Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học (in vitro) của vỏ thân cây quách (cortex limoniae acidissimae)

. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  NGUYỄN MINH TÚ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC (IN VITRO) CỦA VỎ THÂN CÂY QUÁCH (Cortex Limoniae acidissimae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 . . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  NGUYỄN MINH TÚ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC (IN VITRO) CỦA VỎ THÂN CÂY QUÁCH (Cortex Limoniae acidissimae) Ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền Mã số: 8720206 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN THỊ VÂN ANH Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 . . LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nguyễn Minh Tú . . LỜI CÁM ƠN Với những gì đã đạt được hôm nay tôi trân trọng công ơn Ba Mẹ, người đã cho con cả cuộc đời này. Tôi xin cám ơn Phòng Sau Đại học – Khoa Dược - Trường Đại Học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy hướng dẫn của tôi – cô TS. Trần Thị Vân Anh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt khoảng thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua. Đồng hành, chia sẻ, hỗ trợ cùng tôi là quý Thầy Cô các bộ môn, các anh chị khóa 2017-2019, anh Roatha, Ths. Nguyễn Thế Anh, các em Trâm, Hiền, Hà, Phát... Tôi xin chân thành cảm ơn những tình cảm này. Ở nơi xa tại xã Long Hữu, thị xã Duyên Hải, tỉnh Trà Vinh tôi xin cảm ơn anh Quốc, anh Bồng và chị Hoa đã nhiệt tình giúp đỡ tôi thu hái nguyên liệu bất cứ lúc nào để phục vụ cho công tác nghiên cứu. Và hơn tất cả, tôi xin cảm ơn người phụ nữ đã luôn lo lắng, hy sinh thầm lặng cho sự thành công ngày hôm nay của tôi. Anh cảm ơn Em. Tôi sẽ mãi trân trọng tất cả những tình cảm quý báu này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng 9 năm 2019 Nguyễn Minh Tú . . TÓM TẮT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ dược học – Khóa 2017-2019 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC (IN VITRO) CỦA VỎ THÂN CÂY QUÁCH (Cortex Limoniae acidissimae) Nguyễn Minh Tú Thầy hướng dẫn: TS. Trần Thị Vân Anh Đặt vấn đề Cây Quách (Limonia acidissima Groff, Rutaceae) phân bố chủ yếu ở các nước châu Á, được sử dụng trong y học dân gian để điều trị nhiều bệnh. Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần và tác dụng sinh học của cây Quách nhưng chỉ tập trung ở bộ phận quả, lá và rễ. Đề tài thực hiện nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát một số tác dụng sinh học của vỏ thân cây Quách tại Việt Nam để có cơ sở khoa học trong việc sử dụng cây Quách chữa bệnh đồng thời là tiền để cho những nghiên cứu tiếp theo trong việc khai thác cây Quách làm thuốc. Phương pháp nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là vỏ thân cây Quách thu hái ở tỉnh Trà Vinh (4/2018). Sử dụng phương pháp chiết xuất ngấm kiệt, các phương pháp sắc kí để phân lập các chất. Cấu trúc chất phân lập được xác định bằng phổ MS và NMR. Khảo sát các hoạt tính chống oxy hóa (mô hình DPPH), hoạt tính ức chế tyrosinase, tác dụng độc tính tế bào trên dòng tế bào ung thư cơ vân (RD) bằng phương pháp MTT. Kết quả Thành phần hóa học của vỏ thân cây Quách có sự hiện diện của các nhóm hợp chất coumarin, alkaloid, saponin, flavonoid, acid hữu cơ. 7,7 kg bột vỏ thân cây Quách được chiết ngấm kiệt với cồn 96% thu được 280 g cao chiết đậm đặc. Tiến hành lắc phân bố lỏng-lỏng với lần lượt các dung môi có độ phân cực tăng dần thu được 16,88 g cao petrol ether (LA-A), 65,45 g cao dicloromethan (LA-B), 29,91 g cao ethyl acetat (LA-C), 48,57 g cao n-butanol bão hòa nước (LA-D) và 60,62 g cao nước (LA-E). Tiến hành sắc kí cột nhanh cao phân đoạn LA-B thu được 9 hợp chất lần lượt được xác định là aurapten (29 mg), acid atraric (5 mg), β-sitosterol (369 mg), xanthyletin (14 mg), 5,3'dihydroxy-4'-methoxy-6",6''-dimethylchromeno-(7,8,5'',6'')-flavanon (7,2 mg), xanthotoxin (7 mg), isopimpinellin (5 mg), 7’(E)-4-hydroxy-3,5’-dimethoxy-4’,7-epoxy-8,3’-neolig-7’-en9,9’-diyil diacetat (18 mg) và 4-methoxy-1-methyl-2-quinolon ( 725,6 mg). Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa trên mô hình DPPH, 3 cao LA-D, LA-B, LA-C, đều có hoạt tính với IC50 < 70 µg/mL. Tuy nhiên, các chất phân lập được từ LA-B đều có hoạt tính chống oxy hóa yếu (% HTCO <20 % ở nồng độ 100 µM). Khảo sát hoạt tính ức chế tyrosinase, phân đoạn LA-C có hoạt tính thấp (nồng độ 66,67 µg/ml ức chế 24,55 %), các cao phân đoạn còn lại không thể hiện hoạt tính. Các chất phân lập được từ phân đoạn DCM ở nồng độ 100 µM đều biểu hiện hoạt tính ức chế tyrosinase dưới 15%. Riêng xanthotoxin có biểu hiện kích thích tyrosinase. 2 cao phân đoạn LA-A và LA-B có tác dụng độc tế bào RD với giá trị IC50 tương ứng là 42,49 và 79,06 µg/ml. Kết luận Thành phần hóa học trong vỏ thân cây Quách khá đa dạng, có chứa các nhóm hợp chất hữu cơ: coumarin, alkaloid, flavonoid, acid hữu cơ,... Đề tài đã phân lập 9 hợp chất từ cao phân đoạn LA-B và được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ học. Các hợp chất phân lập không thể hiện hoặc có hoạt tính chống oxy hóa yếu, kết quả tương tự khi khảo sát hoạt tính ức chế tyrosinase. . . ABSTRACT Graduation thesis of Pharmacy Master’s degree – Academic year 2017 – 2019 CHEMICAL CONSTITUENTS AND PHARMACOLOGICAL ACTIVITIES OF THE STEM BARK FROM LIMONIA ACIDISSIMA (Cortex limoniae acidissimae) Nguyen Minh Tu Instructor: Dr. Tran Thi Van Anh Introduction Limonia acidissima, distributed mainly in Asian countries, is used in folk medicine for the treatment of many diseases. There are many studies of chemical constituents and pharmacological activities of Limonia acidissima conducted, but the main objects of these studies are the fruit, leave and root. The aim of this study was to investigate the chemical constituents and biological activities of the stem bark from Limonia acidissima to give scientific data for the use of this plant and to prepare for further studies on the bioactivity of this plant. Material and method Material: The stem bark of L. acidissima was collected in Tra Vinh province (4/2018) Methods: Percolation, liquid-liquid extraction and different means of chromatography were used for the extraction and isolation. The structures of isolated compounds were determined by MS and NMR spectrometry methods. Evaluation of biological activities were accessed by three models: antioxidant activity using DPPH test, inhibition of tyrosinase enzyme, antiproliferation effect on human rhabdomyosarcoma cell line (RD) were evaluated by MTT method. Results Chemical composition analysis showed the presence of coumarin, alkaloid, saponin, flavonoid, and oganic acid. 7.7 kg dried stem bark powder was percolated with ethanol 96% to give 280 g concentrated extract, then liquid – liquid extracted to obtain 16.88 g petrol ether (LA-A), 65.45 g dichloromethane extract (LA-B), 29.91 g ethyl acetat extract (LA-C), 48.57 g n-butanol (LAD), and 60.62 g water extract (LA-E). LA-B was separated to obtain 9 compounds which were elucidated as aurapten (29 mg), acid atraric (5 mg), β-sitosterol (369 mg), xanthyletin (14 mg), 5,3'-dihydroxy-4'-methoxy-6",6''-dimethylchromeno-(7,8,5'',6'')-flavanon (7.2 mg), xanthotoxin (7 mg), isopimpinellin (5 mg), 7’(E)-4-hydroxy-3,5’-dimethoxy-4’,7-epoxy-8,3’neolig-7’-en-9,9’-diyil diacetat (18 mg) and 4-methoxy-1-methyl-2-quinolon ( 725.6 mg). Investigation of antioxidant activity on DPPH test showed LA-D, LA-B and LA-C extracts have good activity with ED50 < 70 µg/ml. However, the isolates from LA-B extract expressed weak activity (% inhibition < 20% at 100 µM concentration). LA-C fraction showed low activity in tyrosinase inhibition test (concentration of 66.67 µg/ml inhibited 24.55%), the residual extracts did not show activity. All isolated compounds at the concentration of 100 µM exhibited tyrosinase inhibitory activity below 15%, particularly xanthotoxin expressed the stimulated effect with tyrosinase. LA-A and LA-B extratcs had cytotoxic effect on RD cell line with IC50 values of 42.49 and 79.06 µg/ml, respectively. Conclusion The chemical constituents of stem bark from Limonia acidissima are diverse with groups of compounds: coumarin, alkaloid, flavonoid, organic acid, ... In this study, 9 compounds were isolated from LA-B extract and their structure were determined by spectrometry methods. The isolated compounds did not show or had weak antioxidant and tyrosinase inhibitory activities. . . MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................... LỜI CÁM ƠN ............................................................................................................... MỤC LỤC ....................................................................................................................i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ......................................................iv DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................vi DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... viii DANH MỤC SƠ ĐỒ .................................................................................................ix DANH MỤC BIỂU ĐỒ .............................................................................................ix MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3 1.1. TỔNG QUAN THỰC VẬT HỌC.................................................................... 3 1.1.1. Vị trí trong sinh giới .................................................................................. 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật họ Rutaceae ................................................................. 3 1.1.3. Đặc điểm thực vật cây Quách .................................................................... 4 1.2. TỔNG QUAN HÓA HỌC ............................................................................... 6 1.3. TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ ................................................. 11 1.3.1. Tác dụng dược lý ..................................................................................... 11 1.3.2. Công dụng dân gian ................................................................................. 16 1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC IN VITRO ............. 17 1.4.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa...................................... 17 1.4.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế tyrosinase ................................. 18 1.4.3. Phương pháp thử độc tính tế bào ............................................................. 21 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 23 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................ 23 2.1.1. Nguyên liệu .............................................................................................. 23 2.1.2. Dung môi, hóa chất dùng trong nghiên cứu hóa học ............................... 24 2.1.3. Hóa chất dùng trong nghiên cứu hoạt tính sinh học ................................ 24 2.1.4. Dụng cụ và trang thiết bị nghiên cứu....................................................... 24 2.1.5. Nơi thực hiện đề tài ................................................................................. 25 . . 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 26 2.2.1. Kiểm tra nguyên liệu ............................................................................... 26 2.2.2. Xác định sơ bộ thành phần hóa học ......................................................... 26 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học............................................ 27 2.2.4. Nghiên cứu thành phần hóa học của vỏ thân cây Quách ......................... 33 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN............................................................... 36 3.1. KIỂM TRA NGUYÊN LIỆU ......................................................................... 36 3.1.1. Khảo sát thực vật ..................................................................................... 36 3.1.2. Đánh giá độ tinh khiết.............................................................................. 39 3.1.3. Xác định sơ bộ thành phần hóa thực vật trong vỏ thân cây Quách ......... 40 3.2. PHÂN TÁCH VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CAO PHÂN ĐOẠN ........................................................................................................ 41 3.2.1. Chiết xuất ................................................................................................. 41 3.2.2. Phân tách cao chiết toàn phần.................................................................. 41 3.2.3. Khảo sát các tác dụng sinh học in vitro của các cao phân đoạn .............. 44 3.3. PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ CAO LA-B ..................................................... 48 3.3.1. Phân tách cao LA-B bằng sắc ký cột nhanh ............................................ 48 3.3.2. Phân lập các chất tinh khiết từ phân đoạn của cao LA-B ........................ 51 3.4. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC CHẤT PHÂN LẬP TỪ CAO LA-B ........... 69 3.4.1. Xác định cấu trúc chất Laci-1 .................................................................. 69 3.4.2. Xác định cấu trúc chất Laci-2 .................................................................. 71 3.4.3. Xác định cấu trúc chất Laci-3 .................................................................. 73 3.4.4. Xác định cấu trúc chất Laci-4 .................................................................. 73 3.4.5. Xác định cấu trúc chất Laci-5 .................................................................. 75 3.4.6. Xác định cấu trúc chất Laci-6 .................................................................. 78 3.4.7. Xác định cấu trúc chất Laci-7 .................................................................. 80 3.4.8. Xác định cấu trúc chất Laci-8 .................................................................. 82 3.4.9. Xác định cấu trúc chất Laci-9 .................................................................. 85 3.5. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT TINH KHIẾT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CAO LA-B ..................................................................... 88 3.5.1. Hoạt tính chống oxy hóa .......................................................................... 88 . .i 3.5.2. Hoạt tính kháng tyrosinase ...................................................................... 88 3.6. BÀN LUẬN.................................................................................................... 91 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................ 93 4.1. KẾT LUẬN .................................................................................................... 93 4.2. KIẾN NGHỊ.................................................................................................... 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... 95 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 99 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các chất tinh khiết ......................................... PL-1 Thử hoạt tính sinh học ................................................................................... PL-116 Hoạt tính chống oxy hóa ............................................................................ PL-116 Hoạt tính kháng tyrosinase ........................................................................ PL-120 Tác dụng độc tế bào ................................................................................... PL-124 . . DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ tắt 13 C - Nuclear Magnetic Resonance 1 13 2 1 3 CHCl3 Cloroform 4 COSY Correlation spectroscopy 5 DCM Dicloromethan 6 DĐVN Dược điểnViệt Nam 7 DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer 8 DMSO Dimethyl sulfoxid 9 EtOAc Ethylacetat 10 EtOH Ethanol 11 HPLC High performance liquid chromatography 12 HSQC Heteronuclear SpectroscopyQuantum Coherence 13 HTCO Hoạt tính chống oxy hóa 14 Hx n-hexan 15 MeOH Methanol 16 MS Mass spectrometry 17 n-BuOH n-butanol 18 NMR Nuclear Magnetic Resonance 19 PĐ Phân đoạn C-NMR 1 H-NMR . Ý nghĩa Chữ nguyên H - Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân C13 Cộng hưởng từ hạt nhân proton Sắc ký lỏng hiệu năng cao Khối phổ Cộng hưởng từ hạt nhân . STT Chữ tắt Chữ nguyên Ý nghĩa Độ sai chuẩn của trị số trung bình 20 SEM Standard Error of the Mean 21 SKC Sắc ký cột 22 SKĐ Sắc kí đồ 23 SKLM Sắc ký lớp mỏng 24 TT Thuốc thử 25 UV-vis Ultraviolet and Visible 26 VLC Vacuum Liquid Chromatography Tử ngoại khả kiến 27 VS Vanillin - acid sulfuric Sắc ký cột chân không . i. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cơ chế ức chế tyrosinase trong con đường sinh tổng hợp melanin .........21 Hình 2.2. Các hình ảnh về cây Quách ......................................................................23 Hình 2.3. Vỏ thân cây Quách thu hái tại Trà Vinh ...................................................24 Hình 3.4. Một số hình ảnh của cây Quách tại Trà Vinh ...........................................36 Hình 3.5. Hình chi tiết vi phẫu thân non cây Quách ................................................37 Hình 3.6. Hình chi tiết vi phẫu lá cây Quách ...........................................................38 Hình 3.7. Các cấu tử của bột vỏ thân cây Quách .....................................................39 Hình 3.8. SKLM phân tích các cao phân đoạn .........................................................42 Hình 3.9. Kết quả ức chế gốc tự do các cao chiết vỏ thân cây Quách trên bản mỏng Silicagel .....................................................................................................................44 Hình 3.10. Sắc kí đồ các phân đoạn sắc kí cột của cao LA-B..................................50 Hình 3.11. Sắc kí đồ các phân đoạn của LA-B.6 .....................................................51 Hình 3.12. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của Laci-1 ..........................................52 Hình 3.13. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của Laci-2 ..........................................53 Hình 3.14. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của Laci-3 ..........................................54 Hình 3.15. Sắc kí đồ các phân đoạn của LA-B.8 .....................................................55 Hình 3.16. Sắc kí đồ các phân đoạn của LA-B.8.4 ..................................................56 Hình 3.17. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của Laci-4 ..........................................56 Hình 3.18. Sắc kí đồ các phân đoạn của LA-B.11 ...................................................57 Hình 3.19. Sắc kí đồ các phân đoạn của LA-B.11.6 ................................................58 Hình 3.20. Sắc kí đồ các phân đoạn của LA-B.11.6.1 .............................................59 Hình 3.21. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của Laci-5 ..........................................60 Hình 3.22. Sắc kí đồ các phân đoạn của LA-B.12 ...................................................60 Hình 3.23. Sắc kí đồ các phân đoạn của LA-B.12.4 ................................................61 Hình 3.24. Sắc kí đồ các phân đoạn của LA-B.12.4.1 .............................................62 Hình 3.25. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của Laci-6 ..........................................63 Hình 3.26. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của Laci-7 ..........................................63 Hình 3.27. Sắc kí đồ các phân đoạn của LA-B.16 ...................................................64 Hình 3.28. Sắc kí đồ các phân đoạn của LA-B.16.3 ................................................65 Hình 3.29. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của Laci-8 ..........................................66 Hình 3.30. Sắc kí đồ các phân đoạn của LA-B.19 ...................................................67 Hình 3.31. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của Laci-9 ..........................................67 Hình 3.32. SKĐ các hợp chất phân lập được từ cao LA-B ......................................68 Hình 3.33. Phổ khối ESI-MS (positive) của Laci-1 .................................................69 Hình 3.34. Cấu trúc Laci-1 và các tương tác HMBC quan trọng ............................71 Hình 3.35. Cấu trúc Laci-2 và các tương tác HMBC quan trọng ............................73 . .i Hình 3.36. Phổ khối ESI-MS positive của Laci-4 ...................................................73 Hình 3.37. Cấu trúc Laci-4 và các tương tác HMBC quan trọng ............................75 Hình 3.38. Phổ khối ESI-MS của Laci-5 .................................................................75 Hình 3.39. Cấu trúc Laci-5 và các tương tác HMBC quan trọng ............................78 Hình 3.40. Phổ khối ESI-MS của Laci-6 .................................................................79 Hình 3.41. Cấu trúc Laci-6 và các tương tác HMBC quan trọng ............................80 Hình 3.42. Phổ khối ESI-MS của Laci-7 .................................................................81 Hình 3.43. Cấu trúc Laci-7 và các tương tác HMBC quan trọng ............................82 Hình 3.44. Phổ khối ESI-MS của Laci-8 .................................................................82 Hình 3.45. Cấu trúc Laci-8 và các tương tác HMBC quan trọng ............................85 Hình 3.46. Phổ khối ESI-MS của Laci-9 .................................................................86 Hình 3.47. Cấu trúc Laci-9 và các tương tác HMBC quan trọng ............................87 . . ii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Công thức một số hợp chất phân lập từ cây Quách ...................................7 Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng của quả Quách...................................................11 Bảng 1.3. Một số chất có hoạt tính ức chế enzym tyrosinase...................................20 Bảng 2.4. Hỗn hợp thí nghiệm DPPH trên đĩa 96 giếng ..........................................28 Bảng 2.5.Trình tự pha mẫu thí nghiệm ức chế tyrosinase của acid kojic .................31 Bảng 2.6. Trình tự pha mẫu thí nghiệm ức chế tyrosinase của chất thử ..................31 Bảng 3.7. Độ ẩm bột vỏ thân cây Quách ..................................................................39 Bảng 3.8. Độ tro của bột vỏ thân cây Quách ............................................................40 Bảng 3.9. Hàm lượng chất chiết được ......................................................................40 Bảng 3.10. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học dịch chiết từ vỏ thân Quách ...................................................................................................................................40 Bảng 3.11. Khối lượng các phân đoạn cao thu được từ cao cồn (96%) toàn phần ..42 Bảng 3.12. Kết quả % HTCO của cao toàn phần và các cao phân đoạn ..................45 Bảng 3.13. EC50 của cao toàn phần và các cao phân đoạn .......................................45 Bảng 3.14. Kết quả % ức chế tyrosinase của cao toàn phần và các cao phân đoạn .46 Bảng 3.15. Kết quả thử độc tính tế bào trên đĩa 96 giếng của cao toàn phần và các cao phân đoạn ............................................................................................................47 Bảng 3.16. Khảo sát các tác dụng sinh học in vitro của các cao phân đoạn ............48 Bảng 3.17. Các phân đoạn thu được từ cao LA-B....................................................48 Bảng 3.18. Khối lượng các phân đoạn phân tách được từ phân đoạn LA-B.6 .........51 Bảng 3.19. Khối lượng các phân đoạn phân tách được từ phân đoạn LA-B.6.3 ......53 Bảng 3.20. Khối lượng các phân đoạn phân tách được từ phân đoạn LA-B.8 .........54 Bảng 3.21. Khối lượng các phân đoạn phân tách được từ phân đoạn LA-B.8.4 ......55 Bảng 3.22. Khối lượng các phân đoạn phân tách được từ phân đoạn LA-B.11 .......57 Bảng 3.23. Khối lượng các phân đoạn phân tách được từ phân đoạn LA-B.11.6 ....58 Bảng 3.24. Khối lượng các phân đoạn phân tách được từ phân đoạn LA-B.11.6.1.59 Bảng 3.25. Khối lượng các phân đoạn phân tách được từ phân đoạn LA-B.12 .......60 Bảng 3.26. Khối lượng các phân đoạn phân tách được từ phân đoạn LA-B.12.4 ....61 Bảng 3.27.Khối lượng các phân đoạn phân tách được từ phân đoạn LA-B.12.4.1..62 Bảng 3.28. Khối lượng các phân đoạn phân tách được từ phân đoạn LA-B.16 .......64 Bảng 3.29. Khối lượng các phân đoạn phân tách được từ phân đoạn LA-B.16.3 ....65 Bảng 3.30. Khối lượng các phân đoạn phân tách được từ phân đoạn LA-B.19 .......66 Bảng 3.31. Các giá trị phổ NMR của Laci-1............................................................70 Bảng 3.32. Các giá trị phổ NMR của Laci-2............................................................72 Bảng 3.33. Các giá trị phổ NMR của Laci-4............................................................74 Bảng 3.34. Các giá trị phổ NMR của Laci-5............................................................77 . . Bảng 3.35. Các giá trị phổ NMR của Laci-6............................................................80 Bảng 3.36. Các giá trị phổ NMR của Laci-7............................................................81 Bảng 3.37. Các giá trị phổ NMR của Laci-8............................................................84 Bảng 3.38. Các giá trị phổ NMR của Laci-9............................................................87 Bảng 3.39. Kết quả % HTCO của các chất tinh khiết ..............................................89 Bảng 3.40. Kết quả % ức chế tyrosinase của các chất tinh khiết .............................90 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1. Vị trí phân loại chi Limonia ......................................................................3 Sơ đồ 2.2. Bố trí thí nghiệm DPPH trên đĩa 96 giếng ..............................................28 Sơ đồ 2.3. Bố trí thí nghiệm ức chế tyrosinase trên đĩa 96 giếng .............................30 Sơ đồ 3.4. Quy trình chiết xuất và phân tách các cao từ cao cồn 96% của vỏ thân cây Quách ........................................................................................................................43 Sơ đồ 3.5. Tóm tắt qui trình phân lập các chất từ cao DCM (LA-B) .......................68 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Hoạt tính ức chế gốc tự do của các cao chiết vỏ thân cây Quách ........45 Biểu đồ 3.2. So sánh giá trị EC50 của các cao so với vitamin C ...............................46 . . Luận văn Thạc sĩ Mở đầu MỞ ĐẦU Sức khỏe luôn là mối quan tâm hàng đầu trong cuộc sống. Con người không ngừng đi tìm các loại thuốc mới và thực phẩm bổ sung để điều trị bệnh, phòng bệnh và nâng cao thể trạng. Những sản phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ con đường hóa tổng hợp có ưu điểm nổi bật như tác động nhanh, hiệu quả lâm sàng rõ rệt, phù hợp đối với những bệnh cấp tính. Tuy nhiên, những sản phẩm này cũng ngày càng bộc lộ những khuyết điểm như thời gian sàng lọc để tìm ra công thức mới rất lâu, chi phí nghiên cứu cao, tác dụng phụ tích lũy theo thời gian dài khó quan sát, tốc độ đề kháng nhanh. Chính vì lý do đó, con người đã dần dần quay lại sử dụng những sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên với kinh nghiệm sử dụng và tác dụng đã được kiểm chứng xuyên suốt chiều dài lịch sử từ xưa đến nay. Cây Quách (Limonia acidissima Groff, Rutaceae) phân bố chủ yếu ở các nước Châu Á nhiệt đới như Ấn Độ, Srilanca, Myanmar, Thái Lan, Campuchia, Lào và Việt Nam. Trong dân gian, cây Quách được sử dụng điều trị và hỗ trợ rất nhiều bệnh như táo bón, kiết lỵ, ho mạn tính, đau cổ họng, nấc cụt, hen suyễn, viêm nướu răng, tác dụng lên khối u, viêm mắt và bệnh huyết trắng, kích thích tiêu hóa,... Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần và tác dụng sinh học của cây Quách. Các nghiên cứu này chủ yếu ở quả, lá và rễ của cây Quách với nguồn nguyên liệu không phải của Việt Nam. Ở Việt Nam, cây Quách mọc chủ yếu ở những vùng đất khô pha cát như các tỉnh: Trà Vinh, Sóc Trăng, Cà Mau, Bạc Liêu, Bến Tre, Vĩnh Long,... Thời gian qua, một số nghiên cứu trong nước được tiến hành trên quả Quách với mục đích chế biến quả Quách cho ngành thực phẩm. Hiện nay,chưa có nghiên cứu nào về tác dụng sinh học của cây Quách được tiến hành, đặc biệt là vỏ thân cây Quách. Do những tiềm năng về công dụng cây Quách sử dụng trong dân gian và các công trình nghiên cứu của các tác giả trên thế giới đã công bố, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học (in vitro) của vỏ thân cây Quách (Cortex Limoniae acidissimae)” để có cơ sở khoa học trong việc sử dụng cây Quách chữa bệnh đồng thời là tiền để cho những nghiên cứu tiếp theo trong việc khai thác cây Quách làm thuốc. Đề tài được thực hiện với các mục tiêu như sau: Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học (in vitro) của vỏ thân cây Quách (Cortex Limoniae acidissimae). . . Luận văn Thạc sĩ Mở đầu Mục tiêu cụ thể - Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của vỏ thân cây Quách. - Chiết xuất cao toàn phần, phân tách các phân đoạn. - Sàng lọc hoạt tính sinh học (in vitro) của cao toàn phần và cao phân đoạn (tác dụng chống oxy hóa, ức chế tyrosinase, độc tế bào). - Phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất chính từ phân đoạn cao thể hiện các tác dụng sinh học (in vitro). - Thử nghiệm các tác dụng sinh học của các hợp chất phân lập được. . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 3 Luận văn Thạc sĩ Dược học Tổng quan tài liệu 1.1. TỔNG QUAN THỰC VẬT HỌC Theo Takhtajan, vị trí của chi Limonia trong giới thực vật như sau [44]: Giới Thực vật (Plantae) Ngành Hạt kín (Angiospermatophyta) hay ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Hai lá mầm (Dicotyledoneae) hay lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidae) Bộ Bồ hòn (Sapindales) Họ Cam (Rutaceae) Chi Limonia L. Loài Limonia acidissima Groff Sơ đồ 1.1. Vị trí phân loại chi Limonia - Thân: thường là cây gỗ, to hay nhỏ, nhiều loại có gai; ít khi là cỏ sống dai (Cửu lý hương). - Lá: mọc cách, đôi khi mọc đối, không có lá kèm, thường kép lông chim. - Hoa: mọc riêng lẻ hoặc tụ thành xim, chùm, ngù, tán. Hoa thường đều, lưỡng tính, hoa mẫu 5, ít khi đơn tính (Zanthoxylum). Đĩa mật to nằm giữa bộ nhị và bầu. Bao hoa: 5 lá đài có thể rời hay dính nhau, 5 cánh hoa rời, ít khi là 4 cánh. . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 4 Luận văn Thạc sĩ Dược học Tổng quan tài liệu - Bộ nhị: có 2 kiểu. Kiểu đảo lưỡng nhị của Ruta: kiểu này hay bị thu hẹp vì vòng ngoài bị trụy, đôi khi còn lại nhị lép; vòng trong có thể mất đi 1-2 nhị. Sự thu hẹp tối đa dẫn đến hoa đơn tính. Kiểu nhiều nhị của Citrus: bắt đầu từ kiểu đảo lưỡng nhị nhưng số nhị tăng lên rất nhiều, các nhị có thể rời hay dính thành nhiều bó hoặc dính thành ống. Màng hạt phấn có 3-6 rãnh lỗ. - Bộ nhụy: có 2 kiểu. Kiểu Rutoideae: 4-5 lá noãn, rời ở bầu, dính nhau ở đáy và vòi nhụy, mỗi lá noãn chứa 2 hay nhiều noãn. Kiểu Aurantioideae: số lá noãn nhiều hơn số lá đài và dính liền nhau tạo thành bầu trên, nhiều ô, mỗi ô có 2 hay nhiều noãn, đính noãn trung trụ. - Quả: loại cam, đây là một quả loại mọng đặc biệt, vỏ quả ngoài có nhiều túi tiết tinh dầu, vỏ quả giữa trắng và xốp, vỏ quả trong mỏng và dai; từ vỏ quả trong mọc ra nhều lông chứa đầy nước ngọt. Hạt đôi khi có nội nhũ, hạt đa phôi ở Citrus (các phôi thặng dư được tạo thành từ các tế bào của phôi tâm, không có sự thụ tinh). - Cơ cấu học: túi tiết tinh dầu kiểu tiêu ly bào trong tất cả các mô, nhất là phiến lá, vách bầu, vỏ quả. Phân họ Aurantioideae (Citroideae): lá noãn dính, bộ nhị đa thể, quả loại cam.[3] - Các chi trong phân họ Aurantioideae: Poncirus, Citrus, Burkillanthus, Clymenia, Oxanthera, Microcitrus, Fortunella, Citropsis, Eremocitrus, Limonia (gồm cả Feronia), Triphasia (gồm cả Echinocitrus), Monanthocitrus, Wenzelia, Naringi, Balsamocitrus; Clauseneae: Murraya, Luvunga, Paramignya, Micromelum, Glycosmis, Merrillia, Pleiospermium, Clausena, Atalantia, Severinia, Pamburus, Merope, Swinglea, Balsamocitrus, Aegle, Afraegle, Aeglopsis, Feroniella [44]. - Hiện nay họ Rutaceae trên thế giới có khoảng 161 chi và 2070 loài. Riêng ở Việt Nam có gần 30 chi và khoảng 110 loài: Acronychia, Aegle, Atalantia, Boenninghausenia, Citrus, Clausena, Euodia, Feroniella, Fortunella (Citrofortunella), Glycosmis (Hesperthusa), Limnocitrus, Limonia, Luvunga (“Lavanga”), Maclurodendron, Micromelum, Murraya, Naringi, Paramignya, Phellodendron, Pleiospermium, Ruta, Severinia, Skimmia, Tetradium, Thoreldora, Toddalia, Triphasia, Zanthoxylum [3]. - Chi Limonia chỉ có 1 loài duy nhất là Limonia acidissima [3]. - Tên khoa học: Limonia acidissima Groff, Rutaceae. - Tên đồng nghĩa: Feroniaele phantum Correa, Feronia limonia (L.) Swingle, Schinus limonia L. - Tên nước ngoài: Wood Apple, Elephant Apple, Monkey Fruit or Curd Fruit (Anh); Kaitha, Kath Bel hoặc Kabeet (Hindi); Kaitha (Oriya); Kapittha or Dadhistha . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 5 Luận văn Thạc sĩ Dược học Tổng quan tài liệu (Sanskrit); Vellaga Pandu (Telugu); Vilam Palam (Tamil); Vilam Kai (Malayalam); Koth Bel (Bengali); Kothu (Gujarati); Gujarati (Malaysia) [47]. - Tên Việt Nam: cây Quách (Kvet – Khmer), cây cần thăng, cây gáo [2], [7]. Mô tả thực vật - Đại mộc nhỏ, cao 6-10m, có gai nhọn 2-5 cm, lá rụng theo mùa. - Cành non có ít lông. Lá có sóng có cánh, mang 7 lá phụ thon hẹp, không lông. - Hoa thường là lưỡng tính. Chùm dày, trắng hay đỏ ở nách lá và ngọn; 5 lá đài nhỏ; 5 cánh hoa, có rìa lông; 20 tiểu nhụy; noãn sào không lông, đính phôi trắc mô. - Quả phì to, xanh xám, ngoại quả bì cứng. Vỏ quả dày hóa gỗ, nhẵn, giòn, cứng, loang lổ. Bên trong là 1 buồng chứa thịt quả, hạt và các sợi gân. Thịt quả của quả còn non có màu trắng, vị rất chát. Quả vừa chín rụng thịt quả có màu vàng nhạt, mùi thơm dịu, có vị chua chua và ngọt nhẹ nhưng vẫn còn hơi chát. Đặc biệt khi quả chín rục, vỏ quả có màu bạc trắng, mềm và thịt quả chuyển sang màu nâu đen (như màu me chín), mùi thơm nồng, có vị ngọt dịu gần như không còn vị chát. - Hạt nhiều, láng, dài 6 mm. - Gỗ vàng cứng, cho một gôm như gôm arabic. - Bộ phận sử dụng: quả, thịt quả, hạt, lá, rễ, gai được sử dụng trong y học dân gian. Vỏ của quả Quách rất cứng, rất khó đập vỡ, thường phải dùng búa, phần thịt quả dính, ăn được và thường được sử dụng để làm syrup, thạch, mứt, kẹo... [7], [10], [47]. Phân bố và thu hái Cây Quách có nguồn gốc và phổ biến ở vùng đồng bằng khô, thích hợp với khí hậu gió mùa với mùa khô rõ rệt, chịu hạn và thích nghi tốt nhất với đất nhẹ (đất cát thường chứa hàm lượng mùn đất thấp, nghèo dưỡng chất cho cây hấp thu, thường cho năng suất thấp). Cây Quách mọc rải rác trong rừng, nhưng thường được trồng để lấy quả hoặc nuôi cánh kiến ở Campuchia và Ấn Độ, Myanmar, Trung Quốc, Lào, Việt Nam. Ở Việt Nam cây mọc chủ yếu ở những vùng đất khô pha cát ở các tỉnh: Trà Vinh, Sóc Trăng, Cà Mau, Bạc Liêu, Bến Tre, Vĩnh Long,... [2]. Cây Quách hiện nay có nhiều ở Trà Vinh, được trồng chủ yếu là để lấy bóng mát và lấy quả. So với các loại cây khác, cây Quách dễ trồng, cây phát triển nhanh mà có thể không cần bất cứ một loại phân bón nào. Cây thường được trồng bằng hạt để có bộ rễ chắc, ít đổ ngã. Cây Quách trồng khoảng 6-7 năm tuổi thì cho quả, mỗi năm cho một vụ quả, bắt đầu ra hoa vào khoảng tháng 3 và quả chín rộ vào khoảng tháng 11-12 hàng năm [10]. .