Tài liệu Nghiên cứu phát triển bộ kít phát hiện độc tố ricin dựa trên công nghệ aptamer

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGÔ NGỌC TRUNG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ KÍT PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ RICIN DỰA TRÊN CÔNG NGHỆ APTAMER LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGÔ NGỌC TRUNG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ KÍT PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ RICIN DỰA TRÊN CÔNG NGHỆ APTAMER Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 9420101.16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : 1. PGS. TS Lê Quang Huấn 2. PGS. TS Nguyễn Đình Thắng HÀ NỘI - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào, các dữ liệu tham khảo được trích dẫn đầy đủ. Hà Nội, ngày 08 tháng 11 năm 2020 Tác giả luận án Ngô Ngọc Trung LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, em xin chân thành cảm ơn PGS. TS Lê Quang Huấn, PGS.TS Nguyễn Đình Thắng đã định hướng nghiên cứu và tận tình hướng dẫn em thực hiện nội dung của luận án. Em xin chân thành cảm ơn cán bộ phòng Công nghệ tế bào động vật/ Viện Công nghệ Sinh học/Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Bộ môn Hóa sinh và Sinh học phân tử, Khoa Sinh học/ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội, Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia (NAFOSTED) đã quan tâm giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi và dành thời gian cho em trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận án. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các cán bộ, đồng nghiệp tại Viện Hóa học Môi trường quân sự/ Bộ Tư lệnh Hóa học đã có những chia sẻ, động viên trong những năm em thực hiện luận án. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã động viên giúp đỡ trong quá trình nghiên cứu thực hiện luận án. Hà Nội, tháng 11 năm 2020 Nghiên cứu sinh Ngô Ngọc Trung MỤC LỤC Trang Danh mục các chữ viết tắt i Danh mục các bảng iii Danh mục các hình v MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. RICIN 3 1.1.1 Ricin từ hạt Thầu Dầu 3 1.1.2. Cấu trúc phân tử và cơ chế tác động của ricin 4 1.1.2.1 Cấu trúc phân tử của ricin 4 1.1.2.2 Cơ chế tác động của ricin 7 1.1.3 Độc tính và ứng dụng của ricin 9 1.1.3.1 Độc tính của ricin 9 1.1.3.2 Ứng dụng trong y học 9 1.1.3.3 Ứng dụng trong quân sự 10 1.1.4 Các phương pháp tách chiết và tinh sạch ricin 11 1.1.4.1 Các phương pháp tách chiết ricin 11 1.1.4.2 Các phương pháp tinh sạch ricin 11 1.1.5 Tình hình nghiên cứu về ricin trong và ngoài nước 12 1.1.5.1 Tình hình nghiên cứu ricin trên thế giới 12 1.1.5.2 Tình hình nghiên cứu ricin tại Việt Nam 13 1.1.6 Các phương pháp phát hiện ricin 13 1.1.6.1 Phương pháp miễn dịch đánh dấu phóng xạ (RIA) 13 1.1.6.2 Phương pháp sử dụng cảm biến sinh học 14 1.1.6.3 Phương pháp sắc ký miễn dịch 15 1.1.6.4 Phương pháp ELISA 16 1.1.6.5 Phương pháp PCR, RT-PCR và I-PCR 17 1.1.6.6 Một số phương pháp khác 20 1.2 APTAMER VÀ ỨNG DỤNG PHÁT HIỆN RICIN 21 1.2.1 Giới thiệu về aptamer 21 1.2.2 Các quy trình thu nhận aptamer 23 1.2.2.1 Quy trình SELEX 23 1.2.2.2 Quy trình SELEX sử dụng màng lọc nitrocellulose 24 1.2.2.3 Quy trình SELEX sử dụng sắc ký ái lực và hạt từ 24 1.2.3. Các phương pháp xác định ái lực của aptamer với phân tử đích 25 1.2.4 Nghiên cứu về sự tương tác giữa aptamer và ricin 26 1.2.5 Thư viện aptamer sử dụng trong sàng lọc ricin 27 1.2.6 Tình hình nghiên cứu aptamer trong và ngoài nước 28 1.2.6.1 Các nghiên cứu của aptamer phát hiện kháng nguyên 28 1.2.6.2 Các nghiên cứu về aptamer phát hiện ricin 29 1.2.7 Thành phần và nguyên lý hoạt động của một số bộ kít phát hiện ricin 30 1.2.7.1 Bộ kít phát hiện ricin theo phương pháp ELISA 30 1.2.7.2 Bộ kít phát hiện ricin theo phương pháp real-time PCR 32 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 34 2.2 THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU VÀ HÓA CHẤT 34 2.2.1 Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu 34 2.2.2 Các hóa chất chính 35 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.3.1 Phương pháp tách chiết và tinh sạch ricin 35 2.3.1.1 Tách chiết ricin từ hạt Thầu Dầu 35 2.3.1.2 Tinh sạch ricin bằng sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel 36 2.3.2. Các phương pháp xác định ricin 36 2.3.2.1 Xác định hàm lượng protein 36 2.3.2.2 Xác định độ tinh sạch của ricin bằng phương pháp điện di 36 2.3.2.3 Phân tích khối phổ xác định ricin (LC-MS/MS) 36 2.3.2.4 Phương pháp sắc ký miễn dịch phát hiện ricin 37 2.3.2.5 Xác định hàm lượng ricin tương đối dựa trên test phát hiện nhanh 38 2.3.2.6 Kiểm tra sự có mặt của ricin bằng phương pháp Western blot 38 2.3.3 Phương pháp SELEX cải tiến sàng lọc aptamer đặc hiệu ricin 40 2.3.3.1 Chuẩn bị thư viện ssDNA thứ cấp 41 2.3.3.2 Gắn kết aptamer và Q sepharose fast flow 41 2.3.3.3 Rửa, giải hấp và thu sản phẩm 42 2.3.4 Các phương pháp sử dụng để chọn lọc aptamer 43 2.3.4.1 Phương pháp khuếch đại gen bằng PCR 44 2.3.4.2 Phản ứng gắn ADN vào vector tách dòng 45 2.3.4.3 Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E.coli DH5α 45 2.3.4.4 Chọn dòng tế bào chứa plasmid tái tổ hợp 46 2.3.4.5 Phương pháp giải trình tự axit nucleic tự động 47 2.3.4.6 Phương pháp điện di trên gel agarose 47 2.3.4.7 Phương pháp tính giá trị hằng số phân ly K d 47 2.3.4.8 Dự đoán cấu hình không gian của aptamer 48 2.3.5 Phương pháp chọn dòng aptamer bằng Enzyme – Limked Aptamer Assay (ELAA) 2.3.6 Xác định ricin bằng phương pháp Enzyme - Linked Aptamer Assay (ELAA) 48 49 2.3.7 Xác định ricin bằng phương pháp Real-time PCR 50 2.3.7.1 Xây dựng mối tương quan giữa ricin với aptamer Ar5.9 51 2.3.7.2 Phương pháp real-time PCR để phát hiện aptamer Ar5.9 51 2.3.8 Thẩm định sự phù hợp của phương pháp 51 2.3.8.1 Giới hạn phát hiện (LOD) 52 2.3.8.2 Giới hạn định lượng (LOQ) 52 2.3.8.3 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu 52 2.3.8.4 Xác định độ chính xác, độ không đảm bảo đo 53 2.3.8.5 Độ ổn định của phương pháp 56 2.3.9 Phương pháp lấy mẫu nước 57 2.3.10 Phương pháp thống kê trong xử lý kết quả thí nghiệm 57 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 58 3.1. TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH RICIN TỪ HẠT THẦU DẦU 58 3.1.1 Tách chiết protein tổng số từ hạt Thầu Dầu 58 3.1.2 Kết quả tinh sạch ricin 60 3.1.2.1 Tinh sạch ricin bằng sắc ký trao đổi ion 60 3.1.2.2 Tinh sạch ricin bằng sắc ký lọc gel 62 3.1.3 Kết quả xác định ricin bằng sắc ký khối phổ LC- MS/MS 66 3.2 NGHIÊN CỨU CHỌN LỌC APTAMER ĐẶC HIỆU RICIN 70 3.2.1 Chuẩn bị thư viện TV40 70 3.2.2 Nhân aptamer sợi đơn (ssADN) từ thư viện TV40 bằng phản ứng PCR mồi lệch, cặp ApF2/ApR2 73 3.2.3 Sàng lọc aptamer đặc hiệu ricin 71 3.2.4 Kết quả tách dòng và giải trình tự nucleotide của aptamer 72 3.2.5 Xác định giá trị Kd cho các aptamer đặc hiệu ricin 76 3.2.6 Xác định tính đặc hiệu của aptamer Ar5.9 83 3.3 KẾT QUẢ PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP VÀ CHẾ TẠO KÍT PHÁT HIỆN RICIN 3.3.1 Phát triển phương pháp phát hiện ricin bằng Aptamer Ar5.9 dựa trên nguyên lý ELAA 86 86 3.3.1.1 Khảo sát các thành phần phản ứng ELAA 86 3.3.1.2 Xây dựng đường chuẩn giữa ricin và aptamer Ar5.9 87 3.3.1.3 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 89 3.3.1.4 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp ELAA 90 3.3.1.5 Xác định khả năng phản ứng chéo trong phương pháp ELAA 93 3.3.1.6 Xác định độ chính xác của phương pháp 94 3.3.1.7 Xác định độ thu hồi và độ không đảm bảo đo của phương pháp 96 3.3.1.8 Xác định độ ổn định của phương pháp theo thời gian 97 3.3.2 Phát triển phương pháp phát hiện ricin bằng Aptamer Ar5.9 dựa trên kỹ 99 thuật real-time PCR 3.3.2.1 Kết quả kiểm tra phản ứng real-time PCR với aptamer Ar5.9 3.3.2.2 Kết quả xác định nhiệt độ tối ưu tách aptamer Ar5.9 từ phức hợp kháng thể đơn dòng - ricin - Aptamer Ar5.9 99 100 3.3.2.3 Khảo sát một số thành phần của phản ứng real-time PCR 101 3.3.2.4 Xây dựng đường chuẩn giữa ricin - aptamer Ar5.9 105 3.3.2.5 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 107 3.3.2.6 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp 108 3.3.2.7 Xác định khả năng phản ứng chéo của phương pháp real-time PCR 109 3.3.2.8 Xác định độ chính xác của phương pháp 110 3.3.2.9 Xác định độ thu hồi và độ không đảm bảo đo của phương pháp 112 3.3.2.10 Xác định độ ổn định của phương pháp theo thời gian 113 3.3.3 Đánh giá, so sánh 02 phương pháp phát hiện ricin 115 3.3.4 Nghiên cứu sản xuất bộ kít phát hiện ricin trong mẫu nước 116 3.3.4.1 Xây dựng quy trình sản xuất kít phát hiện ricin bằng phương pháp realtime PCR kết hợp aptamer Ar5.9 116 3.3.4.2 Đặc tính kỹ thuật của bộ kít 118 3.3.4.3 Quy trình phân tích 119 3.3.4.4 Kết quả thực hành sử dụng trong phát hiện ricin tại hiện trường 120 3.3.5 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến độ chính xác của bộ kít 124 3.3.5.1 Ảnh hưởng của một số kim loại nặng 124 3.3.5.2 Ảnh hưởng của một số loại ion vô cơ 125 3.3.5.3Ảnh hưởng của các chất hoạt động bề mặt 126 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 128 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN 129 ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO 130 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BSA Bovine serum albumine -Albumin huyết thanh bò CDC Centers of Disease Control and Prevention (Trung tâm kiểm soát và ngăn ngừa bệnh dịch) NBCW Nuclear - Biology - Chemistry weapons - Vũ khí Hóa sinh hạt nhân PCR Polymerase Chain Reaction RT-PCR Real - time Polymerase Chain Reaction ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay RIP Ribosome Inhibiting Protein -Protein ức chế ribosome RTA Ricin Toxin chain A - Chuỗi A của độc tố ricin RTB Ricin Toxin chain B - Chuỗi B của độc tố ricin RIA Radioimmunoassay - Miễn dịch đánh dấu phóng xạ NATO North Atlantic Treaty Organization (Tổ chức Hiệp ước Bắc Đại Tây Dương) SELEX Systematic evolution of ligands by exponential enrichment 2-ME 2-Mercaptoethanol ssADN Sợi đơn ADN ELAA Enzym - Linked Aptamer Assay LOD Giới hạn phát hiện LOQ Giới hạn định lượng SD Độ lệch chuẩn kDa Kilo Dalton LC-MS/MS Liquid Chromatography Mass Spectrometry Sắc ký lỏng khối phổ HPLC High-performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao i SDS Sodium dodecyl sulfate TE Tris - EDTA TEMED N,N,N’,N’-tetramethylenediamide SDS– PAGE Sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis PBS Phosphat Buffer Saline OPCW Organisation for the Prohibition of Chemical Weapons (Tổ chức cấm phổ biến vũ khí hóa học) TPBS PBS + 0,05% Tween -20 PBSM PBS + 0,1% methyl cellulose TBS Tris Buffer Saline (Đệm TBS) TTBS Tween - Tris Buffer Saline (Đệm Tris-Tween) TMB 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine SB Sodium Borate buffer (Đệm SB) DMSO Dimethyl sulfoxide LB Lysogeny Broth (Môi trường LB) HRP Horseradish Peroxidase AOAC Association of Official Analytical Chemists (Hiệp hội các nhà hoá học phân tích chính thống) DEAE Diethylaminoethanol ppm Parts per million - Một phần triệu ppb Parts per billion - Một phần tỷ ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Thành phần bộ kít phát hiện ricin của tetracore 31 2.1 Thành phần các chất trong phản ứng real-time PCR 51 2.2 Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau 54 2.3 Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau 55 2.4 Quy định về độ thu hồi của hội đồng châu Âu 55 3.1 Kết quả tách protein từ hạt Thầu Dầu bằng muối (NH4)2SO4 58 3.2 Kết quả xác định ricin trong các dung dịch protein sau tủa muối 59 3.3 3.4 Kết quả xác định ricin trong các phân đoạn chạy sắc ký trao đổi ion bằng test phát hiện nhanh Kết quả xác định ricin trong các phân đoạn chạy sắc ký lọc gel bằng test phát hiện nhanh 60 63 3.5 Các bước tách và tinh sạch ricin từ hạt thầu dầu 65 3.6 Kết quả sàng lọc aptamer đặc hiệu ricin 74 3.7 Trình tự nucleotide của 03 aptamer Ar4.5, Ar5.4 và Ar5.9 80 3.8 Kết qủa xác định tính đặc hiệu với ricin của các aptamer (OD 450nm) 83 3.9 Kết quả ELAA với ricin và Aptamer Ar5.9 89 3.10 Kết quả ELAA trên 10 mẫu trắng 91 3.11 3.12 Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu phát hiện ricin theo phương pháp ELAA Kết quả xác định khả năng phản ứng chéo với một số loại lectin tương tự 92 93 3.13 Độ chụm của phương pháp ELAA trong 03 nồng độ ricin 94 3.14 Kết quả xác định độ thu hồi của phương pháp 96 3.15 Giá trị S2 của các đợt thí nghiệm 98 3.16 Giá trị Ftn tại các thời điểm khác nhau so với thời điểm ban đầu 98 3.17 Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp 102 iii 3.18 Kết quả phát hiện ricin sử dụng aptamer Ar5.9 106 3.19 Kết quả real-time PCR trên 10 mẫu trắng 108 3.20 3.21 Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp real-time PCR sử dụng aptamer Ar5.9 phát hiện ricin Kết quả Ct (trung bình) xác định khả năng phản ứng chéo với một số loại lectin tương tự 109 109 3.22 Độ chụm của phương pháp real-time PCR 110 3.23 Kết quả xác định độ thu hồi của phương pháp 112 3.24 Giá trị S2 của các đợt thí nghiệm 113 3.25 Giá trị Ftn tại các thời điểm khác nhau so với thời điểm ban đầu 114 3.26 Các thông số kỹ thuật của 02 phương pháp phát hiện ricin 115 3.27 Thành phần bộ kít Real-time PCR phát hiện ricin cho 96 mẫu 116 3.28 Kết quả xác định ricin bằng bộ kít real-time PCR với các mẫu nước 117 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Tên hình Trang Cây Thầu Dầu (Ricinus communis.L) và hạt Thầu Dầu - một trong 3 những nguồn cung cấp ricin từ tự nhiên 1.2 Cấu hình không gian của ricin 5 1.3 Tiền chất preproricin 5 1.4 Cấu trúc ricin với các vị trí hoạt động 6 1.5 Cơ chế sinh tổng hợp ricin trong tế bào 6 1.6 Các con đường vận chuyển ricin trong tế bào 8 1.7 Cơ chế hoạt động gây độc của ricin trong ribosome 8 1.8 Cấu trúc của test phát hiện ricin bằng phương pháp sắc ký miễn dịch 16 1.9 Sơ đồ nguyên lý phát hiện ricin qua real-time PCR đoạn ADN marker 19 1.10 Sơ đồ sàng lọc thu nhận aptamer đặc hiệu phân tử đích 24 1.11 Sơ đồ dự đoán vị trí liên kết giữa ricin – aptamer (A) và ricin – kháng thể đơn dòng (B) 26 1.12 Sơ đồ thư viện ADN sợi đơn 27 2.1 Quy trình tách chiết và tinh sạch ricin từ hạt Thầu Dầu 40 2.2 Sơ đồ quy trình sàng lọc Aptamer đặc hiệu ricin bằng cột NANOSEP 5K OMEGA 43 2.3 Sơ đồ quy trình tách dòng và chọn lọc aptamer đặc hiệu ricin 44 2.4 Mô hình đồ thị xác định giá trị Kd 48 2.5 Sơ đồ nguyên lý phát hiện ricin bằng phương pháp ELAA 49 2.6 Sơ đồ nguyên lý phát hiện ricin bằng phương pháp real-time PCR 50 3.1 Điện di đồ SDS-PAGE (3.1 a) và western blot của quá trình tách chiết ricin 59 3.2 Sắc đồ rửa giải ricin trên cột sắc ký trao đổi ion 61 3.3 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch sau khi chạy sắc ký trao đổi ion 61 3.4 Sắc ký đồ tinh sạch ricin bằng sắc ký lọc gel 62 v 3.5 Kết quả điện di ricin sau chạy sắc ký lọc gel 64 3.6 Kết quả kiểm tra độ tinh sạch ricin bằng phần mềm ImageJ 65 3.7 Trình tự axit amin nhận được và các đoạn peptide (các đoạn có màu) khi phân tích LC- MS/MS mẫu ricin tinh sạch. 67 3.8 Kết quả phân tích khối phổ ricin trình tự A,B 67 3.9 Kết quả phân tích khối phổ ricin trình tự C,D 68 3.10 So sánh trình tự thu được với thư viện protein 69 3.11 Trình tự phân tích khối phổ MALDI MS của ricin 69 3.12 Kết quả phản ứng PCR từ thư viện TV40 70 3.13 Kết quả PCR với cặp mồi lệch từ thư viện TV40 71 3.14 Kết quả PCR aptamer sau sàng lọc với ricin 76 3.15 Kết quả biến nạp vào vector pBT (3.16A) pCR2.1 (3.16B) vào tế bào khả biến E. coli DH5α 77 3.16 Kết quả sàng lọc sơ bộ các dòng có thể mang aptamer đặc hiệu ricin 77 3.17 Kết quả sàng lọc sơ bộ các dòng có thể mang aptamer đặc hiệu ricin 78 3.18 Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp mang aptamer đặc hiệu ricin 78 3.19 Kết quả xác định khả năng gắn kết của 8 aptamer có ái lực cao nhất với ricin qua phản ứng ELAA 79 3.20 Cấu trúc không gian của Ar4.5 80 3.21 Cấu trúc không gian của aptamer Ar5.4 81 3.22 Cấu trúc không gian của aptamer Ar5.9 81 3.23 Mô hình aptamer SSRA1 của Elise A. Lamont 83 3.24 Đồ thị xác định giá trị Kd của aptamer Ar4.5 84 3.25 Đồ thị xác định giá trị Kd của aptamer Ar5.4 84 3.26 Đồ thị xác định giá trị Kd của aptamer Ar5.9 85 3.27 Kết quả xác định tính đặc hiệu của aptamer Ar5.9 với ricin bằng Dot blot 86 3.28 Kết quả khảo sát hàm lượng aptamer liên kết với ricin 87 3.29 Kết quả khảo sát các loại đệm liên kết và quá trình tiền xử lý aptamer 88 3.30 Đồ thị xác định các điểm hồi quy tuyến tính giữa OD450 và nồng độ 89 vi ricin trong phản ứng ELAA 3.31 Đường chuẩn xác định hàm lượng ricin bằng phương pháp ELAA 90 3.32 Kết quả phản ứng Real-time PCR với Aptamer Ar5.9 99 3.33 Kết quả điện di sản phẩm sau khi chạy real-time PCR với Ar5.9 100 3.34 Kết quả phản ứng real-time PCR sử dụng Aptamer Ar5.9 sau khi biến tính (tách ra khỏi phức hợp Aptamer - ricin) ở các nhiệt độ khác nhau 101 3.35 Kết quả phản ứng realtime PCR ở nhiệt độ 62 oC 102 3.36 Kết quả phản ứng real-time PCR với các nồng độ primer khác nhau 103 3.37 Kết quả chạy phản ứng realtime PCR với master mix IDT 104 3.38 Kết quả chạy phản ứng realtime PCR với master mix Bioneer 105 3.39 Mối tương quan giữa nồng độ ricin - aptamer và giá trị Ct 106 3.40 Phương trình đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa Ct và nồng độ aptamer Ar5.9 107 3.41 Kết quả xác định ricin bằng phương pháp sắc ký miễn dịch 124 3.42 Ảnh hưởng của một số kim loại nặng đến độ chính xác của bộ kít 125 3.43 Ảnh hưởng của một số loại muối vô cơ đến độ chính xác của kít 126 3.44 Ảnh hưởng của một số chất tẩy rửa đến độ chính xác của kít 126 vii MỞ ĐẦU Ricin là một loại protein có đặc tính liên kết đặc hiệu với đường, thuộc nhóm lectin, có nhiều nhất trong hạt Thầu Dầu (Ricinus communis.L.). Ricin được xem như một loại tác nhân sinh học điển hình do có độc tính cao với người và động vật. Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ xếp ricin vào mức độ nguy hiểm nhóm B cùng với các loại vi sinh và độc tố khác như phẩy khuẩn tả (Vibrio cholera), tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus), vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm (Escherichia coli O157:H7) và độc tố Botulinum. Bởi vậy, ricin được quan tâm như một tác nhân sinh học có thể gây nguy hiểm cho người khi được sử dụng trong khủng bố hoặc chiến tranh sử dụng vũ khí sinh học. Có nhiều phương pháp phát hiện ricin trong môi trường, trong tế bào và sinh vật. Trong khuôn khổ luận án này, tác giả tập trung hướng nghiên cứu phát hiện ricin trong các mẫu môi trường, phục vụ quân đội để trinh sát phát hiện tác nhân nguy hiểm này. Để phát hiện ricin trong mẫu môi trường, người ta hay sử dụng các phương pháp đặc hiệu để phát hiện nhanh và chính xác có độ nhạy lên đến nanogram như: sắc ký miễn dịch, ELISA, sử dụng các Aptamer đặc hiệu ricin, tán xạ raman dựa trên aptamer, Real-time PCR... Các phương pháp miễn dịch và ELISA đòi hỏi phải có ricin chuẩn (là đối chứng dương) và các kháng thể đơn dòng kháng ricin (kháng thể kháng chuỗi A và kháng chuỗi B của ricin), kháng thể này chỉ có một số ít công ty trên thế giới sở hữu nên chỉ có thể đặt mua với số lượng hạn chế với giá thành cao. Ricin cũng không thể mua được dạng thương mại vì liên quan đến tính gây độc cực cao cũng như việc tham gia hiệp ước không phổ biến vũ khí hủy diệt lớn mà Việt Nam là một thành viên. Chính vì vậy, việc tách, tinh sạch ricin và tìm ra những phân tử nhằm thay thế kháng thể đơn dòng có ái lực cao với ricin là một hướng nghiên cứu cần thiết. Sử dụng aptamer chính là một trong các hướng nghiên cứu thay thế đáng quan tâm cho vấn đề này. Aptamer là các sợi đơn oligonucleotide ADN hoặc ARN có cấu trúc đặc biệt và có khả năng gắn kết đặc hiệu với các phân tử đích khác nhau, ví dụ như các phân 1 tử hữu cơ nhỏ, các dạng protein hay tế bào ung thư. So với kháng thể đơn dòng thì aptamer có các ưu thế như: ổn định về mặt hóa học trong phạm vi nhiệt độ cao đến 90OC, có thể biến tính thuận nghịch và có thể được phân lập bằng phương pháp in vitro mà không có phản ứng miễn dịch. Hơn nữa, các sợi aptamer được tổng hợp một cách nhanh chóng thông qua phản ứng PCR sau một vài chu trình, có thể dễ dàng sửa đổi và đánh dấu bằng các kỹ thuật đơn giản mà không làm ảnh hưởng đến khả năng liên kết đặc hiệu với phân tử đích. Aptamer hiện nay đang được nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực trong đó có lĩnh vực chẩn đoán phát hiện kháng nguyên, phát hiện dư lượng kháng sinh và điều trị vận chuyển thuốc. Bởi vậy, nghiên cứu sàng lọc aptamer đặc hiệu ricin, nghiên cứu phương pháp và bộ kít phát hiện ricin là một trong những vấn đề cần thiết hiện nay. Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát triển bộ kít phát hiện độc tố ricin dựa trên công nghệ aptamer” nhằm phát hiện và đinh lượng độc tố ricin trong môi trường nước bằng cách kết hợp giữa aptamer đặc hiệu ricin cùng với các phương pháp hiện đại là ELISA và real - time PCR. Luận án được tiến hành với các mục tiêu sau: - Tách, tinh sạch độc tố ricin từ hạt Thầu Dầu được trồng tại Việt Nam. - Sàng lọc aptamer đặc hiệu ricin. - Phát triển các phương pháp và xây dựng quy trình, sản xuất các thành phần bộ kít phát hiện ricin và ứng dụng trong phân tích mẫu nước. Những đóng góp mới của luận án: - Đã đưa ra quy trình tách chiết và tinh sạch ricin tại Việt Nam dựa trên phương pháp kết tủa bằng muối trung tính kết hợp với sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel. - Đã sàng lọc được 03 dòng aptamer đặc hiệu với ricin trong đó aptamer Ar5.9 có ái lực cao nhất với ricin, giá trị Kd = 0,83 nM. - Đã phát triển được 02 phương pháp phân tích ricin sử dụng aptamer đặc hiệu ricin và quy trình chế tạo bộ kít phát hiện ricin bằng phương pháp real-time PCR, bước đầu ứng dụng bộ kít phân tích ricin trong các mẫu nước. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1 RICIN 1.1.1 Ricin từ hạt Thầu Dầu Ricin là một loại protein thuộc nhóm chimerolectin, được tìm thấy nhiều trong tự nhiên, nhất là trong hạt cây Thầu Dầu (Ricinus communis.L). Cây Thầu Dầu thuộc họ Euphorbiaceae, chi Ricinus, loài Ricinus communis.L. Cây Thầu Dầu có nguồn gốc từ vùng Đông Phi nhưng hiện nay được trồng phổ biến trên toàn cầu. Hạt Thầu Dầu chứa 45÷50% dầu, 25% chất albuminosid, một số loại tinh dầu và nitrogen (ricidin), axít malic, một số loại đường và muối, cellulose, ricin và ricinin, các enzyme thủy phân trong đó có lipase [19]. Theo các nghiên cứu của Funatsu và cộng sự thì tỷ lệ ricin trong hạt Thầu Dầu tương đối cao, chiếm tới 0,2 – 0,3% khối lượng khô. Ngoài ra, ricin cũng tồn tại lâu trong nước, đất mà không mất đi hoạt tính sinh học [49]. Hình 1.1: Cây Thầu Dầu (Ricinus communis.L) và hạt Thầu Dầu – Một trong những nguồn cung cấp ricin từ tự nhiên [19] Trong tế bào của hạt Thầu Dầu, ricin được chứa trong không bào dự trữ protein. Tương tự như các thành phần dự trữ protein khác của không bào, ricin được tổng hợp trong quá trình chín của hạt và được thủy phân trong vài ngày đầu sau khi nảy mầm. Ngoài ra, có một số dạng cấu trúc tương tự ricin là ricin D, E và một loại lectin có liên quan là agglutinin (RCA) cũng được tìm thấy trong hạt Thầu Dầu. Tổng cộng ricin chiếm khoảng 5% lượng protein tổng số trong hạt trưởng thành [21, 35]. 3 Cũng như các lectin có nguồn gốc thực vật khác, ricin có tính đặc hiệu liên kết với một số loại đường và đặc hiệu ngưng kết nhóm máu. Ricin có thể liên kết với các phân tử đường đơn hoặc các gốc đường nằm trên bề mặt màng tế bào như galactose hoặc N - acetyl-galactosamine. Đặc biệt, chuỗi B của phân tử ricin có liên kết chặt chẽ với gốc đường galactose bằng các liên kết phân cực (liên kết giữa các nhóm - OH của đường với các đầu phân cực của các gốc axit amin trên phân tử ricin) và các liên kết không phân cực như liên kết không gian, liên kết Vander Wall [135]. 1.1.2. Cấu trúc phân tử và cơ chế tác động của ricin 1.1.2.1 Cấu trúc phân tử của ricin Các nghiên cứu đã cho thấy ricin có khối lượng phân tử khoảng 65 kDa với cấu trúc phân tử gồm hai chuỗi polypeptide được ký hiệu là chuỗi A và chuỗi B. Hai chuỗi được liên kết với nhau qua cầu nối disulfide (-S-S-). Trong cấu trúc không gian, chúng cuộn xoắn tạo thành hình cầu [100]. Chuỗi A có khối lượng phân tử vào khoảng 30-32 kDa, được cấu tạo từ 267 axit amin và là thành phần chính gây độc cho tế bào. Chuỗi B có khối lượng phân tử khoảng 32-34 kDa, gồm 262 axit amin tạo nên và là thành phần liên kết đặc hiệu với đường galactose trên bề mặt tế bào, giúp cho quá trình xâm nhập của ricin vào trong tế bào. Cấu trúc ba chiều của ricin đã được phân tích bằng phương pháp tinh thể học tia X và được nghiên cứu chi tiết đến độ phân giải 2,5 Å [109], cấu trúc giả định 3D [96]. Mô hình này cho phép mô tả chính xác và chi tiết về cấu trúc của cả chuỗi A và chuỗi B. Trong một nghiên cứu khác, cấu trúc của chuỗi A tái tổ hợp đã được phân tích đến độ phân giải 2,3 Å [95]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng chuỗi B có đặc tính liên kết đặc hiệu với gốc đường galactose của màng tế bào để tạo ra glycoprotein, chịu trách nhiệm liên kết với màng tế bào để vận chuyển ricin qua màng. Chuỗi A là thành phần gây độc cho tế bào bằng cách liên kết và gây bất hoạt ribosome. 4