Tài liệu Nghiên cứu tạo dòng chủng bacillus subtilis py79 tái tổ hợp ifn trên tiêm mao

. BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG CHỦNG BACILLUS SUBTILIS PY79 TÁI TỔ HỢP IFN TRÊN TIÊM MAO Mã số: Chủ nhiệm đề tài: TS. Vũ Thanh Thảo Tp. Hồ Chí Minh, 9/2018 . . BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG CHỦNG BACILLUS SUBTILIS PY79 TÁI TỔ HỢP IFN TRÊN TIÊM MAO Mã số: Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Vũ Thanh Thảo Tp. Hồ Chí Minh, 9/2018 . . Danh sách những thành viên tham gia nghiên cứu đề tài và đơn vị phối hợp chính 1. Nguyễn Thị Linh Giang, Bộ môn Vi sinh – Ký sinh, Khoa Dược. 2. Lê Văn Thanh, Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Chợ Rẫy. . i . MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG............................................................................................. iv DANH MỤC HÌNH .............................................................................................. iv MỞ ĐẦU.................................................................................................................1 CHƯƠNG 1 . TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................3 1.1. Tổng quan về interferon alpha .........................................................................3 1.2. Interferon alpha 2 .............................................................................................4 1.2.1. Cấu trúc gen và protein mã hóa cho Interferon alpha 2 ............................4 1.2.2. Chế phẩm Interferon alpha 2 tái tổ hợp sử dụng điều trị cho người trên thị trường.............................................................................................................4 1.2.3. Interferon alpha 2 liều thấp đường uống...................................................6 1.3. Bào tử Bacillus là một giá mang protein hữu hiệu ..........................................8 CHƯƠNG 2 . VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .....................................................10 2.1. Vật liệu ...........................................................................................................10 2.1.1. Chủng vi sinh vật và vector.....................................................................10 2.1.2. Danh sách mồi.........................................................................................10 2.1.3. Bố trí thí nhiệm .......................................................................................10 2.1.4. Phương pháp chung.................................................................................11 2.1.5. Phương pháp tạo dòng Bacillus subtilis mang Interferon alpha 2a được khảm trong cấu trúc tiêm mao...........................................................................13 2.1.6. Đánh giá sự biểu hiện protein tiêm mao và biểu hiện IFN-α2a ..............17 CHƯƠNG 3 . KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .............................................................18 3.1. Thiết kế trình tự tối ưu của IFN alpha 2a biểu hiện trên Bacillus subtilis PY79......................................................................................................................18 3.2. Tạo dòng Bacillus subtilis mang interferon αlpha 2a đượckhảm trong cấu trúc tiêm mao.........................................................................................................19 3.2.1. Thu nhận gen HagN, IFNA2 và HagC và vector pDG364 .....................19 3.2.2. Tạo dòng vector tái tổ hợp pHagP-NIC trong Escherichia coli DH5 ..20 3.2.3. Tạo dòng Bacillus subtilis PY79 mang gen tái tổ hợp HagP-NIC .........21 3.3. Đánh giá sự biểu hiện của IFN alpha 2a khảm trong protein tiêm mao ........24 3.3.1. Kết quả đánh giá sự biểu hiện protein IFN-α2a......................................24 3.3.2. Kết quả nhuộm tiêm mao các chủng Bacillus subtilis ............................24 . ii . 3.3.3. Kết quả đánh giá sự biểu hiện tiêm mao bằng phương pháp quan sát di động dưới kính hiển vi ......................................................................................25 3.3.4. Kết quả đánh giá sự biểu hiện tiêm mao bằng phương pháp Western Blot ...........................................................................................................................26 3.4. Bàn luận .........................................................................................................27 CHƯƠNG 4 . KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...............................................................29 4.1. Kết luận ..........................................................................................................29 4.2. ĐỀ NGHỊ .......................................................................................................29 Tài liệu tham khảo.................................................................................................29 . iii . DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Trình tự các mồi sử dụng trong Nghiên cứu.............................................10 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR thu nhận các đoạn gen..................................15 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng BamHI và HindIII.....................15 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng Golden Gate pDG364 với 3 gen HagN, HagC và IFNA2. .......................................................................................................................16 Bảng 3.5. Kết quả tối ưu hóa codon biểu hiện của gen hag-O .................................18 Bảng 3.6. Các thông số của quá trình tối ưu hóa ......................................................19 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Sơ đồ tạo dòng pHagP-NIC. .....................................................................14 Hình 3.1. Kết quả PCR thu nhận gen HagN, IFNA2 và HagC. ................................19 Hình 3.2. Kết quả kiểm tra pDG364 cắt với enzym BamHI/HindIII........................20 Hình 3.3. Kết quả PCR khuẩn lạc sàng lọc chủng mang vector pHagP-NIC. ..........20 Hình 3.4. Vector tái tổ hợp pHagP-NIC xử lý bằng XhoI.........................................21 Hình 3.5. Kết quả PCR khuẩn lạc B. subtilis PY79 tái tổ hợp gen HagP-NIC.........22 Hình 3.6. Kết quả kiểm tra khả năng phân giải tinh bột của B. subtilis PY79 tái tổ hợp gen HagP-NIC....................................................................................................22 Hình 3.7. Kết quả PCR xác nhận gen tái tổ hợp HagP-NIC trong B. subtilis PY79. ...................................................................................................................................23 Hình 3.8. Kết quả Western Blot với kháng thể Anti-IFN-α2....................................24 Hình 3.9. Kết quả nhuộm tiêm mao của các chủng B. subtilis PY79. ......................25 Hình 3.10. Kết quả Western Blot với kháng thể Anti-Hag.......................................26 . iv . MỞ ĐẦU Từ lúc được phát hiện vào năm 1957, nhiều loại interferon (IFN) đã được tìm ra và cho thấy những hoạt tính khác nhau trong sinh vật. Các nghiên cứu về tiềm năng trị liệu của IFN đã được thực hiện và trong số những nghiên cứu đó, nhiều loại IFN đã được chấp thuận điều trị cho người. Đặc biệt, interferon alpha (IFN-α) đã được nghiên cứu rộng rãi, chuyên sâu và đang được sử dụng như một phương pháp điều trị tiêu chuẩn của nhiều bệnh. Ví dụ, Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã chấp thuận chỉ định IFN liều cao như liệu pháp bổ trợ cho các bệnh nhân mắc ung thư hắc tố da (melanoma). Ngoài ra, IFN-α được gắn polyethylen glycol (PEG) cũng đã được nghiên cứu, giúp kéo dài thời gian bán hủy của IFN trong huyết tương mà không gây ảnh hưởng đến hoạt tính của IFN. Tuy nhiên, dù sử dụng IFN-α ở dạng nào, IFN-α đều có thể gây ra hàng loạt tác dụng phụ ở hầu hết các hệ cơ quan. Hiển nhiên, điều này ảnh hưởng đến chất lượng sống của các bệnh nhân điều trị với IFN-α. Hơn nữa, tác dụng phụ còn cản trở việc đạt và duy trì liều điều trị cần thiết để cho hiệu quả điều trị tối đa ở bệnh nhân. Thậm chí, trong nhiều trường hợp, tác dụng phụ còn dẫn đến việc bệnh nhân từ bỏ điều trị. Như vậy, mục tiêu quan trọng cần đạt được chính là việc biến đổi các IFN-α sao cho ra đời được phân tử có hiệu quả trị liệu lâm sàng với tác dụng phụ tối thiểu [17]. Mặt khác, các nghiên cứu về hiệu quả sử dụng IFN liều thấp đường uống đã được thực hiện. Nhiều nghiên cứu cho thấy IFN đường uống liều thấp là an toàn và có lợi trong điều trị các bệnh ở người gây ra bởi virus [38], ung thư [13], tự miễn [12] ... Tuy nhiên, với bản chất là protein, việc dùng IFN đường uống gặp phải nhiều trở ngại, điển hình là việc IFN dễ dàng bị phân hủy bởi acid dịch vị và các enzym phân giải protein. Như vậy, việc tạo ra được dạng IFN có thể dùng đường uống mà không bị mất hoạt tính khi đưa vào cơ thể là cần thiết, giúp cải thiện hiệu quả trị liệu. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu về vi sinh vật biến đổi gen dùng làm giá thể tải thuốc đã được thực hiện và cho thấy tiềm năng phát triển. Trong đó, các nghiên cứu sử dụng Bacillus subtilis làm hệ thống biểu hiện protein như protein pneumolysin [37], interferon [26], độc tố bạch hầu [20], năm tiểu đơn vị của độc tố ho gà [31], đoạn C độc tố uốn ván [23] đã thu được những kết quả chứng minh tính khả thi của giá mang này. . 1 . Xuất phát từ các lý do trên, đề tài “Nghiên cứu tạo dòng chủng Bacillus subtilis PY79 tái tổ hợp IFN trên tiêm mao.” đã được thực hiện, nhằm tạo ra chủng B. subtilis biểu hiện protein IFN-α2a người khảm trong tiêm mao, mục tiêu hướng đến việc sử dụng như chế phẩm probiotic dự phòng tăng cường miễn dịch ở người. . 2 . CHƯƠNG 1 . TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về interferon alpha Interferon (IFN) được phát hiện vào năm 1957 do hoạt tính ngăn cản sự nhân lên của siêu vi ở các tế bào mới bị nhiễm. Ngày nay, IFN được biết đến như một nhóm có nhiều loại phân tử khác nhau; ngoài tác động ngăn cản sự nhân lên của siêu vi, IFN còn ngăn cản sự tăng sinh của một số tế bào và có tác dụng điều hòa đáp ứng miễn dịch [29]. Căn cứ vào các đặc điểm tổng quát, IFN được chia làm 2 tuýp: - IFN tuýp 1 chủ yếu gồm IFN alpha (IFN-α), IFN beta (IFN-β), có hoạt tính chống siêu vi. - IFN tuýp 2 có IFN gamma (IFN-γ), có hoạt tính điều hòa đáp ứng miễn dịch. Trong đó, interferon alpha (IFN-α) là nhóm IFN được tiết chủ yếu từ bạch cầu (tế bào tua và đại thực bào). Phân tử IFN-α có trọng lượng phân tử khoảng 18000 đến 20000 Da [29]. Có 14 gen đã được tìm thấy quy định mã hóa cho các loại IFN-α người [27]. Mỗi loại IFN-α được cho là có chức năng khác nhau, ví dụ như kháng virus, ngăn sự tăng trưởng tế bào và hoạt hóa các hoạt động gây độc tế bào của tế bào giết tự nhiên (NK cell) và tế bào T. Các hoạt động này không có một sự tương quan rõ ràng, do đó các thành viên trong họ IFN-α được xem như có chức năng riêng biệt. Hầu hết các loại IFN-α không được glycosyl hóa, mặc dù một số có chứa carbohydrat [28]. Các gen mã hóa cho IFN-α thường không có intron và được điều hòa bởi vùng promoter riêng, có vùng gắn các yếu tố phiên mã chuyên biệt [9]. Ở người, các loại IFN-α có trình tự amino acid và trình tự gen bảo tồn cao, sự tương đồng từ 78% đến 99% [1, 36]. Nhiều nghiên cứu cho thấy sự đa dạng về các gen mã hóa cho IFN-α là kết quả của quá trình nhân đôi gen qua thời gian, tuy rằng đã có nghiên cứu cho thấy các loại IFN-α này có chức năng không giống nhau. Các loại IFN-α được cho rằng có tác động kháng lại virus khác nhau. Ví dụ, ở dòng tế bào người, IFN-α10 được chứng minh có tác động hiệu quả nhất chống lại rhinovirus và virus viêm miệng mụn nước, trong khi đó IFN-α2 có tác động hiệu quả hơn cả đối với virus HIV-1. Bên cạnh sự khác biệt về tiềm lực tác động đối với từng tác nhân gây bệnh, các loại IFN-α còn cho tác động riêng biệt khi được biểu hiện ở các tế bào đích khác nhau. Trong các loại . 3 . IFN-α, IFN-α2 đã được chứng minh có tác động kháng virus mạnh nhất ở dòng tế bào MT-2 [35]. Cơ chế hoạt động của Interferon alpha được Burke chia sự hình thành IFN thành 3 giai đoạn - Sự xâm nhập tế bào chủ của virus, dẫn đến sự tháo bỏ vỏ virion, giải phóng chất cảm ứng IFN là acid nucleic của virus. - Sự tương tác trực tiếp hay gián tiếp giữa acid nucleic của virus và bộ gen tế bào chủ, cảm ứng sản xuất mRNA quy định cho IFN. - mRNA quy định tổng hợp IFN được dịch mã tạo IFN và protein có liên quan. 1.2. Interferon alpha 2 Trong các loại IFN-α, interferon alpha 2 (IFN-α2) là loại IFN-α đầu tiên được phân tích vào đầu những năm tám mươi. Do đó, IFN-α2 đã được dùng rộng rãi trong các nghiên cứu cơ bản để làm rõ tác động sinh học, cấu trúc và cơ chế tác động của các loại IFN tuýp 1 khác. IFN-α2 còn là loại IFN đầu tiên được cấp phép sử dụng điều trị bệnh cho người. Có thể nói, IFN-α2 là loại IFN tuýp 1 được nghiên cứu nhiều và biết đến rõ nhất [19]. 1.2.1. Cấu trúc gen và protein mã hóa cho Interferon alpha 2 Gen mã hóa cho IFN-α2, tức gen IFNA2, được nhóm lại với tất cả các gen IFN tuýp 1 khác trên nhiễm sắc thể số 9 và như tất cả các gen mã hóa cho IFN tuýp 1 khác, gen IFNA2 không có intron [30]. Trình tự mã hóa của gen IFNA2 quy định cho một tiền protein dài 188 amino acid, trong đó có 23 amino acid đầu là tín hiệu tiết (signal peptide). Protein trưởng thành bao gồm 165 amino acid, ngắn hơn 1 amino acid so với các loại IFN-α khác của người. Ở người, có 3 loại IFN-α2 được tìm thấy, tương ứng với 3 allele của gen IFNA2, bao gồm IFN-αA (IFN-α2a), IFN-α2 (IFN-α2b) và IFN-α2c. Trong số đó, IFN-α2a và IFN-α2b được biết đến nhiều hơn cả do được sử dụng làm thuốc điều trị bệnh cho người. Sự khác biệt giữa IFN-α2a và IFN-α2b nằm ở amino acid thứ 23 của chuỗi polypeptid, ở IFN-α2a là lysin, còn ở IFN-α2b là arginin [27]. 1.2.2. Chế phẩm Interferon alpha 2 tái tổ hợp sử dụng điều trị cho người trên thị trường Hiện nay, trên thị trường có hai loại chế phẩm từ IFN-α2 được sử dụng rộng rãi trong lâm sàng là PEG-IFN-α2a và PEG-IFN-α2b. Mục đích chính khi gắn polyethylen . 4 . glycol (PEG) cho protein trị liệu là để cải thiện dược động học của thuốc, giảm thải trừ và tăng đáp ứng điều trị [16]. IFN-α2 tái tổ hợp (IFN-α2a và IFN-α2b) được sử dụng điều trị cho các bệnh nhân nhiễm virus (như bệnh nhân viêm gan siêu vi B, siêu vi C mạn tính) hay bệnh nhân mắc bệnh ung thư (như ung thư hắc tố, ung thư biểu mô thận hay các bệnh lý huyết học ác tính) [2]. Một số chế phẩm IFN-α2 được dùng trong điều trị lâm sàng cho người trên thị trường: - Intron A: là chế phẩm protein IFN-α2b tái tổ hợp được dùng theo đường tiêm bắp, tiêm dưới da, tiêm tại chỗ hay tiêm tĩnh mạch. Thuốc được bào chế dưới dạng thuốc bột pha tiêm interferon tái tổ hợp tiệt trùng. Thuốc được sản xuất bằng phương pháp lên men một dòng vi khuẩn Escherichia coli chứa plasmid tái tổ hợp có gen mã hóa cho IFN-α2b có nguồn gốc từ tế bào bạch cầu người. - PegIntron: là chế phẩm thuốc bột pha tiêm, cũng được bào chế từ IFN-α2b tái tổ hợp, nhưng được gắn thêm monomethoxy polyethylene glycol. Khối lượng trung bình của PEG khoảng 12 kDa, do đó khi kết hợp với IFN-α2b, phân tử PEG làm tăng khối lượng trung bình của phân tử PegIntron lên khoảng 31000 dalton. - Pegasys: là sản phẩm kết hợp giữa IFN-α2a tái tổ hợp (khối lượng phân tử khoảng 20 kDa) với một chuỗi bis-monomethoxy polyethylen glycol (khối lượng phân tử khoảng 40 kDa). Trong chế phẩm này, phân tử PEG được gắn vào phân tử IFNα2a bằng một liên kết amid bền vững với lysin. IFN-α2a được sản xuất bằng kĩ thuật DNA tái tổ hợp, bằng cách tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa cho IFN-α2a từ tế bào bạch cầu người trong Escherichia coli. Các chế phẩm IFN-α2 tái tổ hợp hiện nay trên thị trường đã cho thấy có tác dụng điều trị hiệu quả trên bệnh nhân qua các nghiên cứu lâm sàng đáng tin cậy. Tuy nhiên, các bệnh nhân điều trị với IFN-α2 thường phải đối mặt với các tác dụng phụ đáng kể của thuốc, dẫn đến tỉ lệ cao bệnh nhân phải giảm liều hay ngừng hẳn liệu trình điều trị [33]. Những tác dụng phụ này bao gồm các triệu chứng giống cúm như ớn lạnh, sốt, đau khớp và cơ, trầm cảm với ý định tự tử hay giảm số lượng tế bào máu. Tuy nhiên, ngày càng nhiều bằng chứng cho thấy IFN tuýp 1 nội sinh đóng vai trò trong việc kích thích phản ứng kháng virus của hệ miễn dịch và IFN tuýp 1 có khả năng tăng cường hoạt tính chống khối u của các liệu pháp hóa trị, xạ trị và một số liệu pháp trúng đích [8]. Như vậy, mục tiêu quan trọng trong tương lai chính là việc biến đổi . 5 . IFN-α2 sao cho ra đời được phân tử có hiệu quả trị liệu trên lâm sàng nhưng với tác dụng phụ tối thiểu [17]. 1.2.3. Interferon alpha 2 liều thấp đường uống Hiện nay, các chế phẩm IFN-α2 (về bản chất là một loại cytokin) trên thị trường đều được dùng dưới dạng tiêm. Tuy nhiên, sử dụng đường tiêm có thể cung cấp quá nhiều cytokin trong các mô ngoại vi, dẫn đến việc gây ra tác dụng phụ thay vì chỉ cung cấp cytokin cục bộ tại vị trí nhiễm bệnh hoặc chỉ cần cung cấp cho bộ phận miễn dịch chịu trách nhiệm phản ứng với các tác dụng điều hòa của cytokin. Ngoài ra, trong các thử nghiệm trên động vật và thực nghiệm trên người, nhiều tác dụng độc hại đã được ghi nhận khi sử dụng cytokin liều cao đường tiêm, được chứng minh qua nhiều thử nghiệm lặp lại, cả đối với người khỏe mạnh và mắc bệnh [11]. Hầu như không có trường hợp sinh lý nào cho thấy việc tiết cytokin cần lượng lớn yếu tố kích thích (ví dụ như nhiều miligam protein hay hàng triệu đơn vị sinh học) như lượng được yêu cầu trong các chế phẩm tiêm. Trong điều kiện sinh lý bình thường, các cytokin có hoạt tính sinh học thường hiện diện ở mức picogam, nanogam hoặc ít hơn, tương ứng với một phần nhỏ của liều thường được sử dụng đường tiêm. Một dạng thuốc cytokin lý tưởng sẽ là dạng thuốc có thể đưa các cytokin trực tiếp đến các tế bào mục tiêu ở liều và tần suất gần nhất so với quá trình tự nhiên diễn ra ở tế bào đó khi được kích thích. Nghiên cứu cho thấy, các đường dùng khác, cụ thể là qua đường hầu họng có thể là phương thức cung cấp cytokin hữu hiệu để thúc đẩy các tác dụng có lợi ở động vật và con người [4]. Nhiều báo cáo đã ghi nhận việc phát hiện các loại cytokin và phân tử tín hiệu trong dịch cơ thể như sữa, nước bọt và dịch tiết mũi. Số lượng và loại phân tử trong dịch tiết thay đổi theo tình trạng sức khỏe của cá nhân; do đó, nói chung, những tín hiệu này đều phản ảnh và là một thành phần không thể tách rời của các phản ứng sinh lý, tình trạng bệnh tật khác nhau của cơ thể. Điều đó cũng chứng minh rằng các phân tử được sản xuất và tiết cục bộ này là chỉ dấu của các quá trình đáp ứng miễn dịch liên tục và có thể đóng một vai trò sinh học mang tính hệ thống, do nồng độ của chúng thay đổi theo từng trạng thái và giai đoạn của bệnh. Vì sự hiện diện của các cytokin và phân tử tín hiệu trong các khoang niêm mạc, chúng được cho là có tầm quan trọng trong các quá trình sinh học và tác dụng của chúng có thể được sao chép, tăng cường . 6 . hay bắt chước bằng cách cung cấp các cytokin tương tự (ở nồng độ và tần suất thích hợp) cho bệnh nhân qua đường hầu họng [4]. Nghiên cứu về vấn đề kiểm soát số lượng và loại phân tử tín hiệu trong các dịch tiết để tạo ra được tác dụng sinh học cục bộ hay hệ thống có thể xác định được hiện là một vấn đề đang được quan tâm, nhất là những nghiên cứu về tác dụng của các cytokin đường uống đối với cơ thể. Trong số các cytokin đã được nghiên cứu, họ IFN là nhóm cytokin được áp dụng rộng rãi nhất cho động vật và con người qua đường uống, niêm mạc mũi và niêm mạc ruột. Các IFN không chỉ là họ cytokin được mô tả đầu tiên, IFN còn là họ cytokin đã được sản xuất dạng tinh khiết như dạng tiết tự nhiên hoặc qua các phân tử tái tổ hợp. Hơn nữa, các IFN đã được xác định rằng không gây độc sau khi dùng qua đường mũi, miệng hay dạ dày ở những liều và điều kiện khác nhau [11]. Do đó, nhiều nghiên cứu về hiệu quả sử dụng IFN liều thấp đường uống đã được thực hiện: Các IFN đường uống từ chuột, cừu hay có nguồn gốc từ người đã cho thấy tác dụng có lợi trên động vật gặm nhấm trong điều trị các bệnh truyền nhiễm, bệnh tự miễn hay ung thư. Các dữ liệu cho thấy những tác dụng có lợi này không liên quan trực tiếp đến sự hấp thu của IFN vào hệ tuần hoàn mà thông qua sự tương tác giữa IFN và niêm mạc mô bạch huyết tại nơi tiếp xúc của đường dùng. Thông qua những tương tác này, tác động của IFN được chuyển từ niêm mạc miệng hoặc hầu họng đến các vị trí tác động một cách có hệ thống. Trong các nghiên cứu [14], IFN đường uống cho kết quả nhất quán trong việc cảm ứng một hoặc nhiều chỉ số kích hoạt tế bào bởi IFN như sự tăng 2'5'AS tại các điểm tác động (2'5'AS là enzym 2'5'-oligoadenylat synthetase, enzym này chỉ được cảm ứng biểu hiện bởi IFN, do đó, nó là chỉ dấu phân tử cho sự kích thích tế bào do IFN gây ra). Theo đó, một loạt các cơ chế sẽ được kích hoạt bởi liều thấp IFN tại các vị trí tiếp xúc với đường dùng nơi có thụ thể của IFN, tạo thành tác động toàn thân qua thời gian. Thực tế, chỉ cần 1 đơn vị của IFN-α chuột và IFN-β chuột trong khoang miệng đã làm thay đổi số lượng của tế bào bạch cầu ở lách chuột [6]. Tại Nhật Bản, vào tháng 07 năm 2014, Bộ Nông nghiệp và Đánh bắt thủy sản đã chấp thuận sử dụng IFN-α người liều thấp đường uống trong điều trị bệnh tiêu chảy do rotavirus ở bê bé hơn 30 ngày tuổi. Liều IFN được chấp thuận trong điều trị là 0,5 U/kg cân nặng, một lần mỗi ngày, trong 5 ngày liên tiếp [11]. . 7 . Trên động vật, tác dụng bất lợi của IFN đường uống, chẳng hạn như gây độc hay làm trầm trọng bệnh chưa được ghi nhận; việc sử dụng IFN đường uống mang lại sự điều hòa phù hợp ở mức độ tế bào và phân tử, do đó nhìn chung mang lại đáp ứng sinh lý có lợi và không gây ra tác dụng dược lý có hại. Đây chính là yếu tố làm cho IFN dùng đường uống được quan tâm trong các ứng dụng lâm sàng và hứa hẹn được nghiên cứu dùng trên động vật và con người [11]. Nhiều nghiên cứu khác về tác dụng có lợi của IFN trên động vật cũng đã được thực hiện. Trong các nghiên cứu này, sự gia tăng liều IFN-α hoặc IFN-β không làm tăng tác dụng của IFN được sử dụng [5, 6, 7, 18, 32]. Các nghiên cứu cho thấy liều thấp IFN (1 đến 5 U/kg) tạo ra lợi ích lâm sàng lớn hơn so với liều cao (lớn hơn 10 U/kg). Hơn nữa, liều phải được điều chỉnh với từng bệnh cụ thể để đạt được lợi ích lâm sàng tối đa. Bên cạnh đó, trong hầu hết các trường hợp, tác dụng tối đa đạt được khi sử dụng IFN là dùng IFN trước khi khởi phát bệnh. Điều này đặc biệt đúng đối với các bệnh truyền nhiễm. Đối với các bệnh tự miễn, IFN giúp ngăn chặn hay làm giảm các phản ứng viêm, mức độ cải thiện lâm sàng tương quan chặt chẽ với lượng mô hay cơ quan bị tổn thương trước khi bắt đầu điều trị với IFN [11]. 1.3. Bào tử Bacillus là một giá mang protein hữu hiệu Vi khuẩn Gram dương B. subtilis đã được nghiên cứu chuyên sâu như là một hệ thống prokaryot mô hình vì vi khuẩn này không gây bệnh và được sử dụng như probiotic cho người và động vật [21]. Điểm khác biệt là B. subtilis có thể tạo nội bào tử như là một phần của vòng đời phát triển của nó khi thiếu các chất dinh dưỡng. Bào tử có thể chịu được điều kiện nhiệt độ khắc nghiệt như khô hạn, chịu được dung môi và các hóa chất độc hại. Trong nghiên cứu của Duc (2003), khi cho chuột uống bào tử B. subtilis SC2362 đã được tái tổ hợp gen biểu hiện protein β-galactosidase (gen này chỉ biểu hiện khi bào tử nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng), kết quả cho thấy trong huyết thanh của chuột có kháng thể kháng β-galactosidase, điều này chứng minh rằng bào tử nảy mầm có thể có hiệu quả trong việc gây đáp ứng miễn dịch trên đường tiêu hóa [15]. Với những thuận lợi như trên, B. subtilis rất có tiềm năng trở thành một giá mang protein hữu hiệu. Các protein được dung hợp vào bộ gen của B. subtilis và biểu hiện khi bào tử nảy mầm thành dạng sinh dưỡng. . 8 . Các nghiên cứu trước đây cho thấy rằng, các protein của tiêm mao vi khuẩn như flagellin có khả năng kích thích các đại thực bào sản xuất các cytokin tiền viêm như tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), và IL-6 (12) thông qua thụ thể Toll-like receptor 5 (TLR5) trên bề mặt đại thực bào và các tế bào có chức năng trình diện kháng nguyên khác như tế bào tua. Các protein tái tổ hợp với flagellin của vi khuẩn tạo được đáp ứng miễn dịch đặc hiệu qua trung gian tế bào lympho T, hình thành kháng thể đặc hiệu và có khả năng bảo vệ vật chủ khi phơi nhiễm với kháng nguyên [22]. Flagellin của B. subtilis được mã hóa bởi gen Hag có trình tự dài 915 nucleotid là một protein cấu trúc gồm 304 amino acid (aa). Cấu trúc bậc 3 của protein Hag cho thấy, vùng đầu N (aa 1-143) và vùng đầu C (aa 218-304) sẽ gấp lại và là vùng nhận diện của thụ thể TLR5 trên tế bào. Các trình tự amino acid ở giữa sẽ là vùng nhận biết của kháng thể [34]. Như vậy việc dung hợp một kháng nguyên vào flagellin của B. subtilis sẽ giúp cho việc trình diện kháng nguyên hiệu quả hơn thông qua thụ thể TLR5. Ngoài ra, Hag còn là một protein được biểu hiện nhiều nhất trong tế bào với số lượng lên đến 15 x 104 phân tử/tế bào. Mặt khác, protein Hag không phải là protein thiết yếu của vi khuẩn B. Subtilis, vì vậy biến đổi di truyền liên quan đến protein này cũng không làm ảnh hưởng đến sự sống còn của vi khuẩn [10]. Do đó, việc tái tổ hợp một gen mã hóa cho protein lạ vào gen Hag và biểu hiện trong B. subtilis sẽ có những lợi ích sau: (i) protein được biểu hiện với số lượng nhiều, (ii) tạo đáp ứng miễn dịch tế bào hiệu quả nhờ flagellin, (iii) kháng nguyên được bảo vệ tránh những yếu tố lý hóa khi được mang bởi vi khuẩn ở dạng bào tử, (iv) kháng nguyên sẽ được sản xuất tại nơi cần tác động (tại ruột) khi bào tử B. subtilis nảy mầm thành dạng sinh dưỡng. . 9 . CHƯƠNG 2 . VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 2.1.1. Chủng vi sinh vật và vector - Escherichia coli DH5α (fhuA2 lac(Δ)U169 phoA glnV44 Φ80 lacZ(Δ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17) được dùng làm chủng tạo dòng. - Escherichia coli BL21 (DE3) (F–ompT gald cmlo nhsdSB(rB–mB–) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB+]K-12(λS)) được dùng làm chủng biểu hiện protein. - Bacillus subtilis PY79 - Plasmid pET28b(+), plasmid pDG364 - Plasmid pUC57-IFN là plasmid pUC57 mang đoạn gen IFNA2 mã hóa cho IFNα2a người, được gửi tổng hợp tại công ty GenScript. Trình tự đoạn gen IFNA2 này đã được tối ưu hóa để biểu hiện trong vi khuẩn Bacillus subtilis. 2.1.2. Danh sách mồi Mồi được thiết kế bằng phần mềm SnapGene 1.1.3 và được gửi tổng hợp bởi Công ty Intergrated Technologies (IDT). Bảng 2.1. Trình tự các mồi sử dụng trong Nghiên cứu. Tên HAGN_F HAGN_R IFN_F IFN_R HAGC_F HAGC_R Trình tự (*) 5’GGTCTCTGATCCgcagcagcgttatccagc3’ 5’GGTCTCACAGtgatttgcaggagtagctgtg 3’ 5’GGTCTCAACtgtgacctgccgcaaac3’ 5’GGTCTCACAGCttctttgcttctcaggctttc3’ 5’GGTCTCtgctgatatcggtttcgatg3’ 5’GGTCTCAAGCTCctggcaacgccaaggtc3’ Đầu dính Nhiệt độ gắn mồi tương thích BamHI 58 oC 56 oC IFN_F 57 ºC HagN_R 55 ºC HagC_F 58 ºC IFN_R HindIII 61 ºC (*) Chữ thường: trình tự bắt cặp; Gạch chân: Trình tự đầu dính tương thích; VIẾT HOA: trình tự thêm vào; VIẾT HOA IN ĐẬM: Trình tự nhận diện của enzym cắt giới hạn BsaI 2.1.3. Bố trí thí nhiệm Bước 1: Thiết kế trình tự tối ưu của IFN alpha 2a biểu hiện trên Bacillus subtilis PY79 . 10 . - Việc tối ưu hóa codon được thực hiện bằng cách thay đổi các codon dựa trên trang web http://atgme.org/, và so sánh chỉ số CAI, ENc của gen mã hóa IFN alpha 2a của B. subtilis bằng trang web http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/. Trong đó, bảng tần suất sử dụng codon của loài B.subtilis subsp. subtilis str. 168 lấy từ trang http://www.kazusa.or.jp/codon/ được sử dụng để tham chiếu. - Sau khi hoàn tất tối ưu hóa codon, gửi trình tự đoạn gen mã cho IFN alpha 2a để tiến hành tổng hợp. Bước 2: Tạo dòng Bacillus subtilis mang Interferon alpha 2a được khảm trong cấu trúc tiêm mao: - Cấu trúc vector pHagP-NIC là pDG364 mang gen HagP-NIC tái tổ hợp và biến nạp vào E. coli DH5, chọn lọc thể biến nạp. - Biến nạp vào B. subtilis PY79, chọn lọc và tạo dòng chủng B. subtilis PY79 mang gen tái tổ hợp HagP-NIC. Bước 3: Đánh giá sự biểu hiện protein tiêm mao và sự biểu hiện protein IFN-α2a - Sự biểu hiện tiêm mao được đánh giá bằng các phương pháp: Quan sát di động dưới kính hiển vi, nhuộm tiêm mao và Western Blot. - Các chủng B. subtilis PY79 tái tổ hợp mang gen HagP-NIC được kiểm tra sự biểu hiện IFN-α2a bằng phương pháp Western Blot. 2.1.4. Phương pháp chung 2.1.4.1. Sàng lọc chủng mang gen tái tổ hợp Chủng mang gen tái tổ hợp được sàng lọc bước đầu trên đĩa biến nạp bằng phản ứng PCR khuẩn lạc [3]: - Phân tán các khuẩn lạc trên đĩa biến nạp trong 15 µl NF-Q1 và sốc nhiệt ở 95 oC trong 3 phút. - Thực hiện phản ứng PCR khuẩn lạc với 3 µl dịch vi khuẩn đã sốc nhiệt, sử dụng cặp mồi và chương trình nhiệt tương ứng cho gen tái tổ hợp. - Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose kèm chứng dương. Các khuẩn lạc cho kết quả PCR khuẩn lạc dương tính được xác nhận tái tổ hợp bằng phản ứng với enzym cắt giới hạn hoặc phản ứng PCR kiểm tra với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen tái tổ hợp theo các bước sau: . 11 . Cấy hoạt hóa các khuẩn lạc cho kết quả dương tính với phản ứng PCR khuẩn lạc trong 5 ml LB bổ sung kháng sinh phù hợp, lắc ở 37 oC trong 14-16 giờ. Sau đó chọn 1 trong 2 cách để kiểm tra sự hiện diện của đoạn chèn bằng cách cắt với enzym cắt giới hạn. 2.1.4.2. Chuẩn bị tế bào khả nạp Bacillus subtilis - Ria chủng B. subtilis trên thạch LB và ủ qua đêm ở 37 oC. - Cấy 1 khóm B. subtilis vào 20 ml môi trường SpC đã được làm ấm. - Lắc ở 37 oC/200 rpm đến khi OD600 không đổi qua 20-30 phút. - Kiểm tra di dộng của vi khuẩn dưới kính hiển vi - phần lớn vi khuẩn cần phải di dộng. - Pha loãng dịch canh cấy SpC tỉ lệ 1:10 vào môi trường SpII mới chuẩn bị đã được làm ấm. - Lắc ở 37 oC với tốc độ 150 rpm. Kiểm tra di động dưới kính hiển vi. - Ly tâm 8000 g trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, hút dịch nổi giữ lại. - Nhẹ nhàng phân tán cắn trong 1/10 thể tích dịch nổi và thêm glycerol vô trùng để đạt nồng độ cuối là 10%. - Chia thành các ống 200 μl. Đông lạnh tức thời bằng nitơ lỏng trong 5-10 phút. Giữ ở -80 oC [3]. 2.1.4.3. Phương pháp Western Blot Chuẩn bị trước khi chuyển protein lên màng [3]: - Ngâm gel polyacrylamide điện di protein SDS-PAGE trong Đệm chuyển màng trong 15 phút. - Cắt màng nitrocellulose sao cho vừa kích thước gel polyacrylamide, đánh dấu chiều của màng. - Làm ướt màng bằng cách ngâm trong Đệm chuyển màng trong 15 đến 30 phút. - Bão hòa giấy lọc (loại dày) trong Đệm chuyển màng. Thực hiện việc chuyển protein lên màng theo các bước áp dụng cho máy Trans-Blot SD, theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Chạy máy ở 15V trong 30 phút. Sau khi đã chuyển protein lên màng, thực hiện cố định màng: - Ngâm màng trong TBS-T + 5% sữa gầy trong 1 giờ, lắc trên máy lắc phiến. . 12 . - Rửa màng với TBS-T qua 3 bước: (i) rửa nhanh 2 lần, (ii) ngâm trong 15 phút (iii) ngâm trong 5 phút x 2 lần. - Ủ màng với kháng thể sơ cấp trong 1 giờ. Rửa màng với TBS-T như bước trước đó. - Ủ màng với kháng thể thứ cấp trong 1 giờ Rửa màng với TBS-T như bước trước đó. Phát hiện protein mục tiêu: Cho từng giọt TMB (3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin) (Sigma) lên màng, quan sát nếu có protein mục tiêu sẽ xuất hiện vạch màu tím. 2.1.5. Phương pháp tạo dòng Bacillus subtilis mang Interferon alpha 2a được khảm trong cấu trúc tiêm mao Với mong muốn tạo dòng B. subtilis mang Interferon alpha 2a được khảm trong cấu trúc tiêm mao, gen IFNA2 đã được chèn vào giữa đoạn gen Hag mã hóa cho protein tiêm mao của B. subtilis, thay cho vùng không bảo tồn của gen Hag. Nghiên cứu sử dụng pDG364 làm vector để tích hợp gen tái tổ hợp HagP-NIC vào bộ gen B. subtilis theo cơ chế trao đổi chéo double crossover vào cassette AmyE. . 13 . Hình 2.1. Sơ đồ tạo dòng pHagP-NIC. 2.1.5.1. Tạo dòng vector pHagP-NIC trong Escherichia coli DH5α Bước 1: Thu nhận nguyên liệu tạo dòng: - Thu nhận vector pDG364 bằng kit chiết plasmid. - Thu nhận gen HagN (676 bp) bằng phản ứng PCR với cặp mồi HAGN_F/HAGN_R, gen HagC (335 bp) với cặp mồi HAGC_F/HAGC_R trên khuôn mẫu là bộ gen của B. subtilis PY79. Bộ gen của B. subtilis PY79 được thu nhận bằng kit chiết DNA NST. - Thu nhận gen IFNA2 (495 bp) bằng phản ứng PCR với cặp mồi IFN_F/IFN_R trên khuôn mẫu là vector pUC57-IFN. . 14