Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa của lá trâm mốc (folium syzygii cuminii (l.) skeels, myrtaceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH ----------------- LÊ NGỌC DANH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ TRÂM MỐC (Folium Syzygii cuminii (L.) Skeels, Myrtaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH ----------------- LÊ NGỌC DANH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ TRÂM MỐC (Folium Syzygii cuminii (L.) Skeels, Myrtaceae) Chuyên ngành: Dược học cổ truyền Mã số: 60 72 04 06 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. VÕ VĂN LẸO Thành phố Hồ Chí Minh – 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. i TÓM TẮT LUẬN VĂN Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ dược học – Năm học 2015 – 2017 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA LÁ TRÂM MỐC (Folium Syzygii cuminii (L.) Skeels) Lê Ngọc Danh Người hướng dẫn khoa học: TS. Võ Văn Lẹo Đặt vấn đề Trâm mốc, dân gian hay gọi là cây Vối rừng có tên khoa học là Syzygium cumini (L.) Skeels, họ Sim (Myrtaceae), là loại cây mọc hoang hoặc được trồng trong vườn làm cây cảnh, người dân hay dùng trái để ăn, vỏ thân, vỏ cành dùng chữa đau bụng, đầy chướng, táo bón, ăn không tiêu, nôn mửa, lỵ, tiêu chảy,…. Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như tác dụng dược lý của cây Trâm mốc. Đối tượng nghiên cứu Lá Trâm mốc, thu hái tại huyện Củ Chi,TP. Hồ Chí Minh vào tháng 10/2016. Phương pháp nghiên cứu Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các cao chiết phân đoạn và các chất phân lập được bằng mô hình đánh bắt gốc tự do DPPH. Sử dụng các phương pháp chiết xuất, phân bố lỏng – lỏng, sắc ký cột chân không và các phương pháp tinh chế để phân lập các chất tinh khiết từ các phân đoạn có tác dụng chống oxy hóa mạnh qua sàng lọc. Xác định cấu trúc các chất phân lập dựa vào dữ liệu khối phổ và phổ NMR. Kết quả và bàn luận Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa các cao phân đoạn bằng phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH Thử nghiệm trên DPPH được đo ở bước sóng λmax 517 nm sau thời gian phản ứng 30 phút. Kết quả cho thấy khả năng chống oxy hóa của các cao giảm dần theo thứ tự sau: cao ethyl acetat (HTCO là 94,50 %) > cao nước (HTCO là 20,58 %) > cao cồn ii (HTCO là 18,09 %) > cao cloroform (HTCO là 14,87 %) > cao n-hexan (HTCO là 6,45 %). Do đó cao ethyl acetat được chọn để khảo sát tiếp về thành phần hóa học. Chiết xuất – phân lập chất và xác định cấu trúc Bột lá Trâm mốc (10 kg) được chiết ngấm kiệt với cồn 80 % thu được cao cồn (3,45 kg). Từ cao cồn, chiết phân bố lỏng – lỏng lần lượt với các dung môi thu được cao n-hexan (17,6 g), cao cloroform (81,06 g) và cao ethyl acetat (236,26 g). Từ 100 g cao ethyl acetat, bằng kỹ thuật sắc ký cột chân không (VLC) đã phân lập được acid ellagic (502,3 mg), acid gallic (40,31 mg), myricetin (11,25 mg), bergenin (509,17 mg) và myricitrin (43,0 mg). IC50 của các chất phân lập được và của cao ethyl acetat được xác định và so sánh với acid ascorbic, kết quả như sau: myricitrin (3,834 µg/ml) < acid ascorbic (2,454 µg/ml) < cao ethyl acetat (2,273 µg/ml) < myricetin (1,589 µg/ml) < acid ellagic (0,755 µg/ml) < acid gallic (0,656 µg/ml). Riêng bergenin hầu như không có hoạt tính chống oxy hóa. Như vậy khả năng chống oxy hóa sẽ theo thứ tự sau: acid gallic (0,656 µg/ml) > acid gllagic (0,755 µg/ml) > myricetin (1,589 µg/ml) > cao ethyl acetat (2,273 µg/ml) > acid ascorbic (2,454 µg/ml) > myricitrin (3,834 µg/ml). Kết luận Từ cao ethyl acetat đã thu được 5 chất tinh khiết acid ellagic, acid gallic, myricetin, bergenin và myricitrin. Trong đó, có 3 chất là acid ellagic, acid gallic, myricetin có hoạt tính chống oxy hóa mạnh hơn so với chất đối chiếu acid ascorbic. Các kết quả nghiên cứu thu được từ Luận văn này còn góp phần nâng cao giá trị sử dụng lá Trâm mốc vào mục đích chữa bệnh và giúp định hướng cho những nghiên cứu tiếp theo về hóa học cũng như tác dụng dược lý sau này. iii Thesis of master of pharmacy, course: 2015 – 2017 Major: Pharmacognosy – Traditional Pharmacy BIOACTIVE-GUIDED ISOLATION FOR THE ANTIOXIDANT CONSTITUENTS OF SYZYGUIM CUMINI. Le Ngoc Danh Supervisor: Dr. Vo Van Leo Introduction Syzygium cumini (L.) Skeels belongs to the family Myrtaceae. It has not been used as a medicine in Vietnam, but in Mediterranean, its leaves have been often used for the treatment of stomachache, flatulent, constipation, vomit, dysentery and diarrhea. The reports showed the leaf contains flavonoids, tannin, such as myricitrin, myricetin, acid ellagic, acid gallic. In Vietnam, there is no research on the chemical compositions and the pharmacological activities of the leaves of this plant. As a result, our aim in this research is to isolate substances for the antioxidant acitivity on DPPH of the folium Syzygii cuminii (L.) Skeels. Materials: Folium Syzygii cuminii (L.) Skeels, collected in October, 2016. Methods In-vitro screening of fractions and isolated compounds for the antioxidant activity on DPPH assay. Distribution of liquid-liquid extraction, vacuum liquid chromatography and other refined methods for the isolated compounds and fractions having strong antioxidant effects. Structure elucidation was based on NMR and MS method. Results and discussions Screening the antioxidant activity in-vitro by DPPH assay DPPH method was performed at λmax 517 nm after the reaction of 30 minutes. The results showed that the antioxidant activity of extracts was as follows: ethyl acetate extract (94,50 %) > water extract (20,58 %) > chloroform extract (14,87 %) > nhexane extract (6,45 %). Therefore, ethyl acetate extract was chosen for isolation later. iv Extraction, isolation and structure elucidation 10 kg of the leaves powder of Syzygium cumini (L.) Skeels was extracted with 80 % alcohol to obtain 3,45 kg of extract. Alcohol extract was successively portioned with solvents to obtain n-hexane extract (17,6 g), chloroform extract (81,06 g) and ethyl acetate extract (236,26 g). From 100 g of the ethyl acetat extract, by vacuum liquid chromatography, 5 substances were obtained: acid ellagic (502,3 mg), acid gallic (40,31 mg), myricetin (11,25 mg), bergenin (509,17 mg) and myricitrin (43,0 mg). IC50 values of isolated substances and ethyl acetate extract comparing with ascorbic acid were as follows: myricitrin (3,834 µg/ml) < acid ascorbic (2,454 µg/ml) < cao ethyl acetat (2,273 µg/ml) < myricetin (1,589 µg/ml) < acid ellagic (0,755 µg/ml) < acid gallic (0,656 µg/ml). Bergenin has no effect. Therefore, their antioxidant activities were as follows: acid gallic (0,656 µg/ml) > acid ellagic (0,755 µg/ml) > myricetin (1,589 µg/ml) > cao ethyl acetat (2,273 µg/ml) > acid ascorbic (2,454 µg/ml) > myricitrin (3,834 µg/ml). Conclusion Acid ellagic, acid gallic, myricetin, bergenin and myricitrin were obtained from ethyl acetate extract. Among them, the antioxidant effect of acid ellagic, acid gallic, myricetin is stronger than ascorbic acid. The results also support the value of Syzygium cumini (L.) Skeels in healing purposes and help for the further researches on chemical analyses and pharmacological effects in the future. v LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong Khoa Dược và Bộ môn Dược Liệu - Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện, tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cũng như kinh nghiệm quý báu để em có thể hoàn thành tốt Luận văn này. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy TS. Võ Văn Lẹo. Thầy đã luôn quan tâm, tận tình chỉ bảo em dù cho trong quá trình thực hiện em còn nhiều thiếu sót. Thầy đã giúp em có thêm niềm đam mê với nghiên cứu khoa học và truyền đạt cho em rất nhiều kinh nghiệm sống để em có thể tiếp tục theo đuổi ước mơ của mình. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy TS. Nguyễn Viết Kình, đã tận tình giảng giải, giúp đỡ cho em trong phần biện luận phổ NMR, thầy đã cho em thấy được cách làm việc và tư duy khoa học, rõ ràng, trách nhiệm với công việc mình làm. Xin gởi lời cảm ơn đến ThS. Huỳnh Lời, ThS. Lê Văn Huấn đã luôn giúp đỡ khi tôi gặp khó khăn. Xin gởi lời cảm ơn đến DS. Trần Anh Tú đã đồng hành với tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận văn. Xin gởi lời cảm ơn đến các chị Liên, chị Xuyến, chị Châu, chị Lan, chị Giang đã tạo điều kiện tốt nhất cho chúng tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận văn. Xin cảm ơn tất cả các bạn cùng lớp cao học Dược học cổ truyền khóa 2015 – 2017 đã động viên, giúp đỡ và chia sẻ những vui buồn cùng nhau trong suốt quá trình học tập. vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................v MỤC LỤC ................................................................................................................. vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ..................................................... ix DANH MỤC CÁC BẢNG..........................................................................................x DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................ xii ĐẶT VẤN ĐỀ .............................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC ...............................................................3 1.1.1 Đặc điểm của họ Myrtaceae (Họ Sim) ...............................................................3 1.1.2 Đặc điểm về thực vật học của cây Trâm mốc ....................................................4 1.2 TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC ................................................7 1.2.1 Tổng quan về thành phần hóa học chi Syzygium ................................................7 1.2.2 Tổng quan thành phần hóa học của Syzygium cumini ......................................13 1.3 TÁC DỤNG VÀ CÔNG DỤNG CỦA CÂY TRÂM MỐC ............................17 1.3.1 Tác dụng dược lý ..............................................................................................17 1.3.2 Thử độc tính .....................................................................................................21 1.3.3 Tính vị, công năng ............................................................................................21 1.3.4 Công dụng ........................................................................................................21 1.3.5 Bài thuốc có cây Trâm mốc ..............................................................................21 1.4 TỔNG QUAN VỀ GỐC TỰ DO VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA .....22 1.4.1 Đại cương về gốc tự do ....................................................................................22 1.4.2 Bản chất hóa học của gốc tự do ........................................................................23 1.4.3 Sự liên quan của gốc tự do và bệnh tật con người ...........................................23 1.4.4 Các chất chống oxy hóa....................................................................................25 1.4.5 Tác động chống oxy hóa của flavonoid............................................................26 1.4.6 Thử nghiệm đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro ...................................26 1.4.7 Thử nghiệm đánh giá khả năng đánh bắt gốc tự do bằng DPPH .....................27 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 29 vii 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ..........................................................................29 2.1.1 Nguyên liệu ......................................................................................................29 2.1.2 Nơi thực hiện đề tài ..........................................................................................29 2.1.3 Dung môi và hóa chất .......................................................................................29 2.1.4 Dụng cụ, trang thiết bị ......................................................................................29 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................30 2.2.2 Nghiên cứu thực vật học...................................................................................31 2.2.3 Thử tinh khiết ...................................................................................................31 2.2.4 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật ..........................................................32 2.2.5 Chiết xuất cao toàn phần ..................................................................................32 2.2.6 Tách các phân đoạn bằng chiết phân bố lỏng – lỏng .......................................33 2.2.7 Phương pháp sàng lọc tác dụng chống oxy hóa trên mô hình in vitro .............33 2.2.8 Phân lập và tinh chế các chất từ cao có tác dụng chống oxy hóa .....................34 2.2.9 Xác định cấu trúc của hợp chất phân lập được.................................................36 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................ 38 3.1 NGHIÊN CỨU THỰC VẬT HỌC ..................................................................38 3.1.1 Đặc điểm hình thái lá Trâm mốc ......................................................................38 3.1.2 Vi phẫu lá Trâm mốc ........................................................................................38 3.1.3 Tách biểu bì ......................................................................................................43 3.1.4 Soi bột ...............................................................................................................43 3.2 THỬ TINH KHIẾT ..........................................................................................44 3.3 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC ..............................................................................44 3.3.1 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật ...........................................................44 3.3.2 Chiết xuất và phân lập các chất từ cao có tác dụng chống oxy hóa .................49 3.3.3 Kiểm tra khả năng chống oxy hóa của các cao chiết phân đoạn ......................52 3.3.4 Phân lập chất từ cao ethyl acetat bằng VLC ....................................................54 3.3.5 Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập được bằng SKLM ............................58 3.3.6 Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập được bằng UPLC .............................60 3.3.7 Xác định cấu trúc của hợp chất phân lập được.................................................65 viii 3.4 KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỒNG OXY HÓA TRÊN CHẤT TINH KHIẾT ............................................................................................................87 3.4.1 Định tính bằng SKLM ......................................................................................87 3.4.2 Thử HTCO trên các chất phân lập bằng phương pháp DPPH .........................88 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN – KẾT LUẬN– ĐỀ NGHỊ ........................................ 96 4.1 BÀN LUẬN......................................................................................................96 4.2 KẾT LUẬN ......................................................................................................97 4.3 ĐỀ NGHỊ ..........................................................................................................98 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................99 ix DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 25 26 27 28 29 30 31 32 Chữ tắt 13 C-NMR Chữ nguyên 13 C-Nuclear Magnetic Resonance 1 1 H-NMR H-Nuclear Magnetic Resonance BHA Butylated hydroxyanisol BHT Butylated hydroxytoluen d doublet DĐVN Dược điển Việt Nam DEPT Distortionless Enhancement by polarization Transfer DPPH 1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl EA /EtOAc Ethyl acetat HPLC High performance liquid chromatography HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HSQC Heteronuclear SpectroscopyQuantum Coherence HTCO Hoạt tính chống oxy hóa IC50 Inhibitor concentration 50% m multiplet MDA Malonyl dialdehyd MeOH Methanol MS Mass Spectroscopy NMR Nuclear Magnetic Resonance PDA Photodiode Array s singlet SKC Sắc ký cột SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng t triplet TLTK Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử UV-Vis Ultraviolet and Visible VLC Vacuum Liquid Chromatography FeCl3 5% FeCl3 5% /cồn 96% VS Vanillin - acid sulfuric Ý nghĩa Cộng hưởng từ hạt nhân 13 C Cộng hưởng từ hạt nhân proton Đỉnh đôi Sắc ký lỏng hiệu năng cao Nồng độ ức chế 50% Nhiều đỉnh Khối phổ Cộng hưởng từ hạt nhân Dãy diod quang Đỉnh đơn Đỉnh ba Tử ngoại khả kiến Sắc ký cột chân không x DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Cấu trúc của một số triterpenoid....................................................................... 7 Bảng 1.2 Cấu trúc của một số hợp chất steroid ............................................................... 8 Bảng 1.3 Cấu trúc của một số hợp chất tannin ................................................................ 8 Bảng 1.4 Cấu trúc của một số hợp chất flavanon ............................................................ 9 Bảng 1.5 Cấu trúc của một số hợp chất flavan-3-ol ....................................................... 10 Bảng 1.6 Cấu trúc của một số hợp chất chalcon ............................................................ 10 Bảng 1.7 Cấu trúc của một số hợp chất chalcon từ nụ Cleistocalyx operculatus (Syzygium nervosum) ...................................................................................... 11 Bảng 1.8 Cấu trúc của một số hợp chất flavonol ........................................................... 12 Bảng 1.9 Cấu trúc của một số hợp chất khác ................................................................. 12 Bảng 1.10 Cấu trúc của một số hợp chất triterpenoid trong cây Trâm mốc .................... 13 Bảng 1.11 Cấu trúc của một số hợp chất tannin trong cây Trâm mốc ............................. 14 Bảng 1.12 Cấu trúc của một số hợp chất flavonoid trong cây Trâm mốc ....................... 14 Bảng 1.13 Cấu trúc một số hợp chất phenol trong hạt ..................................................... 16 Bảng 1.14 Cấu trúc một số hợp chất monoterpenoid trong hạt ....................................... 17 Bảng 2.1 Cách pha mẫu đo của phương pháp DPPH .................................................... 34 Bảng 3.1 Kết quả thử tinh khiết của bột lá Trâm mốc ................................................... 44 Bảng 3.2 Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật lá Trâm mốc ..................... 45 Bảng 3.3 Kết quả chiết phân bố cao cồn ........................................................................ 51 Bảng 3.4 Kết quả thử nghiệm HTCO bằng phương pháp DPPH trên các mẫu cao ...... 53 Bảng 3.5 Các phân đoạn của cao ethyl acetat thu được qua VLC ................................. 55 Bảng 3.6 Các hệ dung môi kiểm tra độ tinh khiết của SY-1, SY-2, SY-3, SY-4, SY-5 58 Bảng 3.7 Kết quả phân tích UPLC của SY-1, SY-2, SY-3, SY-4, SY-5 ....................... 65 Bảng 3.8 So sánh dữ liệu phổ NMR của SY-1 và acid ellagic đo trong DMSO-d6....... 67 Bảng 3.9 So sánh dữ liệu phổ NMR của SY-2 và acid gallic. ....................................... 71 Bảng 3.10 So sánh dữ liệu phổ NMR của SY-3 và myricetin. ........................................ 75 Bảng 3.11 So sánh dữ liệu phổ NMR của SY-4 và bergenin........................................... 79 Bảng 3.12 So sánh dữ liệu phổ NMR của SY-5 và myricitrin......................................... 84 Bảng 3.13 Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa trên cao ethyl acetat............................. 88 Bảng 3.14 Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa trên acid ascorbic ................................ 89 Bảng 3.15 Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa trên acid ellagic ................................... 90 xi Bảng 3.16 Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa trên acid gallic ..................................... 91 Bảng 3.17 Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa trên myricetin ...................................... 92 Bảng 3.18 Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa trên myricitrin ..................................... 93 Bảng 3.19 Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa trên bergenin ....................................... 94 Bảng 3.20 Bảng so sánh IC50 của các chất tinh khiết: ..................................................... 95 xii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ vị trí của cây Trâm mốc trong hệ thống phân loại thực vật ................... 4 Hình 1.2 Cây Trâm mốc (Syzygium cumini (L.) Skeels, Myrtaceae) .............................. 6 Hình 1.3 Cành, hoa và quả của cây Trâm mốc (Syzygium cumini (L.) Skeels, Myrtaceae) ........................................................................................................ 6 Hình 1.4 Phản ứng trung hòa gốc DPPH. ...................................................................... 27 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu chung ................................................................................. 30 Hình 2.2 Sơ đồ chiết xuất cao cồn toàn phần lá Trâm mốc ........................................... 32 Hình 3.1 Lá Trâm mốc Syzygium cumini (L.) Skeels Myrtaceae .................................. 38 Hình 3.2 Vi phẫu lá Trâm mốc (4X) ............................................................................. 39 Hình 3.3 Sơ đồ vi phẫu lá Trâm mốc............................................................................. 39 Hình 3.4 Vi phẫu thân Trâm mốc (4X) ......................................................................... 39 Hình 3.5 Sơ đồ vi phẫu thân Trâm mốc......................................................................... 39 Hình 3.6 Vi phẫu chi tiết lá Trâm mốc .......................................................................... 40 Hình 3.7 Vi phẫu chi tiết cuống lá Trâm mốc ............................................................... 41 Hình 3.8 Vi phẫu chi tiết thân Trâm mốc ...................................................................... 42 Hình 3.9 Biểu bì dưới .................................................................................................... 43 Hình 3.10 Biểu bì trên ..................................................................................................... 43 Hình 3.11 Tinh thể calci oxalat hình cầu gai ở biểu bì dưới ........................................... 43 Hình 3.12 Các cấu tử có trong bột lá Trâm mốc ............................................................. 44 Hình 3.13 Sơ đồ chiết xuất bột lá Trâm mốc................................................................... 49 Hình 3.14 Sơ đồ chiết phân bố lỏng – lỏng với cao cồn Trâm mốc ................................ 50 Hình 3.15 Sắc ký lớp mỏng cao phân đoạn ..................................................................... 51 Hình 3.16 Sắc ký đồ của các cao phân đoạn Trâm mốc với TT DPPH........................... 52 Hình 3.17 Biểu đồ kết quả thử HTCO của các phân đoạn cao chiết ............................... 53 Hình 3.18 Kết quả thăm dò hệ dung môi cho VLC trên sắc ký lớp mỏng ...................... 54 Hình 3.19 Sắc ký đồ các phân đoạn của cao ethyl acetat qua cột VLC .......................... 56 Hình 3.20 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ các phân đoạn cột VLC ................................ 57 Hình 3.21 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của SY-1, SY-2, SY-3, SY-4, SY-5 ........... 59 Hình 3.22 Sắc ký đồ UPLC kiểm tra độ tinh khiết của SY-1 .......................................... 60 Hình 3.23 Sắc ký đồ UPLC kiểm tra độ tinh khiết của SY-2 .......................................... 61 Hình 3.24 Sắc ký đồ UPLC kiểm tra độ tinh khiết của SY-3 .......................................... 62 xiii Hình 3.25 Sắc ký đồ UPLC kiểm tra độ tinh khiết của SY-4 .......................................... 63 Hình 3.26 Sắc ký đồ UPLC kiểm tra độ tinh khiết của SY-5 .......................................... 64 Hình 3.27 Phổ MS (MS-) của SY-1 ................................................................................. 65 Hình 3.28 Phổ UV (MeOH) của SY-1 ............................................................................ 66 Hình 3.29 Cấu trúc hóa học của SY-1 (acid ellagic) ....................................................... 68 Hình 3.30 Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của SY-1 ............................................ 68 Hình 3.31 Phổ DEPT (DMSO-d6, 125 MHz) của SY-1 .................................................. 69 Hình 3.32 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của SY-1 ............................................. 69 Hình 3.33 Phổ MS (MS-) của SY-2 ................................................................................. 70 Hình 3.34 Phổ UV (MeOH) của SY-2 ............................................................................ 70 Hình 3.35 Cấu trúc của SY-2 (acid gallic). ..................................................................... 71 Hình 3.36 Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của SY-2 ............................................ 72 Hình 3.37 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của SY-2 ............................................. 72 Hình 3.38 Phổ DEPT (DMSO-d6, 125 MHz) của SY-2 .................................................. 73 Hình 3.39 Phổ MS (MS-) của SY-3 ................................................................................. 73 Hình 3.40 Phổ UV (MeOH) của SY-3 ............................................................................ 74 Hình 3.41 Cấu trúc của SY-3 (myricetin) ....................................................................... 75 Hình 3.42 Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của SY-3 ............................................ 76 Hình 3.43 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của SY-3 ............................................. 76 Hình 3.44 Phổ DEPT (DMSO-d6, 125 MHz) của SY-3 .................................................. 77 Hình 3.45 Phổ MS (MS-) của SY-4 ................................................................................. 77 Hình 3.46 Phổ UV (MeOH) của SY-4 ............................................................................ 78 Hình 3.47 Cấu trúc của SY-4 (bergenin). ........................................................................ 80 Hình 3.48 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của SY-4 ............................................. 80 Hình 3.49 Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của SY-4 ............................................ 81 Hình 3.50 Phổ DEPT (DMSO-d6, 125 MHz) của SY-4 .................................................. 81 Hình 3.51 Phổ MS (MS-) của SY-5 ................................................................................. 82 Hình 3.52 Phổ UV (MeOH) của SY-5 ............................................................................ 82 Hình 3.53 Cấu trúc của SY-5 (myricitrin) ....................................................................... 85 Hình 3.54 Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) của SY-5 ............................................ 85 Hình 3.55 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) của SY-5 ............................................. 86 Hình 3.56 Phổ DEPT (DMSO-d6, 125 MHz) của SY-5 .................................................. 86 xiv Hình 3.57 Sắc ký đồ của các chất được phân lập với TT DPPH ..................................... 87 Hình 3.58 Hoạt tính chống oxy hóa trên cao ethyl acetat................................................ 89 Hình 3.59 Hoạt tính chống oxy hóa trên acid ascorbic ................................................... 90 Hình 3.60 Hoạt tính chống oxy hóa trên acid ellagic ...................................................... 91 Hình 3.61 Hoạt tính chống oxy hóa trên acid gallic ........................................................ 92 Hình 3.62 Hoạt tính chống oxy hóa trên myricetin ......................................................... 93 Hình 3.63 Hoạt tính chống oxy hóa trên myricitrin ........................................................ 94 Hình 3.64 Biểu đồ so sánh IC50 của các mẫu thử theo phương pháp DPPH ................... 95 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Xã hội ngày càng phát triển thì tuổi thọ và dân số cũng ngày càng tăng lên từ đó dẫn đến nhiều vấn đề cần phải giải quyết như vấn đề về lương thực, thực phẩm, bệnh tật,… Do đó, nghiên cứu và phát triển các thuốc mới giúp con người chống lại bệnh tật, nâng cao sức khỏe là nhiệm vụ quan trọng của các nhà dược học. Có nhiều con đường tìm ra thuốc mới như tổng hợp hóa học, mô hình trên máy tính, sàng lọc tác dụng sinh học từ dược liệu. Ngày nay việc sử dụng các cây cỏ có nguồn gốc dược liệu để làm thuốc chữa bệnh đang là một xu hướng toàn cầu. Con người đang quay về với thiên nhiên, phát huy hết các tiềm năng của thiên nhiên để phục vụ cho nhu cầu bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cho con người. Việt Nam vốn được đánh giá là nước có nguồn dược liệu tự nhiên phong phú và đa dạng về chủng loại lẫn công dụng làm thuốc. Đất đai và khí hậu phù hợp với nhiều loài cây trồng, trong đó có nhiều loài cây thuốc quý xuất xứ từ các nguồn khác nhau. Để phát huy hết các lợi thế và tiềm năng về nguồn dược liệu to lớn này và cũng tiếp nối truyền thống sử dụng cây thuốc có tác dụng chữa bệnh có từ rất lâu đời của ông cha ta, rất nhiều nhà nghiên cứu đã và đang tiến hành rất nhiều các phương pháp hiện đại để chiết tách, phân lập được các thành phần hóa học có trong dược liệu kết hợp với phương pháp thử hoạt tính sinh học để chứng minh một cách khoa học những chất trong dược liệu có tác dụng làm thuốc. Bên cạnh những dược liệu có tác dụng làm thuốc đã được các nhà khoa học nghiên cứu có cơ sở khoa học thì cũng còn có rất nhiều cây mà người dân hay dùng làm rau ăn để thanh nhiệt, giải độc và chữa các bệnh thông thường mà vẫn chưa được nhiều sự quan tâm để phân tích các thành phần hóa học có trong nó, trong số có cây Trâm mốc. Trâm mốc, dân gian hay gọi là cây Vối rừng có tên khoa học là Syzygium cumini (L.) Skeels, họ Sim (Myrtaceae), là loại cây mọc hoang hoặc được trồng trong vườn làm cây cảnh, người dân hay dùng trái để ăn, vỏ thân, vỏ cành dùng chữa đau bụng, đầy chướng, táo bón, ăn không tiêu, nôn mửa, lỵ, tiêu chảy,…. Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như tác dụng dược lý của cây Trâm mốc. Vì vậy trong phạm vi đề tài này chúng tôi đặt vấn đề khảo sát lá Trâm mốc nhằm bước đầu chứng minh giá trị sử dụng của cây này với đề tài mang tên: “Khảo sát 2 thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa của lá cây Trâm mốc (Folium Syzygii cuminii (L.) Skeels, Myrtaceae)” với các mục tiêu sau: - Thử tác dụng chống oxy hóa in vitro bằng phương pháp đánh bắt gốc tự do DPPH của các cao chiết từ lá cây Trâm mốc. - Phân lập và xác định cấu trúc của các chất chính từ cao có tác dụng chống oxy hóa mạnh qua sàng lọc trên mô hình đánh bắt gốc tự do DPPH. - Thử hoạt tính chống oxy hóa của chất tinh khiết thu được sau khi phân lập. 3 CHƯƠNG 1. 1.1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.1.1 Đặc điểm của họ Myrtaceae (Họ Sim) Thân: gỗ, cây nhỏ, vừa hay to và có khi rất cao như cây Bạch đàn (100 – 150 m). Lá: đơn, mọc đối, không có lá kèm. Phiến nguyên, dày, cứng, có thể có nhiều chấm trong mờ do túi tiết tạo ra. Hình dạng và vị trí của lá có thể thay đổi tùy theo cành non hay già (Eucaluptus globulus). Cụm hoa: hoa có thể mọc riêng lẻ hay tụ thành chùm, chùm – xim, xim ở nách lá hay ngọn cành. Hoa: đều, lưỡng tính, mẫu 5 hay mẫu 4, kiểu vòng, đế hoa hình ống hay hình chén. Bao hoa: lá đài và cánh hoa có thể rời hay dính nhau thành một chóp, bị hất tung ra ngoài khi hoa nở chỉ còn để lại một sẹo tròn, chóp này đặc sắc của họ. Ở một vài chi, chóp chỉ do tràng hoa tạo thành vì đài rất nhỏ (Eucaluptus). Bộ nhị: nhị xếp trên 2 vòng, nhưng kiểu này chỉ còn gặp ở vài chi (Verticordia), thông thường nhị phân nhánh và hợp lại thành 2 kiểu khác nhau: nhiều nhị rời xếp không thứ tự quanh miệng của đế hoa (Eucaluptus, Eugeniia, Rhodamnia, Rhodomyrtus) hoặc nhị hợp thành nhiều bó (Melaleuca). Bộ nhụy: số lá noãn bằng số cánh hoa hoặc ít hơn, dính nhau thành bầu dưới, nhiều ô, mỗi ô nhiều noãn, đính noãn trung trụ, 1 vòi nhụy và 1 đầu nhụy [13]. Quả: mọng, phần nạc do đế hoa tạo ra (Mận, Ổi) hay quả nang (Bạch đàn), thường quả chỉ có ít hạt. Hạt không nội nhũ, mầm thẳng hay cong. Cơ cấu học: túi tiết tinh dầu kiểu ly bào dưới biểu bì của lá, trong mô mềm vỏ của thân. Libe 2 kết tầng, libe quanh tủy. Yếu tố mạch có mặt ngăn thủng lỗ đơn. Ở Việt Nam có khoảng 15 chi: Acmena, Baeckea, Callistemon, Caryophyllus, Cleistocalyx, Decaspermum, Eucalyptus, Eugenia, Melaleuca, Osbornia, Psidium, Rhodamnia, Rhodomyrtus, Syzygium, Tristaniopsis; gần 100 loài. Một số cây trong họ: - Bạch đàn xanh (Khuynh diệp cầu): Eucalyptus globulus Labill. Lá và tinh dầu được dùng trong các bệnh đường hô hấp và đường tiết niệu, thấp khớp, ký sinh trùng đường ruột, đau nửa đầu. - Bạch đàn chanh (Khuynh diệp sả): Eucalyptus citriodora Hook.f. Rễ và cành lá dùng cất tinh dầu. Tinh dầu bạch đàn nói chung được dùng làm thuốc sát khuẩn tại chỗ, đặc biệt trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp trên và trong một số bệnh ngoài da.