Tài liệu Nghiên cứu thành phần hoá học theo định hướng chống oxy hoá, ức chế α glucosidase và động thái tích luỹ oxy trans resveratrol và moracin m trong cành dâu tằm (ramulus mori albae) thu hái tại bảo lộc – lâ

. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ MỘNG THI NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC THEO ĐỊNH HƢỚNG CHỐNG OXY HOÁ, ỨC CHẾ α-GLUCOSIDASE VÀ ĐỘNG THÁI TÍCH LUỸ OXY-TRANS-RESVERATROL VÀ MORACIN M TRONG CÀNH DÂU TẰM (Ramulus Mori albae) THU HÁI TẠI BẢO LỘC – LÂM ĐỒNG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2020 . . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ MỘNG THI NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC THEO ĐỊNH HƢỚNG CHỐNG OXY HOÁ, ỨC CHẾ α-GLUCOSIDASE VÀ ĐỘNG THÁI TÍCH LUỸ OXY-TRANS-RESVERATROL VÀ MORACIN M TRONG CÀNH DÂU TẰM (Ramulus Mori albae) THU HÁI TẠI BẢO LỘC – LÂM ĐỒNG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC Ngành: Dƣợc liệu – Dƣợc học cổ truyền Mã số: 8720206 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Huỳnh Ngọc Thụy Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2020 . . LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nguyễn Thị Mộng Thi . . TÓM TẮT Luận văn thạc sĩ – Khóa 2018-2020 Ngành: Dƣợc liệu-Dƣợc cổ truyền – Mã số: 8720206 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC THEO ĐỊNH HƢỚNG CHỐNG OXY HOÁ, ỨC CHẾ α-GLUCOSIDASE VÀ ĐỘNG THÁI TÍCH LUỸ OXY-TRANS-RESVERATROL VÀ MORACIN M TRONG CÀNH DÂU TẰM (Ramulus Mori albae) THU HÁI TẠI BẢO LỘC – LÂM ĐỒNG Nguyễn Thị Mộng Thi Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Huỳnh Ngọc Thuỵ Mở đầu Dâu tằm (Morus alba L.) là loài cây quý với nhiều đặc tính dƣợc lý quan trọng và tiềm năng phát triển rất lớn trong lĩnh vực dƣợc phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm chức năng nổi bật là tác dụng ức chế α-glucosidase. Đề tài thực hiện khảo sát thành phần hoá học theo định hƣớng tác dụng sinh học và theo dõi động thái tích luỹ oxy-trans-resveratrol và moracin M trong cành Dâu tằm góp phần hoàn thiện cơ sở khoa học cho việc đƣa cao chiết chất lƣợng cao vào trong sản phẩm ph ng và h trợ điều trị bệnh đái tháo đƣờng. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu Cành Dâu tằm thu hái tại Bảo Lộc, Lâm Đồng từ tháng 1/2019 – 12/2019. Khảo sát hoá học hƣớng tác dụng chống oxy hoá theo mô hinh DPPH và ức chế αglucosidase theo phƣơng pháp của Zhi-Wei Wang et al., (2013). Phân lập, tinh chế, định danh và đánh giá hoạt tính sinh học của chất tinh khiết. Ứng dụng phƣơng pháp UPLC-PDA đánh giá hàm lƣợng oxy-trans-resveratrol và moracin M trong các mẫu cao cồn Dâu tằm theo thời gian thu hái. Kết quả Từ 3 kg cành dâu tằm, chiết ngấm kiệt với cồn 96% thu đƣợc 150 g cao cồn. Tiến hành lắc phân bố lỏng-lỏng với lần lƣợt các dung môi có độ phân cực tăng dần thu đƣợc 82 g cao cloroform (cao A), 10 g cao EtOAc (cao B), 58 g cao nƣớc (cao C). Từ 10 g cao phân đoạn EtOAc thu đƣợc 6 hợp chất lần lƣợt đƣợc xác định là: kuwanon G (24 mg), moracin M (8,2 mg), kuwanon C (35 mg), acid coumaric (7 mg), morusin (8,5 mg) và β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranosid (200 mg). . . Khảo sát hoạt tính chống oxy hoá trên mô hinh DPPH, moracin M có hoạt tính mạnh (IC50 = 30,66 µM), các chất còn lại cho hoạt tính trung bình hoặc yếu. Khảo sát tác dụng ức chế α-glucosidase, có 4 chất cho tác dụng mạnh với IC50 lần lƣợt là kuwanon G (8,93 µM), kuwanon C (26,99 µM), moracin M (37,07 µM), morusin (62,07 µM). Hàm lƣợng oxy-trans-resveratrol và moracin M thay đổi giữa các tháng trong năm và trong cùng một quý, cao nhất là tháng 1 và tháng 12, thấp nhất là tháng 4. Sau 9 tháng lƣu trữ, hàm lƣợng oxy-trans-resveratrol giảm 18,7 %; moracin M giảm 11,4 % so với ban đầu. Kết luận Từ cao phân đoạn ethyl acetat có hoạt tính sinh học mạnh nhất đã phân lập đƣợc 6 hợp chất và 4 trong số đó thể hiện hoạt tính ức chế α-glucosidase mạnh hơn chứng dƣơng acarbose nhiều lần, tiềm năng trong h trợ điều trị bệnh đái tháo đƣờng. . . ABSTRACT Master‟s thesis – Academic course: 2016 – 2018 Speciality: Pharmacognosy – Traditional Pharmacy - Code: 8720206 IN VITRO SCREENING FOR THE ANTIOXIDANT AND αGLUCOSIDASE INHIBITORY ACTIVITIES AND THE ACCUMULATION OF OXY-TRANS-RESVERATROL AND MORACIN M IN MULBERRY TWIGS (Ramulus Mori albae) GROWING IN BAO LOC, LAM DONG PROVINCE, VIETNAM Nguyen Thi Mong Thi Instructor: Huynh Ngoc Thuy, Assoc. Prof., Dr Introduction Mulberry tree (Morus alba L.) is used in folk medicine for the treatment numbers of diseases. It has been reported for various biological activities and has a good potential for using in cosmetics and pharmaceutical preparations. This study focused on the screening for active constituents and investigating the accumulation of oxy-transresveratrol and moracin M in mulberry twigs collected at different time schedule in Bao Loc, Lam Dong province to provide a scientific basis and new applications for quality control and standardization of mulberry extracts in diabetes prevention and treatment products. Materials and research method Material: The twigs of Morus alba L. was collected in Lam Dong province at different time from January to December 2019. Methods: Sreening for the compounds having antioxidant (using DPPH test) and the in vitro α- glucosidase inhibitory effects by the method described by Zhi-Wei Wang et al. (2013). Percolation, liquid-liquid extraction and different techniques of chromatography were used for the extraction and isolation. The structures of isolated compounds were determined by MS and NMR spectrometry methods. The content and stability of oxy-trans-resveratrol and moracin M; the inhibitory activity on α-glucosidase in alcoholic extract of samples collected over the time were monitoring according the known methods. Result Twig powder of 3,0 kg Morus alba L. was percolated with ethanol 96% to give 150 g concentrated extract. The extract was then subjected to liquid – liquid extraction to obtain cloroform (A, 82 g), ethyl acetat (B, 10 g), and water (C, 58 g) extracts. B was further separated by chromatographic techniques to obtain 6 compounds which were . . structural elucidated as kuwanon G (24 mg), moracin M (8,2 mg), kuwanon C (35 mg), acid coumaric (7 mg), morusin (8,5 mg) and β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside (200 mg). Investigation of antioxidant activity on DPPH test showed moracin M has strong activity with IC50 = 30,66 µM. All other 4 compounds have shown moderate or weak activities: kuwanon G (IC50 8,93 µM), kuwanon C (26,99 µM), moracin M (37,07 µM), morusin (62,07 µM). MA1 and MA4 contents in twigs were highest in January and December, lowest in April. After 9 months of storage, oxy-trans-resveratrol content decreased by 18.7%; moracin M decreased by 11.4% compared to their original contents in twigs. Conclusion In this study, 6 compounds were isolated from EtOAc extract and 4 of them posessed remarkable α-glucosidase inhibitor activity compare to the positive control, acarbose. The contents of oxyresveratrol and moracin M were decreased during the time of storage. . . . . i MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................ iv DANH MỤC HÌNH ............................................................................................... v DANH MỤC BẢNG ............................................................................................ vii MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC ....................................................... 3 1.1.1. Vị trí phân loại ................................................................................. 3 1.1.2. Đặc điểm chi Morus ......................................................................... 3 1.1.3. Đặc điểm cây Dâu tằm ..................................................................... 4 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC ................................................................... 5 1.3. TÁC DỤNG DƢỢC LÝ....................................................................... 10 1.3.1. Tác dụng theo y học hiện đại ......................................................... 10 1.3.2. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền ................................ 13 1.3.3. Một số bài thuốc và chế phẩm trên thị trƣờng sử dụng dâu tằm. .. 14 1.4. TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP THỬ CHỐNG OXY HOÁ....... 16 1.5. TỔNG QUAN PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ ỨC CHẾ αGLUCOSIDASE .............................................................................................. 16 1.6. MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ CÂY DÂU TẰM TẠI BỘ MÔN DƢỢC LIỆU – ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH .. 17 1.6.1. Chiết xuất, phân lập thành phần chính trong dƣợc liệu Dâu tằm (Morus alba L., Moraceae) .......................................................................... 17 1.6.2. Sàng lọc in vitro tác dụng ức chế α-glucosidase của một số loài thuộc họ Dâu tằm (Moraceae). ..................................................................... 17 1.6.3. Sàng lọc tác dụng ức chế α-glucosidase của cây Dâu tằm Morus alba thu hái theo mùa ở một số tỉnh của Việt Nam ..................................... 18 . . ii 1.6.4. Theo dõi hàm lƣợng oxy-trans-resveratrol và moracin M trong thân dâu tằm (Morus alba L., Moraceae) theo mùa thu hái bằng phƣơng pháp UPLC-PDA. ................................................................................................. 18 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 20 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU.............................................................. 20 2.1.1. Đối tƣợng ....................................................................................... 20 2.1.2. Dung môi, hóa chất ........................................................................ 20 2.1.3. Dụng cụ thiết bị .............................................................................. 21 2.1.4. Nơi thực hiện đề tài ........................................................................ 21 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 22 2.2.1. Kiểm tra nguyên liệu .......................................................................... 22 2.2.2. Phƣơng pháp sàng lọc hoạt tính sinh học .......................................... 22 2.2.3. Phân lập chất tinh khiết theo định hƣớng kết quả sàng lọc sinh học…………… ............................................................................................ 26 2.2.4. Kiểm tra độ tinh khiết .................................................................... 28 2.2.5. Xác định cấu tr c các chất phân lập đƣợc ..................................... 28 2.2.6. Theo dõi động thái tích lũy của oxy-trans-resveratrol và moracin M trong cây dâu tằm thu hái tại Bảo lộc theo thời gian thu hái bằng phƣơng pháp UPLC/PDA. ......................................................................................... 28 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................... 30 3.1. KIỂM TRA NGUYÊN LIỆU ............................................................... 30 3.1.1. Định danh bằng phƣơng pháp giải trình tự ADN .......................... 30 3.1.2. Đặc điểm h nh thái ......................................................................... 31 3.1.3. Đặc điểm vi học ............................................................................. 32 3.1.4. Xác định độ tinh khiết .................................................................... 34 3.2. KẾT QUẢ S NG LỌC HOẠT TÍNH SINH HỌC ............................. 34 Kết quả sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa bằng DPPH ................. 34 3.2.1. . . iii Kết quả sàng lọc tác dụng ức chế α-glucosidase ........................... 35 3.2.2. 3.3. PHÂN LẬP HỢP CHẤT TỪ CAO ETHYL ACETAT (CAO B) ....... 37 3.3.1. Sắc ký cột nhanh cao ethyl acetat ..................................................... 37 3.3.2. Đánh giá tác dụng sinh học các cao phân đoạn ............................. 38 3.3.3. Phân lập, kiểm tra độ tinh khiết các hợp chất ................................ 40 3.4. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC TỪ CAO ETHYL ACETAT ............................................................................................ 51 3.4.1. Xác định cấu trúc của MT2 ............................................................ 51 3.4.2. Xác định cấu trúc của MT7 ............................................................ 52 3.4.3. Xác định cấu trúc của MT4 ............................................................ 54 3.4.4. Xác định cấu trúc của MT6 ............................................................ 56 3.4.5. Xác định cấu trúc của MT8 ............................................................ 59 3.4.6. Xác định cấu trúc của MT3 ............................................................ 62 3.5. ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC ………………………………………………………………………..66 3.5.1. Tác dụng chống oxy hoá DPPH ..................................................... 66 3.5.2. Tác dụng ức chế α-glucosidase ...................................................... 69 3.6. THEO DÕI ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY CỦA OXY-TRANSRESVERATROL (MA4) VÀ MORACIN M (MA1) TRONG CÂY DÂU TẰM THU HÁI TẠI BẢO LỘC, L M ĐỒNG THEO THỜI GIAN THU HÁI BẰNG PHƢƠNG PHÁP UPLC/PDA. .................................................... 72 CHƢƠNG 4: B N LUẬN ................................................................................... 78 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN V ĐỀ NGHỊ ........................................................... 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 83 PHỤ LỤC ............................................................................................................. 87 . . iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Chữ tắt Chữ nguyên Ý nghĩa br broad Đỉnh rộng d doublet Đỉnh đôi DĐVN Dƣợc điển Việt Nam DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH HTCO 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl Heteronuclear Multiple Bond Correlation Heteronuclear Single Quantum Correlation Hoạt tính chống oxy hóa IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% J Coupling constant Hằng số ghép m multiplet Đỉnh phức tạp MS Mass Spectroscopy Phổ khối NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân ppm parts per million Phần triệu PDA Photodiode array Dãy diod quang s Singlet Đỉnh đơn SKC Sắc ký cột SKLM Sắc ký lớp mỏng TLTK Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử UV-Vis Ultraviolet - Visible MA4 Oxy-trans-resveratrol MA1 Moracin M VS Vanillin-acid sulfuric HMBC HSQC p-nitrophenyl-α-Dglucopyranoside p-nitrophenol PNPG PNP . Tử ngoại - khả kiến . v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Vị trí phân loại của cây Dâu tằm...................................................................... 3 Hình 1.2. Phản ứng giữa DPPH và một chất chống oxi hóa .................................................. 16 Hình 2.1. Bố trí thí nghiệm thử DPPH tr n đĩa 96 giếng ............................................... 24 Hình 2.2. Quy trình chiết cao phân đoạn ....................................................................... 27 Hình 3.1. Hình cây Dâu tằm........................................................................................... 32 Hình 3.2. Vi phẫu cành cây dâu tằm .............................................................................. 33 Hình 3.3. Một số cấu tử trong bột cành cây dâu tằm ..................................................... 34 Hình 3.4. Sắc ký đồ các cao phân đoạn với thuốc thử DPPH ........................................ 35 Hình 3.5. Biểu đồ so sánh tác dụng ức chế α-glucosidase của 12 tháng ....................... 36 Hình 3.6. Biểu đồ kết quả thử HTCO của các mẫu cao thử nghiệm.............................. 37 Hình 3.7. Sắc ký đồ các phân đoạn từ cột nhanh của cao ethyl acetat ............................ 38 Hình 3.8. Kết quả sàng lọc DPPH các cao phân đoạn từ sắc ký cột nhanh ................... 39 Hình 3.9. Biểu đồ thể hiện IC50 của các phân đoạn từ cột nhanh ................................. 40 Hình 3.10. Sắc ký đồ các phân đoạn thu đƣợc từ SKC phân đoạn B2 .......................... 41 Hình 3.11. Sắc ký đồ cột Sephadex LH-20 phân đoạn B2.3 ......................................... 41 Hình 3.12. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của MT8 ................................................... 42 Hình 3.13. Sắc ký đồ các phân đoạn thu đƣợc từ SKC phân đoạn B3 .......................... 43 Hình 3.14. Sắc ký đồ các phân đoạn thu đƣợc từ SKC phân đoạn B3.2 ....................... 43 Hình 3.15. Sắc ký đồ các phân đoạn thu đƣợc từ SKC phân đoạn B3.2.2 .................... 44 Hình 3.16. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của MT6 ................................................... 44 Hình 3.17. Sắc ký đồ các phân đoạn thu đƣợc từ SKC phân đoạn B3.2.3 .................... 45 Hình 3.18. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của MT7 ................................................... 45 Hình 3.19. Sắc ký đồ các phân đoạn thu đƣợc từ SKC phân đoạn B3.3 ....................... 46 Hình 3.20. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của MT4 ................................................... 46 Hình 3.21. Sắc ký đồ các phân đoạn thu đƣợc từ SKC phân đoạn B4 .......................... 47 Hình 3.22. Sắc ký đồ các phân đoạn thu đƣợc từ SKC phân đoạn B4.2 ....................... 48 Hình 3.23. Sắc ký đồ các phân đoạn thu đƣợc từ SKC phân đoạn B4.2.3 .................... 49 Hình 3.24. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của MT3 ................................................... 49 Hình 3.25. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của MT2 .................................................. 50 H nh 3.26. Sơ đồ tổng hợp quá trình phân lập các chất tinh khiết từ cao B .................. 51 . . vi Hình 3.27. Phổ MS (APCI-) của MT2............................................................................ 52 Hình 3.28. Cấu trúc của β-sitosterol-O-3-β-D-glucopyranosid ..................................... 52 Hình 3.29. Phổ (-)ESI-MS của MT7 .............................................................................. 53 Hình 3.30. Cấu tr c và tƣơng tác của trans-p-coumaric acid ........................................ 54 Hình 3.31. Phổ MS (ESI-) của MT4 ............................................................................... 55 Hình 3.32. Cấu tr c và tƣơng tác của Moracin M.......................................................... 56 Hình 3.33. Phổ MS (ESI-) của MT6 ............................................................................... 57 Hình 3.34. Cấu tr c và tƣơng tác của Kuwanon C ........................................................ 59 Hình 3.35. Phổ MS (ESI-) của MT8 ............................................................................... 60 Hình 3.36. Cấu tr c và tƣơng tác của morusin............................................................... 62 Hình 3.37. Phổ MS (ESI-) của MT3 .............................................................................. 63 Hình 3.38. Cấu tr c và tƣơng tác của kuwanon G ......................................................... 66 Hình 3.39. Sắc ký đồ các chất tinh khiết với thuốc thử DPPH ...................................... 66 Hình 3.40. Biểu đồ so sánh IC50 (μM) của các chất tinh khiết phân lập đƣợc với vitamin C ..................................................................................................................................... 69 Hình 3.41. Biểu đồ so sánh IC50 (μM) của các chất tinh khiết phân lập đƣợc với acarbose. ......................................................................................................................... 72 Hình 3.42. Sắc ký đồ của mẫu thử ................................................................................. 73 H nh 3.43. Độ tinh khiết và phổ UV của pic cần định lƣợng ........................................ 73 Hình 3.44. Phổ UV của chất đối chiếu MA4 và MA1 ................................................... 74 Hình 3.45. Biểu đồ so sánh hàm lƣợng MA4 và MA1 trong cành Dâu tằm qua các tháng thu hái ................................................................................................................... 75 Hình 3.46. Biểu đồ so sánh hàm lƣợng MA4 và MA1 sau thời gian lƣu trữ ................. 76 . . vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số cấu trúc thành phần hóa học của cây Dâu tằm ................................... 6 Bảng 1.2. Một số chế phẩm chứa dâu tằm ..................................................................... 15 Bảng 2.1. Các loại mẫu cho thử nghiệm in vitro mô hình DPPH ................................. 24 Bảng 2.2. Thành phần các chất tham gia trong các mẫu thử nghiệm tr n đĩa 96 .......... 26 Bảng 3.1 Mức độ tƣơng đồng của mẫu L1 khi BLAST trên NCBI ............................... 30 Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của bột cành cây Dâu tằm ............................. 34 Bảng 3.3. Kết quả chiết xuất, sàng lọc tác dụng ức chế α-glucosidase của 12 tháng .... 35 Bảng 3.4. Tác dụng ức chế α-glucosidase của cao phân đoạn ở nồng độ 0,5 mg/ml và 0,25 mg/ml. .................................................................................................................... 36 Bảng 3.5. Các phân đoạn thu đƣợc từ cao EtOAc ......................................................... 38 Bảng 3.6. Kết quả tác dụng ức chế α-glucosidase của các phân đoạn ở nồng độ 0,5 mg/ml và 0,25 mg/ml. .................................................................................................... 39 Bảng 3.7. Các phân đoạn thu đƣợc từ SKC phân đoạn B2 ............................................ 41 Bảng 3.8. Kết quả cột Sephadex LH-20 phân đoạn B2.3 .............................................. 41 Bảng 3.9. Các phân đoạn thu đƣợc từ SKC phân đoạn B3 ............................................ 43 Bảng 3.10. Kết quả cột Sephadex LH-20 phân đoạn B3.2 ............................................ 43 Bảng 3.11. Kết quả sắc ký cột phân đoạn B3.2.3 .......................................................... 45 Bảng 3.12. Kết quả cột Sephadex LH-20 phân đoạn B3.3 ............................................ 46 Bảng 3.13. Các phân đoạn thu đƣợc từ SKC phân đoạn B4 .......................................... 47 Bảng 3.14. Các phân đoạn thu đƣợc từ SKC phân đoạn B4.2 ....................................... 47 Bảng 3.15. Các phân đoạn thu đƣợc từ SKC phân đoạn B4.2.3 .................................... 48 Bảng 3.16. Bảng dữ liệu phổ NMR của MT7 và trans-p-coumaric acid....................... 54 Bảng 3.17. Bảng dữ liệu phổ NMR của MT4 và moracin M ........................................ 56 Bảng 3.18. Bảng dữ liệu phổ NMR của MT6 và kuwanon C ........................................ 58 Bảng 3.19. Bảng dữ liệu phổ NMR của MT8 và morusin ............................................. 61 Bảng 3.20. Bảng dữ liệu phổ NMR của MT3 và kuwanon G........................................ 64 Bảng 3.21. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hoá của kuwanon G (MT3) ..................... 67 Bảng 3.22. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hoá của moracin M (MT4) ...................... 67 Bảng 3.23. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hoá của kuwanon C (MT6) ..................... 67 Bảng 3.24. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hoá của acid coumaric (MT7) ................. 68 . . viii Bảng 3.25. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hoá của morusin (MT8) .......................... 68 Bảng 3.26. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hoá của vitamin C ................................... 68 Bảng 3.27. IC50 của các chất tinh khiết đã phân lập đƣợc ............................................. 69 Bảng 3.28. Phần trăm ức chế α-glucosidase của kuwanon G (MT3) ............................ 70 Bảng 3.29. Phần trăm ức chế α-glucosidase của moracin M (MT4) ............................. 70 Bảng 3.30. Phần trăm ức chế α-glucosidase của kuwanon C (MT6) ............................. 70 Bảng 3.31. Phần trăm ức chế α-glucosidase của acid coumaric (MT7) ........................ 71 Bảng 3.32. Phần trăm ức chế α-glucosidase của morusin (MT8) .................................. 71 Bảng 3.33. Phần trăm ức chế α-glucosidase của acarbose ............................................ 71 Bảng 3.34. Bảng so sánh IC50 của các chất tinh khiết đã phân lập đƣợc ....................... 72 Bảng 3.35. Hàm lƣợng MA4 và MA1 có trong dƣợc liệu dâu tằm (%) ........................ 74 Bảng 3.36. So sánh hàm lƣợng MA4 và MA1 theo thời gian lƣu trữ ............................ 76 . . 1 MỞ ĐẦU Cây Dâu tằm (Morus alba L.) trong sách cổ của Trung Quốc đƣợc coi là loài cây quý, vừa có thể làm thuốc trị bệnh, vừa có thể làm thực phẩm bồi bổ cơ thể, mỹ phẩm. Đây là một cây thân g kinh tế quan trọng, có tác động đáng kể đến xã hội loài ngƣời do giá trị kinh tế trong ngành trồng dâu nuôi tằm cũng nhƣ lợi ích dinh dƣỡng và giá trị y học. Hiện nay, Dâu tằm đƣợc sử dụng nhiều trong các bài thuốc do có nhiều tác dụng nhƣ kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hóa, làm đẹp da, h trợ điều trị tiểu đƣờng,...[17]. Nhìn chung, Dâu tằm là một nguồn nguy n liệu đa chức năng với các đặc tính dƣợc phẩm đầy hứa hẹn. Nhận thấy tiềm năng to lớn trong y học của cây Dâu tằm, Bộ môn Dƣợc liệu – Đại học Y dƣợc TP. Hồ Chí Minh đã thực hiện hàng loạt đề tài nghiên cứu về cây Dâu tằm với kết quả đã phân lập đƣợc nhiều chất, hai trong số các chất đã phân lập đƣợc có tác dụng ức chế α-glucosidase mạnh nhất là moracin M với IC50 là 0,02 mg/ml và oxytrans-resveratrol với IC50 là 0,0101 mg/ml so với IC50 acarbose (Hebei Huarong Pharmaceutical Co., LTD – China) là 0,0151 mg/ml. Hai chất này đã đƣợc sử dụng làm chất đối chiếu để xây dựng phƣơng pháp định lƣợng chúng trong Dâu tằm và kết quả cho thấy bộ phận dùng có hàm lƣợng tác dụng cao nhất là rễ, trong đó hàm lƣợng moracin M cao nhất là mẫu rễ ở Huế 12/2016 (0,09%) và hàm lƣợng oxy-transresveratrol cao nhất là mẫu rễ ở B nh Định 3/2017 (0,88%). Hàm lƣợng moracin M và oxy-trans-resveratrol cũng cao trong mẫu dâu tằm ở Đức trọng, Lâm Đồng vào tháng 1/2018; đồng thời kết quả thử tác dụng ức chế α-glucosidase của mẫu này cũng cho kết quả rất tốt (IC50 = 1,013 µg/ml) [3]. Kết quả nghiên cứu sơ bộ về tính ổn định theo thời gian cũng cho thấy, có sự tƣơng quan nhất định giữa hàm lƣợng MA1 và oxy-trans-resveratrol với tác dụng ức chế αglucosidase. Trong điều kiện bảo quản ở nhiệt độ mát (12-15 oC, tránh sánh sáng), hàm lƣợng oxy-trans-resveratrol và moracin M giảm, đồng thời hoạt tính ức chế αglucosidase cũng giảm. Ngoài ra, nồng độ ở thân thay đổi nhiều hơn so với rễ giữa các tháng trong năm. . . 2 Để cung cấp bằng chứng khoa học về thành phần hoá học và tác dụng của Dâu tằm, cũng nhƣ tối ƣu hóa về năng suất, hiệu quả kinh tế trong khai thác, hoàn thiện những cơ sở kiến thức cho việc đƣa cao chiết chất lƣợng cao vào trong sản phẩm ph ng và h trợ điều trị bệnh đái tháo đƣờng, ch ng tôi đã lựa chọn và tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng chống oxy hoá, ức chế αglucosidase và động thái tích luỹ oxy-trans-resveratrol và Moracin M trong cành dâu tằm (Ramulus Mori albae) thu hái tại Bảo Lộc – Lâm Đồng”. Mục tiêu nghiên cứu bao gồm: 1. Thu hái mẫu cành Dâu tằm ở Bảo Lộc tỉnh Lâm Đồng từ tháng 1/2019 – 12/2019. 2. Khảo sát thành phần hóa học của phân đoạn có tác dụng oxi hoá và ức chế αglucosidase mạnh. 3. Phân lập hợp chất chính trong phân đoạn có tác dụng và xác định cấu trúc hóa học. 4. Theo dõi động thái tích lũy của oxy-trans-resveratrol và moracin M trong cây Dâu tằm theo thời gian thu hái bằng phƣơng pháp UPLC/PDA. . . 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1..1. TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.1.1. Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan [47], vị trí phân loại của chi Morus đƣợc trình bày nhƣ Hình 1.1. Giới : Plantae Ngành : Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp : Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp: Sổ (Dilleniidae) Bộ : Gai (Urticales) Họ : Dâu tằm (Moraceae) Chi : Morus Loài : Morus alba L. Hình 1.1. Vị trí phân loại của cây Dâu tằm 1.1.2. Đặc điểm chi Morus Chi Morus L. có khoảng 10 loài trên thế giới, trong đó Việt Nam có 4 loài, cây có tên là Dâu tằm gồm 2 loài trồng và mọc hoang dại ở vùng núi cao khoảng 1500 m. Loài dâu tằm đƣợc trồng hiện nay gồm nhiều giống, thích nghi với các vùng khí hậu khác nhau: Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên và một số vùng Ấn Độ… thích nghi với điều kiện của vùng ôn đới ấm hoặc cận nhiệt đới, mùa đông có băng giá. Các giống cây trồng ở Việt Nam và các nƣớc Đông Nam Á lại thích nghi với khí hậu nhiệt đới nóng và ẩm [1]. . . 4 Chi Morus L. có đặc điểm cây g nhỏ, lá hình tim hay 3 thùy, mép khía răng. Cây trồng lấy lá nuôi tằm, ăn quả. Chi Morus L. đƣợc phân loại rất phức tạp và vẫn c n tranh cãi. Hơn 150 loài đã đƣợc đặt t n nhƣng trong đó chỉ có 10-16 loài là đƣợc chấp nhận rộng rãi và phân bố ở Châu Á, Châu u, Châu Phi, và Bắc, Trung và Nam Mỹ [41]. Các loài sau đây đƣợc đa số nhà thực vật học chấp nhận:  - Morus alba L. – Dâu tằm trắng, dâu tằm thƣờng. Đông Á.  - Morus australis Poir. – Dâu tằm tàu. Đông Nam Á.   - Morus celtidifolia Kunth – Mexico.   - Morus insignis – Nam Mỹ.   - Morus mesozygia Stapf – Dâu châu Phi. Trung và nam châu Phi.  - Morus microphylla – Dâu Texas. Mexico, Texas (Hoa Kỳ).   - Morus nigra L. – Dâu tằm đen. Tây Nam Á.   - Morus rubra L. – Dâu tằm đỏ. Miền đông Bắc Mỹ.  1.1.3. Đặc điểm cây Dâu tằm T n gọi khác: Dâu ta, Dâu trắng, Dâu cang, tầm tang, mạy môn [2], [8]. T n tiếng Anh: White mulberry (Anh) T n khoa học: Morus alba L. Moraceae. Phân bố Loài Morus alba đƣợc nhà thực vật học Carl Linnaeus mô tả khoa học đầu ti n năm 1753. Cây Dâu tằm (Morus alba ) thuộc họ Moraceae có nguồn gốc từ Trung Quốc. Đã đƣợc đi vào Việt Nam từ lâu, hiện nay đƣợc trồng ở khắp nơi để lấy lá nuôi tằm, một số bộ phận đƣợc khai thác dùng làm thuốc [2]. Ở Việt Nam, tại Miền Bắc, dâu đƣợc trồng nhiều ở vùng bãi sông: sông Hồng, sông Đáy, sông Thái B nh. Ở Miền Nam, dâu đƣợc trồng nhiều ở tỉnh Lâm Đồng và đƣợc mọc hoang hoặc trồng rải rác ở đồng bằng song Cửu Long. Trong nhà dân, bà con thƣờng trồng một vài cây dâu vừa hàng rào vừa làm thuốc nam. Một số ngƣời cho rằng cây dâu có tác dụng kị tà. Trong nhà dân, bà con thƣờng trồng một vài cây dâu vừa làm hàng rào vừa làm thuốc nam [12]. Mô tả .