Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa của cây nghể bụi (polygonum posumbu buch. ham. ex d. don)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN VIỆT DŨNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY NGHỂ BỤI (Polygonum posumbu Buch.-Ham. ex D. Don) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN VIỆT DŨNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY NGHỂ BỤI (Polygonum posumbu Buch.-Ham. ex D. Don) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Chuyên ngành Dược liệu – Dược học cổ truyền Mã số: 8720206 Người hướng dẫn khoa học: TS. VÕ VĂN LẸO Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nguyễn Việt Dũng TÓM TẮT Luận văn thạc sĩ – Khóa 2018-2020 Ngành: Dược liệu - Dược cổ truyền – Mã số: 8720206 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƯỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY NGHỂ BỤI (Polygonum posumbu Buch.-Ham. ex D. Don) Nguyễn Việt Dũng Người hướng dẫn khoa học: TS. Võ Văn Lẹo Mở đầu và đặt vấn đề Cây Nghể bụi (Polygonum posumbu) thường mọc nơi đất ẩm ven rừng, ven suối, bờ sông ngòi, mương rạch, ruộng bỏ hoang, phân bố nhiều ở Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam. Tại Vân Nam Trung Quốc, người ta dùng toàn cây để trị lỵ, viêm dạ dày, ruột, tiêu chảy, phong thấp, đau xương khớp, rắn cắn, mẩn ngứa ngoài da. Ở Việt Nam chưa có tài liệu ghi chép về kinh nghiệm sử dụng trong dân gian cũng như chưa có những công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây này. Đó là lý do thực hiện đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa của cây Nghể bụi (Polygonum posumbu Buch.-Ham. ex D. Don). Đối tượng Toàn cây Polygonum posumbu thu hái tại Quảng Nam vào tháng 3 năm 2019. Phương pháp nghiên cứu Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các phân đoạn bằng thử nghiệm DPPH. Sử dụng các phương pháp chiết ngấm kiệt, chiết phân bố lỏng lỏng , sắc ký cột chân không, sắc ký cột cổ điển và các phương pháp tinh chế khác để phân lập các hợp chất tinh khiết từ các phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa mạnh. Xác định cấu trúc dựa vào phổ MS và NMR. Kết quả và bàn luận Hoạt tính chống oxy hóa của các cao giảm dần theo thứ tự sau: cao ethyl acetat (87,3%) > cao cồn 80% (65,7%) > cao cloroform (44,9%) > cao nước (14,2%) > cao n-hexan (12,1%). Bột dược liệu (6,5 kg) chiết ngấm kiệt với cồn 80%, cô thu hồi thu được 3,7 L cao cồn lỏng. Chiết phân bố lỏng lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần, loại dung môi thu được cao n-hexan (1,7 g), cao cloroform (18,2 g), cao ethyl acetat (149,7 g) và cao nước (468,3 g). Từ 18,2 g cao cloroform thu được 1 hợp chất (acid 3,3’-di-O-methylellagic). 60 g cao ethyl acetat bằng kỹ thuật VLC, sephadex, kết tinh phân đoạn thu được 9 chất tinh khiết đó là: rhamnazin, isorhamnetin, quercetin, acid succinic, acid gallic, myricetin, distichin, quercitrin, catechin. Xác định IC50 của 8 hợp chất và so sánh với vitamin C, kết quả HTCO giảm dần như sau: acid gallic (9,28 µM) > quercetin (11,09 µM) > myricetin (12,33 µM) > quercitrin (15,36 µM) > vitamin C (25,5 µM) > isorhamnetin (30,12) > rhamnazin (36,67 µM) > acid 3,3’-diO-methylellagic (108,6 µM). Kết luận 1 hợp chất từ phân đoạn cloroform và 9 hợp chất từ cao ethyl acetat đã được phân lập. Trong đó acid 3,3’-di-O-methylellagic, rhamnazin, isorhamnetin, myricetin, distichin, quercitrin, catechin lần đầu tiên được phân lập trong loài P. posmbu, distichin lần đầu tiên được phân lập trong chi Polygonum. Quercetin, acid gallic, myricetin, quercitrin đều thể hiện hoạt tính mạnh hơn so với vitamin C (tính theo µM) trên thử nghiệm DPPH; rhamnazin, isorhamnetin, catechin có khả năng chống oxy hóa gần tương đương với vitamin C; acid 3,3’-di-O- methylellagic thể hiện hoạt tính yếu hơn so với vitamin C khoảng 4 lần và acid succinic không thể hiện HTCO. ABSTRACT Master’s thesis – Academic course: 2018 – 2020 Speciality: Pharmacognosy – Traditional Pharmacy Speciality code: 8720206 BIOACTIVITY-GUIDED ISOLATION OF ANTIOXIDANT CONSTITUENTS FROM THE AERIAL PARTS OF POLYGONUM POSUMBU BUCH.-HAM. EX D. DON Nguyen Viet Dung Supervisors: Dr. Vo Van Leo Introduction Polygonum posumbu often grows in moist soil, rivers, canals, abandoned fields and is widely distributed in China, India and Vietnam. In Yunnan China, people use the aerial parts to treat dysentery, gastritis, intestinal inflammation, diarrhea, rheumatism, osteoarthritis, snakebites, skin rashes. In Vietnam, there are no records of experience and no studies on the chemical composition and biological acitivity of this plant. As a result, our aim in this rearch is to isolate compounds for the antioxidant activity of Polygonum posumbu. Materials The aerial parts of P. posumbu were collected in Quang Nam, in March, 2019. Methods In-vitro screening of fractions and isolated compounds for the antioxidant activity on DPPH assay. Distribution of liquid-liquid extraction, vaccum liquid chromatography, silica column chromatography and other refined methods for the isolated compounds and fractions have strong antioxidant activity. Structure elucidation was based on NMR and MS method. Results and discussion The antioxidant activities of fractions decrease in order: ethyl acetat fraction (87,3%), ethanol 80% (65,7%), chloroform fraction (44,9 %), water fraction (14,2%), n-hexan fraction (12,1%). Dried whole plant of P. posumbu (6.5 kg) was extracted with 80% ethanol to obtain 3,7 L of ethanol extract. The extract was diluted with water and distributed with solvents to obtain 4 fractions: n-hexan (1,7 g), chloroform (18,2 g) and ethyl acetate (149,7 g) and water fraction (468,3 g). From 18.2 g of chloroform fraction obtained 1 compound (3,3’-di-O-methylellagic acid). From ethyl acetate fraction, by vacuum liquid chromatography and sephadex column, 9 compounds were obtained: rhamnazin, isorhamnetin, quercetin, acid succinic, gallic acid, myricetin, distichin, quercitrin and catechin. Determination of IC50 of 8 compounds and comparison with vitamin C, the results of the antioxidant activity were as follows: gallic acid (9,28 µM) > quercetin (11,09 µM) > myricetin (12,33 µM) > quercitrin (15,36 µM) > vitamin C (25,5 µM) > isorhamnetin (30,12) > rhamnazin (36,67 µM) > acid 3,3’-di-O-methylellagic (108,6 µM). Conclutions One compound from the chloroform fraction and 9 compounds from the ethyl acetat fraction were isolated. In which, 3.3’-di-O-methylellagic acid, rhamnazin, isorhamnetin, myricetin, distichin, quercitrin, catechin were isolated for the first time from P. posumbu, distichin was isolated for the first time in the genus Polygonum. Quercetin, gallic acid, myricetin, and quercitrin showed stronger antioxidant activity than vitamin C (µM) in the DPPH assay; rhamnazin, isorhamnetin, catechin have antioxidant capacity equivalent to vitamin C; 3,3’-di-O-methylellagic acid exhibited approximately 4 times weaker than vitamin C and succinic acid did not exhibit antioxidant capacity. MỤC LỤC MỤC LỤC .............................................................................................................................. i DANH MỤC BẢNG ............................................................................................................ iii DANH MỤC HÌNH .............................................................................................................. iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................................ vi LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................... viii ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 3 TỔNG QUAN VỀ CHI POLYGONUM ..................................................................... 3 1.1.1. Thực vật học chi Polygonum ................................................................................ 3 1.1.2. Thành phần hóa học ............................................................................................. 5 1.1.3. Tác dụng dược lý các loài thuộc chi Polygonum ............................................... 16 TỔNG QUAN VỀ LOÀI POLYGONUM POSUMBU ............................................. 24 1.2.1. Thực vật học ....................................................................................................... 24 1.2.2. Thành phần hóa học ........................................................................................... 26 1.2.3. Tác dụng dược lý ................................................................................................ 26 1.2.4. Công dụng trong y học cổ truyền ....................................................................... 27 TỔNG QUAN VỀ GỐC TỰ DO, CHẤT CHỐNG OXY HÓA VÀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA ............................................................. 28 1.3.1. Gốc tự do ............................................................................................................ 28 1.3.2. Chất chống oxy hóa và flavonoid ....................................................................... 31 1.3.3. Một số phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa. ................................... 33 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 37 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .................................................................................. 37 2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................................ 37 2.1.2. Dung môi, hóa chất ............................................................................................ 37 2.1.3. Trang thiết bị nghiên cứu ................................................................................... 38 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................ 38 2.2.1. Nghiên cứu thực vật học .................................................................................... 38 2.2.2. Thử độ tinh khiết ................................................................................................ 38 2.2.3. Định danh dược liệu bằng phương pháp giải trình tự ADN ............................... 39 2.2.4. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học .................................................................... 39 2.2.5. Xác định hàm lượng chất chiết được.................................................................. 39 2.2.6. Chiết xuất và tách phân đoạn bằng phân bố lỏng - lỏng .................................... 39 2.2.7. Phân lập chất tinh khiết theo định hướng chống oxy hóa .................................. 40 2.2.8. Kiểm tra độ tinh khiết......................................................................................... 40 2.2.9. Xác định cấu trúc các chất phân lập được .......................................................... 40 2.2.10. Thử tác dụng chống oxy hoá trên mô hình DPPH ........................................... 41 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................................ 45 KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC ................................................................................ 45 3.1.1. Định danh bằng phương pháp giải trình tự ADN ............................................... 45 3.1.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................................. 45 3.1.3. Đặc điểm vi phẫu................................................................................................ 46 THỬ TINH KHIẾT .................................................................................................. 51 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHẤT CHIẾT ĐƯỢC ................................................ 52 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC ...................................................................................... 52 3.4.1. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật ............................................................ 52 3.4.2. Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa từ các phân đoạn của cây nghể bụi .............. 55 3.4.3. Chiết xuất và tách phân đoạn bằng phân bố lỏng – lỏng.................................... 56 3.4.4. Phân tách các phân đoạn từ cao EtOAc ............................................................. 59 3.4.5. Phân lập các hợp chất và kiểm tra độ tinh khiết từ cao phân đoạn .................... 64 3.4.6. Xác định cấu trúc các chất phân lập được .......................................................... 75 ĐÁNH GIÁ HTCO CỦA CÁC CHẤT TINH KHIẾT ............................................. 92 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN................................................................................................... 97 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................................. 99 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 102 PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 109 i DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số loài trong chi Polygonum .......................................................................... 4 Bảng 1.2. Flavonoid trong các loài thuộc chi Polygonum ..................................................... 6 Bảng 1.3. Các hợp chất quinon có trong chi Polygonum....................................................... 9 Bảng 1.4. Các hợp chất stilben trong chi Polygonum .......................................................... 11 Bảng 1.5. Triterpenoid và steroid trong chi Polygonum ...................................................... 12 Bảng 1.6. Phenyl propanoid và lignan trong chi Polygonum .............................................. 13 Bảng 1.7. Một số thành phần khác trong chi Polygonum .................................................... 14 Bảng 1.8. Các hợp chất có chứa oxygen và nitrogen hoạt động (ROS và RNS) ................. 28 Bảng 2.9. Pha mẫu đo trong đĩa 96 giếng ............................................................................ 42 Bảng 3.10. Mức độ tương đồng của hai mẫu khi BLAST trên NCBI ................................. 45 Bảng 3.11. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết dược liệu P. posumbu ....................................... 51 Bảng 3.12. Kết quả xác định hàm lượng chất chiết được của P. posumbu.......................... 52 Bảng 3.13. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật .............................................. 53 Bảng 3.14. HTCO của các cao phân đoạn bằng phương pháp đo quang............................. 55 Bảng 3.15. Kết quả thử HTCO của các cao phân đoạn ....................................................... 58 Bảng 3.16. Các phân đoạn thu được từ cột VLC cao E ....................................................... 60 Bảng 3.17. Kết quả thử nghiệm HTCO của cao cao phân đoạn từ cột VLC ....................... 63 Bảng 3.18. Các phân đoạn chạy sephadex tủa E5T ............................................................. 68 Bảng 3.19. Các phân đoạn thu được từ sephadex phân đoạn E8 ......................................... 72 Bảng 3.20. Bảng so sánh phổ NMR của PPC1 và acid 3,3’-di-O-methylellagic ................ 75 Bảng 3.21. Bảng so sánh phổ NMR của PPE1 và rhamnazin ............................................. 77 Bảng 3.22. Bảng so sánh phổ NMR của PPE2 và isorhamnetin ......................................... 78 Bảng 3.23. Bảng so sánh phổ NMR của PPE3 và quercetin ............................................... 80 Bảng 3.24. Dữ liệu phổ NMR của PPE4 ............................................................................. 81 Bảng 3.25. Bảng so sánh phổ NMR của PPE5 và acid gallic .............................................. 82 Bảng 3.26. Bảng so sánh phổ NMR của PPE6 và myricetin ............................................... 84 Bảng 3.27. Bảng so sánh phổ NMR của PPE7 và distichin................................................. 86 Bảng 3.28. Bảng so sánh phổ NMR của PP11 và quercitrin ............................................... 88 Bảng 3.29. Bảng so sánh phổ NMR của PP12 và catechin ................................................. 90 Bảng 3.30. Kết quả đo HTCO, xác định IC50 của vitamin C ............................................... 92 Bảng 3.31. Kết quả đo HTCO, xác định IC50 của PPC1...................................................... 92 Bảng 3.32. Kết quả đo HTCO, xác định IC50 của PPE1 ...................................................... 93 Bảng 3.33. Kết quả đo HTCO, xác định IC50 của PPE2 ...................................................... 93 Bảng 3.34. Kết quả đo HTCO, xác định IC50 của PPE3 ...................................................... 93 Bảng 3.35. Kết quả đo HTCO, xác định IC50 của PPE4 ...................................................... 94 Bảng 3.36. Kết quả đo HTCO, xác định IC50 của PPE5 ...................................................... 94 Bảng 3.37. Kết quả đo HTCO, xác định IC50 của PPE6 ...................................................... 94 Bảng 3.38. Kết quả đo HTCO, xác định IC50 của PPE11 .................................................... 95 Bảng 3.39. Kết quả đo HTCO, xác định IC50 của PPE12 .................................................... 95 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Một số cấu trúc flavonoid trong chi Polygonum.................................................... 9 Hình 1.2. Một số cấu trúc stilben trong chi Polygonum ...................................................... 12 Hình 1.3. Cây Nghể bụi (Polygonum posumbu Buch.-Ham. ex D. Don) ............................ 25 Hình 1.4. Một số hợp chất flavonoid trong loài P. posumbu ............................................... 26 Hình 2.5. Sơ đồ chuẩn bị mẫu nghiên cứu ........................................................................... 41 Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm trên đĩa 96 giếng ...................................................................... 43 Hình 3.7. Đặc điểm hình thái cây Nghể bụi......................................................................... 45 Hình 3.8. Vi phẫu thân cây nghể bụi ................................................................................... 46 Hình 3.9. Sơ đồ cấu tạo thân ................................................................................................ 46 Hình 3.10. Vi phẫu chi tiết thân ........................................................................................... 47 Hình 3.11. Vi phẫu lá ........................................................................................................... 48 Hình 3.12. Sơ đồ cấu tạo lá .................................................................................................. 48 Hình 3.13. Vi phẫu chi tiết gân giữa lá ................................................................................ 49 Hình 3.14. Vi phẫu chi tiết phiến lá ..................................................................................... 50 Hình 3.15. Biểu bì của lá Nghể bụi...................................................................................... 50 Hình 3.16. Hình ảnh một số cấu tử trong lá cây Nghể bụi .................................................. 51 Hình 3.17. Hình ảnh một số cấu tử trong thân cây Nghể bụi .............................................. 51 Hình 3.18. Sắc ký đồ các cao phân đoạn với TT DPPH ...................................................... 55 Hình 3.19. Biểu đồ thể hiện HTCO của các cao phân đoạn ................................................ 56 Hình 3.20. Sơ đồ chiết xuất và tách phân đoạn bằng phân bố lỏng lỏng ............................. 57 Hình 3.21. Sắc ký đồ các cao phân đoạn ............................................................................. 58 Hình 3.22. Biểu đồ thể hiện HTCO của các cao phân đoạn ................................................ 59 Hình 3.23. Sắc ký đồ các cao phân đoạn của cao E trên SKLM ......................................... 62 Hình 3.24. Sắc ký đồ các phân đoạn cao E với DPPH ........................................................ 63 Hình 3.25. Biểu đồ thể hiện HTCO của các phân đoạn cao E ............................................. 64 Hình 3.26. Sắc kỳ đồ kiểm tra tinh khiêt PPC1 ................................................................... 65 Hình 3.27. Sắc ký đồ kiểm tra tinh khiết của PPE1, PPE2, PPE3, PPE4 ............................ 66 Hình 3.28. Sắc ký đồ tủa E5T .............................................................................................. 67 Hình 3.29. Sắc ký đồ các phân đoạn sephadex tủa E5T ...................................................... 68 Hình 3.30. Sắc kỳ đồ kiểm tra tinh khiết PPE5, PPE6 ........................................................ 69 Hình 3.31. Sắc kỳ đồ kiểm tra tinh khiết PPE7, PPE11 ...................................................... 71 Hình 3.32. Sắc ký đồ các phân đoạn sephadex E8 .............................................................. 72 Hình 3.33. Sắc kỳ đồ kiểm tra tinh khiết PPE12 ................................................................. 73 Hình 3.34. Sơ đồ tổng kết phân lập các hợp chất từ cao C và cao E ................................... 74 Hình 3.35. Cấu trúc của PPC1 (acid 3,3’-di-O-methylellagic) và các tương tác HMBC .... 76 Hình 3.36. Cấu trúc PPE1 (rhamnazin) và một số tương tác chính trên HMBC ................. 77 Hình 3.37. Cấu trúc PPE2 (isorhamnetin) và một số tương tác chính trên HMBC ............. 79 Hình 3.38. Cấu trúc PPE3 (quercetin) và tương tác trên HMBC......................................... 81 Hình 3.39. Cấu trúc PPE4 (acid succinic) và tương tác HMBC .......................................... 82 Hình 3.40. Cấu trúc PPE5 (acid gallic) và tương tác trên HMBC ....................................... 83 Hình 3.41. Cấu trúc PPE6 (myricetin) và tương tác chính trên HMBC .............................. 84 Hình 3.42. Cấu trúc PPE7 (distichin) và một số tương tác chính trên HMBC, COSY ....... 87 Hình 3.43. Cấu trúc PPE11 (quercitrin) và tương tác chính trên HMBC ............................ 89 Hình 3.44. Cấu trúc PPE12 (catechin) và các tương tác trên HMBC .................................. 91 Hình 3.45. Cấu trúc 3D của PPE12 (catechin) .................................................................... 91 Hình 3.46. Biểu đồ so sánh IC50 của các chất phân lập so với vitamin C (µM) .................. 95 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ tắt ADN Acid desoxynucleic ARN Acid ribonucleic br broad COSY Correlated Spectroscopy d doublet DCM Dichloromethane DĐVN Dược điển Việt Nam DMSO Dimethyl sulfoxid EtOAc Ethyl acetate Ferric Reducing Antioxidant Power Heteronuclear Multiple Bond Correlation FRAP HMBC Ý nghĩa Chữ nguyên Đỉnh rộng Đỉnh đôi Khả năng chống oxy hóa khử ion sắt HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation HTCO Hoạt tính chống oxy hóa IC50 Half maximal inhibitory concentration Nồng độ ức chế 50% sinh vật thử nghiệm J Coupling constant Hằng số ghép m multiplet Nhiều đỉnh MBC Minimum bactericidal concentration Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MIC Minimal inhibitory concentration Nồng độ nhỏ nhất có tác dụng ức chế MS Mass spectrometry Phổ khối NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân ORAC Oxygen radical absorbance capacity Khả năng hấp thu các gốc oxygen ppm parts per million Phần triệu RNS Reactive Nitrogen Species Những chất chứa nitrogen hoạt động i ROS Reactive Oxygen Species Những chất chứa oxygen hoạt động s singlet Đỉnh đơn SKLM Sắc ký lớp mỏng t triplet Đỉnh ba TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity Hàm lượng chất chống oxy hóa tương đương gallic acid TLTK Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử UV Ultra violet Tử ngoại VLC Vacuum liquid chromatography Sắc ký cột chân không VS Vanillin sulfuric δ Độ dời hóa học i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Thầy TS.Võ Văn Lẹo đã giúp đỡ em hoàn thành luận văn này. Thầy luôn luôn cùng đồng hành, giúp đỡ và chia sẻ kinh nghiệm trong suốt quãng thời gian làm đề tài. Những kiến thức Thầy đã chỉ dạy cho em nó không chỉ dừng lại ở lý thuyết mà nó là kinh nghiệm thực tế trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật nói riêng và nghiên cứu Dược liệu nói chung và sẽ là hành trang giúp ích cho em để tiếp tục học hỏi, nâng cao kiến thức chuyên môn về sau. Em xin gửi lời cảm ơn các Thầy, Cô trong bộ môn: PGS.TS Trần Hùng, PGS.TS Huỳnh Ngọc Thụy, TS. Mã Chí Thành, TS. Phạm Đông Phương, TS. Trần Thị Vân Anh, PGS. TS. Bùi Mỹ Linh đã tham gia giảng dạy các học phần trong chương trình cao học giúp em có kiến thức lý thuyết nền tảng để có thể ứng dụng vào nghiên cứu thực tế, cảm ơn Thầy TS. Huỳnh Lời đã thu hái dược liệu để em có thể thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô trong Hội Đồng Đánh Giá Luận Văn Thạc Sĩ đã đọc và phản biện đề tài: Thầy Minh Đức (CT), Thầy Kình (PB1), Cô Vân Anh (PB2), Thầy Thành (Ủy Viên Thư Ký), Thầy Phương (Ủy Viên). Gửi lời cảm ơn đến em DS. Đinh Quang Dương lớp D2015 đã phụ anh cùng làm đề tài, cảm ơn các Anh, Chị, em lab. 414 đã cùng đồng hành, giúp đỡ lẫn nhau trong quãng thời gian thực hiện nghiên cứu. Xin gửi lời cảm ơn đến ban Ban Lãnh Đạo Trường ĐH Buôn Ma Thuột đã tạo điều kiện cho em có thời gian để thực hiện đề tài. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay với sự phát triển của xã hội, khoa học kỹ thuật, y tế thì đời sống của con người ngày càng được nâng cao. Kèm theo đó môi trường sống cũng bị ảnh hưởng bởi sự ô nhiễm của đất, nước và không khí tác động xấu đến sức khỏe con người – là nguyên nhân ngoại sinh hình thành các gốc tự do trong cơ thể. Khi số lượng gốc tự do sinh ra quá nhiều, làm mất cân bằng hệ thống bảo vệ trong cơ thể, lúc này các ROS, RNS sẽ tấn công các đại phân tử ADN, ARN, protein, lipid làm thay đổi cấu trúc và chức năng sinh lý trong cơ thể. Đó là một trong những nguyên nhân gây ra các bệnh lý trên cơ thể như tim mạch, đái tháo đường, thoái hóa thần kinh, lão hóa, ung thư, viêm... Do đó việc bổ sung các chất chống oxy hóa để kiểm soát hàm lượng các gốc tự do, ngăn ngừa và điều trị bệnh là hoàn toàn cần thiết. Những năm gần đây xu hướng phát triển các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu đang được quan tâm và đẩy mạnh phát triển vì những ưu điểm so với thuốc tân dược. Trong khi đó trước đây việc điều trị bệnh chỉ dựa vào những kinh nghiệm dân gian, lý luận y học cổ truyền mà chưa có những chứng cứ khoa học về mặt thực nghiệm. Do đó, ngày nay với sự phát triển của khoa học kỹ thuật thì không chỉ riêng Việt Nam mà trên thế giới đã có rất nhiều những nghiên cứu về hóa học, sinh học và dược lý nhằm làm sáng tỏ những tác dụng, công dụng điều trị bệnh của các loại dược liệu. Chi Polygonum với khoảng 300 loài phân bố rộng rãi toàn cầu chủ yếu là vùng ôn đới ở bắc bán cầu. Từ xa xưa đã được sử dụng rất nhiều trong các bài thuốc y học cổ truyền phương Đông. Nhiều loài trong số đó đã được đưa vào Dược Điển Trung Quốc như: Polygonum cuspidatum, Polygonum multiflorum,… Nghể bụi (Polygonum posumbu) là một loài thuộc chi Polygonum mọc nơi đất ẩm ven rừng, ven suối, bờ sông ngòi, mương rạch, ruộng bỏ hoang, phân bố nhiều ở Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam. Tại Vân Nam (TQ), người ta dùng toàn cây trị lỵ, viêm dạ dày ruột, tiêu chảy, phong thấp, đau xương khớp, trị rắn cắn, mẩn ngứa ngoài da. Tuy nhiên, hiện có rất ít những công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây này. Do đó, để hiểu rõ hơn về thành phần hóa học, tác dụng sinh học và các hoạt chất liên quan nhằm nâng cao giá trị sử dụng của dược liệu, đề tài này được thực hiện với các mục tiêu như sau: - Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết toàn phần và các cao phân đoạn từ loài P. posumbu trên mô hình DPPH. - Phân lập, xác định cấu trúc các hoạt chất trong các cao phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa mạnh. - Thử hoạt tính chống oxy hóa của các chất phân lập được. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU TỔNG QUAN VỀ CHI POLYGONUM 1.1.1. Thực vật học chi Polygonum Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại của A. L. Takhtajan (2009), vị trí của chi Polygonum được xác định như sau [79]: Giới thực vật (Plantae) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Cẩm chướng (Caryophyllidae) Liên bộ Rau răm (Polygonanae) Bộ Rau răm (Polygonales) Họ Rau răm (Polygonaceae) Phân họ Polygonoideae Tông Polygoneae Chi Polygonum Về nguồn gốc, Bộ Rau răm rất gần với Bộ Cẩm chướng (Caryophyllales) [79]. Một số hệ thống phân loại khác xếp họ Polygonaceae dưới Bộ Cẩm Chướng [85],[97]. Đặc điểm chi Polygonum Mô tả Chi Polygonum thuộc họ Rau răm (Polygonaceae), tên thường gọi là knotgrass (tiếng Anh), là loại cỏ một năm hoặc nhiều năm, một số ít dạng cây bụi; thân đứng thẳng, chếch, bò lan hoặc bò trườn, phân cành ít hoặc nhiều; có gai mọc ngược hoặc không, có lông tuyến hoặc nhẵn, một số ít có điểm tuyến, lóng dài hoặc ngắn; đốt có rễ hoặc không, rễ mảnh hoặc thô. Lá mọc cách, có cuống hoặc gần như không cuống; phiến lá nguyên, một số ít chia thùy, hình dạng và kích thước khác nhau, mỏng, 2 mặt có lông tơ hoặc không, một số ít có điểm tuyến, mép có lông tơ hoặc không, gân bên dạng lông chim, nổi rõ ở mặt dưới lá, chóp nhọn ngắn, gốc hình nêm, hình tim, tròn, mũi tên hoặc bằng. Bẹ chìa hình ống, chất lá hoặc màng mỏng, mép vát hoặc cụt, mép có lông mi hoặc không. Hoa mọc tụm ở nách lá hoặc là cụm hoa dạng bông, dạng đầu hoặc chùy, mọc ở đỉnh cành hoặc nách lá, hình trụ hoặc hình sợi, phân nhánh hoặc không, hoa nhiều, xếp đơn độc hoặc 3-5 hoa mọc tụm trong mỗi lá bắc, lá bắc hình phễu, mép vát, có lông hoặc không. Hoa mẫu 4-5, lưỡng tính, một số ít đơn tính, nhỏ, màu trắng, hồng hoặc vàng xanh, cuống mềm yếu, có mấu. Bao hoa 45 mảnh, một số ít 3, nhẵn, không có lông, một số ít có điểm tuyến, đồng trưởng hoặc không đồng trưởng với quả. Nhị 5-8, một số ít 1-4, thường ngắn hơn bao hoa, bao phấn đính lưng, 2 ô, hướng trong, mở theo khe dọc. Bầu thượng, hình trứng, 3 cạnh, 3 lá noãn, 1 ô, có 1 noãn, thẳng, đính gốc; vòi nhụy 2 hoặc 3, rời nhau hoặc dính nhau ở phần dưới; đầu nhụy dạng đầu. Quả bế hình trứng, 3 cạnh nhọn hoặc tù hoặc là hình thấu kính lồi 2 mặt, màu nâu đen nhẵn bóng, được bao trong bao hoa đồng trưởng hoặc không. Hạt có phôi ở bên, rễ mầm dài, lá mầm nhỏ, dẹp [3]. Phân bố Chi Polygonum là chi lớn nhất trong họ Polygonaceae [3] với khoảng 300 loài phân bố rộng rãi toàn cầu chủ yếu là vùng ôn đới ở bắc bán cầu. 120 loài đã tìm thấy ở vùng tây nam Trung Quốc [82]. Việt Nam có khoảng 32 loài, đây là chi có số lượng loài nhiều nhất trong họ, phân bố khắp đất nước từ Bắc tới Nam [3]. Theo “Từ Điển Cây Thuốc Việt Nam” của Võ Văn Chi, một số loài trong chi Polygonum ở Việt Nam được liệt kê ở bảng 1.1 [6]. Bảng 1.1. Một số loài trong chi Polygonum Tên khoa học Tên thường gọi 1 Polygonum filiforme Thunb. Kim tuyến thảo 2 Polygonum neofiliforme (Nakai) H. Hava Kim tuyến thảo lông ngắn 3 Polygonum uviferum L. Nho biển 4 Polygonum emarginatum Roth Kiều mạch 5 Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson Hà thủ ô đỏ 6 Polygonum dibotrys D.Don Bông chua STT 7 Polygonum alatum Buch-Ham. ex. D.Don Nghể núi, nghể nepal 8 P. barbatum L. Nghể trắng, nghể râu, nghể dại 9 P. capitatum Buch-Ham. ex. D.Don Nghể hoa đầu 10 P. chinense L. Thồm lồm 11 P. chinense L. var ovalifolium Meissn Nghể Mã lai 12 P. cuspidatum L. Cốt khí củ 13 P. glabrum Willd Nghể nhẵn 14 P. hydropiper L. Nghể răm 15 P. lanigerum R.Br. Nghể trắng 16 P. lapathifolium Nghể điểm, nghể bột 17 P. minus Huds Nghể tăm 18 P. molle D.Don (P. paniculatum Blume) Nghể chùm 19 P. orientale L. Nghể đông, nghể bà 20 P. odoratum Lour. Rau răm 21 P. palmatum Dunn Nghể chàm 22 P. perfoliatum L. Thồm lồm gai, rau má ngọ 23 P. plebeium R.Br. (P. aviculare) Mễ tử liễu, nghể thường, mót dê 24 P. posumbu Buch.-Ham. ex D.Don Nghể phù, nghể bụi 25 P. pubescens Blume Nghể lông ngắn 26 P. runcinatum Buch-Ham Nghể bào, nghể bào xẻ lông chim 27 P. senticosum (Meisn.) Franch. et Sav. Nghể gai móc, nghể móc 28 P. strigosum R.Br Nghể gai 29 P. thunberrgii Sieb et Zucc Nghể ba kích, nghể thunberg 30 P. tinctorium Aiton Nghể chàm 31 P. tomentosum Willd Nghể lông dày 32 P. viscosum Buch-Ham. ex D.Don Nghể dính 1.1.2. Thành phần hóa học Đã có nhiều công trình nghiên cứu về các loài thuộc chi Polygonum, kết quả cho thấy flavonoid, quinon, triterpen, stilben là những hợp chất chính có trong cây. Trong số đó, flavonoid là thành phần phổ biến được tìm thấy trong chi Polygonum và trước đây đã được sử dụng như là các marker của các loài trong chi Polygonum, đóng vai trò quan trọng trong hệ thống phân loại các loài thuộc họ Polygonaceae [56].