Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn clorororm của thân xáo tam phân (paramignya trimera) trồng ở đồng nai

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN CLORORORM CỦA THÂN XÁO TAM PHÂN (PARAMIGNYA TRIMERA) TRỒNG Ở ĐỒNG NAI Chủ nhiệm đề tài: TS. Phạm Đông Phương Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2019 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN CLORORORM CỦA THÂN XÁO TAM PHÂN (PARAMIGNYA TRIMERA) TRỒNG Ở ĐỒNG NAI Chủ nhiệm đề tài: TS. Phạm Đông Phương Ký tên Thành phố Hồ Chí Minh – 2019 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. MỤC LỤC I. ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………...........1 II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU …………...........3 2.1. Nguyên vật liệu, dung môi hóa chất và dụng cụ nghiên cứu……...........3 2.2. Phương pháp nghiên cứu……………………………………………….4 III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………………………………………….4 3.1. Chiết xuất và phân tách các phân đoạn………………………………..5 3.2. Khảo sát hệ dung môi phân tích cao cloroform……………………….6 3.3. Phân lập các chất trong cao CHCl3……………………………………7 3.4. Xác định cấu trúc các chất phân lập được……………………………12 III. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ…………………………………………………..17 IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………............18 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. I. ĐẶT VẤN ĐỀ: Cây Xáo tam phân có tên khoa học là Paramignyatrimera (Oliv.) Burkill, thuộc họ Cam (Rutaceae) phân bố chủ yếu ở Việt Nam và Thái Lan [12]. Tại Việt Nam, Xáo tam phân mọc chủ yếu ở Khánh Hòa, Ninh Thuận...Vào năm 2013, tin đồn Xáo tam phân chữa được năm loại bệnh ung thư nở rộ, người dân ở khắp nơi đã “đua nhau” tìm mua sử dụng, và xem đó như một “thần dược”. Do nhu cầu Xáo tam phân tăng cao, người dân ở các địa phương nói trên đã đổ xô đi thu hái Xáo tam phân trong tự nhiên để bán. Hệ quả của việc khai thác tràn lan này đã làm cho Xáo tam phân hầu như bị tận diệt trong tự nhiên. Do nhu cầu sử dụng Xáo tam phân cao nên một số người dân đã nghiên cứu nhân giống thành công và đã trồng khá tập trung trên các vùng đất ven đồi ở một vài huyện của tỉnh Đồng Nai. Việc trồng Xáo tam phân mang lại hiệu quả kinh tế khá cao, cây trồng khoảng 3-5 năm là có thể thu hoạch được. Hiện tại, trên thị trường giá của Xáo tam phân khá cao khoảng (5 – 6 triệu đồng/ kg rễ tươi loại tốt; 2 triệu đồng/ kg thân, lá tươi). Cho tới nay, các báo cáo về cây Xáo tam phân hầu như chỉ thực hiện chủ yếu trên rễ cây mọc tự nhiên về thực vật, hóa học, tác dụng dược lý và kiểm nghiệm với các nội dung cụ thể như sau: - Về thực vật: Báo cáo về hình thái và vi học của Xáo tam phân [18]. - Về hóa học: Đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của một số hợp chất thuộc nhóm coumarin, triterpenoid và acridon alkaloid [14], [7], [3], [16], [15], [6]. - Về tác dụng dược lí: Về tác dụng: Cao chiết methanol, phân đoạn n-hexan và hợp chất ostruthin phân lập từ Xáo tam phân có tác dụng ức chế tốt viêm gan cấp khi thử nghiệm trên nhuột nhắt trắng; có tác dụng ức chế và tiêu diệt đối với 5 dòng tế bào ung thư gồm: ung thư gan Hep-G2, ung thư đại tràng HTC116, ung thư vú MDA MB231, ung thư buồng trứng OVCAR-8 và ung thư cổ tử cung Hela, trong đó tác dụng mạnh nhất đối với ung thư cổ từ cung Hela và ung thư gan Hep-G2 nghiên cứu độc tính cấp, tác dụng bảo vệ gan, tác dụng gây độc một số dòng tế bào ung thư của Xáo tam phân [13]. - Về kiểm nghiệm: Đã có 2 công trình trong nước công bố về định lượng ostruthin [1] hoặc định lượng đồng thời ostruthin và 8-methoxxy ostruthin trong rễ Xáo tam phân bằng HPLC [5]. 1 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. Theo kinh nghiệm dân gian, bộ phận dùng chủ yếu của Xáo tam phân là rễ. Còn phần trên mặt đất của Xáo tam phân thì ít được sử dụng. Nếu phần thân cũng có tác dụng tốt như phần rễ thì sẽ càng nâng cao giá trị của cây Xáo tam phân.Vấn đề đặt ra là các bộ phận trên mặt đất có tác dụng không và thành phần hóa học của chúng như thế nào?. Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn clorororm của thân Xáo tam phân Paramignyatrimera (Oliv.) Burkill Rutaceae” được tiến hành góp phần giải đáp một phần câu hỏi ở trên. Đề tài được thực hiện với những nội dung sau: - Chiết xuất cao toàn phần từ thân Xáo tam phân thu hái tại Đồng Nai. - Tách cao toàn phần thành các các phân đoạn đơn giản hơn bằng phân bố lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần. - Phân lập và tinh chế các hợp chất trong phân đoạn CHCl3. - Xác định cấu trúc và định danh các hợp chất phân lập được. 2 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 3 II. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu, dung môi hóa chất và dụng cụ nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu Nguyên liệu là thân cây Xáo tam phân trồng 3 năm được lấy mẫu trực tiếp ở Đồng Nai. Sau khi thu hái, rửa sạch, thái lát mỏng (bằng máy thái dược liệu của cơ sở trồng trọt), sấy nhẹ cho khô và xay bột thô cho chiết xuất (Hình 1.). Thân xáo tam phân trồng ở Đồng Nai thái lát 2.1.2. Nguyên liệu, dung môi, hóa chất, thiết bị nghiên cứu Dung môi: cồn 96%, n-butanol, diethyl ether, n-hexan, cloroform, ethyl acetat, methanol,… dùng loại AR do Trung Quốc sản xuất. - Thuốc thử FeCl3 1% và KOH 5%/cồn, vanilin-sulfuric (VS) và một số hóa chất cơ bản khác. - Bản mỏng silica gel F254 tráng sẵn trên nền nhôm (Merck, Art. 1.05554). - Silica gel (HiMedia Laboratories) cỡ hạt 40-63 μm 2.1.3. Dụng cụ trang thiết bị: - Cột sắc ký: cột cổ điển (6 × 80 cm), cột sephadex LH-20 (2 × 60 cm), cột Sunfire C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm) và tiền cột Sunfire C18 (12,5 × 4,6 mm; 5 µm). - SKLM dùng bản silica gel F254 tráng sẵn trên nền nhôm (Merck, Art. 1.05554). - SKC dùng silica gel hạt vừa (Trung Quốc), cỡ hạt 40- 63µm và silica gel hạt mịn (Merck) cỡ hạt 15- 40µm). Máy cô quay Buchi R300 (Nhật Bản). Bể siêu âm Ultrasonic Bath (Đức). Tủ sấy Gallentkamp (Anh). Nồi cách thủy Memmert WB-14 (Đức). Cột sắc ký và các dụng 3 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 4 cụ thí nghiệm thông thường trong phòng thí nghiệm của Bộ môn Dược liệu và Phòng nghiên cứu hóa các hợp chất tự nhiên thuộc Trung tâm Đào tạo và nghiên cứu phát triển thuốc nguồn gốc tự nhiên – ĐH. Y Dược Tp. HCM. - Máy đo khối phổ (Micromass Quattro microTM API – Waters). - Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) BRUKER - AV - 500, tại Viện hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học công nghệ Việt nam - Hà nội. - Cột sắc ký: cột cổ điển (6 × 80 cm), cột sephadex LH-20 (2 × 60 cm), cột Sunfire C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm) và tiền cột Sunfire C18 (12,5 × 4,6 mm; 5 µm). - Phần mềm EMPOWER truy xuất hình ảnh, số liệu cho định tính, định lượng trên máy HPLC. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Chiết xuất và phân tách các phân đoạn - Bột thân Xáo tam phân được chiết ngấm kiệt với cồn 96%, cô thu hồi dung môi bằng áp suất giảm, thu được cao lỏng. - Cao lỏng được lắc phân bố với các dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần, bao gồm: n-hexan, cloroform, n-butanol, cô dưới áp suất giảm cho các cao tương ứng: n-hexan, cao cloroform, cao n-butanol và cao nước. Sử dụng cao CHCl3 để phân lập các hợp chất. 2.2.2. Khảo sát hệ dung môi phân tích cao cloroform - Tiến hành SKLM và khảo sát trên các hệ dung môi khác nhau - Chọn hệ dung môi phân tích cho kiểm tra các phân đoạn và chất tinh khiết - Chọn hệ dung môi cho SKC 2.2.4. Phân lập 2.2.4.1. SKC chân không (VLC): Điều kiện SK như trong phần thực nghiệm 2.2.4.2. Phân lập bằng SKC cổ điển: Điều kiện SK như trong phần thực nghiệm - Tinh chế: Các phân đoạn sau khi cô quay được kết tinh hay kết tinh phân đoạn trong lượng tối thiểu dung môi thích hợp (có gia nhiệt). Kiểm tra chất kết tinh trên SKLM với ít nhất 2 hệ dung môi khác nhau. 2.2.5. Kiểm tra độ tinh khiết trên SKLM: Điều kiện SK như trong phần thực nghiệm 4 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 5 2.2.6. Xác định cấu trúc các chất phân lập - Chất tinh khiết được phân tích bằng phương pháp phổ khối (MS), HPLC-PDA, NMR, so sánh đối chiếu với các dữ liệu về phổ NMR, MS của các chất tương tự đã công bố trong tài liệu. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo trên máy BRUKER – AV – 500, tại Viện hóa học thuộc Viện hàn lâm Khoa học công nghệ Việt nam – Hà nội. Mẫu được hòa tan trong CD3OD hoặc CD3COCD3 với TMS là chất chuẩn nội. Phổ proton (1H-NMR) được đo ở 500 MHz, phổ carbon (13C-NMR) được đo ở 125 MHz. Độ dịch chuyển hóa học được tính theo thang ppm (δTMS = 0) với chuẩn là tín hiệu của TMS. Các hằng số ghép (J) tính bằng Hertz (Hz). III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Chiết xuất và phân tách các phân đoạn Bột thân Xáo tam phân (5,3 kg) được chiết ngấm kiệt với cồn 96% (90 lít), cô thu hồi dung môi bằng áp suất giảm, thu được 430 ml cao lỏng (d = 1 g/ml). Cao lỏng được lắc phân bố với các dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần, bao gồm: nhexan, cloroform, n-butanol. Các dịch sau khi lắc phân bố được cô áp suất giảm cho các cao n-hexan (Ho, 36g), cao cloroform (19 g), cao n-butanol (39,7g) và cao nước (92g). Sơ đồ chiết xuất được trình bày ở Hình 3.1. 5 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 6 Hình 0.1. Sơ đồ chiết xuất thân xáo tam phân 3.2. Khảo sát hệ dung môi phân tích cao cloroform Tiến hành phân tích cao CHCl3 trên SKLM với các hệ dung môi khác nhau, phát hiện bằng soi UV 365, 254 nm và phun thuốc thử VS. Kết quả như bảng dưới đây: Bảng 0.1. Thăm dò hệ dung môi sắc kí phân tích cao cloroform Hệ dung môi Số vết Rf Khả năng tách Ghi chú 1 n-hexan 1 0 0 2 n-hexan – CHCl3 (2:8) 5 0,45 + Kéo vệt 3 n-hexan – EtOAc (6:4) 4 0,4 0 Kéo vệt 4 CHCl3 6 0,55 + Kéo vệt 5 EtOAc 5 0,8 + Kéo vệt 6 CHCl3 – EtOAc (9:1) 8 0,7 ++ Khá tốt 7 CHCl3 – EtOAc (8:2) 10 0,85 +++ Tốt 6 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 7 CHCl3 – EtOAc (7:3) 8 9 0,9 Khá tốt ++ Từ kết quả thăm dò trên, chọn hệ dung môi CHCl3 – EtOAc (8:2) làm hệ dung môi phân tích cho toàn bộ quá trình phân lập các chất trong cao CHCl3 3.3. Phân lập các chất trong cao CHCl3 Tiến hành phân lập các chất trong cao CHCl3 bằng sắc ký cột chân không (VLC). 3.3.1. Thăm dò dung môi cho VLC SKLM cao CHCl3 với 3 hệ dung môi: n-hexan – cloroform (5:5), n-hexan – CHCl3 (2:8) và CHCl3 (100%). Kết quả đã chọn hệ n-hexan – cloroform (5:5) có khả năng tách khá tốt các chất trong cao này. - Phát hiện: bằng soi UV 365 nm, UV 254 nm, thuốc thử VS Dựa vào UV 365 nm, đặt tên các vết chính có giá trị Rf từ cao đến Rf thấp trong hệ cloroform – EtOAc (8:2). Kết quả được trình bày trong Bảng 3.2. Bảng 0.2. Kết quả phân tách qua cột VLC Phân đoạn P (mg) 1-4 (I) 100 mg n-hexan – CHCl3 5-7 (II) 195 mg 2 3 4 (5 : 5) 8-9 (III) 110 mg 2 3 4 5 10-13 (IV) 280 mg 4 5 6 14-20 (V) 210 mg 4 5 21-24 (VI) 140 mg 25-27 (VII) 95 mg 28-32 (VIII) 420 mg 33-40 (IX) 360 mg n-hexan – CHCl3 41-45 (X) 450 mg (0:10) 4650 (XI) 360 Dung môi n-hexan – CHCl3 (4:6) n-hexan – CHCl3 (3:7) n-hexan – CHCl3 (2:8) n-hexan – CHCl3 (1:9) Thành phần chính 1 2 6 5 7 7 8 9 6 7 8 6 7 8 9 8 9 10 9 10 Tạp Nhận xét: - Phân đoạn V giàu vết 8 có thể tiếp tục phân lập chất bằng cột cổ điển. 7 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 8 - Phân đoạn VIII giàu vết 7, 9, 10 có thể tiếp tục phân lập qua cột cổ điển. - Phân đoạn IX giàu vết 9, 10 có thể tiếp tục phân lập qua cột cổ điển. - Các phân đoạn còn lại có thành phần phức tạp hay có khối lượng nhỏ. 3.3.2. Phân lập các chất từ phân đoạn V của VLC bằng cột cổ điển 1 (CĐ1) Thăm dò dung môi sắc ký: Phân đoạn V được sắc ký lớp mỏng với một số hệ dung môi và đã chọn được hệ dung môi n-hexan – EtOAc (6:4) có khả năng tách tốt cho các hợp chất trong phân đoạn 5 của cột VLC. Phân đoạn V được sắc ký cột cổ điển (SKC) với điều kiện: - - Cột 2×25 cm, nạp 12 g silica gel hạt vừa (40-63 μm) dạng hỗn dịch trong dung môi n-hexan – EtOAc (6:4). Mẫu thử: 210 mg phân đoạn V được hòa trong một lượng tối thiểu CHCl3, nhỏ từng giọt lên 200 mg silica gel hạt vừa (40-63 μm), trộn đều sấy trong tủ sấy chân không để tạo bột khô, tơi xốp và nạp mẫu khô. Pha động: n-hexan – EtOAc (6:4). Thể tích hứng mỗi phân đoạn 3 ml. Theo dõi thành phần của các phân đoạn bằng SKLM với dung môi khai triển là CHCl3-EtOAc (8:2), phát hiện bằng UV 254, 365 nm và thuốc thử VS. Gộp các phân đoạn chứa riêng chất 8. - Phát hiện: UV 254 nm, UV 365 nm, thuốc thử VS Kết quả sắc ký: Sau khi sắc ký thu được 7 phân đoạn (VA → VF), trong đó: - Phân đoạn VD (50 mg) có thành phần chính là chất 8, sẽ được xử lý tiếp tục để lấy chất tinh khiết. - Các phân đoạn khác có khối lượng nhỏ hay khá phức tạp, không tiếp tục xử lý. Tinh chế chất 8: Phân đoạn VD khi cô quay được tủa hình cầu gai vàu vàng xanh, kết tinh lại trong methanol được tinh thể hình cầu gai của chất 8, lọc và rửa với nhexan, MeOH lạnh thu được chất 8 (12 mg) ở dạng tinh khiết. Đặt tên là PT-T8. 3.3.2. Phân lập các chất từ phân đoạn VIII của VLC bằng cột cổ điển 2 (CĐ2) • Thăm dò dung môi sắc ký: Phân đoạn VIII được SKLM với nhiều hệ dung môi và đã chọn được dung môi n-hexan : EtOAc (6:4) chạy lặp lại có khả năng tách tốt. Phát hiện bằng UV 254, 365 nm và thuốc thử VS. • Tiến hành phân lập phân đoạn VIII trên sắc ký cột cổ điển với điều kiện: - 400 mg phân đoạn VIII được hòa trong một lượng tối thiểu CHCl3, nhỏ từng giọt 8 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 9 lên 400 mg silica gel hạt vừa (40-63 μm), trộn đều tạo bột khô, tơi, sấy trong tủ sấy chân không và nạp mẫu khô lên cột. - Cột SK, 2×25 cm, nạp 24 g silica gel hạt vừa (40-63 μm) dạng hỗn dịch trong dung môi n-hexan – EtOAc (6:4). - Pha động: n-hexan – EtOAc (6:4). Thể tích hứng mỗi phân đoạn 5 ml. - Theo dõi thành phần của các phân đoạn bằng SKLM với dung môi khai triển là CHCl3 – EtOAc (8:2), phát hiện bằng UV 254, 365 nm và thuốc thử VS. Gộp các phân đoạn chứa chất 9. - Phát hiện: UV 254 nm, UV 365 nm và thuốc thử VS - Kết quả sắc ký phân đoạn VIII: Thu được 9 phân đoạn VIIIA → VIIIG Nhận xét - Phân đoạn VIIID (80 mg) có thành phần chính là vết 9 sẽ được xử lý tiếp tục để lấy chất tinh khiết. - Các phân đoạn khác khá phức tạp, không tiếp tục xử lý. • Phân lập các chất từ phân đoạn VIIID của cột CĐ2 bằng SKC cổ điển - Thăm dò dung môi sắc ký: Phân đoạn VIIID được sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi và đã chọn được hệ dung môi CHCl3 : EtOAc (8:2), khai triển lặp lại 3 lần có khả năng tách tốt, phát hiện bằng UV 254, 365 nm, thuốc thử VS. Tiến hành phân lập phân đoạn VIIID trên SKC cổ điển 3 (SKC) với điều kiện: - Mẫu sắc ký: Phân đoạn VIIID (80 mg) được hòa trong một lượng tối thiểu dung môi CHCl3 - EtOAc (8:2) và nạp mẫu ướt. - Cột 1×20 cm, nạp 5 g silica gel hạt vừa (40-63 μm) dạng hỗn dịch trong dung môi CHCl3 : EtOAc (8:2). - Pha động: CHCl3 : EtOAc (8:2). Thể tích hứng mỗi phân đoạn 2 ml. - Tiến hành SKC và theo dõi thành phần của các phân đoạn trên SKLM với dung môi CHCl3 – EtOAc (6:4), phát hiện bằng UV 254, 365 nm và thuốc thử VS Gộp các phân đoạn chứa riêng chất 9. - Phát hiện: UV 254 nm, UV 365 nm, thuốc thử VS Kết quả: Sau khi SKC thu được 5 phân đoạn từ D1 đến D3, trong đó: - Phân đoạn D3 chứa chất 9 (20mg), kết tinh lại trong ethylacetat, lọc và rửa với n- 9 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 10 hexan, MeOH lạnh thu được chất 9 (10mg) ở dạng tinh khiết, đặt tên là PT-T9. - Các phân đoạn khác có khối lượng nhỏ hay khá phức tạp, không tiếp tục xử lý. 3.3.3. Phân lập các chất từ phân đoạn IX của cột VLC bằng cột cổ điển 4 (CĐ4) - Thăm dò dung môi sắc ký: Phân đoạn IX được sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi, chọn được dung môi CHCl3 : EtOAc (9:1) có khả năng tách tốt. Phát hiện bằng UV 254, 365 nm, thuốc thử VS. - Tiến hành phân lập phân đoạn IX trên SKC với với điều kiện như sau: - 350 mg IX được hòa trong một lượng tối thiểu dung môi CHCl3 : EtOAc (9:1), nạp cột theo phương pháp nạp mẫu ướt. - Cột 2×25 cm, nạp 21g silica gel hạt vừa (40-63 μm) dạng hỗn dịch (dung môi CHCl3 : EtOAc (9:1)). - Pha động: CHCl3 : EtOAc (9:1). Thể tích hứng mỗi phân đoạn 4 ml. Tiến hành SKC và theo dõi thành phần của các phân đoạn bằng SKLM với dung môi khai triển CHCl3 – EtOAc (7:3), phát hiện bằng UV 254, 365 nm. Gộp các phân đoạn chứa chủ yếu chất 10. - Phát hiện: UV 254 nm, UV 365 nm, thuốc thử VS Kết quả: Sau khi SKC thu được 7 phân đoạn (IXA→IXG), trong đó: - Phân đoạn IXD chứa chủ yếu chất 10 (90mg). - Các phân đoạn khác có khối lượng nhỏ hay khá phức tạp, không tiếp tục xử lý. 3.3.4. Phân lập các chất từ phân đoạn IXD của cột CĐ4 bằng cột cổ điển 5 (CĐ5) - Thăm dò dung môi sắc ký: Phân đoạn IXD được sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi, chọn được dung môi n-hexan : EtOAc (6:4) có khả năng tách tốt. Phát hiện bằng UV 254, 365 nm, thuốc thử VS. - Tiến hành phân lập Phân đoạn IXD được sắc ký cột cổ điển (SKC) với điều kiện: - 90 mg IXD được hòa trong một lượng tối thiểu CHCl3, nhỏ từng giọt lên một lượng tối thiểu silica gel hạt mịn vừa (40-63 μm), trộn đều tạo bột khô, tơi, sấy trong tủ sấy chân không. Mẫu sau đó được nạp khô vào cột. - Cột 1×20 cm, nạp 5 g silica gel hạt vừa (40-63 μm) dạng hỗn dịch trong dung môi n-hexan : EtOAc (6:4). - Pha động: C5 = n-hexan : EtOAc (6:4). Thể tích hứng mỗi phân đoạn 2 ml. Tiến hành phân lập trê SKC, theo dõi thành phần của các phân đoạn bằng SKLM với 10 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 11 dung môi khai triển n-hexan – EtOAc (3:7), phát hiện bằng UV 254, 365 nm và thuốc thử VS. Gộp các phân đoạn chỉ chứa chất 10. Kết quả:Sau khi sắc ký thu được 7 phân đoạn (Da→Dg), trong đó: - Phân đoạn Dc sau khi cô quay dung môi, thu được hợp chất PT9 (10 mg) có dạng dầu. Các phân đoạn khác khá phức tạp, không tiếp tục xử lý. Quá trình phân lập và tinh chế các chất từ cao cloroform của Thân Xáo tam phân được tóm tắt qua Hình 3.3. Hình 0.3. Tóm tắt quá trình phân lập các chất từ cao cloroform 11 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 12 3.3.4. Kiểm tra độ tinh khiết của PT-T8, PT-T9, PT-T10 Tiến hành: khai triển trên sắc kí lớp mỏng các chất phân lập được với các hệ dung môi P1, P2, P3 (Bảng 3.3.), phát hiện bằng UV 254, 365 nm và nhúng thuốc thử VS; PT-T8, PT-T9, PT-T10 chỉ cho 1 vết. Kết quả sắc ký thể hiện ở Hình 3.4. Bảng 0.3. Các hệ dung môi kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập Hệ dung môi PT-T8 PT-T9 PT-10 CHCl3– EtOAc (8:2) Rf = 0.355 Rf = 0.352 Rf = 0.253 n-hexan – EtOAc (6:4) Rf = 0.165 Rf = 0.175 Rf = 0.125 CHCl3 Rf = 0.125 Rf = 0.075 Rf = 0.05 Nhận xét: - Dưới UV 365 nm, PT-T8, PT-T9, PT-T10 phát quang xanh da trời. Khi tác dụng với thuốc thử VS, PT-T8 không cho màu, PT-T9 cho màu xanh lục nhạt, PT-T10 cho màu xanh dương nhạt. Có thể sơ bộ kết luận PT-T8, 9, 10 là coumarin. 3.4. Xác định cấu trúc các chất phân lập được 3.4.1. Xác định cấu trúc của hợp chất PT-T8 - PT-T8 thu được dưới dạng tinh thể hình cầu gai (trong methanol) có màu vàng xanh, tan tốt trong CHCl3, tan được trong ethyl acetat, tan vừa trong methanol, không tan trong n-hexan. - Dưới UV 254/365 nm; PT-T8 cho vết phát quang màu xanh da trời. PT-T8 không cho màu với thuốc thử VS. - Phổ UV của PT-T8 đo trong MeOH cho λmax ở 202,2 và 332,9 nm. - Phổ MS (kỹ thuật ESI) của PT-T8 cho mảnh m/z 245 tương ứng với ion [M−H]− [PL-4]. Phổ MS (kỹ thuật ESI) của PT-T8 cho mảnh m/z 247 tương ứng với ion [M+H]+ [PL-4]. Suy ra số khối của PT-T8 là M = 246. - Phổ NMR của PT-T8 cho thấy sự hiện diện của 14 tín hiệu carbon, trong đó: - 1 nhóm –CH3 (δC 17,7 ppm) - 2 nhóm >CH2 (δC 35,8; 110,1 ppm) - 5 nhóm =CH- (δC 73,4; 101,5; 111,2; 130,5 và 144,6 ppm) 12 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 13 - 6 carbon bậc 4, trong đó: 5 nhóm CIV sp3 (δC 110,8; 123,6; 147,9; 153,8; 159,4 ppm) và 1 nhóm >C=O (δC 160,6 ppm) - Các dữ liệu phổ NMR của PT-T8 được trình bày ở Bảng 3.4 Bảng 0.4. Dữ liệu phổ NMR của PT-T8 PT-T8 (DMSO-d6) C DEPT δc ppm δH ppm, m (J, Hz) HMBC (H → Cn) COSY (H → Hn) 2 C 160,6 − − − 3 CH 111,2 6,16 d (9,5) 2; 10 4 4 CH 144,6 7.89 d (9,5) 2, 9, 5, 10 3 5 CH 130,5 7,39 s 7; 9; 4; 8; 1’ − 6 C 123,6 − − − 2 C 159,4 − − − 8 CH 101,5 6,72 s 7; 9; 6; 10 − 9 C 153,8 − − − 10 C 110,8 − − − 1’ CH2 35,8 2,79 dd (13,5; 5) 2.61 dd (13.5; 7.5) 7; 3’; 5; 6; 2’ 2’ 2’ CH 73,4 4,18 m 3’; 4’; 1’; 5’; 6 1’ 3’ C 147,9 − − − 4’ CH2 110,1 4,77 m 4,68 m 2’; 5’; − 5’ CH3 17,7 1.72 s 3’; 4’; 2’ − 5' 2' 4' 3' HO 6 5 10 4 1' H HO 7 3 2 8 9 O 1 O Hình 0.4. Cấu trúc của PT-T8 Từ phân tích dữ liệu phổ MS và NMR của PT-T8, xác định chất này là 7-hydroxy6-(2’-hydroxy-3’-methylbut-3’-enyl)coumarin. Chất này đã được phân lập từ phần trên mặt đất trong cây Amyris balsamifera [21]. 3.4.2. Xác định cấu trúc của hợp chất PT-T9 - PT-T9 thu được dưới dạng bột vô định hình (trong ethylacetat) có màu vàng nhạt, 13 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 14 tan tốt trong CHCl3, tan vừa trong methanol và ethylaceatat, không tan trong nhexan. - Dưới UV 254/365 nm; PT-T9 cho vết phát quang màu xanh da trời. PT-T9 cho màu xanh lục nhạt với thuốc thử VS. - Phổ UV của PT-T9 đo trong MeOH cho λmax ở 203,4 và 334,1 nm [PL-2]. - Phổ MS (kỹ thuật ESI) của PT-T9 cho mảnh m/z 313 tương ứng với ion [M−H]− [PL-5]. Suy ra số khối của PT-T9 là M = 314. - Phổ NMR của PT-T9 cho thấy sự hiện diện của 19 tín hiệu carbon, trong đó: - 2 nhóm –CH3 (δC 16,1; 17,6 ppm) - 4 nhóm >CH2 (δC 27,3; 33,3; 35,3; 109,9 ppm) - 6 nhóm =CH- (δC 73,5; 101,6; 111,2; 121,5; 128,4 và 144,6 ppm) - 7 carbon bậc 4, trong đó: 6 nhóm CIV sp3 (δC 111; 125,6; 136; 148,2; 153,7; 159 ppm) và 1 nhóm >C=O (δC 160,6 ppm) - Dữ liệu phổ NMR của PT-T9 được trình bày ở Bảng 3.5. Bảng 0.5. Dữ liệu phổ NMR của PT-T9 PT-T9 (DMSO-d6) C DEPT δc ppm δH ppm, m (J, Hz) HMBC (H → Cn) COSY (H → Hn) 2 C 160,6 − − − 3 CH 111,2 6,16 d (9) 2; 10 4 4 CH 144,6 7.9 d (9,5) 2; 9; 5 3 5 CH 128,4 7,33 s 7; 9; 4; 1’ − 6 C 125,6 − 7 C 159,0 − − − 8 CH 101,6 6,74 s 7; 9; 6; 10 − 9 C 153,7 − − − 10 C 111 − − − 1’ CH2 27,3 3,24 d (7,5) 2’; 3’; 5; 6; 7 2’ 2’ CH 121,5 5,28 m 1’; 4’; 10’ 1’ 3’ C 136,0 − 4’ CH2 35,3 2,03 m 1,93 m 2’; 3’; 5’; 10’ 5’ 5’ CH2 33,3 1,51 m 4’; 6’ 4’; 6’ − − 14 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 15 6’ CH 73,5 3,84 m 8’ − 7’ C 148,2 − − − 8’ CH2 109,9 4,83 m 4,71 s 6’; 9’ − 9’ CH3 17,6 1,62 s 6’; 7’; 8’ − 10’ CH3 16,1 1,66 s 2’; 3’; 4’ − − -OH 4,68 d (4) 6’ − − -OH 10,61 s − − 9' 7' 8' HO 10' 2' 4' 6' 5' 6 3' 5 10 4 1' 2 H HO 3 7 8 9 O 1 O Hình 0.5. Cấu trúc của PT-T9 Từ phân tích dữ liệu phổ MS và NMR của PT-T9, xác định chất này là 6-(6’hydroxy-3’,7’-dimethylocta-2’,7’-dienyl)-7-hydroxycoumarin. Chất này đã được Nguyen Manh Cuong và cộng sự phân lập trong rễ cây Xáo tam phân [31]. 3.4.3. Xác định cấu trúc của hợp chất PT-T10 - PT-T10 thu được dưới dạng dầu (trong ethylacetat) có màu vàng nhạt, tan tốt trong CHCl3, tan vừa trong methanol và ethylaceatat, không tan trong n-hexan. - Dưới UV 254/365 nm; PT-T10 cho vết phát quang màu xanh da trời. PT-T10 cho màu xanh lục nhạt với thuốc thử VS. - Phổ UV của PT-T10 đo trong MeOH cho λmax ở 203,4 và 332,3 nm [PL-3]. - Phổ MS (kỹ thuật ESI) của PT-T10 cho mảnh m/z 313 tương ứng với ion [M−H]− [PL-6]. Suy ra số khối của PT-T10 là M = 314. - Phổ NMR của PT-T10 cho thấy sự hiện diện của 19 tín hiệu carbon, trong đó có: - 3 nhóm –CH3 (δC 15,9; 30,1 ppm) - 2 nhóm >CH2 (δC 27,4; 41,9 ppm) - 7 nhóm =CH- (δC 101,6; 111,3; 123,3; 123; 128,4; 140,8 và 144,6 ppm) - 7 carbon bậc 4, trong đó: 6 nhóm CIV sp3 (δC 68,8; 111; 125,5; 135,1; 153,7; 159 ppm) và 1 nhóm >C=O (δC 160,6 ppm 15 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 16 - Dữ liệu phổ NMR của PT-T10 được trình bày ở Bảng 3.6. Bảng 0.6. Dữ liệu phổ NMR của PT-T10 PT-T10 (DMSO-d6) C DEPT 2 C δc ppm 160,6 3 CH 4 δH ppm, m (J, Hz) HMBC (H → Cn) COSY (H → Hn) − − − 111,3 6,16 d (9,5) 2; 10 4 CH 144,6 7,88 d (9,5) 2; 9; 5 3 5 CH 128,4 7,33 s 7; 9; 4; 1’ − 6 C 125,5 − − − 7 C 159 − − − 8 CH 101,6 6,74 s 6; 7; 9; 10 − 9 C 153,7 − − − 10 C 111 − − − 1’ CH2 27,4 3,25 d (7) 2’; 3’; 5; 6; 10 2’ 2’ CH 122,3 5,32 m 1’; 4’; 10’ 1’ 3’ C 135,1 − − − 4’ CH2 41,9 2,65 d (7) 2’; 3’; 5’; 6’ 5’ 5’ CH 123 5.47 m 4’, 6’, 7’ 4’ 6’ CH 140,8 5,56 4’; 5’; 7’; 8’; 9’ − 7’ C 68,8 − − − 8’, 9’ 2 CH3 30,1 1.15 s 6’ ; 7’ − 10’ CH3 15,9 1,65 s 2’; 3’; 4’ − 10,62 s 6; 7; 8 − OH 9' HO 8' 10' 7' 2' 4' 6' 5' 3' 6 5 10 4 3 1' HO 2 7 8 9 O 1 O Hình 0.6. Cấu trúc của PT-T10 Từ phân tích dữ liệu phổ MS và NMR của PT-T10, xác định chất này là 6-(7′hydroxy-3′,7′-dimethylocta-2′,5′-dienyl)-7-hydroxycoumarin. Chất này đã được Makio Shibano và cộng sự phân lập trong cây Ligusticum involucratum [22]. 16 . Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. 17 IV. KẾT LUẬN Đề tài đã đạt được các kết quả sau: Chiết xuất: Từ 5,3 kg bột thân Xáo tam phân được chiết ngấm kiệt với cồn 96% (90 lít), cô thu hồi dung môi bằng áp suất giảm, thu được 430 ml cao lỏng. Cao lỏng được lắc phân bố với các dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần, cô áp suất giảm cho các cao tương ứng, bao gồm: n-hexan (36g), cao cloroform (19 g), cao n-butanol (39,7g) và cao nước (92g). Phân lập: Từ 17 g cao CHCl3, bằng các kỹ thuật sắc ký VLC, SKC trên Silica-gel và các phương pháp tinh chế phù hợp đã phân lập được 3 hợp chất ký hiệu là PT-T8 (12 mg), PT-T9 (10 mg) và PT-T10 (15 mg). Xác định cấu trúc Bằng các khảo sát phổ học (UV, MS, 1D- và 2D-NMR) đã xác định được cấu trúc hóa học của PT-T8, PT-T9 và PT-T10 lần lượt là 7-hydroxy-6-(2’-hydroxy-3’-methylbut-3’enyl) coumarin, 6-(6′-hydroxy-3′,7′-dimethylocta-2′,7′-dienyl)-7-hydroxycoumarin, 6-(7′hydroxy-3′,7′-dimethylocta-2′,5′-dienyl)-7-hydroxycoumarin và là chất clần đầu tiên được báo cáo trong thành phần của Xáo tam phân. Cả 3 chất đều thuộc nhóm coumarin có chung khung cấu trúc umbelliferon. Ba chất chỉ khác nhau cấu tạo mạch nhánh ở vị trí số 6 của khung umbelliferon. Đây là báo cáo đầu tiên về thành phần hóa học của phần thân cây Xáo tam phân vì chưa có công trình nghiên cứu nào về thân của cây này. 17 .