đồ các hoạt tính sinh học của peptide được quan tâm nghiên cứu Hình 1.2. Hệ thống Renin – angiotensin - aldosterone Trang Hình 1.3. Minh hoạ cơ chế kháng khuẩn của peptide có hoạt tính sinh học 15 Hình 1.4. Thị trường Bia Việt Nam giai đoạn 2010-2015 20 Hình 1.5. Hình dạng tế bào nấm men saccharomyces cerevisiae 21 Hình 1.6. Mô hình kìm hãm của TPTQQS lên ACE 30 Hình 3.1. Bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme và thời gian đến quá trình thuỷ phân tạo peptide sinh học Hình 3.2. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu các điều kiện thủy phân bã nấm men bia tạo peptide thấp phân tử có hoạt tính sinh học Hình 3.3. Quá trình thuỷ phân bã nấm men bia thu peptide có hoạt tính sinh học Hình 3.4. Sắc ký đồ lượng HA thu được trong phản ứng ACE với HHL 41 Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ peptide (µg/ml) đến khả năng kìm hãm ACE Hình 3.6. Hoạt tính kìm hãm ACE của dịch peptide có khối lượng phân tử thấp < 10 kDa; < 5kDa; < 3 kDa Hình 3.7. Biểu đồ thể hiện khả năng thu dọn gốc tự do DPPH với các nồng độ peptide khác nhau Hình 3.8. Khả năng ức chế vi khuẩn của peptide sinh học 48 Hình 3.9. Ảnh khuẩn lạc Salmonella typhi sau 24h nuôi cấy trên môi trường XLD so với mẫu đối chứng không bổ sung dịch peptide Hình 3.10. Ảnh khuẩn lạc E. coli sau 24h nuôi cấy trên môi trường TBX so với mẫu đối chứng không bổ sung dịch peptide Hình 3.11. Ảnh khuẩn lạc Vibrio cholera sau 24h nuôi cấy trên môi trường TCBS so với mẫu đối chứng không bổ sung dịch peptide Hình PL1. Đồ thị đường chuẩn peptone 54 Hình PL2. Sắc ký đồ đường chuẩn HA 60 Hình PL3. Đồ thị đường chuẩn HA 61 Cao Hải Yến - 2015B 11 13 42 43 47 49 50 52 55 56 59 4 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật Công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Bảng 1.1: Thành phần của bã men bia (%) - Saccharomyces cerevisiae Trang 22 22 Bảng 1.2: Thành phần axit amin (g/100g protein) của bã nấm men bia Saccharomyces cerevisiae Bảng 1.3: Thành phần chất khoáng của bã nấm men bia – 23 Saccharomyces cerevisiae Bảng 2.1. Thành phần của phản ứng giữa ACE và HHL 35 Bảng 3.1. Ma trận thực nghiệm Box-Benken ba yếu tố và hàm lượng peptide thu được trong các điều kiện thủy phân khác nhau Bảng 3.2. Phân tích phương sai ANOVA của mô hình 39 Bảng 3.3. Hoạt tính ức chế vi khuẩn của dịch peptide thể hiện qua giá trị 57 40 MIC Cao Hải Yến - 2015B 5 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật Công nghệ sinh học MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... 3 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ...............................................................................4 DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................5 MỤC LỤC .................................................................................................................6 MỞ ĐẦU ....................................................................................................................8 PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................10 1.1. Tổng quan về peptide có hoạt tính sinh học ..........................................10 1.1.1. Khái niệm về peptide có hoạt tính sinh học ...................................... 10 1.1.2. Hoạt tính sinh học của peptide ........................................................... 10 1.1.2.1. Hoạt tính kìm hãm ACE (Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory)11 1.1.2.2. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và virut ..................................... 14 1.1.2.3. Peptide có hoạt tính chống oxy hóa ................................................... 17 1.1.2.4. Hoạt tính chống ung thư .................................................................... 18 1.1.2.5. Các hoạt tính sinh học khác............................................................... 18 1.2. Tổng quan về bã nấm men bia ................................................................19 1.2.1. Ngành công nghiệp sản xuất bia và hiện trạng sử dụng bã nấm men bia tại Việt Nam .................................................................................................. 19 1.2.2. Giới thiệu về nấm men Saccharomyces ............................................. 21 1.2.3. Thành phần hóa học và dinh dưỡng của bã men bia ....................... 22 1.2.4. Một số nghiên cứu về ứng dụng của bã nấm men bia trên thế giới và Việt Nam ............................................................................................................. 23 1.3. Tổng quan về protease .............................................................................27 1.3.1. Khái niệm về protease ......................................................................... 27 1.3.2. Giới thiệu một số chế phẩm Protease thương mại............................ 28 1.4. Các nghiên cứu về peptide sinh học từ bã nấm men bia ......................29 1.4.1. Các nghiên cứu quốc tế ....................................................................... 29 1.4.2. Các nghiên cứu trong nước ................................................................ 31 PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................33 2.1. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................33 2.1.1. Vật liệu.................................................................................................. 33 2.1.2. Hóa chất, môi trường phân tích ......................................................... 33 2.1.3. Thiết bị.................................................................................................. 34 Cao Hải Yến - 2015B 6 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật Công nghệ sinh học 2.2. Phương pháp nghiên cứu.........................................................................34 2.2.1. Thủy phân bã nấm men bia và tinh sạch peptide ............................ 34 2.2.2. Xác định hàm lượng peptide tổng theo phương pháp OPA.………35 2.2.3. Xác định hoạt tính kìm hãm ACE ..................................................... 35 2.2.4. Xác định hoạt tính chống oxi hóa DPPH............................................37 2.2.5. Xác định hoạt tính kháng khuẩn........................................................ 37 2.2.6. Tối ưu hóa quá trình thủy phân bã nấm men bia theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai Box-Benken................................................... 37 PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................39 3.1. Tối ưu hóa quá trình thủy phân bã nấm men bia theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai Box-Benken sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.5.......................................................................................................................... 39 3.2. Xây dựng quy trình thủy phân giới hạn bã nấm men bia bằng protease thu peptide có hoạt tính sinh học ................................................................................ 42 3.3. Khảo sát hoạt tính kìm hãm Angiotensin Converting Enzyme (ACE) của peptide có khối lượng phân tử thấp ..................................................................... 44 3.3.1. Khảo sát hoạt tính kìm hãm ACE của peptide sinh học có khối lượng phân tử < 10 kDa ................................................................................................ 44 3.3.2. Ảnh hưởng nồng độ peptide sinh học đến khả năng kìm hãm ACE (IC 50)………………………………………………………………………………..48 3.3.3. Khảo sát hoạt tính ức chế Angiotensin Converting Enzyme (ACE) của các peptide có khối lượng phân tử < 10 kDa, < 5 kDa, < 3 kDa ..................... 49 3.4. Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa của peptide sinh học có khối lượng phân tử < 10 kDa ............................................................................................................. 50 3.5. Khảo sát hoạt tính ức chế vi khuẩn Salmonella typhi, Escherichia coli và Vibrio cholera của peptide sinh học có khối lượng phân tử < 5 kDa ................. 51 3.5.1. Khảo sát hoạt tính ức chế vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch trên môi trường chọn lọc ......................................................................... 51 3.5.2. Khảo sát hoạt tính ức chế vi khuẩn bằng phương pháp đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch chọn lọc ................................................................... 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................58 PHỤ LỤC.................................................................................................................59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................63 Cao Hải Yến - 2015B 7 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật Công nghệ sinh học MỞ ĐẦU Sự tăng trưởng ngày càng mạnh mẽ của công nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng chứa peptide có hoạt tính sinh học trong những năm gần đây chứng tỏ con người đang rất quan tâm đến nhu cầu cải thiện sức khoẻ, nâng cao chất lượng cuộc sống. Đặc biệt trong bối cảnh khí hậu ngày càng khắc nghiệt, môi trường ô nhiễm, dịch bệnh phức tạp, nhu cầu đó ngày càng tăng cao. Đó cũng là động lực để nhiều nhà khoa học nghiên cứu, phát hiện ra các dạng Peptide mới cho hoạt tính sinh học cao. Peptide có hoạt tính sinh học (Bioactive peptide) là những peptide ngoài giá trị dinh dưỡng còn có khả năng tác động tới chức năng sinh lý của cơ thể, giúp tăng cường và nâng cao sức khỏe của con người như khả năng chống oxi hóa, kháng vi sinh vật, tác dụng kìm hãm enzyme ACE góp phần chống tăng huyết áp. Peptide có thể được tách chiết từ động vật, thực vật hoặc lên men bởi vi sinh vật hoặc thủy phân giới hạn protein từ các nguồn khác nhau bởi protease. Các nghiên cứu về peptide có hoạt tính sinh học ở nước ta khai thác chủ yếu trên đối tượng nguyên liệu từ sữa, đậu tương. Trong khi, nguồn bã nấm men bia rất dồi dào, chứa hàm lượng protein cao, giàu vitamin, đặc biệt là vitamin nhóm B và các khoáng chất, đó sẽ là nguồn nguyên liệu tốt cho quá trình sản xuất peptide. Theo thống kê, năm 2015 sản lượng bia nước ta đạt 4,67 tỉ lít, tăng 20,1% so với cùng kỳ năm trước, tương ứng với 70,1 nghìn tấn bã men bia thải ra. Nếu tận dụng được bã nấm men bia làm nguồn nguyên liệu để thủy phân thu peptide có hoạt tính sinh học bổ sung vào thực phẩm chức năng sẽ tạo sản phẩm có chất lượng cao và giải quyết được vấn đề ô nhiễm môi trường gây ra do lượng lớn bã men bia được thải ra hàng năm. Bởi những lý do nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thu nhận các dạng peptide có hoạt tính sinh học từ bã nấm men bia bằng phương pháp thủy phân giới hạn bởi protease”. Cao Hải Yến - 2015B 8 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật Công nghệ sinh học Nội dung chính bao gồm: - Tối ưu hoá điều kiện thuỷ phân giới hạn bã nấm men bia thu peptide có khối lượng phân tử thấp (< 10kDa): nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, thời gian thuỷ phân. - Khảo sát hoạt tính sinh học: hoạt tính kìm hãm Angiotensin I Converting Enzyme (ACE) chống tăng huyết áp, chống oxi hoá, kháng vi sinh vật. - Khảo sát hoạt tính kìm hãm ACE của các peptide có khối lượng phân tử thấp ( <10kDa, < 5kDa, < 3kDa). Cao Hải Yến - 2015B 9 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật Công nghệ sinh học PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về peptide có hoạt tính sinh học 1.1.1. Khái niệm về peptide có hoạt tính sinh học Peptide là những protein thường có cấu trúc đoạn ngắn khoảng từ hai đến vài chục amino axit nối với nhau bởi liên kết peptide, có khối lượng phân tử thường dưới 6.000 Dalton. Chúng có thể được tổng hợp trong tự nhiên hoặc được hình thành do thủy phân protein. Mặc dù có cấu trúc nhỏ nhưng nhiều peptide có vai trò khá quan trọng trong hoạt động trao đổi chất của cơ thể. Peptide có hoạt tính sinh học (Bioactive peptide) là những peptide ngoài giá trị dinh dưỡng còn có khả năng tác động tới chức năng sinh lý của cơ thể, giúp tăng cường và nâng cao sức khỏe của con người [33] như khả năng chống oxi hóa, kháng vi sinh vật, chống tăng huyết áp, chống đông máu, khả năng điều hòa miễn dịch… 1.1.2. Hoạt tính sinh học của peptide Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của peptide được rất nhiều nhà khoa học quan tâm trong 2 thập niên gần đây. Thay vì trước đây chỉ khoảng 50 công trình nghiên cứu công bố có tiêu đề với cụm từ “peptide có hoạt tính sinh học” mỗi năm, cho đến nay con số này đã tăng hơn 150 bài báo công bố. Có rất nhiều cơ sở dữ liệu được thiết kế để lưu giữ thông tin, đưa ra một cái nhìn tổng quan các nghiên cứu về peptide như: BioPD (Bioactive Peptide Database) là hệ thống dữ liệu lưu giữ các thông tin về cấu trúc của peptide, thông tin về gen, mối liên quan giữa peptide và ảnh hưởng của chúng đến sức khoẻ con người; APD (Antimicrobial Peptide Database) là cơ sở dữ liệu chứa các thông tin về peptide kháng khuẩn, kháng nấm, chống ung thư, virut; BioPep Database (BioPep) chứa thông tin về các hoạt tính sinh học của peptide... Các hoạt tính sinh học được nghiên cứu chủ yếu là hoạt tính ức chế ACE, khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virut, chống oxy hóa và chống ung thư. Dưới đây là biểu đồ thể hiện mức độ nghiên cứu và sản xuất các peptide sinh học [12]. Cao Hải Yến - 2015B 10 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật Công nghệ sinh học Hình 1.1. Biều đồ các hoạt tính sinh học của peptide được quan tâm nghiên cứu [12] 1.1.2.1. Hoạt tính kìm hãm ACE (Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory) Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), tăng huyết áp là một trong những căn bệnh mãn tính phổ biến nhất. Mỗi năm trong số 17,5 triệu người tử vong do các bệnh tim mạch thì tăng huyết áp là nguyên nhân trực tiếp gây tử vong đến 40%. Lý do của sự gia tăng huyết áp này là do hoạt động của ACE trong hệ thống Renin-AngiotensinAldosterol (RAAS) và hệ thống Kalikein-kinin. Trong RAAS, ACE giữ một vai trò quan trọng – nó làm tăng huyết áp máu bằng cách cắt dipeptide đầu C tận cùng của angiotensin I chuyển thành angiotensin II – nhân tố gây co mạch và ức chế bradykinin – nhân tố gây giãn mạch. Sự ức chế ACE được coi là một liệu pháp hữu hiệu trong điều trị cao huyết áp. Rất nhiều chất ức chế ACE được tổng hợp bằng con đường hóa học để giảm cao huyết áp như captopril, enalapril, alacepril và lisinopril. Tuy nhiên, các loại thuốc này thường gây ra các tác dụng phụ như: ho, rối loạn vị giác và mẩn da. Vì vậy, trong khoảng hai thập kỷ gần đây, các nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu và sản xuất nhiều loại peptide ức chế ACE có nguồn gốc từ tự nhiên (thực vật, động vật và vi sinh vật) giúp giảm huyết áp mà ít gây các tác dụng phụ như trên. Cao Hải Yến - 2015B 11 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật Công nghệ sinh học Angiotensin I-converting enzyme có hai đồng dạng ở động vật có vú: Soma ACE (sACE) tồn tại trong các mô soma và bao gồm hai vùng (vùng N và một vùng C), và tACE, được tìm thấy ở tinh hoàn người lớn. Cả hai đồng dạng được mã hóa bởi cùng một gen, nhưng RNA (mRNA) phiên mã bắt đầu tại các vị trí khác nhau. Hai đồng dạng có tính đặc hiệu cao trong miền C, nhưng sACE chứa một chuỗi 36axit amin ở vùng cuối N [5]. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng miền C là quan trọng hơn cho việc điều chỉnh huyết áp và hoàn toàn chiếm vai trò quan trọng cho quá trình giảm huyết áp của sACE. Miền C có hằng số xúc tác cao hơn cho angiotensin I và các cơ chất không có hoạt tính sinh học, hippuryl histidyl-leucine (HHL) [4]. Cơ chế tăng huyết áp: Những peptide có khả năng kìm hãm enzym chuyển hóa angiotensin có trong hệ thống điều hòa huyết áp của cơ thể người và cơ chế điều hòa được thông qua hệ thống renin – angiotensin như sau: Khi thể tích máu trong cơ thể người hạ thấp khiến huyết áp giảm, thận sẽ bài tiết enzym có tên là renin. Renin kích thích sự sản sinh angiotensin. Tiếp đến Angiotensin gây co mạch máu dẫn đến việc tăng huyết áp. Angiotensin cũng kích thích sự tiết hormon aldosterone từ lớp cầu vỏ thượng thận. Aldosterone làm tăng tái hấp thu nước và ion Na+ ở các tế bào biểu mô ống thận. Điều đó sẽ dẫn tới việc tăng lượng nước trong cơ thể, phục hồi huyết áp [6,11]. Hệ thống này có thể được hoạt hóa khi có sự giảm thiểu thể tích máu hay sụt giảm huyết áp (như xuất huyết). Nếu lưu lượng nước qua các tế bào cận tiểu cầu nằm trong phức hợp cận tiểu cầu ở thận giảm xuống, sau đó các tế bào cận tiểu cầu giải phóng enzyme renin. Renin sẽ tác động lên một protein trong huyết tương là angiotensinogen vốn đang ở dạng bất hoạt bằng cách cắt một đoạn zymogen, chuyển nó thành angiotensin I. Angiotensin I sau đó được chuyển đổi thành angiotensin II bởi enzyme chuyển đổi angiotensin được tìm thấy chủ yếu ở mao mạch phổi [5]. Angiotensin II là chất có tác dụng sinh học cao của hệ renin-angiotensin, sẽ gắn lên các thụ thể nằm trên màng tế bào nội mô mao mạch, làm cho các tế bào này co thắt và mạch máu quanh chúng dẫn đến sự giải phóng aldosterone từ vùng cung ở thượng Cao Hải Yến - 2015B 12 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật Công nghệ sinh học thận vỏ. Angiotensin II hoạt động như là hormon nội tiết, tự tiết, cận tiết, và kích thích tố nội bào [10]. Hình 1.2. Hệ thống Renin – angiotensin – aldosterone [54] Những peptid có khả năng kìm hãm ACE thường có cấu tạo từ 2 đến 10 amino axit. Chất ức chế ACE đầu tiên được phát hiện trong nọc rắn Bothrops jararaca vào năm 1970. Trong nọc rắn có các peptide ức chế ACE có từ 5-13 gốc amino axit trong phân tử, trong số đó có peptide Glu-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-pro-pro là có hoạt tính cao nhất in vivo. Một peptide khác là bradykinin-potentiating peptide 5a (BPP5a) Glu-Lys-Trp-Ala-Pro có thứ tự 3 amino axit cuối ở đầu C rất phù hợp cho việc kết hợp với tâm hoạt động của ACE, tuy nhiên peptide này lại dễ bị phân hủy trong điều kiện in vivo. Do đó, người ta đã thay thế gốc Trp trong phân tử bằng gốc Phe để có được phân tử peptide bền hơn nhưng vẫn có hoạt tính ức chế ACE mạnh. Và cũng từ đó, hầu hết các thuốc ức chế ACE được sử dụng đều có cấu trúc tương tự hay liên quan đến tripeptide Phe-Ala-Pro [9]. Một số peptid được tìm thấy khi thuỷ phân protein sữa dê (β-, κ-casein, βlactoglobulin) cũng cho hoạt tính kìm hãm ACE. Có 07 peptide tìm thấy trong trứng Cao Hải Yến - 2015B 13 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật Công nghệ sinh học trong đó có 5 tripeptide và 2 pentapeptide, ngoài ra còn có nhiều trong các loại thực vật như: đậu tương, nấm, bông cải xanh, lúa mạch, gạo, cải bó xôi, tỏi…[1]. Peptide kìm hãm ACE được thu từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như: protein sữa, gạo, ngô, đậu tương, lúa mạch, lúa mì bằng cách dùng enzyme thủy phân giới hạn hay lên men truyền thống. Những enzyme dùng để thủy phân từ những nguồn nguyên liệu này là các chế phẩm protease như alcalase, trypsin, chymotrypsin [9, 13, 16]. 1.1.2.2. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và virut • Kháng khuẩn Peptide kháng khuẩn tương tác ban đầu với vi khuẩn qua màng tế bào chất. Bằng cách tấn công màng cytoplasmic của vi khuẩn làm phá vỡ liên kết màng hoặc ngăn cản chức năng màng tế bào vi khuẩn. Chúng xâm nhập vào màng tế bào bằng một số cơ chế khác nhau (hình 1.3). Một số mô hình như mô hình thùng rỗng, thảm (A, B) nhận được sự chú ý nhất, các mô hình ít được biết đến hơn như mô hình phân tử mang điện tích, bè chìm (D,E). Không phải tất cả các peptide kháng khuẩn đều hoạt động chính trên màng tế bào chất, mà còn tác động lên các mục tiêu nội bào trong vi khuẩn, ức chế tổng hợp protein, hoặc tế bào, tương tác với DNA hoặc RNA hoặc ức chế một số hoạt động enzyme [37]. Cao Hải Yến - 2015B 14 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật Công nghệ sinh học Hình 1.3. Minh hoạ cơ chế kháng khuẩn của peptide có hoạt tính sinh học [37] A: Mô hình thùng rỗng, B: Mô hình thảm, C: Mô hình lỗ, D: Mô hình phân tử mang điện tích, E: Mô hình bè chìm. Peptide kháng khuẩn bacitracin được tách từ Bacillus subtilis vào năm 1945 bởi B. A. Johnson và cộng sự. Peptide này được tìm thấy có phổ kháng khuẩn rộng và được sử dụng trong lâm sàng như một tác nhân hạn chế trong lâm sàng. Cấu trúc của nó sau đó đã được Craig tìm ra. Một decapeptide vòng khác là Gramicidin S cũng được tách chiết từ Bacillus brevis. Cấu trúc của nó được mô tả vào năm 1945 bởi A. H. Gordon và cộng sự. Quá trình tổng hợp nó đạt được vào năm 1970 với công trình của G. Losse và cộng sự. Loại thuốc này thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt trong việc chống lại cả các vi khuẩn Gram âm và dương. Vào năm 1953, Schulman và cộng sự đã tách chiết được Polymyxin B từ Bacillus polymyxa và sau đó là các biến thể của nó là B1 và B2 bởi Hausmann và cộng sự vào năm 1954. Công thức cấu tạo của Polymyxin B cũng đã được tìm ra bởi Vogler vào năm 1994. Polymyxin B được sử dụng chủ yếu để điều trị bệnh liên quan đến vi khuẩn Gram âm bao gồm các tác nhân lây nhiễm đường tiêu hóa P. enteritis hay Shigella và các nhiễm khuẩn tại các vết thương hoặc vết bỏng. Evolidine, một heptapeptide vòng được tách chiết từ là cây Evodia xonthoxyloid và được mô tả các đặc điểm bởi Eastwood và cộng sự vào năm 1955. Cao Hải Yến - 2015B 15 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật Công nghệ sinh học Cấu trúc của nó được làm sáng tỏ nhờ Kopple vào năm 1971 và cấu trúc tinh thể cũng như các nghiên cứu khác cũng đã có trong các báo cáo của Drake vào năm 1991. Peptide này thể hiện hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm tốt. Atinomycin được khám phá bởi A.A.Waksman và cộng sự vào năm 1940 từ Actinomyces antibioticus. Các nghiên cứu chính để xác định cấu trúc và tổng hợp toàn bộ hợp chất này đã được W. Brockmann hoàn thành vào năm 1960. Actinomycin D hay Dactinomycin thể hiện hoạt tính mạnh chống lại các vi khuẩn Gram dương. Tyrocidine-A, một kháng sinh decapeptide vòng, hợp thành tyrothricin đã được phân lập từ Bacillus brevis. • Kháng nấm Tương tự như cơ chế của kháng khuẩn, peptide cũng tấn công màng tế bào nấm, làm rối loạn quá trình tổng hợp lên thành tế bào, tấn công vào ty thể và các cơ quan nội bào khác [32]. Theo De Lucca và Walsh (1999), peptide kháng nấm có thể được phân thành 2 loại dựa vào cơ chế hoạt động của chúng gồm: peptide tấn công qua thành tế bào. Peptid qua màng tế bào nấm và tấn công vào các mục tiêu bên trong tế bào và tạo thành lỗ hổng. Peptide hoạt động bằng cách phân giải tế bào. Các peptide này được đặc trưng bởi bản chất amphipathic của chúng, là phân tử có 2 phần, một tích điện dương, trung hòa và kỵ nước [32, 33, 45]. • Kháng virut Một số nghiên cứu đã chứng minh được Cation Peptide có khả năng ức chế nhiễm virus. Peptide Cecropin A có thể chống lại vi rút Junin (JV-gây bệnh sốt xuất huyết Argentina). Năm 2004, Albiol-Matanic và Castilla 2004 đã tiến hành nghiên cứu và chứng minh Peptide Melittin ức chế được cả hai virus JV và HSV-1, cũng như magainin I và II có thể chống lại HSV-1và HSV-2). Năm 2010, Kết quả nghiên cứu của Chia và cộng sự đã cho thấy peptide vi sinh vật được phân lập từ cá, như cá rô phi hepcidin 1-5 cũng có khả năng chống lại hoạt động của virus gây hoại tử thần kinh (NN virus) - một tác nhân gây tử vong lớn Cao Hải Yến - 2015B 16 Luận văn thạc sỹ kỹ thuật Công nghệ sinh học đối với một số loài cá biển trong giai đoạn ấu trùng. Ngoài ra, peptide được tổng hợp gồm arginine và tryptophan lặp đi lặp lại cũng chứng minh được có khả năng chống lại virus vaccinia (nguyên nhân gây ra bệnh đậu mùa). 1.1.2.3. Peptide có hoạt tính chống oxy hóa Ngày nay, thuật ngữ “chống oxy hoá” được đề cập nhiều trong các diễn đàn bảo vệ, duy trì sức khỏe con người. Chất chống oxy hóa được tìm thấy nhiều trong các loại trái cây và rau quả, thảo dược, trứng, sữa. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh lợi ích của chúng đối với sức khỏe trên nhiều mặt. Gốc tự do (chất oxy hóa) luôn luôn được sinh ra trong cơ thể con người và cũng có vai trò tích cực đối với cơ thể (có thể nói ta không thể sống được nếu trong cơ thể hoàn toàn thiếu vắng gốc tự do). Oxy (dưỡng khí) mà ta hít thở hàng ngày là chất cần thiết nhưng chính nó cũng trở thành gốc tự do (khi đó gọi là oxy đơn bội). Hiện tượng thực bào là hiện tượng vi khuẩn, virut bị tế bào bạch cầu tiêu diệt trong cơ thể, hoặc hiện tượng hô hấp trong tế bào, hoặc cơ chế giải độc ở gan đều là các hoạt động làm sinh ra gốc tự do. Điều quan trọng là trong cơ thể khoẻ mạnh, gốc tự do sinh ra có giới hạn, không quá thừa để gây hại. Bên cạnh các gốc tự do luôn có hệ thống các chất chống oxy hoá "nội sinh" (tức có sẵn trong cơ thể) cân bằng lại, vô hiệu hoá các gốc tự do có hại. Hệ thống các chất chống oxy này gồm các enzym như glutathione peroxidase, superroxid dismutase... đặc biệt là vitamin C, vitamin E, beta-caroten (tiền vitamin A), khoáng chất selen "nội sinh", xúc tác các phản ứng khử để vô hiệu hoá gốc tự do (còn gọi là "bẫy" gốc tự do) giúp cơ thể khoẻ mạnh. Để chống lại sự bội tăng các gốc tự do sinh ra quá nhiều mà hệ thống "chất oxy hoá nội sinh" không đủ sức cân bằng để vô hiệu hoá, các nhà khoa học đặt vấn đề dùng các "chất chống oxy hóa ngoại sinh" với mục đích phòng bệnh, nâng cao sức khỏe, chống lão hóa. Các chất chống oxy hóa ngoại sinh đó đã được xác định, đó là beta-caroten, chất khoáng selen, các hợp chất flavonoid, polyphenol, peptide... Cao Hải Yến - 2015B 17