Tài liệu Nghiên cứu sử dụng nấm lecanicillium kí sinh côn trùng để kiểm soát rệp hại rau

--------------------- NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG NẤM LECANICILLIUM KÍ SINH CÔN TRÙNG ĐỂ KIỂM SOÁT RỆP HẠI RAU LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2019 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU.....................................................................................................1 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...............................................................2 1.1 1.1.1 Đặc điểm sinh học..............................................................................2 1.1.2 Tình hình rệp hại cây trồng trên thế giới.............................................5 1.2 Thuốc diệt côn trùng hóa học ....................................................................8 1.2.1 Tình hình sản xuất và sử dụng............................................................8 1.2.2 Ưu và nhược điểm..............................................................................9 1.3 2 Rệp hại cây trồng ......................................................................................2 Thuốc diệt côn trùng nguồn gốc sinh học ................................................11 1.3.1 Phân loại ..........................................................................................11 1.3.2 Ưu và nhược điểm............................................................................12 1.3.3 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng.......................................13 1.3.4 Khả năng kiểm soát rệp hại cây trồng của nấm Lecanicillium ..........17 1.4 Sản xuất bào tử nấm kí sinh côn trùng.....................................................18 1.5 Ảnh hưởng của môi trường lên sự sinh bào tử của nấm Lecanicillium.....19 1.5.1 Nguồn carbon...................................................................................19 1.5.2 Nguồn nitơ.......................................................................................20 1.5.3 Nhiệt độ môi trường.........................................................................21 1.5.4 Độ ẩm không khí và độ ẩm cơ chất ..................................................21 1.5.5 Một số yếu tố khác...........................................................................21 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................23 2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị....................................................................23 2.1.1 Chủng giống và plasmid...................................................................23 2.1.2 Hóa chất...........................................................................................23 2.1.3 Dung dịch và đệm ............................................................................24 2.1.4 Môi trường nuôi cấy.........................................................................24 Trường Đại học KHTN ii Luận văn thạc sĩ Sinh học 2.1.5 2.2 Vũ Xuân Đạt Thiết bị ............................................................................................ 24 Phương pháp nghiên cứu.........................................................................25 2.2.1 Sàng lọc chủng nấm có độc lực diệt rệp cao .....................................25 2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử...................................................27 2.2.3 Xác định ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên sự sinh bào tử của chủng nấm 485 .............................................................................................. 29 3 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................32 3.1 Sàng lọc chủng nấm có độc lực cao.........................................................32 3.2 Định tên chủng nấm 485 .........................................................................34 3.3 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên sự sinh bào tử của L. lecanii 485.....................................................................................................36 3.3.1 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất..........................................................36 3.3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ các thành phần cơ chất .....................................37 3.3.3 Ảnh hưởng của độ dày cơ chất .........................................................37 3.3.4 Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất..........................................................39 3.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ ...................................................................40 3.3.6 Ảnh hưởng của một số nguồn nitơ vô cơ ..........................................41 3.3.7 Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 .................................................42 3.3.8 Ảnh hưởng của nồng độ MgSO4.......................................................43 3.3.9 Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 .....................................................44 3.3.10 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng ................................................45 3.3.11 Ảnh hưởng của thời gian lên men.....................................................46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................................................49 TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................50 PHỤ LỤC..................................................................................................60 Trường Đại học KHTN iii Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Thiệt hại một số cây trồng do rệp ở Vương quốc Anh.............................. 5 Bảng 2.1. Các dung dịch và đệm ........................................................................... 24 Bảng 2.2. Các thiết bị ............................................................................................ 25 Trường Đại học KHTN iv Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Cấu tạo ngoài của rệp............................................................................... 2 Hình 1.2. Rệp hại cây trồng..................................................................................... 3 Hình 1.3. Vòng đời của rệp ..................................................................................... 4 Hình 2.1. Lá cải có rệp sau khi được phun dịch bào tử nấm................................... 26 Hình 3.1. Kết quả phun bào tử nấm lên rệp cải ...................................................... 32 Hình 3.2. Độc lực diệt rệp của 7 chủng Lecanicillium spp.. ................................... 33 Hình 3.3. Điện di đồ DNA nhân gene 28S rRNA................................................... 34 Hình 3.4. Trình tự gene 28S rRNA của chủng 485 (A) và cây phân loại (B).......... 35 Hình 3.5. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất................................................................ 36 Hình 3.6. Ảnh hưởng của tỉ lệ bột lõi ngô/bột ngô trong môi trường...................... 37 Hình 3.7. Ảnh hưởng của độ dày cơ chất............................................................... 38 Hình 3.8. Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất................................................................ 39 Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ......................................................................... 40 Hình 3.10. Ảnh hưởng của một số nguồn nitơ vô cơ.............................................. 41 Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 ..................................................... 42 Hình 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ MgSO4 .......................................................... 44 Hình 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 ......................................................... 45 Hình 3.14. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng .................................................... 46 Hình 3.15. Ảnh hưởng của thời gian lên men ........................................................ 47 Trường Đại học KHTN v Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt BẢNG CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid dNTP 2-Deoxynucleoside 5-triphosphate ĐC Đối chứng EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid EtBr Ethidium bromide M Marker OD Optical density PCR Polymerase chain reaction RNase Ribonuclease SDS Sodium dodecyl sulfate Taq Thermus aquaticus TE Tris EDTA TBE Tris boric acid EDTA v/v volume/volume w/v weight/volume w/w weight/weight Trường Đại học KHTN vi Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt MỞ ĐẦU Rệp (Aphidoidae) là nhóm côn trùng chích hút nhựa cây phổ biến nhất trên thế giới, phân bố rộng rãi ở các vùng ôn đới, cận nhiệt đới và nhiệt đới. Chúng kí sinh trên hơn 11000 loài cây thuộc 243 họ khác nhau, trong đó có nhiều cây trồng quan trọng như bông, cải, cải dầu, các loại đậu, cà chua, khoai tây, ngũ cốc [39]. Rệp không chỉ phá hoại trực tiếp bằng cách chích hút nhựa cây mà còn truyền virus gây bệnh cho cây. Hàng năm, rệp cùng với các côn trùng khác gây thiệt hại 15% sản lượng cây trồng trên toàn thế giới [22]. Do tính chất nguy hại của rệp, việc sử dụng các biện pháp phòng trừ rệp là cần thiết. Biện pháp phòng trừ rệp phổ biến nhất cho đến nay vẫn là sử dụng thuốc diệt côn trùng hóa học. Mặc dù có ưu điểm là phổ tác dụng rộng và hiệu quả tác dụng nhanh, nhưng thuốc hóa học ngày càng bộc lộ rõ những nhược điểm như nhanh bị kháng bởi côn trùng sau một thời gian sử dụng, gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người. Với ưu điểm vượt trội về độ thân thiện với môi trường, hệ sinh thái và sức khỏe con người, thuốc diệt côn trùng sinh học được coi là sự lựa chọn có tiềm năng lớn trong xu hướng phát triển nền nông nghiệp bền vững. Lecanicillium là chi nấm có khả năng kí sinh tự nhiên trên rệp và nhiều loài côn trùng khác. Từ những năm 1960, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng Lecanicillium để diệt rệp bảo vệ cây trồng, nhiều sản phẩm đã được sản xuất và thương mại hóa. Tuy nhiên, kết quả đạt được trong nghiên cứu và sử dụng thuốc diệt côn trùng sinh học còn hạn chế. Năm 2000, giá trị thương mại của thuốc diệt côn trùng sinh học được sử dụng trên toàn thế giới chỉ chiếm 1,8% tổng giá trị của các loại thuốc diệt côn trùng. Vì vậy, việc tăng cường nghiên cứu phát triển các chế phẩm diệt rệp từ nấm Lecanicillium là cần thiết. Trong khuôn khổ đề tài hợp tác quốc tế của Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, viện Công nghệ Sinh học, viện KH và CN Việt Nam năm 2010-2013 do Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn làm chủ quản, tôi thực hiện đề tài: "Nghiên cứu sử dụng nấm Lecanicillium kí sinh côn trùng để kiểm soát rệp hại rau". Trường Đại học KHTN 1 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Rệp hại cây trồng 1.1.1 Đặc điểm sinh học Rệp (Aphidoidae) là một họ lớn thuộc lớp côn trùng, là các động vật không xương sống, cơ thể chia thành ba phần (đầu, ngực, bụng), có ba cặp chân phân đốt, mắt kép và một cặp râu, cơ thể được bao bọc bởi bộ khung kitin, chiều dài từ 1 đến 10 mm (hình 1.1). Khoảng 3700 loài rệp đã được biết đến trên thế giới [39]. Râu Đầu Ống tiết Đuôi Ngực Bụng Mắt Mắt kép chân chân Vòi chích hút chân Hình 1.1. Cấu tạo ngoài của rệp Rệp là nhóm côn trùng chích hút nhựa cây phổ biến nhất thế giới, phân bố tập trung nhất ở các vùng ôn đới [51], rệp cũng phân bố khá phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt với độ đa dạng thấp hơn. Khoảng 250 loài rệp là côn trùng phá hoại nguy hiểm đối với nông, lâm nghiệp cần được kiểm soát. Tuy nhiên, đứng trên quan điểm động vật học, rệp là nhóm động vật thích nghi tốt với môi trường nhờ khả năng sinh sản vô tính [67]. Phần lớn rệp có thân mềm, màu xanh, đen, nâu, hồng hoặc hầu như không màu (hình 1.2). Phương thức dinh dưỡng của rệp là chích hút nhựa cây bằng miệng có cấu tạo kiểu chích hút. Khi chất dinh dưỡng của cây trở nên nghèo nàn hoặc mật độ rệp quá đông, một số loài rệp sinh ra con có cánh để phát tán đi nơi khác. Nhiều loài rệp chỉ kí sinh trên một loài cây duy nhất, một số khác chẳng hạn như Myzus Trường Đại học KHTN 2 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt persicae (rệp đào) có thể kí sinh trên hàng trăm loài cây thuộc nhiều họ khác nhau. Khi chích hút, chúng truyền virus từ cây bệnh sang cây khỏe mạnh ở một số cây trồng như: khoai tây, ngũ cốc, củ cải đường, cam, quýt [36]. Những vết chích hút bởi rệp trở thành nơi bị tổn thương dễ dàng bị nấm xâm nhập và gây bệnh cho cây. A B C D Hình 1.2. Rệp hại cây trồng Myzus persicae (A và B), Aphis gossypii (C) và Aphis illinoisensis (D) Ở rệp có cả hai kiểu sinh sản đơn tính và hữu tính. Nhiều loài có sự thay đổi giữa kiểu sinh sản đơn tính và hữu tính khá phức tạp. Sự thay đổi giữa hai kiểu sinh sản để sinh ra trứng hoặc ấu trùng, thay đổi giữa cây chủ thân gỗ và cây chủ thân thảo. Khoảng 10% loài rệp thay đổi kiểu sinh sản để thích nghi với sự thay đổi cây chủ [51]. Mặc dù một số ít loài rệp có cả con đực và con cái, nhưng chỉ con cái có trong quần thể. Vào mùa đông, khi nhiệt độ thấp trứng được sinh ra, mùa xuân trứng nở thành rệp cái. Dạng sinh sản phổ biến ở rệp là đơn tính và sinh con, rệp con sinh ra có các đặc điểm giống hệt rệp mẹ ngoại trừ kích thước. Quá trình sinh con lặp đi lặp lại trong suốt mùa hè, sinh ra nhiều thế hệ, thời gian sống của mỗi thế hệ từ 20 đến 40 ngày, từ một rệp cái nở vào mùa xuân có thể sinh ra hàng nghìn rệp con. Chẳng hạn, rệp bắp cải (Brevicoryne brassicae) có thể sinh ra 41 lứa rệp con trong mùa sinh sản. Trường Đại học KHTN 3 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Mùa Xuân Mùa Đông Mùa Hè Trứng đình dục Rệp cái ban đầu Rệp đực * Rệp cái không cánh * có cánh hoặc không cánh Rệp cái vô tính Rệp cái vô tính không cánh có cánh Rệp cái vô tính sinh ra rệp hữu tính Mùa Thu Hình 1.3. Vòng đời của rệp [75] Vào mùa thu, khi có sự thay đổi về cường độ chiếu sáng, nhiệt độ, sự giảm sút về nguồn thức ăn hoặc chất lượng thức ăn, rệp cái sinh ra cả rệp đực và rệp cái con. Đặc điểm di truyền của rệp đực giống hệt rệp mẹ ngoại trừ việc ít hơn một nhiễm sắc thể giới tính. Rệp con hữu tính có thể thiếu cánh, thậm chí thiếu vòi chích hút [51]. Khi trưởng thành, rệp cái giao phối với rệp đực rồi đẻ trứng. Trứng sống sót qua mùa đông khắc nghiệt rồi nở ra thành rệp cái có cánh hoặc không cánh (hình 1.3). Tuy nhiên, ở những môi trường ấm áp như vùng nhiệt đới hoặc trong nhà kính, rệp có thể sinh sản vô tính qua nhiều năm [36]. Một số loài rệp có thể sinh ra rệp cái có cánh vào mùa hè khi nguồn thức ăn hoặc chất lượng thức ăn giảm sút. Rệp cái có cánh di cư để sinh ra một quần thể mới trên cây chủ mới, thường là khác loài với cây chủ ban đầu. Ví dụ như rệp táo (Aphis pomi), sau khi sinh ra nhiều thế hệ rệp cái không cánh trên cây chủ điển hình sẽ sinh ra dạng có cánh bay đi và kí sinh trên cỏ hoặc ngô. Đặc biệt, một số loài có Trường Đại học KHTN 4 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt thể sinh sản "lồng", khi rệp cái mẹ sinh ra rệp cái con thì rệp cái con cũng chuẩn bị sinh ra thế hệ tiếp theo đã có trong cơ thể nó. Cách sinh sản này có thể ảnh hưởng đến kích thước của rệp và tốc độ sinh sản tăng lên [28], [59]. Phần lớn rệp có thân mềm nên chúng dễ dàng bị giết bởi nhiều kẻ thù tự nhiên như bọ rùa ăn rệp, ong bắp cày kí sinh, ấu trùng muỗi kí sinh, nhện cua, vi khuẩn, virus, các loài nấm kí sinh côn trùng Neozygites fresenii, Entomophthora, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae và Lecanicillium lecanii. 1.1.2 Tình hình rệp hại cây trồng trên thế giới Sản lượng nông nghiệp thế giới hàng năm bị thiệt hại khoảng 15% do côn trùng [22], ở Mỹ là 13% [63]. Mặc dù chưa có thống kê chính thức về thiệt hại nông nghiệp do rệp nhưng trong số 300 loài côn trùng gây hại nghiêm trọng [54] thì có đến 250 loài là rệp. Chúng là tác nhân chính gây hại ở nhiều loại cây trồng quan trọng như bông, đậu tương, hướng dương, củ cải đường, khoai tây, ngô, ngũ cốc và rau cải. Nhiều loài rệp có khả năng kí sinh trên nhiều loại cây khác nhau như Aphis gossypii, Myzus persicae và Aphis craccivora. Theo thống kế của Tatchell (1989), rệp phá hoại nhiều loại cây trồng ở Vương quốc Anh. Sản lượng bị thiệt hại thường ở mức 4-10%, và có thể lên đến 46% ở cây đậu (bảng 1.1). Ước tính giá trị thiệt hại lên đến 70 triệu bảng Anh. Aphis gossypii (rệp bông) kí sinh trên 700 loại cây khác nhau trên toàn thế giới, bao gồm nhiều cây quan trọng như dưa hấu, dưa chuột, bí xanh, bí ngô, ớt, cam và quýt. Một trong những cây chủ bị A. gossypii phá hoại nhiều nhất là cây bông vải (Gossypium hirsutum), thuộc nhóm cây công nghiệp quan trọng nhất thế giới. Theo Xia (1997), sản lượng bông hàng năm ở Trung Quốc bị thiệt hại 10-15% và chủ yếu là do A. gossypii [83]. Với sản lượng bông của Trung Quốc năm 2011 là 7,4 triệu tấn (http://www.cotton.org/econ/cropinfo/cropdata/rankings.cfm) thì con số thiệt hại có thể lên đến 0,8-1,2 triệu tấn. Bảng 1.1. Thiệt hại một số cây trồng do rệp ở Vương quốc Anh [78] Trường Đại học KHTN 5 Luận văn thạc sĩ Sinh học Loại cây Lúa mì đông Vũ Xuân Đạt Rệp gây hại Dạng gây hại Sản lượng bị thiệt hại (%) Sitobion avenae Phá hoại 9,7-12,5 Metopolophium dirhodum Phá hoại 13 Lúa mạch đông Rhopalosiphum padi Truyền bệnh 0-86 Lúa mạch xuân M. dirhodum Phá hoại 8,8 Củ cải đường Myzus persicae Truyền bệnh 6,5 Khoai tây Macrosiphum euphorbiae Phá hoại 5,7 Myzus persicae Phá hoại 4,4 Các loại đậu Aphis fabae Phá hoại 16,4-46,3 Đậu Hà Lan Acyrthosiphon pisum Phá hoại 8,0-15,8 Cây hoa bia Phorodon humuli Phá hoại 9,2 Đậu tương là loại hạt dầu được trồng nhiều nhất thế giới [5], nhưng năng suất bị đe dọa nghiêm trọng bởi A. glycines (rệp đậu tương). Sản lượng hạt bị thiệt hại ước tính khoảng 34% [72], theo tính toán của Catangui và cộng sự (2009), con số thiệt hại thậm chí lên đến 48-72%. Nguyên nhân do rệp chích hút có thể làm giảm 50% tốc độ quang hợp của lá cây [18]. Đậu đũa (Vigna unguiculata) là loại cây được trồng nhiều ở châu Phi, ước tính sản lượng hàng năm ở khu vực này khoảng 3,36 triệu tấn. Không giống bông vải bị phá hoại chủ yếu bởi A. gossypii, đậu đũa bị phá hoại bởi nhiều loại rệp như A. craccivora, A. leguminosae, A. laburni, A. fabae, Myzus persicae và cả A. gossypii. Ở những khu vực không có biện pháp bảo vệ, sản lượng thiệt hại có thể lên đến 20-100% [60]. Lipaphis erysimi (rệp cải dầu) kí sinh trên một số loài cây nhưng chủ yếu là các loại cải và cải dầu. Ngoài ra nó còn kí sinh trên cà chua và bí xanh. Ở phía đông của miền trung Ấn Độ, L. erysimi cùng với M. persicae và Brevicoryne brassicae là ba loài rệp nguy hiểm đối với cây cải dầu (Brassica juncea). Trong đó L. erysimi Trường Đại học KHTN 6 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt phá hoại nhiều nhất, riêng nó gây thiệt hại 35,4-91,3% sản lượng [15], [76]. Theo nghiên cứu của Patel và cộng sự (2004), nếu không có biện pháp bảo vệ, L. erysimi có thể gây thiệt hại 80,6-97,6% sản lượng cải dầu [61]. Trong một nghiên cứu khác, Razaq và cộng sự (2011) đã chỉ ra rằng, Brevicoryne brassicae và L. erysimi cũng gây thiệt hại 75,1-81,9% sản lượng cải dầu ở Multan, Punjab, Pakistan [69]. Ngoài cải dầu, B. brassicae còn phá hoại nhiều cây quan trọng khác như, súp lơ, cà rốt và củ cải. Myzus persicae kí sinh trên hàng trăm loại cây thuộc 40 họ khác nhau. Các cây này phân bố rộng khắp thế giới, nhiều cây phân bố ở những vùng khá lạnh như atisô, củ cải, bắp cải, cà rốt, súp lơ, ngô, su hào, cải dầu. Củ cải đường, cà chua, khoai tây cũng là những cây chủ bị M. persicae phá hoại [35]. Aphis craccivora (rệp đậu lăng) cũng là một loại rệp kí sinh trên nhiều cây chủ khác nhau. Ngoài cây đậu đũa, chúng còn phá hoại nhiều cây khác như bông, táo, cà rốt, rau diếp, lúa mì, đậu lăng. Hossain và cộng sự (2006) đã nghiên cứu về thiệt hại do A. craccivora gây ra trên cây đậu lăng, sản lượng bị thiệt hại cao nhất lên đến 9% [40]. Cũng trong nghiên cứu này, sản lượng đậu lăng đã tăng 0,91-9,89% khi áp dụng biện pháp diệt rệp hoặc gieo trồng tránh rệp. Ước tính A. craccivora còn gây thiệt hại 12,8-61,1% sản lượng đậu răng ngựa (Vicia faba) ở Sids ARS, Beni-Suef Governorate, miền Trung Ai Cập [25]. Rệp làm giảm năng suất cây trồng không chỉ do phá hoại trực tiếp mà còn do truyền virus gây bệnh. A. craccivora truyền virus gây bệnh rụng lá ở đậu lăng, đậu răng ngựa, đậu gà [44], [58]. M. persicae là loại nguy hiểm nhất trong 10 loại rệp truyền virus gây bệnh rụng lá ở cây khoai tây [57], [77]. Rệp truyền virus gây bệnh khảm có thể làm thiệt hại 60% năng suất dưa chuột [79]. Không những phá hoại rau và cây công nghiệp, rệp còn là côn trùng nguy hiểm đối với cây lương thực. Diuraphis noxia (rệp lúa mì Nga) chuyên phá hoại lúa mì, lúa mạch đen, lúa mạch trắng, yến mạch. Theo nghiên cứu của Akhtar và cộng sự (2010), năng suất lúa mì có thể bị giảm 7,9-34,2% do D. noxia phá hoại [7]. Trường Đại học KHTN 7 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Như vậy, với nguy cơ làm giảm năng suất cây trồng của rệp, yêu cầu phải có biện pháp kiểm soát rệp để bảo vệ mùa màng là cấp thiết. Biện pháp kiểm soát rệp và các loại côn trùng khác được áp dụng chủ yếu trong nhiều thập kỷ qua là sử dụng hóa chất diệt côn trùng tổng hợp. Cho đến nay, đây vẫn là biện pháp được sử dụng chủ yếu, đặc biệt là ở các nước đang phát triển. 1.2 Thuốc diệt côn trùng hóa học 1.2.1 Tình hình sản xuất và sử dụng Thuốc diệt côn trùng (thuốc trừ sâu) chiếm tỉ lệ lớn trong thuốc bảo vệ thực vật. Chúng có nguồn gốc tự nhiên hoặc được tổng hợp hoàn toàn trong các nhà máy hóa chất, được sử dụng trong nông nghiệp để bảo vệ cây trồng, hoặc phi nông nghiệp để tiêu diệt các vectơ truyền bệnh cho người và vật nuôi như ruồi, muỗi. Từ 2000 năm trước công nguyên con người đã biết sử dụng thuốc diệt côn trùng có nguồn gốc tự nhiên để bảo vệ mùa màng [52], nhưng việc sử dụng chỉ trở nên phổ biến khi các hóa chất diệt côn trùng được tổng hợp dễ dàng trong các nhà máy hóa chất, đặc biệt là sau khi Paul Hermann Müller khám phá ra khả năng diệt côn trùng mạnh mẽ của DDT vào năm 1939. Từ 1945 đến 1975, lượng thuốc bảo vệ thực vật được sản xuất ở Mỹ tăng 40 lần, từ 15,9 nghìn tấn/năm lên 636,3 nghìn tấn/năm. Năm 1975, ước tính toàn thế giới đã sản xuất 1,7 triệu tấn thuốc bảo vệ thực vật với giá trị thương mại khoảng 3,9 tỉ đô la Mỹ, trong đó thuốc diệt côn trùng chiếm 32% [71]. Năm 1997 toàn thế giới sử dụng 2,58 triệu tấn thuốc bảo vệ thực vật với giá trị 37,0 tỉ đô la Mỹ, trong đó thuốc diệt côn trùng chiếm 0,67 triệu tấn với giá trị 11,6 tỉ đô la Mỹ [11]. Năm 2001 các con số trên lần lượt là 2,29 triệu tấn; 31,8 tỉ đô la Mỹ; 0,57 triệu tấn; 8,8 tỉ đô la Mỹ [45]. Và năm 2007 là 2,37 triệu tấn; 39,4 tỉ đô la Mỹ; 0,40 triệu tấn; 11,2 tỉ đô la Mỹ [31]. Trường Đại học KHTN 8 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Ở Việt Nam, lượng thuốc diệt côn trùng được sử dụng càng ngày càng tăng: từ 10300 tấn lên 33000 tấn vào đầu những năm 1990, đến năm 2003 tăng lên 45000 tấn và năm 2005 là 50000 tấn (http://www.donre.hochiminhcity.gov.vn). Mặc dù thế giới đã cố gắng cắt giảm lượng thuốc bảo vệ thực vật được sử dụng nhưng kết quả đạt được còn hạn chế. Khối lượng thuốc bảo vệ thực vật được sử dụng trên toàn thế giới năm 2007 so với năm 1997 chỉ giảm 8%. Tuy nhiên, kết quả đạt được với thuốc diệt côn trùng tương đối khả quan, trong cùng thời gian trên khối lượng thuốc diệt côn trùng được sử dụng đã giảm 40%. 1.2.2 Ưu và nhược điểm Ưu điểm của thuốc diệt côn trùng hóa học là dễ sản xuất ở quy mô lớn với giá thành rẻ, phổ tác dụng rộng với độc lực mạnh và hiệu quả tác dụng nhanh. Tuy nhiên, chúng ngày càng bộc lộ rõ những nhược điểm như nhanh bị kháng bởi côn trùng, gây ô nhiễm đất, nguồn nước và không khí, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người. Thuốc bảo vệ thực vật nói chung và thuốc diệt côn trùng nói riêng được sử dụng tràn lan làm cho các loài gây hại biến đổi nhanh chóng và kháng thuốc. Hiệu quả của viêc sử dụng thuốc ngày càng thấp ngược lại với chi phí ngày càng cao [17]. Ước tính có khoảng 520 loài côn trùng, 150 loài vi sinh vật gây bệnh cây và 273 loài cỏ dại đã kháng lại thuốc (http://www.nd.edu/%01chem191/e2.html). Một số thuốc diệt côn trùng có thời gian phân hủy lâu, sau khi được phun cho cây trồng sẽ thẩm thấu một phần vào đất và các mạch nước ngầm. Các chất này khi đã ngấm vào đất, vào nước ngầm sẽ tồn tại lâu dài vì trong đất có rất ít vi sinh vật phân hủy chúng và mỗi năm chỉ 1% lượng nước ngầm được hồi phục. Điều đáng lo ngại là nhu cầu nước ngọt của một nửa dân số thế giới được đáp ứng từ nước ngầm [19], do đó nguy cơ bị ngộ độc thuốc diệt côn trùng rất cao. Một lượng thuốc diệt côn trùng sau khi được sử dụng trên đồng ruộng sẽ theo kênh thoát nước đi vào các thủy vực. Tại đây chúng giết chết các sinh vật phù Trường Đại học KHTN 9 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt du, làm giảm nguồn cung cấp thức ăn cho cá hoặc giết chết cá, làm giảm sút nguồn lợi thủy sản. Trong trường hợp cá bị nhiễm độc nhưng không chết sẽ gây độc gián tiếp cho người ăn phải. Thuốc diệt côn trùng tổng hợp có độc lực mạnh, phổ tác dụng rộng cũng có nghĩa là có tính chọn lọc kém. Chúng không chỉ tiêu diệt các côn trùng gây hại mà còn tiêu diệt cả những loài có ích như động vật ăn côn trùng, các loài kí sinh côn trùng hại cây trồng [65], tiêu diệt ong mật và côn trùng thụ phấn cho cây làm cho nhiều cây trồng thụ phấn nhờ côn trùng giảm năng suất và chất lượng [56]. Thuốc diệt côn trùng được sử dụng nhằm mục đích tăng năng suất cây trồng, nhưng đôi khi nó lại làm giảm năng suất. Điều này xảy ra khi các chất này ức chế sự phát triển bình thường của cây trồng, thuốc được phun cho các cây trồng mục tiêu nhưng lại bị phát tán do gió gây thiệt hại cho những cây trồng ở vùng lân cận, nông sản bị đổ bỏ vì dư lượng hóa chất độc hại vượt mức cho phép [64]. Bên cạnh đó, đất trồng trọt có độ tơi xốp cao nên thuốc diệt côn trùng dễ ngấm vào đất. Trong đất có nhiều loài sinh vật cần thiết cho hệ sinh thái đất trồng như động vật chân đốt, động vật nguyên sinh, giun đất, nấm, vi khuẩn [66]. Thuốc diệt côn trùng sẽ gây độc và làm đảo lộn hệ sinh thái đất, dẫn đến giảm năng suất cây trồng. Việc lạm dụng thuốc diệt côn trùng làm cho thực phẩm bị nhiễm độc [87] gây ngộ độc cấp tính hoặc mạn tính cho người sử dụng. Trên thế giới, hàng năm có khoảng 26 triệu trường hợp bị ngộ độc (không tử vong) thuốc bảo vệ thực vật [70] (trong đó có thuốc diệt côn trùng), 750 nghìn trường hợp ngộ độc mạn tính, 3 triệu trường hợp phải nhập viện và 200 nghìn trường hợp tử vong [34]. Ở Việt Nam, khoảng 15-20 triệu người thường xuyên phơi nhiễm với thuốc bảo vệ thực vật (http://ca.cand.com.vn). Theo báo cáo của Cục Y tế dự phòng và Môi trường - Bộ Y tế, năm 2009 có 4515 trường hợp bị nhiễm độc thuốc bảo vệ thực vật trong đó có 138 trường hợp tử vong (http://www.thuocbietduoc.com.vn). Con số trên mới chỉ là kết quả thống kê được đối với các trường hợp đã nhập viện. Trường Đại học KHTN 10 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, người phơi nhiễm thuốc trừ sâu và các loại thuốc bảo vệ thực vật tổng hợp khác có thể tăng nguy cơ mắc các bệnh như rối loạn cảm giác, rối loạn trí nhớ [34], hen suyễn, viêm xoang mạn tính, viêm phế quản mạn tính [82], rối loạn chức năng tinh hoàn hoặc vô sinh [20], đột biến gene [41], u lympho không Hodgkin [38], bệnh máu trắng, ung thư da, ung thư thực quản, ung thư dạ dày, ung thư ruột kết, ung thư phổi, ung thư đại tràng, ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến và bàng quang [8], [14]. Thời gian phơi nhiễm càng nhiều thì nguy cơ mắc các bệnh này càng tăng lên. Vì những nhược điểm của thuốc diệt côn trùng hóa học, xu hướng chung trên thế giới hiện nay là không sử dụng thuốc diệt côn trùng hoặc sử dụng thuốc có nguồn gốc sinh học để thay thế dần nhằm phát triển nền nông nghiệp bền vững. 1.3 Thuốc diệt côn trùng nguồn gốc sinh học 1.3.1 Phân loại Thuốc diệt côn trùng, thuốc diệt cỏ, thuốc trừ bệnh được gọi chung là thuốc diệt hại. Thuốc diệt hại sinh học là các chế phẩm có nguồn gốc sinh học. Chúng là các cơ thể sống như vi khuẩn, nấm, động vật hay các chất được tách chiết từ sinh vật như protein, các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật. Theo EPA, Hoa Kỳ (2011), thuốc diệt hại sinh học được chia thành ba nhóm chính (http://www.epa.gov): 1. Thuốc diệt hại có nguồn gốc vi sinh vật: thành phần có hoạt lực diệt hại là các vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, virus hoặc động vật nguyên sinh). Thuốc diệt hại nguồn gốc vi sinh vật được dùng để kiểm soát nhiều loại gây hại khác nhau như côn trùng, cỏ dại. Protein độc của vi khuẩn Bacillus thuringensis (Bt) hay các sản phẩm trao đổi chất khác của vi sinh vật cũng thuộc nhóm này. 2. Các yếu tố bảo vệ được chuyển vào thực vật (plant incorporated protectants, PIPs): là các chất diệt hại thực vật vốn không sản xuất được, nhưng do nhận được gene ngoại lai nên thực vật có khả năng sản sinh ra để tự bảo vệ. gene Trường Đại học KHTN 11 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt mã hóa protein độc của B. thuringensis là một ví dụ điển hình được chuyển vào thực vật [86]. 3. Các chất diệt hại hóa sinh: là các hợp chất kiểm soát dịch hại bằng cơ chế không độc. Không giống các thuốc bảo vệ thực vật tổng hợp trực tiếp giết chết hoặc ức chế dịch hại, các chất diệt hại hóa sinh có thể là pheromone giới tính ức chế trưởng thành giới tính, ức chế sự giao phối của côn trùng [50] từ đó kiểm soát được dịch hại, hoặc là các chất được chiết từ thực vật có khả năng dẫn dụ được dùng để bẫy côn trùng. 1.3.2 Ưu và nhược điểm Mặc dù có một số nhược điểm như giá thành sản xuất còn cao, hoạt lực không mạnh bằng hóa chất tổng hợp, hiệu lực tác dụng chậm, hiệu quả bị ảnh hưởng nhiều bởi các điều kiện ngoại cảnh, nhưng với các ưu điểm vượt trội so với hóa chất tổng hợp về độ thân thiện với môi trường, hệ sinh thái và sức khỏe con người, các chế phẩm sinh học ngày càng được nhận được nhiều sự quan tâm trong nghiên cứu và sản xuất để sử dụng trong nông nghiệp. Các chế phẩm sinh học tác dụng có chọn lọc, mỗi chế phẩm chỉ tác dụng lên một hay một số loài côn trùng nhất định, không hoặc chỉ gây ảnh hưởng đến một số ít thiên địch và các sinh vật có ích khác. Do vậy, các hệ sinh thái được phun các chế phẩm này không bị xáo trộn, đảm bảo sự ổn định bền vững của đất trồng trọt. Chế phẩm khi phát tán sang các khu vực lân cận cũng không gây ảnh hưởng tiêu cực đến cây trồng ở đó. Các chế phẩm chứa yếu tố diệt côn trùng là vi sinh vật có khả năng duy trì hiệu quả kéo dài, chúng không chỉ tiêu diệt lứa côn trùng đang phá hoại mà còn lây nhiễm trên côn trùng từ thế hệ này sang thế hệ khác. Do có tác dụng chọn lọc đến côn trùng gây hại, các chế phẩm sinh học sẽ không được sử dụng tràn lan, do vậy nguy cơ kháng thuốc của côn trùng sẽ được Trường Đại học KHTN 12 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt giảm thiểu, mỗi chế phẩm được sử dụng trong thời gian lâu hơn làm giảm chi phí nghiên cứu sản xuất các chế phẩm mới thay thế. Các chế phẩm sinh học có thành phần chính là các cơ thể sống hoặc có nguồn gốc từ cơ thể sống, chúng dễ bị phân hủy thành các chất không độc sau một thời gian ngắn sử dụng, không làm ô nhiễm đất, nước, không khí. Vì các chế phẩm này đã được chọn lọc để tác dụng đến từng loài côn trùng nhất định, trong trường hợp các cơ thể sống từ chế phẩm còn tồn tại được trên các nông sản cũng không gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Nếu phát tán vào các thủy vực, các chế phẩm này ít gây ảnh hưởng xấu đến các sinh vật ở đó và do vậy không làm giảm giá trị khai thác nguồn lợi thủy sản cũng như sự cân bằng của hệ sinh thái. 1.3.3 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng Hầu hết các loài côn trùng gây hại đều có thể bị nhiễm bệnh bởi các vi sinh vật [54]. Trong tự nhiên, hiện tượng các vi sinh vật nhiễm bệnh và kiểm soát số lượng côn trùng là phổ biến, ví dụ như bọ xít hại vải, nhãn bị nhiễm tự nhiên và bị giết bởi nấm Beauveria bassiana. Đó chính là cơ sở khoa học vững chắc cho việc nghiên cứu sản xuất các chế phẩm sinh học diệt côn trùng. A. Thế giới Sự đóng góp đặt nền móng cho xu hướng kiểm soát côn trùng bằng vi sinh vật là của Mechnikoff (1879) và Krassilnikow (1888), khi lần đầu tiên trình bày các nghiên cứu về khả năng sử dụng nấm kí sinh côn trùng Metarrhizium anisopliae để diệt côn trùng gây hại ngũ cốc và củ cải đường. Năm 1914, lần đầu tiên d’Herelle thử nghiệm kiểm soát côn trùng bằng vi khuẩn [54]. Cho đến năm 2001, có khoảng 195 yếu tố diệt hại sinh học (bao gồm thuốc diệt côn trùng) đã được đăng kí với 780 sản phẩm khác nhau (http://www.epa.gov). ENomita và Azaguard Tech là các chất được chiết từ thực vật. ENomita chứa chất furoflavone chiết từ cây karanjin tác dụng lên ve bét và các côn trùng chích hút. Azaguard Tech là chế phẩm chiết từ hạt neem, tác dụng lên hơn 400 loài côn Trường Đại học KHTN 13 Luận văn thạc sĩ Sinh học Vũ Xuân Đạt trùng khác nhau nhưng không ảnh hưởng đến côn trùng có lợi. Các chất này kiểm soát sự sinh trưởng và do đó kiểm soát số lượng côn trùng. Bacillus thuringensis là một trong những vi khuẩn được sử dụng để kiểm soát côn trùng sớm nhất. Năm 1901, Ishiwatari phát hiện ra một loại vi khuẩn gây bệnh chết đột ngột ở tằm và đặt tên là Bacillus sotto. Năm 1911, Berliner phát hiện ra vi khuẩn này giết chết mọt bột mì và đặt tên lại là Bacillus thuringensis. Chế phẩm từ B. thuringensis (thường được gọi là Bt) bắt đầu được sử dụng để diệt côn trùng từ năm 1920 (http://www.bt.ucsd.edu/bt_history.html). Bt được đăng kí để sử dụng làm thuốc diệt côn trùng lần đầu tiên ở Mỹ từ năm 1961, và được đăng kí lại vào năm 1998 (http://npic.orst.edu/ingred/aifact.html). Năm 2007, Ahmad và cộng sự (2007) đã so sánh khả năng diệt rệp của Bt với một số hóa chất tổng hợp. Kết quả cho thấy, Bt làm giảm 70% số lượng rệp, xấp xỉ với hiệu quả của các hóa chất này [6]. Cho đến nay, có một số sản phẩm Bt thương mại như Able™, Biobit®, Cutlass™, Dipel®, Foray®, Javelin®, Thuricide®, Vectobac® đã được sử dụng để bảo vệ cây trồng. Larvorid là sản phẩm chứa protein độc của B. thuringiensis, tác dụng lên mọt và ruồi trắng. Khi ăn phải độc tố của B. thuringensis, côn trùng không tiêu hóa được thức ăn và chết. Gindin và cộng sự (2006) đã nghiên cứu khả năng diệt mọt cọ Rhynchophorus ferrugineus của Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana. Kết quả cho thấy, sau 1 tuần M. anisopliae diệt được 100% ấu trùng trong khi B. bassiana diệt được 80-82% ấu trùng và trứng của mọt cọ [29]. Kim và cộng sự (2001) sử dụng B. bassiana và Verticillium lecanii để kiểm soát rệp bông Aphis gossypii. Kết quả cho thấy chủng B. bassiana CS-1 diệt được 50% rệp sau 4,6-4,7 ngày và sau 5 ngày diệt được 64-75%. Chủng V. lecanii CS-625 diệt rệp tốt hơn, diệt được 50% rệp chỉ sau 2,7-3,3 ngày và diệt được 97-100% sau 5 ngày. V. lecanii cũng được sử dụng để kiểm soát ruồi trắng Trường Đại học KHTN 14