Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng kháng viêm của lá dâm bụt (hibiscus rosa sinensis l.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HÀ THỊ HỒNG PHÚC NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM CỦA LÁ DÂM BỤT (HIBISCUS ROSA-SINENSIS L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HÀ THỊ HỒNG PHÚC NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM CỦA LÁ DÂM BỤT (HIBISCUS ROSA-SINENSIS L.) Ngành: Dƣợc liệu - Dƣợc học cổ truyền Mã số: 8720206 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Trần Thị Vân Anh Thành phố Hồ Chí Minh – 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi.Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Thị Hồng Phúc TÓM TẮT LUẬN VĂN Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ dƣợc học – Năm học 2016-2018 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM CỦA LÁ DÂM BỤT (Hibiscus rosa-sinensis L. Malvaceae) Hà Thị Hồng Phúc Thầy hƣớng dẫn khoa học: TS. Trần Thị Vân Anh Đặt vấn đề: Dâm bụt (Hibiscus rosa-sinensis L., Malvaceae) là một loài dƣợc liệu đƣợc sử dụng phổ biến ở Việt Nam và một số quốc gia Châu Á trong hỗ trợ điều trị viêm dạ dày, đái tháo đƣờng, điều hòa kinh nguyệt, chống rụng tóc. Tuy nhiên những nghiên cứu về Dâm bụt còn khá ít vì vậy đề tài tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng kháng viêm của lá Dâm bụt nhằm tạo cơ sở khoa học cho việc phát triển cây thuốc. Phƣơng pháp nghiên cứu: Khảo sát tác dụng dự phòng và điều trị viêm của cao với liều uống 100 mg/kg và 200 mg/kg trên chuột nhắt đƣợc gây phù bàn chân bằng carrageenan 1%. Nghiên cứu thành phần hóa học sử dụng phƣơng pháp chiết ngấm kiệt, chiết phân bố lỏng - lỏng, phƣơng pháp sắc kí cột nhanh và phƣơng pháp tinh chế, kết tinh trong dung môi thích hợp. Cấu trúc chất phân lập đƣợc xác định bằng phổ MS và NMR. Kết quả: Cao chiết thể hiện tác động dự phòng viêm cấp trên chuột hi cho uống liều 100 mg/kg và 200 mg/kg giúp giảm độ ph àn chân chuột so với lô chứng ệnh tại các thời điểm hảo sát, liều 200 mg/ g có tác động tốt hơn. Cả hai liều 100 mg/kg và 200 mg/kg thể hiện tác dụng điều trị viêm cấp chậm và yếu hơn thuốc đối chứng diclofenac. Tiến hành sắc kí cột silicagel cao phân đoạn ethyl acetat thu đƣợc 10 chất (HR-T, HR1HR-9), cấu trúc lần lƣợt đƣợc xác định là Takakin 8-O-glucuronide (1677,3 mg), Takakin 8-O-glucuronid -6”-methyl ester (20 mg), 5,4’-dihydroxyl, 7-methoxy flavon -8-C-[O-(β6-(3-hydroxy-2-methylpropanoyl) glycopyranosyl) 1→3-β-2-acetyl-6-(3-hydroxy-2methylpropanoyl)- glycopyranosyl] (rosasinennosid E) (333,4 mg), 5,4’-dihydroxyl, 7methoxy flavon -8-C-[O-(β-6-(3-hydroxy-2-methylpropanoyl) glycopyranosyl) 1→3-β-2acetylglycopyranosyl] (rosasinennosid D) (135,6 mg), isoswertisin (10mg), 5,4’dihydroxyl, 7-methoxy flavon-8-C-[O-(β-glycopyranosyl) 1→3-β-2-acetyl-6-(3-hydroxy2-methylpropanoyl)-glycopyranosyl] (rosasinennosid C) (78,4 mg), acacetin-7-Orutinoside (214,3 mg), 5,4’-dihydroxyl, 7-methoxy flavon-8-C-[O (β-glycopyranosyl) 1→3-β-2-acetylglycopyranosyl] (rosasinennosid B) (20 mg), 6’’-O-(3-hydroxy-2methylpropanyl) isoswertisin-2’’-α-rhamnoside (rosasinennosid A) (90 mg) và isoswertisin-2’’-α-rhamnoside (25 mg). Kết luận: Cao chiết thể hiện tác dụng phòng và điều trị viêm cấp trên chuột nhắt với liều 100 mg/kg và 200 mg/kg. Nghiên cứu thành phần hóa học lá Dâm bụt thu xác định đƣợc 10 chất. Các hợp chất HR-2, HR-3, HR-5, HR-7 và HR-8 là những hợp chất mới, các chất còn lại thì chƣa thấy báo cáo hiện diện trong loài H. rosa-sinensis. ABSTRACT Thesis of Master of Pharmacy, course: 2016– 2018 INVESTIGATION OF THE CHEMICAL CONSTITUENTS AND ANTI-INFLAMMATORY EFFECTS OF HIBISCUS ROSA-SINENSIS LEAF Ha Thi Hong Phuc Supervisor: Dr. Tran Thi Van Anh Background: Hibiscus rosa-sinensis L. (Mavaceae) is used widely in Vietnam and Asian countries for the treatment of gastritis, dia etes, menstrual disoders and hair loss…. However, there is few studies on this species was performed. Therefore, the purpose of this study was to investigate the chemical constituents and anti-inflamatory effect of H. rosasinensis for having scientific evidences to rationalize the usage of this plant. Methods: Anti-inflammatory effect was determined in 1% carrageenan-induced paw edema mouse model. Phytochemical study: percolation, liquid – liquid extraction, liquid chromatography and recrystallization in suitable solvents. The structures of isolated coumpounds were identified by MS, NMR spectroscopy methods. Results: The extract exhibited protective effect against acute inflammation at the oral doses of 100 mg/kg and 200 mg/kg by decreasing hind paw edema in mice compared to pathological control at all tested times. This effect of the dose of 200 mg/kg was better than that of 100 mg/kg one. Both two doses of 100 mg/kg and 200 mg/kg showed a treatment effect against acute inflammation; which was later and weaker than that of reference drug diclofenac. The ethyl acetate extract was separated by different means of chromatography to yield ten compounds (HR-T, HR-1-9) that were determined to be Takakin 8-O-glucuronide (1677,3 mg), Takakin 8-O-glucuronid -6”-methyl ester (20 mg), 5,4’-dihydroxyl, 7-methoxy flavon -8-C-[O-(β-6-(3-hydroxy-2-methylpropanoyl) glycopyranosyl) 1→3-β-2-acetyl-6-(3hydroxy-2-methylpropanoyl)- glycopyranosyl] (rosasinennoside E) (333,4 mg), 5,4’dihydroxyl, 7-methoxy flavone -8-C-[O-(β-6-(3-hydroxy-2-methylpropanoyl) glycopyranosyl) 1→3-β-2-acetylglycopyranosyl] (rosasinennoside D) (135,6 mg), isoswertisin (10mg), 5,4’-dihydroxyl, 7-methoxy flavon-8-C-[O-(β-glycopyranosyl) 1→3β-2-acetyl-6-(3-hydroxy-2-methylpropanoyl)-glycopyranosyl] (rosasinennoside C) (78,4 mg), acacetin-7-O-rutinoside (214,3 mg), 5,4’-dihydroxyl, 7-methoxy flavone-8-C-[O (βglycopyranosyl) 1→3-β-2-acetylglycopyranosyl] (rosasinennoside B) (20 mg), 6’’-O-(3hydroxy-2-methylpropanyl) isoswertisin-2’’-α-rhamnoside (rosasinennoside A) (90 mg) and isoswertisin-2’’-α-rhamnoside (25 mg), respectively. Conclusion: This extract exhibited protective and curative effects on inflammation at the oral doses of 100 mg/kg and 200 mg/kg in mice. The chemical studies of H. rosa-sinensis led to the isolation of ten compounds. Five compounds are new and the others haven’t een reported in H. rosa –sinensis. i MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ------------------------------------------ v DANH MỤC HÌNH --------------------------------------------------------------------------- vii DANH MỤC BẢNG --------------------------------------------------------------------------- ix DANH MỤC SƠ ĐỒ --------------------------------------------------------------------------- ix DANH MỤC BIỂU ĐỒ ----------------------------------------------------------------------- xi ĐẶT VẤN ĐỀ ------------------------------------------------------------------------------------ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU------------------------------------------------------- 3 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI HIBISCUS ------------------------------------------------------- 3 1.1.1 Vị trí phân loại chi Hibiscus -------------------------------------------------------------- 3 1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Hibiscus ---------------------------------------------------------- 3 1.1.3 Thành phần hóa học các loài thuộc chi Hibiscus -------------------------------------- 7 1.1.4 Tác dụng kháng viêm của một số loài thuộc chi Hibiscus ------------------------- 10 1.2 TỔNG QUAN VỀ CÂY DÂM BỤT ---------------------------------------------------- 12 1.2.1 Đặc điểm thực vật ------------------------------------------------------------------------ 12 1.2.2 Sinh thái, phân bố và thu hái ----------------------------------------------------------- 14 1.2.3 Thành phần hóa học --------------------------------------------------------------------- 14 1.2.3.1 Thành phần hóa học từ hoa ----------------------------------------------------------- 14 1.2.3.2 Thành phần hóa học từ lá ------------------------------------------------------------- 14 1.2.4 Tác dụng dƣợc lý------------------------------------------------------------------------- 16 1.2.4.1 Tác dụng kháng viêm ----------------------------------------------------------------- 16 1.2.4.2 Tác dụng kháng khuẩn ---------------------------------------------------------------- 17 1.2.4.3 Tác dụng chống đái tháo đƣờng ----------------------------------------------------- 17 1.2.4.4 Tác dụng chống oxy hóa -------------------------------------------------------------- 18 1.2.5 Công dụng dân gian --------------------------------------------------------------------- 20 1.3 VIÊM VÀ CÁC MÔ HÌNH SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM ---------- 22 1.3.1 Viêm --------------------------------------------------------------------------------------- 22 1.3.1.1 Sơ lƣợc về quá trình viêm ------------------------------------------------------------ 22 ii 1.3.1.2 Điều trị viêm --------------------------------------------------------------------------- 23 1.3.2 Các mô hình thử nghiệm hoạt tính kháng viêm -------------------------------------- 26 1.3.2.1 Mô hình in vitro ------------------------------------------------------------------------ 26 1.3.2.2 Mô hình in vivo ------------------------------------------------------------------------ 26 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU --------------------- 29 2.1 NGUYÊN LIỆU ---------------------------------------------------------------------------- 29 2.2 DUNG MÔI, HÓA CHẤT, THÚ THỬ NGHIỆM ------------------------------------ 29 2.3 DỤNG CỤ VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU --------------------------------- 30 2.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ------------------------------------------------------- 31 2.4.1 Kiểm tra nguyên liệu -------------------------------------------------------------------- 31 2.4.1.1 Khảo sát đặc điểm hình thái ---------------------------------------------------------- 31 2.4.1.2 Khảo sát vi học ------------------------------------------------------------------------- 31 2.4.1.3 Xác định độ tinh khiết ----------------------------------------------------------------- 31 2.4.1.4 Xác định sơ ộ thành phần hóa học ------------------------------------------------- 31 2.4.2 Khảo sát tác dụng kháng viêm của cao toàn phần ----------------------------------- 32 2.4.2.1 Chiết cao dùng cho thử nghiệm dƣợc lý và nghiên cứu hóa học ---------------- 32 2.4.2.2 Khảo sát độc tính cấp của cao chiết dƣợc liệu ------------------------------------- 32 2.4.2.3 Khảo sát tác dụng phòng viêm ------------------------------------------------------- 32 2.4.2.4 Khảo sát tác dụng kháng viêm ------------------------------------------------------- 33 2.4.3 Nghiên cứu hóa học --------------------------------------------------------------------- 33 2.4.4 Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất hóa học của Dâm bụt ---------------- 34 2.4.4.1 Phƣơng pháp sắc ký ------------------------------------------------------------------- 34 2.4.4.2 Phƣơng pháp ết tinh phân đoạn ---------------------------------------------------- 35 2.4.4.3 Kiểm tra độ tinh khiết ----------------------------------------------------------------- 35 2.4.4.4 Xác định cấu trúc các chất ------------------------------------------------------------ 35 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ---------------------------------------------------- 37 3.1 KIỂM TRA NGUYÊN LIỆU------------------------------------------------------------- 37 3.1.1 Khảo sát đặc điểm hình thái ------------------------------------------------------------ 37 iii 3.1.2 Khảo sát đặc điểm vi học --------------------------------------------------------------- 37 3.1.2.1 Vi phẫu lá ------------------------------------------------------------------------------- 37 3.1.2.2 Tách biểu bì ---------------------------------------------------------------------------- 39 3.1.2.3 Soi bột dƣợc liệu Dâm bụt ------------------------------------------------------------ 40 3.1.3 Xác định độ tinh khiết ------------------------------------------------------------------- 40 3.1.4. Hàm lƣợng chất chiết đƣợc ------------------------------------------------------------ 41 3.1.5. Xác định sơ ộ thành phần hóa học--------------------------------------------------- 41 3.2 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM CỦA CAO CHIẾT LÁ DÂM BỤT - 42 3.2.1 Thử nghiệm độc tính cấp cao chiết lá Dâm bụt -------------------------------------- 42 3.2.2 Thử nghiệm hoạt tính phòng viêm và điều trị viêm của cao chiết lá Dâm bụt -- 42 3.2.2.1 Tác dùng phòng viêm cấp ------------------------------------------------------------ 42 3.2.2.2 Tác dụng điều trị viêm cấp ----------------------------------------------------------- 44 3.3 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC --------------------------------------------------------------- 45 3.3.1 Phân tách cao chiết toàn phần ---------------------------------------------------------- 45 3.3.2 Phân tách cao EtOAc (cao HR-C) ----------------------------------------------------- 47 3.3.3 Phân lập các chất từ các phân đoạn cao HR-C --------------------------------------- 51 3.3.3.1 Phân tách phân đoạn HR-C.6 -------------------------------------------------------- 51 3.3.3.2 Phân tách phân đoạn HR-C.9 -------------------------------------------------------- 55 3.3.3.3 Phân tách phân đoạn HR-C16, C17, C18. ------------------------------------------ 56 3.3.3 Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập bằng HPLC------------------------------- 61 3.3.4 Xác định cấu trúc các chất phân lập --------------------------------------------------- 65 3.3.4.1 Xác định cấu trúc chất HR-T --------------------------------------------------------- 65 3.3.4.2 Xác định cấu trúc HR-1 --------------------------------------------------------------- 66 3.3.4.3 Xác định cấu trúc HR-6 --------------------------------------------------------------- 68 3.3.4.4 Xác định cấu trúc HR-4 --------------------------------------------------------------- 70 3.3.4.5 Xác định cấu trúc HR-9 --------------------------------------------------------------- 72 3.3.4.6 Xác định cấu trúc HR-8 --------------------------------------------------------------- 75 3.3.4.7 Xác định cấu trúc HR-7 --------------------------------------------------------------- 77 iv 3.3.4.8 Xác định cấu trúc HR-5 --------------------------------------------------------------- 78 3.3.4.9 Xác định cấu trúc HR-3 --------------------------------------------------------------- 81 3.3.4.10 Xác định cấu trúc HR-2 ------------------------------------------------------------- 82 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ---------------------------------------------------- 86 4.1 BÀN LUẬN --------------------------------------------------------------------------------- 86 4.2 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ------------------------------------------------------------ 89 4.2.1 Kiểm tra nguyên liệu -------------------------------------------------------------------- 89 4.2.2 Tác dụng kháng viêm của cao toàn phần --------------------------------------------- 89 4.2.1 Nghiên cứu hóa học --------------------------------------------------------------------- 90 TÀI LIỆU THAM KHẢO --------------------------------------------------------------------- 92 PHỤ LỤC --------------------------------------------------------------------------------------- 101 v DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ tắt Chữ ngu ên 1 13 13 2 1 C-NMR H-NMR 1 nghĩ C - Nuclear Magnetic Resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân C13 H - Nuclear Magnetic Resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân proton 3 BuOH Butanol 4 CHCl3 Cloroform 5 COSY Correlation spectroscopy 6 COX Cyclooxygenase 7 DCM Dicloromethan 8 DEPT Distortionless Enhancement by polarization Transfer 9 DMSO Dimethyl sulfoxide 10 EtOAc Ethylacetat 11 FeCl3 10% FeCl3 10% / cồn 96% 12 AA Acidacetic 13 HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography 14 HSQC Heteronuclear SpectroscopyQuantum Coherence 15 IR Infrared Spectroscopy 16 LD50 Lethal dose, 50% 17 MeOH Methanol 18 MS Mass spectrometry 19 NaCl Sodium chloride Phổ hồng ngoại vi 20 NMR Nuclear Magnetic Resonance 21 NSAIDs Nonsteroidal anti-inflammatory Cộng hƣởng từ hạt nhân drugs 22 NO Nitric oxide 23 PĐ Phân đoạn 24 PG Prostaglandin 25 SEM Standard Error of the Mean Độ lệch chuẩn của trị số trung bình 26 SKC Sắc ký cột 27 SKĐ Sắc í đồ 28 SKLM Sắc ký lớp mỏng 29 TNF-α Tumor necrosis factor alpha 30 UV-vis Ultraviolet and Visible Tử ngoại khả kiến 31 FC Flash Chromatography Sắc ký cột nhanh 32 VS Vanillin- acid sulfuric 33 IC50 The half maximal inhibitory Nồng độ ức chế tối đa một concentration nửa 34 IL-6 Interleukin 6 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Một số loài tiêu biểu thuộc chi Hibiscus ------------------------------------------- 7 Hình 1.2 Cấu trúc một số hợp chất thƣờng gặp ở chi Hibiscus--------------------------- 10 Hình 1.3 Đặc điểm cây, lá, hoa Dâm bụt ---------------------------------------------------- 13 Hình 1.4 Một số hợp chất tìm thấy trong cây Dâm bụt ------------------------------------ 16 Chiết xuất và phân tách phân đoạn ----------------------------------------------------------- 33 Hình 3.1 Đặc điểm hình thái lá Dâm bụt ---------------------------------------------------- 37 Hình 3.2 Vi phẫu lá và sơ đồ vi phẫu lá ----------------------------------------------------- 39 Hình 3.3 Biểu bì mặt trên và mặt dƣới lá ---------------------------------------------------- 39 Hình 3.4 Thành phần cấu tử trong bột lá Dâm bụt ----------------------------------------- 40 Hình 3.5 Các phân đoạn từ cao cồn 96% toàn phần --------------------------------------- 47 Hình 3.6 Sắc ý đồ chất HR-T trong ba hệ dung môi ------------------------------------- 47 Hình 3.7 Sắc í đồ các phân đoạn sắc kí cột FC cao C ------------------------------------ 49 Hình 3.8 Sắc ý đồ chất HR-1 trong ba hệ dung môi -------------------------------------- 50 Hình 3.9 Sắc ý đồ chất HR-6 với ba hệ dung môi --------------------------------------- 51 Hình 3.10 Sắc ý đồ kiểm tra các phân đoạn từ PĐ HR-C.6 ----------------------------- 52 Hình 3.11: Sắc ý đồ kiểm tinh khiết chất HR-4 trong ba hệ dung môi ---------------- 52 Hình 3.12 Sắc ý đồ kiểm tra các phân đoạn từ HR-C6.1 -------------------------------- 53 Hình 3.13 Sắc ý đồ chất HR-2 trong ba hệ dung môi ------------------------------------ 53 Hình 3.14 Sắc ý đồ kiểm tra các phân đoạn từ Cao HR-C6.2 --------------------------- 54 Hình 3.15 Sắc ý đồ chất HR-3 với ba hệ dung môi --------------------------------------- 55 Hình 3.16 Sắc ý đồ kiểm tra các phân đoạn từ Cao HR-C9 ----------------------------- 56 Hình 3.17 Sắc ý đồ chất HR-5 với ba hệ dung môi --------------------------------------- 56 Hình 3.18 Sắc í đồ phân đoạn HR-C16 – C17 – C18 ------------------------------------ 57 Hình 3.19 Sắc ý đồ các phân đoạn phân tách của HR-C16-C17-C18 ------------------ 57 Hình 3.20 Sắc ý đồ kiểm tra các phân đoạn từ C16-I ------------------------------------ 58 Hình 3.21 Sắc ý đồ kiểm tra chất HR-8 với ba hệ dung môi ---------------------------- 58 Hình 3.22 Sắc ý đồ kiểm tra các phân đoạn từ C16-III ---------------------------------- 59 viii Hình 3.23 Sắc ý đồ kiểm tinh khiết chất HR-9 với ba hệ dung môi -------------------- 59 Hình 3.24 Sắc ý đồ kiểm tra tinh khiết chất HR-7 với ba hệ dung môi ---------------- 60 Hình 3.25 Sắc í đồ các chất phân lập từ cao HR-C --------------------------------------- 61 Hình 3.26 Tổng hợp các sắc í đồ kiểm tra độ tinh khiết các chất HR-T, HR1-9 ----- 64 Hình 3.27 Cấu trúc chất HR-T ---------------------------------------------------------------- 66 Hình 3.28 Cấu trúc chất HR-1 ---------------------------------------------------------------- 66 Hình 3.29 Cấu trúc HR-6 ---------------------------------------------------------------------- 70 Hình 3.30 Cấu trúc HR-4 ---------------------------------------------------------------------- 72 Hình 3.31 Cấu trúc chất HR-9 ---------------------------------------------------------------- 74 Hình 3.32 Nhánh 3-hydroxy-2-methylpropanoyl ------------------------------------------ 75 Hình 3.33 Cấu trúc chất HR-8 ---------------------------------------------------------------- 76 Hình 3.34 Cấu trúc chất HR-7 ---------------------------------------------------------------- 78 Hình 3.35 Nhánh 3-hydroxy-2-methylpropanoyl ------------------------------------------ 79 Hình 3.36 Cấu trúc chất HR-5 ---------------------------------------------------------------- 79 Hình 3.37 Cấu trúc chất HR-3 ---------------------------------------------------------------- 82 Hình 3.38 Cấu trúc chất HR-2 ---------------------------------------------------------------- 83 Hình 3.39 Cấu trúc các chất mới ------------------------------------------------------------- 85 ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tác dụng kháng viêm của một số loài thuộc chi Dâm bụt --------------------- 11 Bảng 1.2. Thành phần hóa học của các bộ phận cây Dâm bụt (theo Begum và các cộng sự) [17] ------------------------------------------------------------------------------------------- 15 Bảng 3.1 Kết quả thử tinh khiết của bột lá Dâm bụt --------------------------------------- 40 Bảng 3.2 Hàm lƣợng chất chiết đƣợc của dƣợc liệu lá Dâm bụt ------------------------- 41 Bảng 3.3 Thành phần hóa thực vật sơ ộ lá Dâm bụt theo dịch chiết ------------------- 41 Bảng 3.4 Sự thay đổi độ phù chân chuột theo thời gian giữa các lô --------------------- 43 Bảng 3.5 Sự thay đổi độ phù chân chuột theo thời gian giữa các lô --------------------- 44 Bảng 3.6 Hiệu suất các cao chiết từ cao cồn (96%) toàn phần --------------------------- 46 Bảng 3.7. Các phân đoạn thu đƣợc từ cao C ------------------------------------------------ 48 Bảng 3.8 Các phân đoạn thu đƣợc từ cao C6 ----------------------------------------------- 51 Bảng 3.9 Các phân đoạn thu đƣợc từ cao HR-C6.1 --------------------------------------- 53 Bảng 3.10 Các phân đoạn thu đƣợc từ cao HR-C6.2 -------------------------------------- 54 Bảng 3.11 Các phân đoạn thu đƣợc từ cao HR-C9 ---------------------------------------- 55 Bảng 3.12 Kết quả thử độ tinh khiết các chất phân lập ------------------------------------ 64 Bảng 3.13 Dữ liệu phổ HR-T và HR-1(125 MHz/500 MHz) đo trong DMSO-d6 so với TLTK --------------------------------------------------------------------------------------------- 67 Bảng 3.14 Dữ liệu phổ HR-6 (125 MHz/500 MHz) đo trong DMSO-d6 so với linarin đo DMSO-d6 ------------------------------------------------------------------------------------ 69 Bảng 3.15 Dữ liệu phổ HR-4 (125 MHz/500 MHz) đo trong DMSO-d6 so với TLTK70 Bảng 3.16 Dữ liệu phổ HR-9 (125 MHz/500 MHz) đo trong MeOD-d4 so với TLTK73 Bảng 3.17 Dữ liệu phổ HR-8 (125 MHz/500 MHz) đo trong MeOD-d4 --------------- 76 Bảng 3.18 Dữ liệu phổ HR-7, HR-5, HR-3 (125 MHz/500 MHz) đo trong MeOD-d4 80 Bảng 3.19 Dữ liệu phổ HR-2 (125 MHz/500 MHz) đo trong MeOD-d4 --------------- 84 x DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1 Vị trí phân loại chi Hibiscus -------------------------------------------------------- 3 Sơ đồ 3.1 Quy trình phân tách cao chiết toàn phần lá Dâm bụt -------------------------- 46 Sơ đồ 3.2 Các chất phân lập từ cao HR-C --------------------------------------------------- 60 xi DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Sự thay đổi độ phù chân chuột giữa các lô theo thời gian ----------------- 43 Biểu đồ 3.2. Sự thay đổi độ phù chân chuột theo thời gian giữa các lô ----------------- 45 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Các loài thảo mộc từ ngàn xƣa đã đóng vai trò quan trọng đối với cuộc sống con ngƣời, không chỉ là nguồn thực phẩm phổ biến mà còn là nguồn dƣợc phẩm dồi dào thể hiện qua vô số các bài thuốc dân gian và y học cổ truyền. Nhiều loại dƣợc phẩm, chế phẩm sinh học hiện đại có nguồn gốc từ các hợp chất tự nhiên đƣợc phân lập từ cây cỏ dựa trên nền tảng kinh nghiệm đƣợc lƣu truyền qua các thế hệ. Xu hƣớng sử dụng các hợp chất tự nhiên, các chiết xuất từ thảo mộc bắt nguồn từ sự an toàn, hiệu quả cũng nhƣ hoạt tính sinh học phong phú. Dâm bụt (Hibiscus rosa-sinensis L.) thuộc họ Bông (Malvaceae) đƣợc trồng phổ biến ở Việt Nam và nhiều nơi trên thế giới do có iên độ sinh thái lớn, với khả năng chịu đựng các điều kiện khí hậu khắc nghiệt. Dâm ụt có hoa lớn, màu đỏ sậm nhƣng ít có hƣơng. Nhiều giống, thứ Dâm bụt đƣợc lai tạo với màu hoa khác nhau từ trắng tới vàng và cam, hồng, đỏ tƣơi, với cánh đơn hay cánh đôi thƣờng đƣợc trồng làm cảnh. Dâm bụt là một loài dƣợc liệu đƣợc sử dụng phổ biến ở Việt Nam và nhiều quốc gia để hỗ trợ điều trị nhiều bệnh hác nhau nhƣ viêm dạ dày, đái tháo đƣờng, điều hòa kinh nguyệt, chống rụng tóc… trong các ài thuốc dân gian. Những định hƣớng trong y học cổ truyền đã thúc đẩy các nhà khoa học thực hiện nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng dƣợc lý của chiết xuất các bộ phận cây Dâm bụt với tiềm năng điều trị các bệnh liên quan đến hội chứng chuyển hóa, viêm đại tràng, đái tháo đƣờng, giảm đau, háng huẩn, kháng nấm… Một trong những công dụng dân gian phổ biến nhất của Dâm bụt là sử dụng lá và hoa giã nhuyễn đắp vào các vết sƣng tấy, mụn nhọt, lở ngứa làm mụn nhọt mau vỡ và lành sẹo. Công dụng dân gian này cùng với hoạt tính kháng viêm của một số loài thuộc chi Hibiscus đã đƣợc công bố là cơ sở để dự đoán tiềm năng điều trị viêm của Dâm bụt. Tuy nhiên, cho đến hiện nay những nghiên cứu về hóa học và tác dụng kháng viêm của Dâm bụt chƣa đƣợc thực hiện đầy đủ. Với mục đích cung cấp cơ sở khoa học giải thích cho các công dụng, chứng minh sự an toàn và hiệu quả của cây 2 thuốc Dâm bụt, đề tài "Nghiên cứu thành phần hoá học và tác dụng kháng viêm của lá Dâm bụt (Hibiscus rosa-sinensis L.)" đƣợc thực hiện với mục tiêu: - Khảo sát thành phần hoá học của lá cây Dâm bụt (H. rosa-sinensis) - Đánh giá tác dụng kháng viêm của cao chiết lá Dâm bụt trên mô hình chuột gây viêm - Phân lập và xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất chính từ lá Dâm bụt 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI HIBISCUS 1.1.1 Vị trí phân loại chi Hibiscus Dâm bụt Hibiscus rosa sinensis L. thuộc chi Dâm bụt Hibiscus, họ Bông Malvaceae. Theo hệ thống phân loại Takhtajan [61] cũng nhƣ hệ thống Cronquist [21], chi Dâm bụt có vị trí nhƣ sau: Giới thực vật (Plantae) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Bộ Bông (Malvales) Họ Bông (Malvacaea) Chi Dâm bụt (Hibiscus) Sơ đồ 1.1 Vị trí phân loại chi Hibiscus 1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Hibiscus Theo Từ điển cây thuốc Việt Nam tập 1 [3], nhiều loài khác nhau của chi Dâm bụt (Hibiscus) họ Bông (Malvaceae) đƣợc mô tả, với đặc điểm sinh thái, phân bố, tính vị và công dụng riêng biệt. - 8 loài theo phân loại của Carl Linnaeus (1707 – 1778) bao gồm H. rosa–sinensis, H. syriacus , H. cannabinus, H. sabdariffa., H. vitifolius, H. tiliaceus, H. sarattensis , H. mutabilis - Loài H. furcatus theo mô tả của William Roxburgh (1751 – 1815). - Loài H. indicus theo mô tả của (Burm.f.) Hochr (Nicolaas Laurens Burman 1734 1793). 4 - Loài H. schizopetalus (Mast.) theo phân loại của Hook.f. (William Jackson Hooker 1785 -1865), ... Đặc điểm thƣờng thấy của chi Hibiscus là cây bụi, cây nhỡ, thân thảo hoặc thân gỗ, là cây 1 – 2 năm hoặc lâu năm. Lá có mép răng cƣa, mặt lá nhẵn hoặc phân thùy. Hoa thƣờng mọc đơn độc ở nách lá, màu sắc hoa trải từ trắng, hồng, tía đến đỏ. Nhị nhiều dính thành cột. Quả nang hình cầu hoặc hình trứng. Số lƣợng và hình dạng hạt đa dạng tùy loài. Ngoài ra, một số loài nhƣ Bụp hoa thòng Malvaviscus arboreuspenduliflorus (DC) Schery đƣợc mô tả bởi Antonio José Cavanilles (1745 – 1804), Bụp tóc Abelmoschus crinitus đƣợc mô tả bởi Nathaniel Wallich (1786 – 1854) thuộc họ Bông (Malvaceae) cũng đƣợc xem xét nhƣ họ hàng gần với Dâm bụt H. rosa–sinensis. Theo nghiên cứu của Phạm Hoàng Hộ, ở Việt Nam chi Hibiscuscó khoảng 22 loài [7]: - Hibiscus rosa-sinensis L. (Bụp, Rose of China, Chinese Hi iscus, Shoe flower, Ketmie) - Hibiscus schizopetalus (Mast.) Hook. (Bụp rìa, Bụp lồng-đèn) - Hibiscus mutabilis L. (Phù dung, Cotton-rose, Confederate-rose) - Hibiscus syriacus L. (Bụp hồng cận, Rose of Sharon) - Hibiscus radiatus Cav. (Bụp tia) - Hibiscus cannabinus L. (Kênáp, Kenaf, Java Jute, Deccan Hemp) - Hibiscus sabdariffa L. (Bụp giấm, Đay Nhật, Red Sorrel, Roselle, Jamaico Sorrel, Oseille de Guinée) - Hibiscus surattensis L. (Bụp xƣớc, Xƣơng chua) - Hibiscus furcatus Roxb. (Bụp chẻ) - Hibiscus indicus (Burm.f.) Hochr. (Bụp Ấn) - Hibiscus vitifolius L. (Bụp lá-nho) - Hibiscus tiliaceus L. (Bụp tra, Tra làm chiếu, Cu an Bast) - Hibiscus macrophyllus Roxb. ex Hornem. (Bụp lá-to) - Hibiscus squamosus Hochr. (Bụp ồ-đề, Bụp vảy)