Tài liệu Nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme pectinase từ aspergillus niger và thử nghiệm bóc vỏ tiêu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM ENZYME PECTINASE TỪ Aspergillus niger VÀ THỬ NGHIỆM BÓC VỎ TIÊU (Pepper nigrum L.) Mã số: Chủ nhiệm đề tài: ThS. Trần Ngọc Hùng Bình Dương, 12 / 2018 MỤC LỤC Danh mục bảng .............................................................................................................. 1 Danh mục hình ............................................................................................................... 2 Danh mục từ viết tắt ....................................................................................................... 3 Thông tin kết quả nghiên cứu ........................................................................................ 4 Mở đầu ........................................................................................................................ 12 1. Tính cấp thiết ............................................................................................................ 12 2. Mục tiêu đề tài .......................................................................................................... 12 3. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................................. 13 4. Phạm vi nghiên cứu ................................................................................................. 13 Chương 1: Tổng quan tài liệu .................................................................................... 14 1.1. Khái quát về nấm Aspergillus ............................................................................... 14 1.1.1. Phân loại Aspergillus ....................................................................................... 14 1.1.2. Đặc điểm hình thái ........................................................................................... 14 1.1.3. Đặc điểm dinh dưỡng ....................................................................................... 15 1.1.4. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của Aspergillus .......................................... 16 1.2. Giới thiệu về enzyme pectinase ............................................................................ 16 1.2.1. Phân loại enzyme pectinase ............................................................................. 16 1.2.2. Đặc điểm cấu trúc và xúc tác của enzyme pectinase ....................................... 17 1.2.3. Nguồn thu nhận enzyme pectinase .................................................................. 20 1.2.4. Đặc điểm enzyme pectinase của Aspergillus ................................................... 20 1.2.5. Vai trò của cơ chất pectin đối với sự phát triển của nấm mốc sinh tổng hợp pectinase ................................................................................... 21 1.2.6. Ứng dụng của enzyme pectinase .................................................................... 22 1.3. Giới thiệu về hồ tiêu .............................................................................................. 23 1.3.1. Đặc điểm chung của cây tiêu .......................................................................... 23 1.3.2. Vai trò của tiêu đối với đời sống ..................................................................... 24 1.3.3. Giá trị kinh tế của hồ tiêu ................................................................................ 24 1.3.4. Thành phần hóa học của hạt tiêu .................................................................... 26 1.3.5. Thành phần hóa học và cấu trúc của vỏ tiêu ................................................... 26 1.3.6. Các phương pháp bóc vỏ tiêu hiện nay ........................................................... 27 1.4. Những nghiên cứu gần đây liên quan đến đề tài ................................................... 28 Chương 2: Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu .................................................... 31 2.1. Vật liệu và các loại môi trường dùng trong nghiên cứu ........................................ 31 2.1.1. Vật liệu ............................................................................................................... 31 2.1.2. Các loại môi trường dùng trong nghiên cứu ...................................................... 31 2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................... 31 2.2.1. Phương pháp nuôi cấy bán rắn thu nhận enzyme ............................................ 31 2.2.2. Phương pháp bóc vỏ tiêu theo truyền thống .................................................... 31 2.2.3. Xác định hoạt tính enzyme pectinase .............................................................. 32 2.2.4. Xác định hoạt tính cellulase theo phương pháp định lượng đường khử .......... 34 2.2.5. Phương pháp xác định hàm lượng piperine ..................................................... 35 2.2.6. Phương pháp xác định hàm lượng protein trong chế phẩm bán tinh sạch ...... 35 2.2.7. Phương pháp xác định độ ẩm chế phẩm pectinase bán tinh sạch ................... 35 2.2.8. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................. 35 2.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................. 36 2.3.1. Xác định các điều kiện nuôi cấy Aspergillus niger để thu nhận chế phẩm enzyme pectinase .............................................................. 36 2.3.2. Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm enzyme giàu pectinase trên quy mô thí nghiệm .................................................................................... 37 2.3.3. Thử nghiệm nâng cao khả năng bóc vỏ tiêu xanh của chế phẩm enzyme pectinase ............................................................................................ 37 Chương 3: Kết quả...................................................................................................... 40 3.1. Xác định các điều kiện nuôi cấy Aspergillus niger để thu nhận chế phẩm enzyme pectinase ................................................................................................... 40 3.2. Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm enzyme giàu pectinase trên quy mô thí nghiệm .......................................................................................... 46 3.3. Thử nghiệm nâng cao khả năng bóc vỏ tiêu xanh của chế phẩm enzyme pectinase .................................................................................................. 48 Chương 4. Kết luận và kiến nghị .............................................................................. 56 4.1. Kết luận ................................................................................................................. 56 4.2. Kiến nghị ............................................................................................................... 56 Tài liệu tham khảo ..................................................................................................... 57 Phụ lục ......................................................................................................................... 61 ii DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Thành phần pectin và mức độ ester hóa của một số loại nguyên liệu ................. 22 Bảng 2. Nội dung các nghiệm thức thí nghiệm ................................................................ 37 Bảng 3. Hoạt độ pectinase của các chủng Aspergillus niger ............................................ 40 Bảng 4. Hoạt tính pectinase của chủng Aspergillus B2 trên môi trường chứa chất cảm ứng khác nhau .................................................... 41 Bảng 5. Ảnh hưởng của tỷ lệ cùi bưởi đến hoạt độ pectinase của chủng Aspergillus B2 .................................................................................... 42 Bảng 6. Ảnh hưởng của lượng nước trong môi trường bán rắn đến hoạt độ pectinase .... 43 Bảng 7. Ảnh hưởng của pH dịch khoáng đến khả năng sinh enzyme pectinase của Asp. niger B2 .................................................................................................. 44 Bảng 8. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ pectinase của chủng Aspergillus B2 ....................................................................................................... 45 Bảng 9. Các chỉ tiêu chất lượng của chế phẩm enzyme pectinase sản xuất trên quy mô pilot .................................................................................................. 48 Bảng 10. Ảnh hưởng của lượng nước ngâm tiêu đến khả năng bóc vỏ ........................... 49 Bảng 11. Ảnh hưởng của thời gian ngâm nước đến hiệu suất bóc vỏ tiêu ........................... 50 Bảng 12. Ảnh hưởng của nhiệt độ ngâm đến hiệu suất bóc vỏ tiêu ................................. 51 Bảng 13. Hàm lượng đường khử và hoạt độ các enzyme trong dịch nước ngâm tiêu ..... 52 Bảng 14. Ảnh hưởng của hoạt độ enzyme pectinase lên hiệu suất bóc vỏ tiêu ............... 53 Bảng 15. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng hoạt động của enzyme pectinase trong dịch ngâm tiêu ...................................................... 54 Bảng 16. Hiệu suất bóc vỏ tiêu trên quy mô pilot ............................................................ 55 Bảng 17. Hàm lượng piperine của tiêu bóc vỏ thử nghiệm và một số sản phẩm cùng loại ............................................................................................ 56 1 DANH MỤC HÌNH Hình 1. Khuẩn lạc Aspergillus trên môi trường PGA sau 3 ngày ..................................... 15 Hình 2. Mô hình hoạt động thủy phân của enzyme pectinase .......................................... 19 Hình 3. Cấu trúc vách tế bào thực vật ............................................................................... 23 Hình 4. Hoạt độ pectinase của các chủng Aspergillus niger ............................................ 40 Hình 5. Ảnh hưởng của cơ chất đến khả năng sinh pectinase của chủng Aspergillus B2 ...................................................................................................... 41 Hình 6. Ảnh hưởng của tỷ lệ cùi bưởi đến khả năng sinh tổng hợp pectinase ................. 42 Hình 7. Ảnh hưởng của lượng nước bổ sung đến khả năng sinh tổng hợp pectinase ....... 43 Hình 8. Ảnh hưởng của pH dịch khoáng lên khả năng sinh enzyme pectinase của Asp. niger B2 ................................................................................................. 44 Hình 9. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ pectinase trong canh trường ...... 45 Hình 10. Quy trình sản xuất chế phẩm giàu enzyme pectinase bán tinh sạch .................. 47 Hình 11. Ảnh hưởng của việc bổ sung nước lên quá trình bóc vỏ tiêu ............................ 49 Hình 12. Ảnh hưởng của thời gian ngâm nước đến hiệu suất bóc vỏ tiêu. ....................... 50 Hình 13. Ảnh hưởng của nhiệt độ ngâm đến quá trình bóc vỏ tiêu. ................................. 51 Hình 14. Hàm lượng đường khử và hoạt độ các enzyme trong dịch nước ngâm tiêu ...... 52 Hình 15. Ảnh hưởng của hoạt độ pectinase bổ sung đến quá trình bóc vỏ tiêu ............... 54 Hình 16. Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến quá trình bóc vỏ tiêu .......................... 54 Hình 17. Hiệu suất bóc vỏ tiêu trên quy mô pilot ............................................................ 55 Hình 18. Hàm lượng piperine của sản phẩm tiêu sọ thử nghiệm và một số sản phẩm tiêu sọ phổ biến trên thị trường .............................................. 57 Hình 19. Tiêu xanh nguyên liệu (a) và sản phẩm tiêu sau khi bóc vỏ ............................. 57 2 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT PTN : Phòng thí nghiệm WA : Water Agar PE : Pectin esterase PME : Pectin Methyl Esterase PG : Polygalacturonase EC. : Enzyme Code TE : Trans-elyminase PL : Pectin lyase GLS : Galacturonic acid RHA : Rhamnose UI : Unit International DNS : Dinitro Salicylic Acid OD : Optical Density TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam NT : Nghiệm thức 3 TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT Đơn vị: Khoa Khoa học Tự nhiên THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Thông tin chung: - Tên đề tài: Nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme pectinase từ Aspergillus niger và thử nghiệm bóc vỏ tiêu (Piper nigrum L.) - Mã số: - Chủ nhiệm: ThS. Trần Ngọc Hùng - Đơn vị chủ trì: Khoa Khoa học Tự nhiên - Thời gian thực hiện: 01/2018 – 01/2019 2. Mục tiêu: - Nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme pectinase bán tinh sạch, dạng bột. - Thử nghiệm khả năng bóc vỏ tiêu của chế phẩm. 3. Tính mới và sáng tạo: Enzyme pectinase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lãnh vực khác nhau như sản xuất nước ép, rượu; ly trích dược chất; xử lý môi trường… Trong lĩnh vực chế biến thực phẩm, enzyme pectinase giúp tăng hiệu quả sản xuất, chế biến của các sản phẩm nông sản như trà, cà phê, hồ tiêu… Tiêu trắng là sản phẩm được nhiều thị trường lớn ưa chuộng. Việc sản xuất tiêu trắng chủ yếu là sản xuất thủ công và bán công nghiệp từ tiêu xanh hoặc tiêu đen theo phương pháp ngâm nước. Quá trình này thường kéo dài từ 10 – 12 ngày, làm cho tiêu sau khi xát vỏ thường sậm màu, mùi rất khó chịu và phải khử màu khử, mùi bằng hóa chất. Lượng nước ngâm tiêu trong quy trình chế biến cũng là một nguy cơ gây ô nhiễm môi trường. Đề tài nghiên cứu khả năng sử dụng enzyme pectinase được nuôi thu nhận từ việc nuôi cấy bán rắn chủng Aspergillus niger B2 để rút ngắn thời gian bóc vỏ tiêu. Theo đó, 4 giúp nâng cao hiệu quả trong chế biến tiêu sọ và giảm áp lực xử lý môi trường của xí nghiệp chế biến tiêu sọ. 4. Kết quả nghiên cứu: Kết quả sàng lọc 9 chủng Aspergillus niger cho thấy, chủng Aspergillus niger B2 có khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase tốt nhất trên môi trường bán rắn chứa 12 % bột cùi bưởi, lượng dịch khoáng bổ sung chiếm 40 %, pH 5,5. Sau 5 ngày, hoạt độ pectinase trong canh trường đạt 4,82 UI/g. Trên quy mô sản xuất thử 10 kg/mẻ, chế phẩm có hoạt độ pectinase đạt 91,3 % so với khi nuôi cấy trong các bình tam giác. Kết quả thí nghiệm cho thấy có sự giải phóng enzyme cellulase và pectinase nội sinh từ vỏ tiêu khi ngâm tiêu với nước trong khoảng 24 giờ. Trong trường hợp không bổ sung enzyme pectinase, hiệu quả bóc vỏ tiêu đạt cao nhất khi bổ sung nước với tỷ lệ tiêu/nước là 1/1, sau 48 giờ ngâm ở nhiệt độ 35 oC, hiệu suất bóc vỏ tiêu đạt 92,20 %. Trên quy mô thử nghiệm với khối lượg 5 kg, tiêu được ngâm nước 24 giờ, bổ sung enzyme pectinase với hoạt độ 4 UI/ 50 g tiêu, ủ ở nhiệt độ 40 oC trong thời gian 4 giờ, hiệu suất bóc vỏ tiêu đạt 93,20 %. Hàm lượng piperine trong sản phẩm tiêu sọ thử nghiệm đạt 6,58 %, cao hơn so với một số sản phẩm phổ biến trên thị trường hiện nay. Kết quả thử nghiệm là cơ sở bước đầu để chúng tôi xây dựng một quy trình sản xuất tiêu sọ hoàn chỉnh. 5. Sản phẩm: 03 bài báo khoa học và hướng dẫn 02 nhóm SV CNKH - Bài báo đăng trên tạp chí Phát triển Khoa học và Kỹ thuật, số chuyên san KHTN: Trần Ngọc Hùng, Nghiên cứu nâng cao hiệu quả bóc vỏ tiêu đen (Piper nigrum L.), Tạp chí Phát triển Khoa học và Kỹ thuật, số chuyên san KHTN, Tập 5, Số T20, 2017, tr. 50-57. - Bài báo đăng trên tạp chí đại học Thủ Dầu Một: Trần Ngọc Hùng, Nguyễn Thị Ngọc Như, Trương Ngọc Loan, Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng bóc vỏ của tiêu đen (Piper nigrum L.), Tạp chí đại học Thủ Dầu Một, Số 6(25), 2015, tr. 40-34. - Bài báo đăng trên tạp chí đại học Thủ Dầu Một: Trần Ngọc Hùng, Nguyễn Thị Ngọc Như, Nguyễn Anh Dũng, Mai T. Ngọc Lan Thanh, Nghiên cứu thu nhận chế 5 phẩm pectinase từ Aspergillus niger nuôi cấy trên môi trường bán rắn chứa cùi bưởi để nâng cao hiệu quả bóc vỏ tiêu, Tạp chí đại học Thủ Dầu Một, Số 5(30), 2016, tr. 82-89. - Hướng dẫn sinh viên thực hiện đề tài NCKH năm 2014-2015: Nghiên cứu sử dụng vi nấm Trichoderma sp. và Aspergillus sp. để bóc vỏ tiêu xanh. Sinh viên thực hiện chính: Trần Thị Ngọc Như; Xếp loại: giỏi - Hướng dẫn sinh viên thực hiện đề tài NCKH năm 2015-2016: Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng bóc vỏ của tiêu đen (Piper nigrum L.). Sinh viên thực hiện chính: Trần Thị Ngọc Như; Xếp loại: tốt - Quy trình sản xuất chế phẩm giàu enzyme pectinase trên quy mô pilot. - Sản phẩm tiêu trắng sau bóc vỏ: 1 kg - Báo cáo tổng thuật tài liệu và báo cáo tổng kết đề tài. 6. Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng: Kết quả đề tài có thể giúp sản xuất chế phẩm giàu enzyme pectinase trên quy mô pilot. Chế phẩm được định hướng để ứng dụng trong chế biến tiêu sọ hoặc chế biến cà phê. Ngày tháng năm Đơn vị chủ trì Chủ nhiệm đề tài (chữ ký, họ và tên) (chữ ký, họ và tên) 6 INFORMATION ON RESEARCH RESULTS 1. General information: Project title: Studying to produce the nitrogen solution from red worm (Perionys excavatus) for add to feed chickend. Code number: Coordinator: MS. Tran Ngoc Hung Implementing institution: Deparment of Natural Science Duration: from January/2018 to January/2019 2. Objective(s): - Study on producing the semi-purified pectinase preparation, powder form. - Experiment the capability of the preparation in taking off the husk of pepper 3. Creativeness and innovativeness: Pectinase enzyme are probably applied in many fields, such as production of fruit juice, wine; extraction of pharmaceutical substrate; environmental treatment… In food process, pectinase enzyme help increase effective of agro-product process such as tea, coffee, pepper… The white pepper are liked by the market of developed countries. Production of white pepper is mainly manual or semi-industrial from the fresh pepper or black pepper by the immersing way. This way often takes 10 – 12 days, making the sheeling pepper have a dark colour, unpleasant smell. This way also require a large of water that is a harzard cause environmental pollution. The experimental subject used pectinase enzyme receiving from culturing the Aspergillus niger B2 on the semi-solid medium to shorten the time of shelling pepper. Accordingly, the result of subject help increase the effective of white pepper process and decrease the pressure of environmental treatment at self enterprise. 4. Research results: The result of screening 9 strains of Aspergillus niger showed B2 strain synthesis pectinase enzyme with the highest yield on the semi-solid medium containing 12 % of pomelo pulp; 40 % of mineral solution, pH 5.5. After 5 days, the pectinase yield in 7 cultured gets 4.82 UI/g. At the 10 kg/batch of scale, pectinase activity of the preparation gets 91.3 % in comparison with the flask scale. The results showed having eliminating of cellulose and pectinase enzyme from the self peel pepper in 24 hours of immersing. Our research gave two solutions to improve these disadvantages gradually. 1) Shelling yield that immersed in water with the ratio 1:1 in weight at 35 oC in 48 hours, gets 92.2 %. 2) When adding pectinase at activity 4 UI/ 50gr pepper, hydrolyzing at 40 oC in 4 hours, the effective of removing the husk of the pepper reaches 93.2 percents after 28 hours, the content of piperine of white pepper reaches 6.58 %. 5. Products: - A article in Jounal of Science and Technology Development: Tran Ngoc Hung, Study on improving the effectiveness of taking off the husk of black pepper (Piper nigrum L.), Jounal of Science and Technology Development, Vol. 5, No. T20, 2017, pp. 50-56. - A article in Jounal of Thu Dau Mot University: Tran Ngoc Hung, Tran Thi Ngoc Nhu, Truong Ngoc Loan, Study on effect of some factors on taking off the husk of the black pepper (Piper nigrum L.), Jounal of Thu Dau Mot University, No. 6 (25), 2015, pp. 50-57. - A article in Jounal of Thu Dau Mot University: Tran Ngoc Hung, Tran Thi Ngoc Nhu, Nguyan Anh Dung, Mai T. Ngoc Lan Thanh, Research on producing pectinase from Aspergillus niger on solid state medium containing grape fruit pulp for improving pepper peeling, Jounal of Thu Dau Mot University, No. 5(30), 2016, pp. 82-89. - Guiding students carry out the scientific subject in 2015: Study on the using Trichoderma sp. and Aspergillus sp. to taking off the husk of fresh pepper. Main responsibility student: Tran Thi Ngoc Nhu; Rank: good - Guiding students carry out the scientific subject in 2016: Study on effect of some factors on taking off the husk of the black pepper (Piper nigrum L.), Main responsibility student: Tran Thi Ngoc Nhu; Rank: excellent - Process of production of the rich-pectinase preparation on the pilot scale. - The peeling pepper product: 1 kg. - The special subject report, the documentary report and the summary report. 8 6. Effects, transfer alternatives of reserach results and applicability: The experimental results could help produce the rich-pectinase preparation on the pilot scale. The preparation is used for apply in the white pepper process or the coffee process. 9 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết Trên thị trường thế giới, giá xuất khẩu tiêu đen khoảng 7.399 USD/tấn, tiêu trắng trên 10.648 USD/tấn. So với 2013, giá tiêu đen tăng 17,56 % so với giá tiêu trắng ở nước ta, tiêu trắng được sản xuất với lượng thấp hơn rất nhiều so với tiêu đen, trong khi ở các nước khác, xu hướng chung là phát triển sản xuất và chế biến tiêu trắng. Tiêu trắng được tiêu thụ chủ yếu ở các nước phát triển như ở Châu Âu, Châu Mỹ, Châu Á ưa chuộng, do màu sắc hấp dẫn, mùi thơm nồng và ít tạp nhiễm vi sinh vật nên tiêu trắng được sử dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm ở nhiều nước (Trần Bình Định, 2012; Hiệp hội hồ tiêu Việt Nam, 2014). Hiện nay, việc sản xuất tiêu trắng chủ yếu là sản xuất thủ công và bán công nghiệp từ tiêu xanh hoặc tiêu đen theo phương pháp ngâm nước. Quá trình này thường ngâm dài ngày, từ 10 – 12 ngày, và thay nước nhiều lần đến khi vỏ tiêu thối mũn mới đem xát vỏ. Vì vậy sau khi xát vỏ, tiêu thường sậm màu, mùi rất khó chịu và phải khử màu, khử mùi bằng hóa chất. Việc phân rã vỏ tiêu chủ yếu là phân rã tự nhiên, chỉ tiêu vi sinh của tiêu trắng thường không đạt tiêu chuẩn, do vậy phải sấy tiêu ở nhiệt độ cao trong thời gian dài để khử khuẩn gây tổn thất các hợp chất thơm bay hơi, làm giảm chất lượng sản phẩm (Trung tâm Khuyến nông quốc gia, 2012). Trong khi đó, nhiều nghiên cứu đã cho thấy enzyme pectinase có khả năng thủy phân tốt thành phần pectin trong vỏ tiêu, giúp quá trình bóc vỏ diễn ra nhanh hơn. Ngoài ra, enzyme còn được sử dụng nhiều trong các quy trình chế biến nước giải khát, nâng cao hiệu quả chế biến cà phê. Enzyme pectinase được sản xuất trên quy mô công nghiệp từ vi khuẩn Bacillus hoặc các loại nấm mốc. Trên môi trường bán rắn, vi khuẩn Bacillus lại sinh tổng hợp pectinase không cao. Trong khi đó, nuôi cấy lỏng lại yêu cầu nhiều thiết bị và dễ nhiễm tạp. So với các nguồn thu nhận pectinase khác, Aspergillus niger có khả năng sản xuất pectinase với hoạt tính cao, rất dễ nuôi cấy, chúng phát triển tốt trên nhiều loại phế phụ liệu nông nghiệp giàu pectin. Với nguồn giống là các chủng Aspergillus niger được phân lập tại địa phương, trên các cơ chất giàu pectin, chúng tôi đề xuất đề tài: Nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme pectinase từ Aspergillus niger và thử nghiệm bóc vỏ tiêu (Pepper nigrum L.). 10 2. Mục tiêu đề tài - Nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme pectinase bán tinh sạch, dạng bột. - Thử nghiệm khả năng bóc vỏ tiêu của chế phẩm. 3. Đối tượng nghiên cứu: - Hồ tiêu (Pepper nigrum L.) : Tiêu già được thu hái, loại cuống, hạt lép và phơi nắng cho đến khi độ ẩm còn khoảng 20 %. Dung trọng tiêu khoảng 570g/lít. - Các chủng nấm Aspergillus niger được phân lập trên các phế liệu giàu pectin như cùi bưởi, cỏ cam, vỏ chanh… do PTN bộ môn sinh học, trường đại học Thủ Dầu Một cung cấp. 4. Phạm vi nghiên cứu: - Nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm enzyme pectinase từ Aspergillus niger ở quy mô thí nghiệm. - Nghiên cứu các điều kiện để nâng cao khả năng bóc vỏ tiêu của chế phẩm enzyme pectinase. 11 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái quát về nấm Aspergillus 1.1.1. Phân loại Aspergillus Aspergillus là một trong những chi có tên là lâu đời nhất của nấm. Đến năm 1926, Aspergillus đã trở thành một trong những nhóm nấm mốc nổi tiếng nhất và nghiên cứu nhiều nhất. Phân loại Aspergillus thuộc giới Fungi, ngành Deuteromycota, bộ Eurotiales, họ Trichocomaceae, chi Aspergillus gồm hơn 185 loài, khoảng 20 loài cho đến đã được báo cáo là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng cơ hội trong cơ thể người, nhiều loài gây bệnh cho thực vật. Nhiều loài được con người ứng dụng để sản xuất thực phẩm, hóa chất và các enzyme như Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus clavatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus terreus, Aspergillus oryzae… (Bùi Xuân Đồng, 2002; Cao Ngọc Điệp, 2005). 1.1.2. Đặc điểm hình thái Aspergillus có khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn ngang hoàn chỉnh, không màu, màu nhạt, hoặc một số trường hợp trở nên nâu hay màu sẫm khác ở vùng nhất định của khuẩn lạc. Nhiều khuẩn ty của Aspergillus phát triển trên bề mặt cơ chất để hấp thu chất dinh dưỡng và khuẩn ty đứt thành khúc và mỗi khúc hay đoạn có thể phát triển cho ra một khuẩn lạc mới. Trong quá trình sinh sản vô tính, khuẩn ty của nấm Aspergillus hình thành một cọng mang túi bào tử và bào tử đính với cọng mang túi bào tử không vách ngăn và không xuất phát từ tế bào. Túi hay bọng là tế bào đa nhân và phát triển bề mặt gắn liền với thể bình. Thể bình có thể có cấu trúc bậc 1 hay bậc 2, thể bình là cấu trúc đa nhân, trên đầu thể bình tạo thành một chuỗi bào tử đính. Những bào tử non ở phía trong và càng xa thì càng già; bào tử trưởng thành sẽ phóng thích vào không khí và nảy mầm. Ngoài hình thức sinh sản vô tính Aspergillus còn có hình thức sinh sản hữu tính. Hình thức này chỉ được phát hiện ở một vài loài, chúng tạo thành những bộ phận sinh dục là túi đực và túi noãn (Bùi Xuân Đồng, 2002; Cao Ngọc Điệp, 2005). 12 b a c d Hình 1. Khuẩn lạc Aspergillus trên môi trường PGA sau 3 ngày. a) Aspergillus T4; b) Aspergillus oryzae; c) Aspergillus niger B2; d) cấu trúc bào tử và cọng mang bào tử đính của chủng Aspergillus B2 trên môi trường WA sau 3 ngày, quan sát ở vật kính 40X. 1.1.3. Đặc điểm dinh dưỡng Nấm Aspergillus sinh trưởng không cần ánh sáng, nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển là từ 2 – 5 oC, tối ưu từ 22 – 27 oC và nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35o – 40 oC. Oxy cũng cần cho sự phát triển của chúng vì chúng là nhóm hiếu khí bắt buộc, sự phát triển sẽ ngưng khi không có oxy và tất nhiên nước là yếu tố cần thiết cho sự phát triển. Theo Alexopoulos và Mims (1979), nguồn dưỡng chất cần thiết cho Aspergillus được xếp theo thứ tự sau: C, O, H, N P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và Ca. Các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn vô cơ đơn giản như glucose, muối ammoni, ... sẽ được nấm hấp thu dễ dàng. Nếu từ nguồn thức ăn hữu cơ phức tạp, nấm Aspergillus sẽ sản sinh và tiết ra bên ngoài các loại enzyme thích hợp để cắt các đại phân tử này thành những phân tử nhỏ để dễ hấp thu vào trong tế bào (Cao Ngọc Điệp, 2005). 13 1.1.4. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của Aspergillus Trong công nghệ sản xuất enzyme (amylase, glucoamylase, pectinase, protease, cellulase), công nghiệp chế biến thực phẩm, sản xuất acid hữu cơ (acid citric, acid gluconic), loài Aspergillus niger và Aspergillus oryzae được sử dụng rất phổ biến. Nhiều loài thuộc chi nấm Aspergillus này có hoạt tính biến đổi sinh học, một số loài tạo thành độc tố (mycotoxin). Đặc biệt đáng chú ý là các loài tạo thành các độc tố aflatoxin gây ung thư gan như loài Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus versicolor tạo thành sterigmatocystin. Ở Việt Nam, có nhiều nghiên cứu chọn lọc các chủng thuộc các loài Aspergillus niger, Aspergillus oryzae có hoạt tính amylase và glucoamylase để phân giải tinh bột sắn. Aspergillus oryzae được nghiên cứu để thu nhận enzyme protease sử dụng trong sản xuất nước chấm và khử lông da súc vật. Aspergillus niger được thu nhận và sử dụng sản xuất enzyme pectinase, amylase để xử lí nguyên liệu nguồn gốc từ thực vật. Aspergillus niger có khả năng tạo cellulase, chủ yếu là cellulase Cl, cellulase Cx, bglucosidase hay cellobiase, ngoài ra nhiều nghiên cứu còn sử dụng một số chủng thuộc loài Aspergillus niger để nâng cao chất lượng thức ăn chăn nuôi (Nguyễn Đức Lượng, 2002). 1.2. Giới thiệu về enzyme pectinase 1.2.1. Phân loại enzyme pectinase Người ta chia pectinase ra làm hai nhóm: Nhóm 1: enzyme thủy phân có sự tham gia của nước - Pectin esterase (PE) hay pectin methyl esterase (PME): EC. 3.1.11.1, xúc tác sự khử ester hoá nhóm methoxyl của pectin, tạo thành acid pectic. Enzyme này hoạt động đặc hiệu với nhóm methyl este của acid galacturonic nằm bên cạnh acid galacturonic không bị este hoá. - Enzyme polygalacturonase (PG): Xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic (acid polygalacturonic), gồm 2 loại: + PG cắt nội mạch: Endo-PG (EC. 3.2.1.15), còn gọi là poly (1,4-α-Dgalacturonide) glycanohydrolase, xúc tác thuỷ phân ngẫu nhiên liên kết α-1,4-glycosid trong phân tử acid pectic. 14 + PG cắt ngoại mạch: Exo-PG (EC. 3.2.1.67), còn gọi là poly (1,4-α-Dgalacturonide) galacturonohydrolase, xúc tác thuỷ phân lần lượt liên kết α-1,4-glycosid của acid pectic từ đầu không khử. PG cắt mạch pectin và có thêm nhóm CH3 của C6 có tên là polymethyl galacturonase (PMG): xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid đặc hiệu với pectin có mức độ ester hoá cao (Mahejibin Khan, 2013). Nhóm 2: enzyme pectinase không có sự tham gia của nước: cắt đứt liên kết glycosid Chúng thuộc nhóm enzyme phân cắt. Tên chung của nhóm là Trans-elyminase (TE) (Gummadi, 2003). Bao gồm: - Pectate lyase (EC. 4.2.2.2) - Exo-pectate lyase (EC. 4.2.2.9) - Endo-pectate lyase (EC. 4.2.2.10) 1.2.2. Đặc điểm cấu trúc và xúc tác của enzyme pectinase Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thủy phân pectin, sản phẩm của quá trình này là acid galacturonic, galactose, arabinose, methanol… đây là một nhóm enzyme được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chỉ đứng sau amylase và protease. Cơ chế hoạt động của enzyme pectinase: Trung tâm hoạt động của enzyme pectinase chứa một vùng có 8 - 10 vòng xoắn kép β quay về phía phải; trong đó 2 vòng sẽ tạo một khe liên kết với cơ chất. Người ta nghiên cứu thấy rằng trung tâm hoạt động của enzyme này có chứa 2 acid amin Aspartic và Lysine. Người ta cũng thấy rằng có một Histidine nằm gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh hưởng đến khả năng xúc tác của enzyme. Nhiệt độ tối ưu của enzyme pectinase thường khoảng 45 – 55 oC. Hoạt động của enzyme liên quan đến việc thủy phân các nhóm methoxyl và acetyl của các đơn vị galacturonate. Các gen mã hóa PE đã được phân lập từ Aspergillus niger, Aspergillus aculeatus, Aspergillus oryzae. Nhìn chung, hoạt động của PE là không mong muốn trong nhiều quá trình chế biến thực phẩm khác nhau do chúng tạo ra methanol. Do đó, hoạt động của chúng được hạn chế để cho phép hoạt động khử polymer, làm thuận lợi cho quá trình phân hủy pectin và nâng cao khả năng tách chiết, hóa lỏng, làm mềm và quá trình lọc. Enzyme polymethylgalacturonase thủy phân trực tiếp liên kết α-1,4 glycoside của các phân tử pectin methyl hóa cao. 15 Polygalacturonase (PGs) thủy phân liên kết α-1,4 glycoside giữa các đơn phân galacturon trong khung sườn. Cùng với rhamnosegalacturonase, chúng thuộc nhóm 28 enzyme thủy phân. PGs được chia thành 4 loại dựa theo cách thức hoạt động: Endo-polygalacturonase thủy phân ngẫu nhiên liên kết α-1,4 glycoside của chuỗi polysaccharide, tạo ra sản phẩm là các phân tử acid galacturonic và các oligomer, làm giảm nhanh độ nhớt của dung dịch. Tuy nhiên, tốc độ và tỷ lệ thủy phân giảm nhanh khi gia tăng mức độ methyl hóa của phân tử. Endopolygalacturonase của cả A. niger và A. aculaetus có một khe trong trung tâm hoạt động thích ứng cho các oligomer có 7 hoặc 8 đơn vị acid galacturonic. Cấu trúc các tiểu phần của enzyme và các dạng năng lượng kết hợp cũng dự báo được các kiểu sản phẩm oligo-galacturonic acid với mức độ polymer hóa từ 7 – 21 đơn phân (Mahejibin Khan, 2013). Exopolygalacturonase I thủy phân D-galacturonic từ đầu không khử. Exopolygalacturonase II thủy giải phóng di-galacturonate từ đầu không khử của phân tử pectin. Các enzyme này không làm giảm nhanh độ nhớt của cung dịch. Hơn 100 trình tự amino acid của nhóm 28 enzyme thủy phân đường đã được cập nhật ở Genbank và cơ sở dữ liệu trình tự SWISS-PROT. Cấu trúc ba chiều của rhamnosegalacturonans A từ Aspergillus aculeatus; PG A từ Erwinia carotovora; PG II của Aspergillus niger đã được mô tả. Tất cả các PGs đề có chứa các cấu trúc xoắn β song song phía bên phải, từ 7 – 12 cuộn xoắn và 3 – 4 phiến β xếp song song. So sánh trình tự amino acid của nhóm 28 enzyme thủy phân đường cho thấy các enzyme này đều có chứa các cầu nối disulfit để ổn định cấu trúc phân tử. Do đó, sự bảo tồn Cysteine tương ứng với các cầu nối disulfit trong bộ khung của các enzyme từ vi khuẩn, nấm và thực vật (Markovic and Janecek, 2001). PG vi khuẩn từ Erwinia carotovora có 2 cầu nối S-S, Cys41-Cys62 và Cys115-Cys125, nhưng lại không có sự bảo toàn Cysteine ở vị trí tương ứng trong tất cả các PG từ vi khuẩn. Mặt khác, Cysteine trong tất cả các PG từ nấm lại được bảo tồn chặt chẽ. PG II từ Aspergillus niger có 4 cầu nối disulfit: Cys30-Cys45, Cys203-Cys219, Cys 329-Cys334 và Cys353-Cys362. Mặc dù 2 cầu nối đầu tiên có mặt trong tất cả các PG từ nấm, nhưng Cys329 được thay bằng Valine và Cys334 được thay bằng Alanine trong các PG của nấm men. Cầu nối S-S thứ tư lại không xuất hiện trong các PG của Claviceps purpurea và Chondrostereum perpureum. Các nhóm chức của amino acid thơm là đặc điểm riêng của các enzyme PG, chúng có thể liên quan trong việc 16 liên kết với cơ chất không chỉ trong các PG mà còn trong cả các enzyme thủy phân glycoside khác amylase. Cấu trúc của PG chịu nhiệt từ Thermotoga maritime cho thấy rằng promotor có dạng tetramer bền ở nhiệt độ cao. Mặc dù toàn bộ dạng cuộn gập của Exo-PG từ T. maritime tương đồng với nhóm 28 enzyme thủy phân glycoside nhưng xoắn β dài hơn. Phía trong kị nước của xoắn β được bảo vệ khỏi dung môi. Điều này trái ngược với cấu trúc của nhóm 28 enzyme thủy phân glycoside, chúng thường có cấu trúc mũ xoắn ở đầu C, một vòng được giữ bằng cầu nối S-S hoặc có sự hiện diện một vòng kém kị nước che chắn phía trong xoắn β khỏi dung môi (Pijning et al, 2009). Pectin lyase (PLs) thủy phân trực tiếp pectin bằng cơ chế tách β tạo thành sản phẩm là các oligogalacturonic chưa bão hòa. Hoạt động của các PL đòi hỏi sự có mặt của ion Ca. Các enzyme này phân bố rộng rãi trong các vi sinh vật gây bệnh thực vật, trong đó chúng đóng vai trò quan trọng như một tác nhân gây hại. PL cũng được tìm thấy trong các chủng thuộc chi Bacillus và một số vi khuẩn chịu nhiệt. Cấu trúc không gian của nhiều PL ngoại bào khác nhau đã được mô tả. Pectate lyase (Pel) C và Pel E từ Erwinia chrysanthemi và Pel từ Bacillus subtilis khác nhau về kích thước và hình dáng các vòng nhưng giống nhau về cấu trúc cơ bản và cấu trúc khác thường gọi là xoắn β, trong đó, chuỗi β gấp vào một cấu trúc siêu xoắn bên phải. Cấu trúc tinh thể của pectin lyase A từ 2 chủng Aspergillus niger N400 và 4M-147 cho thấy PL A được cuộn gập trong các phiến β và có nhiều đặc điểm cấu trúc của PL vi khuẩn. Khe gắn cơ chất của 2 PL A Aspergillus niger được tạo thành từ các nhóm thơm và tích điện âm. Phân tích trình tự protein và so sánh với các pectinase khác cho thấy có sự tương đồng tùy theo nguồn gốc và hoạt tính enzyme tự nhiên. Phân tích các doman cho thấy sự tồn tại của các nhóm pectinase khác nhau dựa theo sự có mặt của các doman riêng biệt (Yadav et al, 2009). 17