Tài liệu Nghiên cứu thử nghiệm mẫu máu giả định ứng dụng trong ngoại kiểm vi sinh

. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ----------------- NGUYỄN THỊ THU DIỂM NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM MẪU MÁU GIẢ ĐỊNH ỨNG DỤNG TRONG NGOẠI KIỂM VI SINH Chuyên ngành: Kỹ thuật xét nghiệm y học Mã số: 8720601 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS.BS HÀ MẠNH TUẤN 2. TS.BS HOÀNG TIẾN MỸ Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2019 . . LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Nguyễn Thị Thu Diểm . . MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1 CÂU HỎI NGHIÊN CỨU ................................................................................ 3 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU.............................................................................. 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4 1.1 Nhiễm khuẩn máu ................................................................................... 4 1.1.1 Khái quát về nhiễm khuẩn máu ..................................................... 4 1.1.2 Tác nhân gây nhiễm khuẩn máu .................................................... 4 1.1.3 Tác nhân Escherichia coli .............................................................. 6 1.1.4 Tác nhân Staphylococcus aureus ................................................... 7 1.2 Xét nghiệm cấy máu trong phòng xét nghiệm ........................................ 8 1.2.1 Quy trình cấy máu bằng phương pháp thông thường .................... 9 1.2.2 Quy trình cấy máu bằng máy tự động.......................................... 10 1.3 Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm.................................................. 12 1.3.1 Định nghĩa về ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm.................. 12 1.3.2 Các phương thức ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm............. 13 1.3.3 Nguyên tắc thực hiện ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm ...... 15 1.3.4 Tầm quan trọng của ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm ........ 16 . . 1.3.5 Mẫu ngoại kiểm sử dụng trong chương trình ngoại kiểm tra chất lượn xét nghiệm .................................................................................... 17 1.4 Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh ...................................... 18 1.4.1 Tình hình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh trên thế giới…………………………………………………………………….19 1.4.2 Tình hình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm vi sinh tại Việt Nam…………………………………………………………………...19 1.4.3 Mẫu ngoại kiểm vi sinh................................................................ 20 1.4.4 Yêu cầu kỹ thuật, thành phần mẫu kiểm vi sinh .......................... 22 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 25 2.1 Thiết kế nghiên cứu ............................................................................... 25 2.2 Đối tượng nghiên cứu ........................................................................... 25 2.3 Cỡ mẫu .................................................................................................. 25 2.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu......................................................... 26 2.5 Quá trình nghiên cứu............................................................................. 26 2.6 Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 27 2.6.1 Thử nghiệm hoạt tính Acid boric-Natri formate .......................... 27 2.6.2 Sản xuất thử nghiệm mẫu bệnh phẩm máu giả định ở quy mô phòng thí nghiệm.............................................................................................. 29 2.7 Vật liệu và cơ sở vật chất sử dụng trong nghiên cứu ............................ 35 2.8 Kỹ thuật vi sinh trong nghiên cứu......................................................... 39 2.8.1 Định danh vi khuẩn ...................................................................... 39 2.8.2 Xác định nồng độ vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm-phương pháp đếm sống ............................................................................................... 40 2.9 Kiểm soát sai lệch ................................................................................. 41 2.9.1 Kiểm soát sai lệch lựa chọn ......................................................... 41 2.9.2 Kiểm soát sai lệch thông tin ......................................................... 42 2.10 Y đức của nghiên cứu.……………………………………………….42 . . CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ ................................................................................. 43 3.1 Thử nghiệm hoạt tính Acid boric-Natri formate ................................... 43 3.1.1 Kết quả thử nghiệm hoạt tính Acid boric-Natri formate trong môi trường nutrient broth, máu cừu 10% ..................................................... 43 3.1.2 Xác định nồng độ Acid boric-Natri formate phù hợp mục đích nghiên cứu sản xuất thử nghiệm mẫu máu giả định ............................. 49 3.2 Kết quả sản xuất thử nghiệm bộ mẫu máu giả định chứa S. aureus .... 56 3.2.1 Kết quả đánh giá tính đồng nhất của bộ mẫu S. aureus............... 61 3.2.2 Kết quả đánh giá độ ổn định của bộ mẫu S. aureus ..................... 63 3.3 Kết quả sản xuất thử nghiệm bộ mẫu máu giả định chứa E. coli ......... 66 3.3.1 Kết quả đánh giá độ đồng nhất của bộ mẫu E. coli ..................... 72 3.3.2 Kết quả đánh giá độ ổn định của bộ mẫu E. coli ......................... 73 3.4 Kết quả quy trình sản xuất thử nghiệm mẫu máu giả định chứa tác nhân đích S. aureus và E. coli .............................................................................. 76 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN .............................................................................. 78 4.1 Thử nghiệm Acid boric-Natri formate .................................................. 78 4.2.1 Thử nghiệm hoạt tính Acid boric-Natri formate đối với E. coli, S. aureus trong môi trường máu giả định ............................................. 78 4.2.2 Xác định nồng độ Acid boric-Natri formate phù hợp mục đích sản xuất thử nghiệm mẫu máu giả định chứa tác nhân E. coli và S. aureus……………………………………………………………………… 81 4.2 Sản xuất thử nghiệm mẫu máu giả định chứa tác nhân đích S. aureus và E. coli ở quy mô phòng thí nghiệm ............................................................. 82 4.2.1 Đặc tính bộ mẫu máu ................................................................... 82 4.2.2 Đánh giá chất lượng của hai bộ mẫu máu giả định...................... 84 4.3 Quy trình sản xuất thử nghiệm mẫu máu giả định chứa tác nhân đích S. aureus và E. coli .......................................................................................... 87 . . KẾT LUẬN ..................................................................................................... 90 KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. i PHỤ LỤC 1 ...................................................................................................... ix PHỤ LỤC 2 ....................................................................................................... x PHỤ LỤC 3 ..................................................................................................... xii PHỤ LỤC 4 .................................................................................................... xiii PHỤ LỤC 5 .................................................................................................... xiv PHỤ LỤC 6 .................................................................................................... xvi PHỤ LỤC 7 .................................................................................................... xxi PHỤ LUC 8 .................................................................................................. xxvi . . DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ Tiếng Việt Từ viết tắt AB Từ Tiếng Anh Acid Boric Chủng vi khuẩn tiêu chuẩn Americal Type Hoa Kỳ Culture Collection BA Thạch máu Blood agar CFU Đơn vị khúm khuẩn Colony forming unit CLXN Chất lượng xét nghiệm EQAs Chương trình ngoại kiểm tra External Quality chất lượng Assessment schemes ATCC GĐ Giai đoạn IQC Nội kiểm tra chất lượng Internal Quality Control ISO Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế International Standard Organization MC Môi trường MacConkey MacConkey Agar NF Natri formate Sodium formate PXN Phòng xét nghiệm TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam XN Xét nghiệm WHO Tổ chức Y tế Thế giới . World Health Organization . DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2. 1 Bảng nồng độ AB và NF tỉ lệ 2:1 sử dụng thử nghiệm ................. 28 Bảng 2. 2 Hóa chất và sinh phẩm.................................................................... 36 Bảng 2. 3 Thiết bị và cơ sở vật chất ................................................................ 37 Bảng 3. 1 Tốc độ sinh trưởng E. coli được biểu thị bằng Log10CFU/mL trong nhóm ống (S)…………………………… …………………………………..43 Bảng 3. 2 Tốc độ tăng trưởng E. coli được biểu thị bằng Log10CFU/mL trong nhóm ống (C)……………………………………………………………..…44 Bảng 3. 3 Tốc độ tăng trưởng S. aureus được biểu thị bằng Log10CFU/mL trong nhóm ống (S) ................................................................................................... 46 Bảng 3. 4 Tốc độ tăng trưởng S. aureus được biểu thị bằng Log10CFU/mL trong nhóm ống (C) .................................................................................................. 47 Bảng 3. 5 Kết quả tốc độ sinh trưởng E. coli ở mỗi nồng độ AB-NF.............51 Bảng 3. 6 Kết quả tốc độ sinh trưởng S. aureus ở mỗi nồng độ AB-NF…….54 Bảng 3. 7 Kết quả kiểm tra vi khuẩn S. aureus............................................... 56 Bảng 3. 8 Kết quả kiểm tra cơ chất sử dụng ở bộ mẫu S. aureus ................... 57 Bảng 3. 9 Kết quả kiểm tra chế phẩm máu cừu ở bộ mẫu S. aureus .............. 58 Bảng 3. 10 Kết quả đánh giá tính đồng nhất của bộ mẫu S. aureus ............... 62 Bảng 3. 11 Kết quả theo dõi nhiệt độ thùng mẫu S. aureus............................ 63 Bảng 3. 12 Kết quả phân tích độ ổn định của bộ mẫu S. aureus .................... 65 Bảng 3. 13 Kết quả kiểm tra vi khuẩn E. coli ............................................... 67 Bảng 3.14 Kết quả kiểm tra chất lượng cơ chất ở bộ mẫu E. coli .................. 68 Bảng 3.15 Kết quả kiểm tra chế phẩm máu cừu ở bộ mẫu E.coli……….......69 Bảng 3. 16 Kết quả phân tích tính đồng nhất của bộ mẫu E. coli................... 73 Bảng 3. 17 Kết quả theo dõi nhiệt độ thùng mẫu E. coli ............................... 74 Bảng 3.18 Kết quả phân tích độ ổn định của bộ mẫu E. coli .......................... 75 . . DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. 1 Vi khuẩn hàng đầu được xác định từ nuôi cấy máu dương tính trong 1 năm. Biểu đồ hình tròn biểu thị sự phân bố của các nhóm ............................ 5 Hình 1. 2 Vi khuẩn Escherichia coli ................................................................. 7 Hình 1. 3 Hình ảnh đặc tính vi khuẩn S. aureus ............................................... 8 Hình 1. 4 Sơ đồ qui trình thực hiện kiểm tra chất lượng ................................ 14 Hình 2. 1 Sinh phẩm và dụng cụ ..................................................................... 36 Hình 2. 2 Thiết bị và cơ sở vật chất ................................................................ 38 Hình 2. 3 Phương pháp đếm sống vi sinh vật trong mẫu ................................ 41 Hình 3. 1 Hai nhóm môi trường (C) và (S) có chứa tác nhân E. coli ............. 43 Hình 3. 2 Hai nhóm môi trường (C) và (S) có chứa tác nhân S. aureus ......... 46 Hình 3. 3 Nhóm ống chứa tác nhân E. coli ở từng nồng độ AB-NF .............. 49 Hình 3. 4 Nhóm ống chứa tác nhân S. aureus ở từng nồng độ AB-NF .......... 53 Hình 3. 5 Hỗn hợp máu giả định chứa tác nhân S. aureus sau phối trộn........ 59 Hình 3. 6 Bộ mẫu S. aureus sau khi phân phối vào ống và đóng gói ............. 60 Hình 3. 7 Bảo quản mẫu ở điều kiện giả định vận chuyển ............................. 61 Hình 3. 8 Nhiệt kế ghi nhận nhiệt độ thùng mẫu S. aureus ............................ 64 Hình 3. 9 Hỗn hợp máu giả định chứa tác nhân E. coli sau khi phối trộn ...... 70 Hình 3. 10 Bộ mẫu E. coli sau khi phân phối vào ống, đóng gói ................... 71 Hình 3. 11 Bảo quản bộ mẫu E. coli ở điều kiện vận chuyển giả định........... 72 . . DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Lưu đồ 2. 1 Quá trình nghiên cứu ................................................................... 26 Sơ đồ 2. 2 Quá trình sản xuất thử nghiệm mẫu máu giả định......................... 29 Sơ đồ 3. 1 Quy trình sản xuất thử nghiệm mẫu máu giả định……………….77 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3. 1 Nghiên cứu in vitro về sự khác biệt về tăng trưởng E. coli........ 45 Biểu đồ 3. 2 Nghiên cứu in vitro về sự khác biệt tăng trưởng S. aureus giữa hai nhóm ống (C) và (S) được biểu thị bằng Log10CFU/mL ................................ 48 Biểu đồ 3. 3 Tốc độ sinh trưởng E. coli ở mỗi nồng độ AB-NF .................... 52 Biểu đồ 3. 4 Tốc độ sinh trưởng S. aureus ở mồi nồng độ AB-NF ................ 55 Biểu đồ 3. 5 Theo dõi độ ổn định của bộ mẫu S. aureus qua biểu đồ ............ 66 Biểu đồ 3. 6 Kết quả theo dõi tính ổn định của bộ mẫu E. coli qua biểu đồ kiểm soát chất lượng ................................................................................................ 76 . . ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm khuẩn máu (NKM) là một hội chứng bệnh nghiêm trọng, đặc trưng bởi tỉ lệ mắc và tử vong cao [38]. Trên thế giới, ước tính mỗi năm có khoảng 30 triệu người mắc và 06 triệu người tử vong do NKM [24], [25]. Tỉ lệ tử vong do NKM chiếm trên 20% tổng số ca tử vong tại bệnh viện [31], [39]. Mặc dù có những tiến bộ trong điều trị nhưng NKM vẫn còn là một gánh nặng đối với hệ thống chăm sóc sức khỏe ở các quốc gia trên toàn thế giới. Đặc biệt trong bối cảnh đa kháng thuốc ngày càng tăng, tỉ lệ tử vong ở bệnh nhân mắc NKM với nguyên nhân do không được điều trị kháng sinh phù hợp khi chưa có kết quả xét nghiệm vi sinh xác định chính xác tác nhân gây NKM lên đến 61,9% [20], [22], [23], [50]. Vì vậy, để có thể hướng dẫn điều trị kháng sinh kịp thời, hiệu quả nhằm giảm tỉ lệ tử vong và chi phí cho bệnh nhân thì việc xác định chính xác tác nhân gây NKM trong thời gian sớm nhất là rất quan trọng. Cấy máu là công cụ đầu tiên và hiện tại cũng là phương pháp chính để xác định căn nguyên NKM tại các cơ sở khám chữa bệnh [27]. Do đó, kết quả xét nghiệm cấy máu có đủ tin cậy để hỗ trợ tốt nhất cho công tác chẩn đoán và điều trị NKM hay không đang là vấn đề rất được quan tâm. Ngoại kiểm tra là yêu cầu không thể thiếu trong đảm bảo chất lượng xét nghiệm (CLXN) theo tiêu chuẩn ISO 15189:2012, đồng thời cũng là tiêu chí đánh giá mức chất lượng phòng xét nghiệm (PXN) y học theo quyết định số 2429/QĐ-BYT của Bộ Y tế năm 2017. Ngoại kiểm tra giúp PXN phát hiện các vấn đề không phù hợp có thể dẫn đến sai sót hay làm giảm tính chính xác của kết quả xét nghiệm, từ đó đề ra các giải pháp can thiệp, xử lý khắc phục kịp thời và từng bước cải tiến nâng cao CLXN [3]. Do đó, cơ sở khám chữa bệnh muốn nâng cao CLXN cấy máu, đòi hỏi các cần phải tối ưu hóa chất lượng thông qua công cụ đánh giá ngoại kiểm cấy máu là việc làm rất cần thiết. . . Để có thể triển khai một chương trình ngoại kiểm, cần phải có bộ mẫu kiểm đảm bảo tính đồng nhất và độ ổn định theo thời gian [5], [15], [48]. Tại Việt Nam, mẫu ngoại kiểm sử dụng cho chương trình cấy máu thường được các đơn vị mua từ các nhà sản xuất nước ngoài với giá thành cao và thủ tục phức tạp. Trên thế giới, các mẫu như máu, đàm, dịch não tủy, dịch hầu họng, nước tiểu dưới dạng mẫu giả định đã được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực ngoại kiểm vi sinh. Tuy nhiên, tại Việt Nam đến nay vẫn chưa có bất kì công trình nghiên cứu nào sản xuất mẫu máu giả định chứa thành phần hóa chất Acid boric và Natri formate nhằm duy trì nồng độ vi khuẩn trong mẫu theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 2016 [57] được công bố. Xuất phát từ những cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu thử nghiệm mẫu máu giả định ứng dụng trong ngoại kiểm vi sinh” nhằm mục đích có thể chủ động cung cấp được nguồn mẫu ngoại kiểm đảm bảo tính đồng nhất và độ ổn định đạt tiêu chuẩn ISO/IEC 17043:2011 với chi phí rẻ, phục vụ công tác ngoại kiểm tra cấy máu cho các PXN. . . CÂU HỎI NGHIÊN CỨU Bộ mẫu máu giả định chứa tác nhân gây NKM ứng dụng trong ngoại kiểm chất lượng xét nghiệm, sản xuất tại Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học - Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh đạt tính đồng nhất, độ ổn định và đáp ứng được các yêu cầu của mẫu ngoại kiểm lượng xét nghiệm vi sinh hay không? MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1. Thử nghiệm hoạt tính Acid boric-Natri formate đối với sự sinh trưởng của E. coli, S. aureus trong môi trường máu giả định. 2. Đánh giá chất lượng bộ mẫu máu giả định đã sản xuất thử nghiệm dựa vào tiêu chí đánh giá tính đồng nhất và độ ổn định. 3. Xây dựng quy trình sản xuất bộ mẫu máu giả định sử dụng trong ngoại kiểm chất lượng xét nghiệm vi sinh. . . CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nhiễm khuẩn máu 1.1.1 Khái quát về nhiễm khuẩn máu NKM là một hội chứng lâm sàng xảy ra khi cơ thể phản ứng lại với các tác nhân nhiễm trùng [25]. NKM có thể là do nhiễm khuẩn mắc phải ở trong môi trường cộng đồng hoặc trong các cơ sở chăm sóc sức khỏe. NKM tại các cơ sở chăm sóc sức khỏe thường nặng và có nguy cơ tử vong cao hơn, ảnh hưởng đến hàng trăm triệu bệnh nhân trên toàn thế giới mỗi năm [54]. 1.1.2 Tác nhân gây nhiễm khuẩn máu Theo thống kê năm 2003, tại Hoa Kỳ, trong tổng số trường hợp có kết quả cấy máu dương tính, vi khuẩn là loại tác nhân gây NKM phổ biến nhất [33]. Hiện nay, hơn 750.000 trường hợp bị NKM được báo cáo tại Hoa Kỳ mỗi năm [16]. Trong đó, Staphylococcus aureus (S. aureus) và Streptococcus pneumonia là hai chủng phân lập phổ biến nhất trong nhóm Gram dương. Trong khi, ở nhóm phân lập Gram âm Escherichia coli (E. coli), Klebsiella spp. và Pseudomonas aeruginosa là 3 tác nhân chiếm ưu thế [36]. Vào năm 2015, tại nghiên cứu của Opota và cộng sự [38] đã chỉ ra rằng E. coli và S. aureus là 2 tác nhân gây chính gây NKM trong tổng số ca cấy máu dương tính hình 1.1. Đến năm 2018 thì chủng hai E. coli và S. aureus chủng này vẫn được xem là 2 tác nhân phổ biến gây NKM [40]. . . Hình 1. 1 Vi khuẩn hàng đầu được xác định từ nuôi cấy máu dương tính trong 1 năm. Biểu đồ hình tròn biểu thị sự phân bố của các nhóm tác nhân gây NKM [38]. Tại Việt Nam, theo một nghiên cứu vào năm 2009 đã cho rằng nhóm vi khuẩn đường ruột chiếm ưu thế vượt trội chiếm 50,89% trong số tác nhân gây nhiễm NKM, tiếp theo là nhóm cầu khuẩn gram dương (33,04%), các trực khuẩn gram âm không lên men chiếm tỉ lệ thấp nhất (16,07%). Xét theo loài, vi khuẩn E. coli chiếm tỉ lệ 24,11%, kế đến Klebsiella spp. (17,83%), S. aureus (8,93%) và cuối cùng là P. aeruginosa và Acinetobacter spp. [10]. Ngoài ra trong các trường hợp NKM, PXN thường phân lập được các chủng vi khuẩn khác như: Streptococci tiêu huyết α, β; Enterococci; Neisseria meningitidis; Neisseria Honorrhoeae; Pseudomonas spp.; Hemophilus influenzae; Yersinia pestis; Brucella spp. Số lượng vi khuẩn có trong máu người mắc NKM dao động từ 1 CFU /mL- 10 CFU /mL đến 1× 10 3- 1×10 5 CFU /mL [17], [38]. Tuy nhiên, với . . nồng độ vi khuẩn lưu thông trực tiếp trong máu toàn phần chỉ từ 1 đến 10 CFU /mL là đã có thể xác định tác nhân NKM bằng các hệ thống cấy máu tự động [26], [51]. CFU/mL ở đây, được diễn giải là sinh vật sống có thể được phục hồi bằng nuôi cấy. Do đó, nó có tương quan chặt chẽ với các phương pháp chẩn đoán dựa trên cấy máu. 1.1.3 Tác nhân Escherichia coli Năm 1885, tại München (Đức), một bác sĩ nhi khoa tên là Theodor Escherich rất quan tâm đến những phát hiện quan trọng của Louis Pasteur và Robert Kock về vi khuẩn. Qua nhiều thí nghiệm lâm sàng để nghiên cứu bệnh tiêu chảy, Escherich tỏ rõ mối quan tâm tới một vi sinh vật đường ruột ở trẻ em. Sau 4 năm, vi khuẩn này được giới chuyên môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân người có công khám phá. Tuy nhiên, năm 1895 nó vẫn được gọi bằng tên Bacillus coli và Bacterium coli vào một năm sau đó. Đến năm 1991, vi khuẩn mới được thế giới thống nhất định danh là Escherichia coli. Tại các nước đang phát triển, NKM do vi khuẩn Gram âm ngày càng chiếm ưu thế. Trong đó E.coli là nguyên nhân hàng đầu gây NKM trong bệnh viện. Một nghiên cứu của tác giả Weinstein cho thấy E. coli chiếm 27%, Streptococcus pneumonia 16% và S. aureus chiếm 12% trong tổng số ca NKM. Trong khi đó, tại Việt Nam, vi khuẩn E. coli cũng chiếm tỉ lệ cao nhất khoảng 24,11% trong tổng số tác nhân gây NKM [10]. E. coli là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi, phát triển ở nhiệt độ từ 5ºC-40°C, nhiệt độ thích hợp là 37°C. E. coli dễ dàng phát triển trên các môi trường nuôi cấy thông thường như MC, EMB…Trong một số điều kiện thích hợp E. coli phát triển rất nhanh, thời gian phân chia chỉ khoảng 20 đến 30 phút. Trong môi trường lỏng (canh thang) vi khuẩn phát triển làm đục nhẹ môi trường sau 3-4 giờ; sau 24 giờ làm đục đều; sau 2 ngày sẽ xuất hiện váng mỏng trên mặt môi trường nuôi cấy. Trên môi trường thạch (môi trường đặc), sau khoảng . . 8-10 giờ, đã thấy xuất hiện khúm khuẩn, sau 24 giờ khúm khuẩn khoảng 1,5 mm. Hình thái khúm khuẩn điển hình dạng S, nhưng cũng có thể gặp dạng R, hoặc M. Hình 1. 2 Vi khuẩn Escherichia coli “Nguồn : https://medicine.wustl.edu- Washington University School of Medicine’’ 1.1.4 Tác nhân Staphylococcus aureus S. aureus là vi khuẩn Gram dương, hình cầu, có xu hướng sắp xếp theo cụm được mô tả là “giống chùm nho” khi quan sát bằng kính hiển vi (Hình 1.3). S. aureus có thể phát triển ở nồng độ 10% muối. Các xét nghiệm sinh hóa điển hình bao gồm catalase dương tính với tất cả Staphylococcus spp. gây bệnh. Ngoài ra, còn sử dụng một số tính chất khác để phân biệt Staphylococcus spp. khác như coagulase dương tính (để phân biệt S. aureus với các loài Staphylococcus spp. khác), novobiocin (phân biệt Staphylococcus saprophyticus) và lên men mannitol dương tính nhằm phân biệt Staphylococcus epidermidis. S. aureus là một trong hai tác nhân vi khuẩn gây tử vong phổ biến nhất của NKM với tỉ lệ 26/100 000 dân số/năm [30]. Các yếu tố góp phần nâng cao khả năng gây bệnh của S. aureus bao gồm mối liên quan của nó với các dụng cụ y tế như đường truyền tĩnh mạch,.. có khuynh hướng tạo ra bệnh phức tạp với khả năng phát triển nhanh chóng, tính đề kháng cao . . với nhiều loại kháng sinh [34]. Ngay cả trong các quần thể có mức độ kháng kháng sinh thấp, S. aureus cũng là nguyên nhân gây NKM nghiêm trọng với tỉ lệ tử vong cao [34], [18]. Hình 1. 3 Hình ảnh đặc tính vi khuẩn S. aureus “Nguồn: https://www.hopkinsguides.com/hopkins/view/ Staphylococcus aureus” 1.2 Xét nghiệm cấy máu trong phòng xét nghiệm Xét nghiệm cấy máu tại các PXN từ các kỹ thuật thông thường như nuôi cấy mẫu máu trong môi trường giàu dinh dưỡng, xác định và kiểm tra tính nhạy cảm của mầm bệnh bằng các kỹ thuật sinh hóa tiêu chuẩn; đến những tiến bộ đáng kể đã được thực hiện trong các hệ thống nuôi cấy bao gồm việc bổ sung các phương tiện tăng trưởng phong phú, các hệ thống kích thích tự động và hiện đại hơn là phát triển phần mềm cho phép phát hiện vi khuẩn nhanh hơn thông qua các thuật toán cải tiến được thiết kế để theo dõi các đường cong phát triển vi khuẩn. Tuy nhiên, để có được kết quả cấy máu chính xác còn phụ thuộc nhiều về chất lượng mẫu máu như máu phải được lấy đúng thời điểm, lấy trước khi bắt đầu điều trị nhiễm khuẩn và đảm bảo thể tích máu được lấy từ mỗi tĩnh mạch vào khoảng 20-40 mL trong một lần cấy máu là yếu tố quan trọng trong việc phát hiện nhiễm khuẩn máu người lớn [58]. Riêng với trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ thể tích máu đặc biệt quan trọng vì không phải lúc nào cũng có thể rút ra một lượng máu lớn. Hiện tại, theo các khuyến cáo nên thu thập ít nhất hai mẫu . . máu với thể tích 3-5 mL đối với trẻ em và 5-10 mL ở người lớn trước khi bắt đầu điều trị bằng kháng sinh được xem là lý tưởng [20]. Kết quả sơ bộ có thể thu được trực tiếp từ nuôi cấy máu dương tính trong vòng vài giờ thay vì chờ kết quả xét nghiệm được xác nhận đầy đủ sau khi tăng trưởng và phân lập các khúm khuẩn. Hiện nay, với sự phát triển của các công cụ hoàn toàn tự động như hệ thống cấy máu tự động thì phát hiện vi sinh vật trong máu ngày càng tiện lợi và nhanh chóng bằng cách phân tích hàm lượng CO2 từ cảm biến huỳnh quang hoặc cảm biến màu và sự thay đổi áp lực trong chai cấy máu do việc tiêu thụ và sản xuất khí từ việc tăng trưởng của vi sinh vật [32]. 1.2.1 Quy trình cấy máu bằng phương pháp thông thường [2]  Ủ ấm bình cấy máu trong điều kiện: • Nhiệt độ: 35ºC-37ºC • Khí trường: Bình thường • Thời gian: 1-7 ngày  Quan sát bình cấy máu: Hàng ngày quan sát bình cấy máu. Nếu có sự phát triển của vi sinh vật, chúng sẽ làm thay đổi môi trường canh thang và được quan sát bằng mắt thường. Nhận định sơ bộ vi sinh vật phát triển trong bình canh thang: • S. aureus thường mọc thành hạt nhỏ đều và có màng ở bề mặt. • Các trực khuẩn Gram âm khi mọc làm canh thang đục đều (trừ Salmonella spp canh thang vẫn có thể trong, vi khuẩn tạo thành một lớp trắng bên trên đáy bình.  Cấy chuyển từ bình cấy máu dương tính: • Lắc đều bình canh thang . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 10 • Dùng bơm tiêm hút khoảng 0,5 mL canh thang. • Nhỏ 1 giọt máu lên lam kính sạch, để khô, cố định rồi nhuộm Gram. Nhận định sơ bộ hình thái, cách sắp xếp, tính chất bắt màu của vi khuẩn. • Cấy chuyển máu sang môi trường BA, CA. • Dùng que cấy vô khuẩn ria đều khắp bề mặt thạch để tạo khúm khuẩn riêng rẽ. • Ủ ấm môi trường BA, CA ở nhiệt độ 35ºC -37oC trong tủ ấm CO2/ qua đêm.  Cấy chuyển “mù” bình cấy máu âm tính sau ủ ấm 4-7 ngày: • Lắc đều bình canh thang. • Dùng bơm tiêm hút khoảng 0,5 mL canh thang. • Cấy chuyển máu sang môi trường BA, CA. Dùng que cấy vô trùng ria đều khắp bề mặt thạch. • Ủ ấm thạch BA, CA ở nhiệt độ 35C-37C trong tủ ấm CO2/ qua đêm.  Đọc đĩa thạch sau ủ ấm: • Quan sát bằng mắt thường sự phát triển của vi sinh vật sau 24 giờ trên tất cả các đĩa và canh thang. • Nếu thấy vi sinh vật phát triển:  Thông báo ngay cho bác sĩ về kết quả chẩn đoán sơ bộ vi sinh vật dựa vào kết quả nhuộm Gram và hình thái khúm khuẩn .  Tiến hành định danh vi sinh vật. • Nếu không thấy vi sinh vật phát triển, tiến hành nhuộm Gram lại bình cấy máu để định hướng tìm nguyên nhân và khắc phục. 1.2.2 Quy trình cấy máu bằng máy tự động [2]  Đưa chai cấy máu vào trong máy và ủ ấm: .