Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây cam sũng (sauropus spatulifolius beille, euphorbiaceae)

. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA DƢỢC NGUYỄN ANH ĐÀO NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY CAM SŨNG (SAUROPUS SPATULIFOLIUS BEILLE, EUPHORBIACEAE) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2020 . . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA DƢỢC NGUYỄN ANH ĐÀO NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY CAM SŨNG (SAUROPUS SPATULIFOLIUS BEILLE, EUPHORBIACEAE) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC Ngành: Dƣợc học cổ truyền Mã số: 8720206 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN THỊ VÂN ANH Thành phố Hồ Chí Minh – 2020 . . LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nguyễn Anh Đào . . Lời cảm ơn Em xin chân thành cảm ơn cô TS. Trần Thị Vân Anh vì đã dành thời gian cho em, hƣớng dẫn em trong suốt quá trình học tập và làm đề tài. Xin cảm ơn các thầy cô đã tận tình hƣớng dẫn kiến thức cũng nhƣ cho em những lời khuyên quý báu. Xin cảm ơn các bạn, các đồng nghiệp, các em khóa luận, các em monitor đã không ngại bỏ thời gian giúp đỡ. Con xin cảm ơn ba mẹ, gia đình đã ở bên con. . . ABSTRACT Graduation thesis of Pharmacy Master’s degree – Academic year 2018 – 2020 CHEMICAL CONSTITUENTS AND PHARMACOLOGICAL ACTIVITIES OF THE LEAVES FROM SAUROPUS SPATULIFOLIUS BEILLE (SAUROPI FOLIUM) Nguyen Anh Dao Instructor: Dr. Tran Thi Van Anh Introduction Sauropus spatulifolius Beille is an evergreen shrub distributed mainly in Asian countries. In traditional Chinese medicine, its leaves are used for the treatment of acute bronchitis, cough and sore throat, as well as a potent anti inflammatory and anticancer drug. The aim of this study was to investigate the chemical constituents and biological activities of the leaves from Sauropus spatulifolius Beille. to give scientific data for the use of this plant. Material and method Material: The leaves of S.spatulifolius was collected in An Giang province (4/2019). Methods: Based on morphology and DNA barcode technology to identify the species Percolation, liquid-liquid extraction and different means of chromatography were used for the extraction and isolation. The structures of isolated compounds were determined by MS and NMR spectrometry methods. Evaluation of biological activities were accessed by three models: antioxidant activity using DPPH test, anti inflammation by using Lipopolysaccharide-Induced Production of Nitric oxide in RAW 264.7 macrophages method, antibacterial by agar well diffusion method. Results Along with traditional morphological approaches, molecular tool was used for the identification of medicinal plant “Cam sung” in Viet Nam. ITS sequence was analyzed and compared to subject nucleotide sequence on database (Genbank). The result confirmed the scientific name of “Cam sung” is Sauropus spatulifolius Beille. (Euphorbiacea) Chemical composition analysis showed the presence of saponin, alkaloid, flavonoid, triterpenoid,... Investigation of antioxidant activity on DPPH test showed ethanol 96%, ethanol 50% and water extraction have good activity with IC50 < 82 µg/ml. All extraction did not present any antibacterial activity on tested strains. For anti inflammination activity, the results indicated that DCM and EtOAc fraction from 50% ethanolic extract reduced nitric oxide (NO) production in lipopolysaccharide (LPS)-activated RAW . . 264.7 cells in a dose-dependent manner. At concentration 50 µg/ml, EtOAc extract showed significant down-regulation of NO (%NO = 30,24%) while cell viability is 120%, which was comparable to the positive control Dexan 20µM (31,34%). Leaves powder of 3,5 kg Sauropus spatulifolius Beille was percolated with 50% ethanol to give concentrated extract, then liquid – liquid extracted to obtain ethyl acetat extract (SauA and Sau B), n-butanol extract (SauC), and water extract (SauD). SauA and SauB was separated to obtain 8 compounds which were elucidated as ethyl octadeca-9,12-dienoate (Sau1, 25 mg), 3-(2-acetyl-1H-pyrrol-1-yl) dihydrofuran-2(3H)-one (Sau2, 10mg), N-(3-carboxypropyl)-2-acetylpyrrole (10 mg), methyl 4-(2-acetylpyrrol-1-yl)butanoate (Sau4, 50mg), acid trans-p-coumaric (25 mg), methyl 3,6-anhydro-2-deoxy-β-D-glucofuranoside (Sau7, 10mg), methyl3,6-anhydro-2-deoxy-β-D-arabino-hexoxofuranoside (Sau 8, 10mg), a mixture of 3,6-anhydro-2-deoxy-β-D-glucofuranose and 3,6-anhydro-2-deoxy-β-D-arabinohexofuranose (Sau9, 10mg). Conclusion The study confirmed the scientific name of “Cam sung” in Viet Nam is Sauropus spatulifolius Beille (Euphorbiaceae). The chemical constituents of leaves from Sauropus spatulifolius Beille are diverse with groups of compounds: alkaloid, flavonoid, organic acid, ... In this study, 8 compounds were isolated from EtOAc extract and their structure were determined by spectrometry methods. Compound Sau2 and Sau4 were the new compounds. . . TÓM TẮT LUẬN VĂN Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ dƣợc học - Năm học 2018-2020 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY CAM SŨNG (Sauropus spatulifolius Beille, Euphorbiaceae) Nguyễn Anh Đào Giảng viên hƣớng dẫn: TS. Trần Thị Vân Anh Đặt vấn đề Cam sũng là một loài đƣợc sử dụng nhiều trong y học dân gian để chữa ho, viêm phổi, chữa bệnh tim, kháng khối u,....Tuy nhiên, trên thế giới mới chỉ có một số ít công trình nghiên cứu về tác dụng dƣợc lý và thành phần hóa học của loài. Đề tài thực hiện nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát một số tác dụng sinh học của của cây Cam sũng (Sauropus spatulifolius Beille, Euphorbiaceae) để có cơ sở khoa học trong việc sử dụng cây Cam sũng chữa bệnh. Phƣơng pháp nghiên cứu: Đối tƣợng nghiên cứu là lá Cam sũng thu hái ở An Giang (4/2019). Sử dụng phƣơng pháp chiết xuất ngấm kiệt, các phƣơng pháp sắc kí để phân lập các chất. Cấu trúc chất phân lập đƣợc xác định bằng phổ MS và NMR. Khảo sát các hoạt tính chống oxy hóa (mô hình DPPH), hoạt tính kháng khuẩn bằng phƣơng pháp khuếch tán đĩa thạch, hoạt tính kháng viêm qua tác dụng ức chế NO của tế bào RAW 264.7 đƣợc kích thích bởi LPS. Kết quả: Khảo sát đặc điểm về hình thái thực vật, vi phẫu cây Cam sũng và so sánh với tài liệu tham khảo. Định danh bằng phƣơng pháp giải trình tự gen, qua đó xác định tên khoa học của cây Cam sũng là Sauropus spatulifolius Beille (Euphorbiaceae). Thành phần hóa thực vật của lá Cam sũng có sự hiện diện của các nhóm hợp chất nhƣ saponin, alkaloid, flavonoid, triterpenoid,… Khảo sát tác dụng chống oxy hóa trên mô hình DPPH cho thấy cao cồn 96%, cồn 50% và cao nƣớc đều có hoạt tính chống oxy hóa với IC50 < 82 µg/ml. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, các cao chiết và các phân đoạn của cao cồn 50% đều không thể hiện . . hoạt tính kháng khuẩn hoặc hoạt tính kháng khuẩn yếu ở nồng độ 100 mg/ml. Khảo sát hoạt tính kháng viêm, các phân đoạn của cao cồn 50% có hoạt tính kháng viêm. Phân đoạn SP50.1 có hoạt tính kháng viêm tốt ở các nồng độ khảo sát, tuy nhiên ở nồng độ 50 µg/ml tỉ lệ tế bào sống chỉ là 15,45%. Phân đoạn SP50.2 có hoạt tính kháng viêm tốt nhất, ở nồng độ 50 µg/ml, phân đoạn này ức chế NO ở mức 30,24% (tỉ lệ tế bào sống tƣơng ứng là 120%) thấp hơn so với chứng dƣơng là Dexan 20µM (31,34%). Chiết xuất cao toàn phần bằng cồn 50% và phân tách phân đoạn. Đã phân lập và xác định cấu trúc của 8 hợp chất: ethyl octadeca-9,12-dienoat (25 mg), 3-(2-acetyl-1Hpyrrol-1-yl)dihydrofuran-2(3H)-on (10 mg), N-(3-carboxypropyl)-2-acetylpyrrol (10 mg), methyl 4-(2-acetylpyrrol-1-yl)butanoat (50 mg), acid trans-p-coumaric (25 mg), methyl 3,6-anhydro-2-deoxy-β-D-glucofuranosid (10mg), methyl-3,6- anhydro-2-deoxy-β-D-arabino-hexoxofuranosid (10mg), hỗn hợp của 3,6-anhydro2-deoxy-β-D-glucofuranose và 3,6-anhydro-2-deoxy-β-D-arabino-hexofuranose (10mg). Trong đó theo giới hạn của tài liệu tham khảo, hợp chất 3-(2-acetyl-1H-pyrrol-1-yl) dihydrofuran-2(3H)-on, methyl 4-(2-acetylpyrrol-1-yl)butanoat lần đầu tiên xác định. Kết luận Đề tài đã xác định tên khoa học của loài Cam sũng ở An Giang (Việt Nam) là Sauropus spatulifolius Beille (Euphorbiaceae) bằng phân tích hình thái và định danh ADN. Khảo sát tác dụng chống oxi hóa, kháng khuẩn, kháng viêm cho thấy phân đoạn cao EtOAc từ cao cồn 50% cho hoạt tính tốt. Thành phần hóa học trong lá Cam sũng đa dạng, đã phân lập đƣợc 9 hợp chất từ cao phân đoạn EtOAc và xác định cấu trúc 8 hợp chất bằng các phƣơng pháp phổ học. Trong đó , chat Sau2 và Sau4 là 2 chất mới trong tự nhiên. . . MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... 3 MỤC LỤC ................................................................................................................... i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ..................................................... iii DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... v DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. vi DANH MỤC SƠ ĐỒ ................................................................................................vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ ............................................................................................vii MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3 1.1. TỔNG QUAN THỰC VẬT HỌC.................................................................... 3 1.1.1. Vị trí trong sinh giới chi Sauropus ............................................................ 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật chi Sauropus ................................................................ 3 1.1.3. Đặc điểm thực vật cây Cam sũng .............................................................. 6 1.2. TỔNG QUAN HÓA HỌC ............................................................................. 12 1.2.1. Thành phần hóa học chi Sauropus ........................................................... 12 1.2.2. Thành phần hóa học loài Sauropus spatulifolius Beille .......................... 17 1.3. TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG DƢỢC LÝ ................................................. 19 1.3.1. Tác dụng dƣợc lý của một số loài trong chi Sauropus ............................ 19 1.3.2. Một số nghiên cứu về tác dụng dƣợc lý của loài Sauropus spatulifolius 23 1.3.3. Công dụng dân gian của cây Cam sũng ................................................... 24 1.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC IN VITRO .............. 25 1.4.1. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa...................................... 25 1.4.2. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn......................................... 27 1.4.3. Mô hình nghiên cứu hoạt tính kháng viêm in vitro ................................. 29 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 31 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................ 31 2.1.1. Nguyên liệu .............................................................................................. 31 2.1.2. Dung môi, hóa chất dùng trong nghiên cứu hóa học ............................... 31 . . 2.1.3. Hóa chất dùng trong nghiên cứu hoạt tính sinh học ................................ 31 2.1.4. Dụng cụ và trang thiết bị nghiên cứu....................................................... 32 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 33 2.2.1. Kiểm tra nguyên liệu ............................................................................... 33 2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học............................................ 35 2.2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu thành phần hóa học của lá Cam sũng ............. 39 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................ 43 3.1. KIỂM TRA NGUYÊN LIỆU ......................................................................... 43 3.1.1. Đặc điểm hình thái Cam sũng .................................................................. 43 3.1.2. Định danh bằng phƣơng pháp giải trình tự ADN .................................... 44 3.1.3. Đặc điểm vi học ....................................................................................... 45 3.1.4. Đánh giá độ tinh khiết.............................................................................. 49 3.1.5. Hàm lƣợng chất chiết đƣợc...................................................................... 50 3.1.6. Xác định sơ bộ thành phần hóa thực vật lá Cam sũng............................. 50 3.2. KHẢO SÁT TÁC DỤNG SINH HỌC CÁC CAO CHIẾT LÁ CAM SŨNG51 3.2.1. Chiết xuất cao thử hoạt tính sinh học ...................................................... 51 3.2.2. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa ........................................................... 52 3.2.3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn .............................................................. 54 3.2.4. Khảo sát hoạt tính kháng viêm ................................................................ 55 3.3. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CAM SŨNG ........ 58 3.3.1. Chiết xuất và phân tách phân đoạn .......................................................... 58 3.3.2. Phân tách cao SauA ................................................................................. 60 3.3.3. Phân tách cao SauB ................................................................................. 69 3.3.4. Xác định cấu trúc các chất phân lập ........................................................ 76 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ....................................................................................... 94 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................................... 99 TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................... 101 PHỤ LỤC ................................................................................................................ 106 . . DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ tắt STT Chữ ngu ên 1. 13 2. 1 3. BuOH n-butanol 4. BAW Butanol : acid acetic: nƣớc 5. CHCl3 Cloroform 6. COSY Correlation spectroscopy 7. DCM Dicloromethan 8. DĐVN Dƣợc điểnViệt Nam 9. DMSO Dimethyl sulfoxide C-NMR H-NMR 10. EtOAc 11. HSQC 13 1 ngh C-Nuclear Magnetic Resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân C13 H-Nuclear Magnetic Resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân proton Ethylacetat Heteronuclear SpectroscopyQuantum Coherence Phổ hồng ngoại 12. IR Infrared Spectroscopy 13. MeOH Methanol 14. MS Mass spectrometry Khối phổ 15. NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân 16. NOESY Two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy 17. PE Petrol ether 18. SEM Standard Error of the Mean 19. SKC Sắc ký cột 20. SKĐ Sắc kí đồ 21. SKLM Sắc ký lớp mỏng 22. TLTK Tài liệu tham khảo . Độ sai chuẩn của trị số trung bình . 23. TT Thuốc thử 24. UV-vis Ultraviolet and Visible 25. VLC Vacuum Liquid Chromatography Sắc ký cột chân không 26. VS Vanillin-acid sulfuric . Tử ngoại khả kiến . DANH MỤC HÌNH H nh . Một số loài trong chi Sauropus .................................................................5 H nh Hình ảnh loài Sauropus rostratus Miq. theo các tác giả ............................8 Hình 1.3. Hình ảnh Sauropus spatulifolius Beille theo các tác giả ............................9 Hình 1.4. Lá và hoa cây Cam sũng ..........................................................................10 Hình 1.5. Các dẫn xuất nitrat đƣợc tổng hợp từ sauropunol ....................................23 Hình 3.1. Hình ảnh mẫu Cam sũng nghiên cứu .......................................................44 Hình 3.2. Bóc tách biểu bì cây Cam sũng ................................................................45 Hình 3.3. Hình chi tiết vi phẫu lá Cam sũng ............................................................46 Hình 3.4. Hình chi tiết vi phẫu thân cây Cam sũng .................................................48 Hình 3.5. Các cấu tử bột dƣợc liệu lá Cam sũng ......................................................49 Hình 3.6. Kết quả ức chế gốc tự do các phân đoạn dịch chiết cồn 50% trên bản mỏng Silicagel ...........................................................................................................54 H nh Kết quả SKLM các phân đoạn dịch chiết cồn 50 % với hệ BWA ...........59 H nh . Sắc ký đồ so sánh thành phần cao SauA với hệ dung môi PE: Aceton (6:4) ...........................................................................................................................61 H nh Sắc ký đồ các phân đoạn thu đƣợc từ SauA.2 ..........................................63 H nh . Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của Sau1 .............................................63 H nh . Sắc ký đồ cột Sephadex LH-20 phân đoạn SauA.3................................64 H nh . Sắc ký đồ cột Sephadex LH-20 phân đoạn SauA.3.3.............................65 H nh . Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của Sau2 .............................................65 H nh . Sắc ký đồ cột Sephadex LH-20 phân đoạn SauA.4................................66 H nh . Sắc ký đồ của các cao phân đoạn SauA.4.3 ...........................................67 H nh . Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của Sau3 .............................................68 H nh Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của Sau4 .............................................68 H nh . Sắc ký đồ các phân đoạn thu đƣợc từ SKC SauA.9 ...............................69 H nh . Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của Sau5 và Sau6 ...............................69 H nh . Sắc ký đồ so sánh thành phần cao SauB ................................................71 H nh . Sắc ký đồ các phân đoạn cao SauB ........................................................72 H nh . Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của Sau7 và Sau8 ...............................73 H nh . Sắc ký đồ cột Sephadex LH-20 phân đoạn SauB.7 ................................73 H nh . Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của Sau9 .............................................74 . . H nh Cấu trúc hóa học của Sau1 và một số tƣơng tác HMBC, COSY chính .76 H nh . Cấu trúc hóa học của Sau2 và một số tƣơng tác HMBC, COSY chính .79 H nh 3.27. Phổ khối HRMS (negative) của Sau3.....................................................80 H nh Cấu trúc hóa học của Sau3 và một số tƣơng tác HMBC, COSY...........81 H nh . Cấu trúc hóa học của Sau4 và một số tƣơng tác HMBC, COSY chính .83 H nh Cấu trúc hóa học của Sau6 và một số tƣơng tác HMBC, COSY chính .84 H nh Phổ khối ESI-MS positive của Sau7 ......................................................85 H nh Cấu trúc hóa học và các tƣơng tác HMBC, COSY chính của Sau7 ......87 H nh Phổ khối ESI-MS positive của Sau8 ......................................................88 H nh Cấu trúc hóa học và các tƣơng tác NOESY chính của Sau8 .................89 H nh . Cấu trúc hóa học của Sau9-1 và Sau9-2 ................................................92 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Cách pha mẫu đo trong ống nghiệm ........................................................35 Bảng 3.1. Kết quả thử tinh khiết của bột dƣợc liệu S.spatulifolius ..........................49 Bảng 3.2. Hàm lƣợng chất chiết đƣợc của dƣợc liệu S.spatulifolius........................50 Bảng 3.3. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học dịch chiết từ lá Cam sũng .50 Bảng 3.4. Kết quả chiết xuất cao để thử hoạt tính sinh học .....................................51 Bảng 3.5. Kết quả lắc phân bố cao để thử hoạt tính sinh học...................................51 Bảng 3.6. IC50 của cao cồn 96%, cồn 50% và cao nƣớc ..........................................52 Bảng 3.7. Kết quả xác định hoạt tính kháng vi sinh 3 cao chiết (nồng độ 1000 µg/ml) ...................................................................................................................................54 Bảng 3.8. Kết quả xác định hoạt tính kháng vi sinh vật các phân đoạn của cao cồn 50% (nồng độ 1000 µg/ml) .......................................................................................55 Bảng 3.9. % tiết NO của Raw 264.7 sau khi xử lý cao chiết....................................55 Bảng 3.10. % tế bào sống của các cao chiết tƣơng ứng ...........................................56 Bảng 3.11. IC50 của cao phân đoạn ..........................................................................57 Bảng 3.12. Hiệu suất các cao chiết từ cao cồn 50% toàn phần ................................59 Bảng 3.13. Các phân đoạn thu đƣợc từ cao SauA ....................................................60 Bảng 3.14. Các phân đoạn thu đƣợc từ SKC SauA.2 ...............................................63 Bảng 3.15. Kết quả cột Sephadex LH-20 phân đoạn SauA.3...................................64 Bảng 3.16. Kết quả cột Sephadex LH-20 phân đoạn SauA.3.3................................64 . . Bảng 3.17. Kết quả cột Sephadex LH-20 phân đoạn SauA.4...................................66 Bảng 3.18. Kết quả sắc kí cột cao SauA.4.3 .............................................................66 Bảng 3.19. Kết quả cột Sephadex LH-20 phân đoạn SauA.9...................................68 Bảng 3.20. Các phân đoạn hứng của cột sắc kí phân tách cao SauB .......................70 Bảng 3.21. Kết quả SKC cột phân đoạn SauB.1 ......................................................72 Bảng 3.22. Kết quả cột Sephadex LH-20 phân đoạn SauB.7 ...................................73 Bảng 3.23. Bảng so sánh dữ liệu phổ NMR của Sau1 và ethyl octadeca-9,12dienoat .......................................................................................................................77 Bảng 3.24. Bảng dữ liệu phổ NMR của Sau2 ..........................................................78 Bảng 3.25. Bảng so sánh dữ liệu phổ NMR của Sau3 và N-(3-carboxypropyl)-2acetylpyrrol ...............................................................................................................81 Bảng 3.26. Bảng dữ liệu phổ NMR của Sau4 ..........................................................82 Bảng 3.27. Bảng so sánh dữ liệu phổ NMR của Sau6 và axit trans-p-coumaric .....84 Bảng 3.28. Bảng so sánh dữ liệu phổ NMR của Sau7 và butyl 3,6-anhydro-2deoxy-β-D-glucofuranosid ........................................................................................86 Bảng 3.29. Bảng so sánh dữ liệu phổ NMR của Sau8 và anhydro-2-deoxy-β-Darabino-hexofuranosid...............................................................................................88 Bảng 3.30. Bảng so sánh dữ liệu phổ NMR của Sau9-1 và 3,6-anhydro-2-deoxy-βD-glucofuranose ........................................................................................................90 Bảng 3.31. Bảng so sánh dữ liệu phổ NMR của Sau9-2 và 3,6-anhydro-2-deoxy-βD-arabino-hexofuranose ............................................................................................91 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1. Sơ đồ chiết xuất và tách cao phân đoạn ..................................................59 Sơ đồ 3.2. Tóm tắt qui trình phân lập các chất từ cao EtOAc (SauA và SauB) .......75 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. So sánh giá trị IC50 của các cao so với vitamin C ...............................53 Biểu đồ 3.2. Khả năng tiết NO của Raw 264.7 sau xử lý cao chiết ........................56 Biểu đồ 3.3. Khả năng gây độc trên tế bào của các cao chiết tƣơng ứng ................57 . . Luận văn Thạc sĩ Dược học 1 Nguyễn Anh Đào MỞ ĐẦU Theo nghiên cứu của tổ chức Y tế Thế giới (WHO), 65% đến 80% dân số của các nƣớc đang phát triển hiện đang sử dụng cây thuốc để chữa bệnh. Theo Grand View Research, năm 2018 thị trƣờng toàn cầu của thuốc có nguồn gốc từ thực vật đạt 59,76 tỷ đô la và ƣớc tính tăng lên đến 210,81 tỷ đô la vào năm 2026. Việt Nam có nguồn tài nguyên thực vật-động vật vô cùng phong phú và đa dạng. Theo Phạm Hoàng Hộ, có khoảng 12 000 loài cây có mạch, không kể rong, rêu và nấm ở Việt Nam [2]. Bên cạnh đó, nền y học cổ truyền ở nƣớc ta cũng đƣợc biết đến với nhiều loài cây quý, những bài thuốc quý. Những thông tin về cây thuốc, bài thuốc đƣợc truyền đi qua các thế hệ và dần trở nên hoàn thiện với sự bổ sung kiến thức qua nhiều thời kỳ. Tuy nhiên, nhiều dƣợc liệu đƣợc sử dụng để chữa bệnh theo kinh nghiệm dân gian nhƣng không hoặc chƣa có đầy đủ những nghiên cứu khoa học chứng minh hiệu quả điều trị. Do vậy, đảm bảo an toàn và chất lƣợng dƣợc liệu trở thành một vấn đề quan trọng khi muốn phát triển thuốc. Trƣớc tình hình đó, hƣớng nghiên cứu hóa học cùng tác dụng sinh học của các cây thuốc dân gian ngày càng đƣợc chú trọng [10]. Cam sũng (Sauropus spatulifolius Beille, Euphorbiaceae) là một loài đƣợc sử dụng trong y học dân gian với nhiều công dụng khác nhau nhƣ chữa ho, bổ phổi, chữa bệnh tim, kháng khối u,.....Ở Trung Quốc, cây này đƣợc biết tới dƣới tên cây Lƣỡi rồng và đƣợc sử dụng từ lâu nhƣ một thành phần của bài thuốc làm mát phổi và trị ho. Ở Việt Nam, cây này còn đƣợc biết tới dƣới tên cây Cam sũng để trị ho, phù nề, khó thở,... Gần đây, một số bà con ở miền Nam dùng cây Cam sũng điều trị bệnh hở van tim. Trên thế giới, đã có một số công trình nghiên cứu về loài này nhƣng chỉ dừng lại ở mức độ khảo sát hoạt tính sinh học của các dịch chiết và rất ít công trình nghiên cứu chi tiết về thành phần hóa học của các hợp chất có trong loài này. Ở Việt Nam hiện vẫn chƣa có công trình nào công bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Cam sũng. . . Luận văn Thạc sĩ Dược học 2 Nguyễn Anh Đào Trên nền tảng những công dụng của cây Cam sũng đƣợc sử dụng trong dân gian và các công trình nghiên cứu của các tác giả trên thế giới đã công bố, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Cam sũng (Sauropus spatulifolius Beille, Euphorbiaceae)” để tìm hiểu sâu hơn về thành phần và các tác dụng sinh học của cây này tại Việt Nam, góp phần cung cấp các dữ liệu khoa học tiền đề cho sự phát triển dƣợc liệu này trong tƣơng lai. Đề tài đƣợc thực hiện với các mục tiêu nhƣ sau: Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Cam sũng (Sauropus spatulifolius Beille, Euphorbiaceae) Mục tiêu cụ thể - Khảo sát đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây Cam sũng (Sauropus spatulifolius Beille). - Sàng lọc các tác dụng kháng khuẩn, chống oxi hóa, kháng viêm của các cao chiết từ cây Cam sũng. - Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất chính từ phân đoạn cao thể hiện các tác dụng dƣợc lý tốt nhất. . . Luận văn Thạc sĩ Dược học Nguyễn Anh Đào 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN THỰC VẬT HỌC 1.1.1. Vị trí trong sinh giới chi Sauropus Theo hệ thống phân loại Armen Takhtajan năm 1997 [7] và APG năm 2013, vị trí phân loại của chi Sauropus đƣợc trình bày trong Bảng 1.1. ảng 1.1. Vị trí phân loại của chi Sauropus Phân giới Cormobionta (Thực vật bậc cao) Ngành Magnoliophyta (Ngành Ngọc Lan) Lớp Magnoliopsida (Lớp Ngọc Lan) Phân lớp Bộ Họ Chi Sổ (Dilleniidae) Thầu dầu (Euphorbiales) Thầu dầu (Euphorbiaceae) Sauropus Theo hệ thống phân loại thực vật có hoa của Armen Takhtajan (1997), chi Sauropus thuộc phân lớp Sổ (Dilleniidae), bộ Thầu dầu (Euphorbiales), họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). Tên của chi là sự kết hợp của các chữ Hy Lạp "αῦρ ς" (sauros) = thằn lằn, và "πottaύς" = chân, do hình dạng của gân lá nhƣ dấu chân của một con khủng long. Theo các nghiên cứu mới nhất dựa trên giải trình tự ADN, chi Sauropus ban đầu đƣợc xếp vào họ Euphorbiaceae, phân tông Phyllanthoideae [40]. Sau đó, họ Euphorbiaceae đƣợc phân tách thành năm họ, chi Sauropus đƣợc xếp vào họ Phyllanthaceae. Tuy nhiên, các tác giả cũng cho rằng cần nhiều dữ liệu phân tích hơn ở cấp độ phân tử để có thể khẳng định việc phân loại này [33]. 1.1.2. Đặc điểm thực vật chi Sauropus Hình thái học . . Luận văn Thạc sĩ Dược học 4 Nguyễn Anh Đào Dạng sống: Hầu hết các loài thuộc chi Sauropus là thảo mộc (thân gỗ) hay cây bụi nhỏ. Một số loài có thể trở thành cây gỗ (ví dụ: Sauropus macranthus, Sauropus rhamnoides). Các loài đƣợc tìm thấy trong các điều kiện sinh thái khác nhau, phân bố chủ yếu ở các vùng đất có độ cao thấp, mặc dù một vài loài có thể xuất hiện ở độ cao lên tới 2100 m. Lá: Lá thƣờng mọc so le, có loài lá kép hình lông chim (bồ ngót). Lá kèm thƣờng nhỏ, rụng sớm. Cuống lá có hình thận ở mặt cắt ngang, trơn nhẵn. Mép lá thƣờng nguyên và phiến lá không có tuyến tiết. Mặt dƣới lá thƣờng đƣợc che phủ bởi lớp sáp, làm cho lá cây có màu xám nhạt. Hoa: hoa thƣờng rất nhỏ, có cuống và đối xứng qua trục. Thƣờng không có cánh hoa và nhụy hoa. Tràng tiêu biến ở hoa cái và biến thành đài ở hoa đực. Cuống hoa thƣờng rất ngắn (ngắn hơn 2 cm) trừ Sauropus macranthus Hassk. Nhị: 3 nhị hợp lại thành một cột ngắn. Bộ nhụy: Đầu nhụy gắn sát bầu noãn. Bầu noãn 3 ô, mỗi ô 2 noãn, mỗi noãn phát triển thành một hạt. Quả: Quả nang tự mở, khi chín quả nứt theo các đƣờng nhƣ sau: song song theo thai tòa tách một cột giữa mang 3 hạt; theo đƣờng hàn lá noãn tách 3 lá noãn ra; theo gân giữa của mỗi lá noãn, do đó quả nứt ra thành sáu mảnh. Vỏ quả thƣờng láng, trơn nhẵn, nhƣng thỉnh thoảng có lông che chở, khô khi chín. Hạt: Hạt thƣờng có mặt cắt tam giác khi cắt ngang, vỏ ngoài lồi và thƣờng có 3 cạnh [37]. Phân bố, sinh thái Chi Sauropus phân bố trải dài từ Mauritius, Ấn Độ, khắp lục địa Đông Nam Á đến Úc. Chi Sauropus có một số loài phân bố rất phổ biến cũng nhƣ nhiều loài đặc hữu thuộc các khu vực khác nhau. Đây là điểm thƣờng gặp ở nhiều loài thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). Các loài phân bố rộng nhất là Sauropus androgynus, Sauropus bacciformis, Sauropus macranthus và Sauropus rhamnoides [37]. . . Luận văn Thạc sĩ Dược học 5 Loài Sauropus androgynus (Rau Bồ ngót) Lá và hoa loài Sauropus bonii (Bồ ngót bon) Loài Sauropus bacciformis (Ngót biển quả mập) Loài Sauropus macranthus (Rau ngót hoa to) H nh 1.1. Một số loài trong chi Sauropus [52] . Nguyễn Anh Đào